Summary
Hier berichten wir über gemeinsame Methoden für die Analyse der phagocytic Funktion der murinen alveolären Makrophagen und bakterielle Freiraum aus der Lunge. Diese Methoden studieren in-vitro-Phagozytose von Fluorescein Herstellung Perlen und in-vivo Phagozytose von Pseudomonas Aeruginosa Green Fluorescent Protein. Wir beschreiben auch eine Methode für das clearing von p. Aeruginosa bei Mäusen.
Abstract
Alveoläre Makrophagen (AMs) bewachen den alveolären Raum der Lunge. Phagozytose durch AMs spielt eine entscheidende Rolle bei der Verteidigung gegen eindringende Krankheitserreger, die Entfernung von abgestorbenen Zellen oder Fremdkörper, und bei der Lösung von Entzündungsreaktionen und Umbau-Gewebe verarbeitet, die durch verschiedene Oberflächen-Rezeptoren vermittelt werden Das AMs. Hier berichten wir über Methoden zur Analyse der phagocytic Funktion des AMs mit in-vitro- und in-vivo-Tests und experimentelle Strategien um zu unterscheiden, die Muster-Anerkennung-Rezeptor - Komplement-Rezeptor- und Fc-Gamma-Rezeptor-vermittelten Phagozytose. Schließlich diskutieren wir eine Methode zu etablieren und zu charakterisieren ein p. Aeruginosa Lungenentzündung Modell bei Mäusen zu in-vivo bakterielle Abstand beurteilen. Diese Tests sind die am häufigsten verwendeten Methoden, AM Funktionen zu bewerten und können auch zur Funktion der Makrophagen und bakterielle Spiel in andere Organe zu studieren.
Introduction
AMs sind die wichtigsten Residenten Fresszellen in die Alveolen in der Ruhephase und einer der Hauptakteure der angeborenen Immunantwort durch die Anerkennung und Internalisierung der eingeatmete Krankheitserreger und Fremdkörper1,2. Es wurde berichtet, dass AMs unerlässlich für die schnelle Abfertigung von vielen pulmonale Krankheitserreger wie p. Aeruginosa und Klebsiella Pneumonie3,4, sind also ein Mangel an AM Phagozytose oft in die Atemwege führt Infektionen, wie z. B. akute Lungenentzündung, die höhere Mortalität und Morbidität führen.
AMs initiieren auch angeborene Entzündungsreaktionen in der Lunge durch die Herstellung Zytokine und Chemokine wie TNF-α und IL-1β, welche Übersprechen mit anderen Zellen der alveolären Umwelt produzieren Chemokine und entzündliche Neutrophilen, Monozyten, rekrutieren und Adaptive Immunzellen in der Lunge5. Zum Beispiel hilft IL-1β von AMs produziert die Freisetzung von Neutrophilen Chemokin CXCL8 aus Epithelzellen6Prime. Darüber hinaus tragen AMs zur Phagozytose des apoptotischen polymorphkernige Leukozyten (PMNs), was dazu führt, das nachhaltige Austreten von intrazellulären Enzyme von PMNs Nichtbeachtung umliegendes Gewebe, wodurch Gewebeschäden und längerer Entzündung 7 , 8 , 9.
Phagozytose durch das AMs wird durch eine direkte Anerkennung der Pathogen-assoziierte molekulare Muster auf der Oberfläche der Erreger durch die Muster-Anerkennung-Rezeptoren (PRRs) des AMs oder durch die Bindung von opsonized Krankheitserreger mit immun-Effektor-Rezeptoren des AMs vermittelt. 10. für Letzteres AMs erkennt die Ziele mit Immunglobulin (IgG) opsonized durch ihre Fcγ Rezeptoren (FcγR) oder die Erreger beschichtet mit Ergänzung Fragmente, C3b und C3bi, durch deren Komplement-Rezeptoren (CR)11. Unter Ergänzung Rezeptoren die CR die Immunglobulin-Superfamilie (CRIg) drückt sich selektiv im Gewebe Makrophagen12und den letzten Feststellung hob die Rolle der CRIg in AM Phagozytose im Zusammenhang mit p. Aeruginosa Lungenentzündung 13.
Viele Originalstudien verwenden Methoden, um Makrophagen Phagozytose um zu beschreiben, die molekularen Mechanismen der Makrophagen Funktion14,15zu bewerten. Methoden wie in-vivo Phagozytose erfordern jedoch eine präzise Quantifizierung der Phagozytose. Hier fassen wir eine detaillierte Methode für in-vitro- und in-vivo Phagozytose mit Fluorescein erfolgt (FITC)-Glas Perlen und p. Aeruginosa grün fluoreszierenden Proteins (GFP), beziehungsweise. Darüber hinaus erläutern wir die Methode der Unterscheidung zwischen PRR, CR und FcγR vermittelt Phagozytose. Zu guter Letzt berichten wir über eine Methode, um bakterielle Clearance bei Maus in Bezug auf p. Aeruginosa Lungenentzündung zu charakterisieren.
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Protocol
Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Eastern Virginia Medical School.
(1) fluoreszierenden Perlen Phagozytose
- Die Maus einschläfern (C57BL/6J, 6 Wochen alt, weiblich) durch CO2 ersticken nach IACUC Protokolle für die ethische Euthanasie von Tieren.
- Legen Sie die Maus Belly-up auf eine Dissektion Board mit Küchenpapier bedeckt. Festzunageln Sie seine Pfoten mit seinen Gliedmaßen Spread-Eagle und Haken Sie eine Zeichenfolge unter seine Vorderzähne, seinen Kopf zurück, so dass die Luftröhre gerade ausgerichtet ist und Niveau.
- Nass, Kehle, Brust und Bauch mit 70 % Ethanol zur Desinfektion und verhindern, dass das Fell kleben an den Werkzeugen der Maus.
- Mit regelmäßigen Pinzette, ziehen Sie die Haut an der Mittellinie des Körpers, und schneiden mit chirurgische scheren sich die Mittellinie an die Spitze der Kehle.
- Mit dem stumpfen Ende standard Chirurgische Scheren, sorgfältig wegziehen von Muskel- und Bindegewebe an der Kehle und Feder Schere (Microscissors) verwenden, um die Luftröhre aussetzen.
- Einen Knorpel-Ring mit der Zange greifen, sorgfältig machen Sie einen kleinen Schnitt (~1.5 mm), mit Microscissors, auf die Herzkammer Gesicht der Luftröhre und legen Sie eine 18 G-Kanüle in der Luftröhre.
- Sanft Lavage 3 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1 mL zu einem Zeitpunkt. Jedes Mal sanft zurückziehen die Flüssigkeit in der Spritze und beleben ihn zurück in die Lunge, 3 X in Folge. Nach dem Sammeln der BALF, führen Sie durch zervikale Dislokation um Euthanasie zu gewährleisten. Übertragen der gesammelten PBS (~2.8 mL), die alvéolaire Lavage Fluid (BALF) ist, zu einem Schlauch, Zentrifuge bei 1.000 x g für 10 min, und sammeln Sie das Pellet. Am Rohr und Zentrifuge bei 1.000 X g für 10 min waschen den Schmutz und sammeln die gebeizte alveolären Makrophagen fügen Sie 1 mL frisch PBS hinzu.
- Aufschwemmen Sie das Pellet in 2 mL Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) mit 10 % Nonheat-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS) und Kultur primäre alveoläre Makrophagen in den gleichen Medien für 2 Tage auf einem Glasboden Teller bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre.
- Aspirieren Sie die alten Medien, waschen Sie es mit 1 mL PBS, und 2 mL frische Medien. Perlen Sie FITC (Carboxylated Latex Perlen, 2 µm im Durchmesser, 50 Perlen/Zelle) und inkubieren Sie für 1 h bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre.
- Waschen Sie ausgiebig mit PBS (1 mL in einer Zeit, für eine Gesamtmenge von fünf Wäschen), um extrazelluläre Perlen zu entfernen. Bild 100 Zellen nach dem Zufallsprinzip und zählen Sie die Zellen mit intrazellulären Perlen (488 nm).
Hinweis: Phagocytic Indizes sind die Anzahl der aufgenommenen Perlen dividiert durch die Gesamtzahl der Makrophagen. der Anteil der phagocytic Zellen ist die Anzahl von Makrophagen, die mindestens eine Perle dividiert durch die Gesamtzahl der Makrophagen16aufnehmen.- Alternativ nach einer 1 h Inkubation mit Perlen, die Zellen mit 3 mL PBS waschen und für Durchflusszytometrie für die Quantifizierung der Phagozytose zu verarbeiten. In ähnlicher Weise verarbeiten Sie AMs ohne Perlen als ungefärbten Zellen oder Kontrolle. Berechnen Sie die prozentuale Positivität und meine Fluoreszenzintensität, mit Flow Cytometry Software, indem Sie diese Optionen in der Software auswählen.
2. FcγR - und CR-vermittelten Phagozytose
- Inkubieren Sie für die Opsonization 2 x 108 Schafe roten Blutkörperchen (SRBCs) mit 50 µL Kaninchen Anti-SRBC-IgM oder 50 µL Kaninchen Anti-SRBC-IgG für 30 min bei Raumtemperatur11.
- Beheben Sie die Ergänzung Fragmente C3b und C3bi auf IgM-beschichtete SRBCs IgM opsonized SRBCs mit 50 µL Humanserum C5-defizienten (C5D) für 30 min bei 37 ° C inkubieren.
- Seed murinen Makrophagen Zellen (MH-S) (10.000 Zellen/Na) in eine 96-Well-Platte und inkubieren Sie es über Nacht um einen Zusammenfluss ~ 70 % zu erhalten. Fügen Sie 100 µL 1 x 107/mL opsonized SRBCs in jede Vertiefung der MH-S Zellen und 1 h bei 37 ° c inkubieren Wash ungebunden SRBCs sehr schnell (~ 1 min) mit 100 µL Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Lysis Puffer.
- Lösen Sie die Zellen mit 0,1 % SDS und fügen Sie 50 µL 2,7-Diaminofluorene (DAF), 3 % Wasserstoffperoxid und 6 M Harnstoff enthält. Messen Sie die Absorption der Hämoglobin-katalysierte Fluorene blau Bildung bei 620 nm.
- Bestimmen Sie die Anzahl der SRBCs mithilfe einer Standardkurve bei 620 nm Absorption Werte mit einer bekannten Anzahl von SRBCs. In ähnlicher Weise inkubiert Prozess MH-S Zellen mit nonopsonized SRBCs, als negative Kontrollen zu verwenden.
(3) PRR-vermittelten Phagozytose
- Schritte 1.1-1.9 für die Isolierung und Kultivierung von Maus primäre alveoläre Makrophagen.
- Entfernen Sie nach 2 Tagen das Medium, die Zellen mit 1 mL PBS waschen und 500 µL frisches Medium mit Alexa Fluor-488-konjugiert Zymosan-A Bioparticles (100 Partikel/Gericht) hinzufügen.
- 1 h bei 37 ° c inkubieren Stoppen Sie die Phagozytose durch Zugabe von 500 µL eiskaltem PBS.
- Waschen Sie die Zellen ausführlich mit PBS (1 mL in einer Zeit, für eine Gesamtmenge von fünf Waschungen). Befestigen Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd für 10 min bei Raumtemperatur.
- Waschen der Zellen ausführlich mit PBS (1 mL in einer Zeit, für eine Gesamtmenge von fünf Wäschen) und halten Sie die Zellen in 500 µL PBS.
- Bild der Zellen unter differential Interferenz-Kontrast und einem fluoreszierenden Kanal bei 488 nm. Zählen Sie AMs mit Zymosan-A Bioparticles und bestimmen Sie den Prozentsatz der Phagozytose.
4. in Vivo Phagozytose durch alveoläre Makrophagen
Hinweis: p. Aeruginosa GFP auf Nähragar Teller zu impfen und über Nacht die Platte bei 37 ° C inkubieren. Am nächsten Tag impfen Sie die einzige Kolonie bis 2 mL der Nährbouillon und wachsen Sie die Bakterien bei 37° C über Nacht.
- Am nächsten Tag zu betäuben Mäuse mit einem intraperitonealer Verabreichung von 100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin. Richtige Anesthetization über eine fehlende Reaktion auf die Zehe Prise zu bestätigen.
- Legen Sie die Maus auf ein flaches Brett mit einem Gummiband über die oberen Schneidezähne und positionieren Sie es semirecumbent (45°) mit der ventralen Oberfläche und Tribüne nach oben zeigt. Mit gebogenen Pinzette, teilweise zurückziehen der Zungenkrebs. Mit einem Mikrosprayer, Intratracheally 50 µL (5 x 106 Koloniebildenden Einheiten [CFU])17 von p. Aeruginosa GFP in die Lungen der narkotisierten Mäuse verwalten.
- Nach 1 h von Infektion Schritte 1,1-1,7.
- Aufschwemmen der Zellen in PBS und Cytocentrifuge sie (1.000 X g, 1 min bei Raumtemperatur) auf einen Objektträger.
- Differentiell Fleck der Cytospin Folien für alveolären Makrophagen, neutrophilen Granulozyten und Lymphozyten, gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Nach dem Zufallsprinzip wählen Sie 100 AMs, zählen Sie das AMs, die intrazelluläre Bakterien, und den Prozentsatz der Phagozytose.
5. in Vivo Bakterien Clearance mittels p. Aeruginosa
- P. Aeruginosa auf eine Agarplatte p. Aeruginosa Isolierung zu impfen und über Nacht die Platte bei 37 ° C inkubieren. Impfen Sie die einzige Kolonie bis 2 mL Lysogeny Brühe (LB) zu und wachsen Sie die Bakterien bei 37° C über Nacht. Berechnen Sie die KBE, mithilfe der folgenden Formel.
KBE/mL = (Anzahl der Kolonien x Verdünnungsfaktor) / Volumen der Kultur-Platte.
Die Kultur mit PBS der gewünschten KBE/mL zu verdünnen. - In Studie 1 Intratracheally injizieren eine subletale Dosis von ~2.5 X 105 KBE/mL p. Aeruginosa in narkotisierten Wildtyp (WT) und TRIM72KO Mäusen, wie in Schritt 4.2 angegeben. Messen Sie das Körpergewicht täglich für 6 Tage.
- Spritzen Sie in Studie 2 eine zweite Dosis von p. Aeruginosa (5 x 105 KBE/mL) in die Mäuse, die in Studie 1 überlebt und das Körpergewicht für 4 Tage zu messen.
- Injizieren Sie in Studie 3, einen anderen Satz von Mäusen WT und TRIM72KO Mäusen mit einer tödlichen Dosis (3 x 107 KBE/mL) von p. Aeruginosa zu und erfassen Sie die Sterblichkeit innerhalb 2 Tagen nach der Injektion. Tiere Anzeichen von schweren Belastungen, wie bedeutende Körper-Gewicht-Verlust, wird durch die behandelnden Tierärzte Rundrücken, Magersucht oder Dyspnoe beurteilt werden. Sofort werden unheilbar Tiere geopfert werden.
- Bei Tod oder nach Euthanasie am 2. Tag nach der Injektion sammeln Sie das ganze Lungengewebe für die Quantifizierung der Lunge bakterielle Belastung am Gipfel Infektion.
- Um die bakterielle Belastung der Lunge zu testen, das Lungengewebe 200 µL des normalen Kochsalzlösung hinzu und homogenisieren sie, mit einer zuvor getesteten Einstellung auf eine elektronische Homogenisator, die völlig das Lungengewebe stört ohne Bakterien. Passen Sie das Gesamtvolumen der Lunge Homogenat zu 1 mL und Platte 100 µL der Lunge lysate auf Pseudomonas isoliert Agarplatten bei 10-divisibel serielle Verdünnungen.
- Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C für 24 h und zählen Sie die Bakterienkolonien um die KBE pro ganze Lunge festzustellen.
6. statistische Analyse
- Verwenden des Student t-Test, um die statistische Signifikanz der Differenz zwischen den beiden Gruppen festzustellen. Einen Unterschied als statistisch signifikant überlegen p < 0,05. Alle Daten werden dargestellt als ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM) bedeutet.
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Representative Results
Zuerst führten wir das Experiment zu analysieren, Phagozytose per Mausklick primäre AMs. Während alle Analysen verglichen wir AMs von WT und TRIM72KO Mäusen isoliert. Wie in Abbildung 1Adargestellt, offenbart Fluoreszenz-Mikroskopie die Phagozytose von FITC-Glasperlen von Maus primären AMs tritt nach 1 h Inkubation. Abbildung 1 B zeigt die Auswertung der Phagozytose durch Durchflusszytometrie. Die Quantifizierung der Phagozytose durch Mikroskopie gemessen und Durchflusszytometrie ist in Abbildung 1C und Abbildung 1D, bzw. vertreten. FcγR - und CR-vermittelten Phagozytose von MH-S-Zellen ist in Abbildung 2Avertreten und Abbildung 2B zeigt die Quantifizierung. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Expression von TRIM72 in MH-S-Zellen eine mehr als Fünffache Abnahme der Ergänzung Phagozytose geführt. Repräsentative Bilder von Alexa Fluor-488-konjugiert Zymosan-A-Teilchen Verschlucken von primären AMs von WT oder TRIM72KO Mäusen isoliert werden in Abbildung 2C, und die Quantifizierung wird dargestellt in Abbildung 2D . In-vivo Phagozytose Ergebnisse sind in Abbildung 3dargestellt. Abbildung 3 A zeigt unterschiedliche Färbung, die Anwesenheit von AMs, Neutrophile, Lymphozyten und GFP+ phagocytic Zellen zu identifizieren. Der Anteil der BALF Zellen und die Quantifizierung der Phagozytose ist in Abbildung 3B und Abbildung 3C, vertreten. Der Anteil der Körper-Gewicht-Verlust bei Mäusen nach der intratrachealen Verabreichung eine subletale Dosis von p. Aeruginosa ist in Abbildung 4Adargestellt, und der Anteil des Überlebens von Mäusen am 2. Tag nach eine tödliche Dosis von p. aeruginosa in Abbildung 4 bangegeben. Abbildung 4 C zeigt ein Streudiagramm für die ganze Lunge bakterielle Belastung bei Tod oder am 2. Tag nach der p. Aeruginosa Infektion bei Mäusen.
Abbildung 1 : Phagozytose in Maus primäre alveoläre Makrophagen. (A) repräsentative Bilder mit geringer im Vergleich zu hohen Phagocytic Indizes zeigen primäre AMs mit grünen fluorescent Perlen (links); repräsentative Bilder zeigen niedrige und hohe Prozentsätze von phagocytic AMs. Pfeile: niedrige Phagocytic Index AMs; Pfeilspitzen: hohe Phagocytic Index AMs. Die Maßstabsleiste = 25 µm für die linken beiden Bilder und 50 µm für den rechten beiden Bildern. (B) Vertreter Fluss Cytometry Erkennung von Zellen in keine-Perlen-Control, WT + Perlen und TRIM72KO + Perlen AMs Erregerelimination. Bars definieren Wulst-haltigen Zellenbevölkerung (in Prozent) und die mittlere Fluoreszenzpräparate Intensität (MFI). (C) Statistiken über die durchschnittliche Phagocytic Index und den Prozentsatz der phagocytic AMs in WT und TRIM72KO AMs; n = 5 für beide Gruppen *p < 0,05. (D) Statistik der Fluss Cytometry MFI und der Anteil der FITC+ Zellen in WT und TRIM72KO AMs; n = 3 für beide Gruppen *p < 0,05. Diese Zahl ist mit freundlicher Genehmigung von der American Thoracic Society13abgedruckt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : FcγR - und CR-vermittelten Phagozytose. (A) repräsentative Bilder opsonized Schafe roter Blutkörperchen (SRBCs) Phagozytose von MH-S Zellen. Die Pfeile verweisen auf einige SRBCs. Die Maßstabsleiste = 25 µm. (B) Quantification SRBCs Phagozytose von MH-S Zellen überexprimiert TRIM72 (TRIM72OE) in Anwesenheit von IgG (FcγR-vermittelten Phagozytose) oder IgM (CR-vermittelten Phagozytose); n = 6 für jede Gruppe, *p < 0,05 und **p < 0,005 verglichen mit WT-Steuerung. (C) repräsentative Bilder von Alexa Fluor-488-konjugiert Zymosan Teilchen Verschlucken von primären AMs von WT oder TRIM72KO Mäusen isoliert. Die Pfeile im Bereich A und B zeigen Zymosan + Zellen. Die Maßstabsleiste = 50 µm. (D) statistische Ergebnisse des Prozentsatzes der Zymosan-haltigen AMs; n = 3 für jede Gruppe, p > 0.05. Diese Zahl ist mit freundlicher Genehmigung von der American Thoracic Society13abgedruckt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: In-vivo Phagozytose von p. Aeruginosa GLP. (A) repräsentative Bilder von alvéolaire Lavage Fluid (BALF) Zelle Cytospin Dias von WT und TRIM72KO Mäusen 1 h nach der Injektion von p. Aeruginosa GFP. Kwik-Diff Färbung kennzeichnet AMs (große, Runde Zellen) und Neutrophilen; GLP identifiziert phagocytic Zellen (weiße Pfeile) und GLP+ differential Interferenz Kontrast (DIC) identifiziert verinnerlichte GFP Bakterien (schwarze Pfeile) im AMs. Der Maßstabsbalken = 50 µm. (B) Quantifizierung des Prozentsatzes der AMs und neutrophilen Granulozyten in BALF WT und TRIM72KO Mäusen 1 h nach der Injektion von p. Aeruginosa . (C) Quantifizierung des Prozentsatzes der phagocytic AMs in WT und TRIM72KO Mäusen; n = 3 für jede Gruppe, *p < 0,05. Die Daten werden dargestellt, wie (± SEM) bedeuten. Diese Zahl ist mit freundlicher Genehmigung von der American Thoracic Society13abgedruckt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : In-vivo Bakterien Abstand mit p. Aeruginosa (P.A.). (A) der Anteil der Körper (B.W.) Gewichtsverlust von naiven WT und TRIM72KO Mäusen nach der ersten intraperitoneale Injektion von 2,5 x 105 KBE/mL PAO1 (eine klinische Isolate von p. Aeruginosa); n = 13 für WT (schwarze Quadrate), n = 8 für TRIM72 (rote Kreise),KO *p < 0,05, **p < 0,005 Gew.% (B) gegenüber den Prozentsatz des Überlebens am 2. Tag nach der 3 x 107 KBE/mL P. Aeruginosa intraperitoneale Injektion; n = 10 für WT (solide schwarze Kreise) und TRIM72 (feste rote Quadrate),KO *p < 0,05 für WT versus TRIM72KO -Gruppen. (C) A Streudiagramm der gesamten Lunge bakterielle Belastung am 2. Tag der Injektion p. Aeruginosa in WT und TRIM72KO. Die grau gestrichelte Linie bezeichnet die bakterielle injizierte Dosis; ^ bezeichnet Mäuse, die gestorben sind. Für WT versus TRIM72KO Gruppen, p < 0,05. Diese Zahl ist mit freundlicher Genehmigung von der American Thoracic Society13abgedruckt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Während der Durchführung einer Gas-Austausch-Funktion, konfrontiert die Lunge anhaltend Fremdkörper, Krankheitserreger und Allergene. AMs bieten die erste Linie der Verteidigung aufgrund ihrer wichtigsten Funktion, nämlich Phagozytose. AMs auch mit anderen Immunzellen in der Krankheitserreger zu zerstören und die Auflösung der Entzündung zu koordinieren. Hier beschrieben wir Methoden zur Bewertung der speziell Phagozytose durch AMs isoliert von der Maus-Lunge. Das Protokoll präsentiert in diesem Manuskript erklärt, eine detaillierte Studie über Phagocytose in vivo und in vitro, die auch kann, zur Untersuchung der Funktion von Makrophagen und bakterielle Abstand in anderen Organen genutzt werden.
Die beschriebenen in-vitro-Phagozytose beruht auf der einfachen Idee der Inkubation Serum behandelt FITC Perlen oder opsonized SRBCs mit kultivierten AMs, Phagozytose zu initiieren. Diese Methode beinhaltet Schritte umfassende waschen und die lyse der nonphagocytized RBCs, den Hintergrund zu reduzieren. Vorsicht ist geboten, nicht zu den eingehalten AMs zu lösen. Der Waschschritt mit ACK Lyse Lösung getan werden innerhalb von 1 min., als ein länger waschen Zeit führt zu die lyse von den Makrophagen.
Darüber hinaus in der bildgebenden Analyse wir den Prozentsatz der Erregerelimination Zellen und Phagocytic Index zu einen umfassenden Überblick über die AM Phagozytose Funktion gekennzeichnet. Wir haben auch erklärt die Methode unter PRR, FcγR und CR-vermittelten Phagozytose in murinen Makrophagen MH-S-Zell-Linie zu unterscheiden. In Verbindung mit genetischen Modulation eignet sich dieser Schritt, bei dem Versuch, mechanistische Einblicke auf die spezifische Phagozytose Weg von der Ziel-gen-Manipulation betroffen war.
Frühere Berichten dokumentiert Methoden, um die bakterielle Aufnahme zu bewerten; die wichtigste Methode ist die Gentamicin Schutz Assay14. In dem hier vorgestellten Protokoll haben wir auch ein bildgebendes Verfahren zur in-vivo Phagozytose Messen gezeigt. Es gibt ein paar wichtige Faktoren, die diese Methode im Vergleich zu den bisher veröffentlichten Methoden besser zu machen. Die hier beschriebene Methode beinhaltet eine intratracheale Injektion von p. Aeruginosa GFP gefolgt von differenziellen Färbung BALF Zellen. Diese Methode zeigt die Verwendung von fluoreszierenden Bakterien, die hilft, um aufgenommene Bakterien in die Fresszellen zu identifizieren. Darüber hinaus hilft die unterschiedliche Färbung des BALF Zellen, speziell die phagocytic Kapazität des AMs von anderen Immunzellen in der in-vivo-Umgebung zu unterscheiden und der relative Anteil der verschiedenen Fresszellen, die bakterielle klar zu bewerten Belastungen aus der Lunge. Eine kleine Einschränkung dieser Methode ist, dass es eine sorgfältige intratrachealen Verwaltung erfordert, die Variabilität zwischen Mäusen zu vermeiden.
Darüber hinaus haben wir die Methode, um ein p. Aeruginosa Bakterien Freiraum bei Mäusen im Zusammenhang mit einer Lungenentzündung zu etablieren erklärt. Um diese Methode zu charakterisieren, haben wir bestimmt die Körper-Gewicht-Verlust und Mortalität nach der intratracheale Anwendung von p. Aeruginosa und einen quantitativen Assay verwendet, um die Lunge Bakterien Belastung zu bestimmen. Sterblichkeit ist ein wichtiger Parameter, um die umfassende Immunantwort des Körpers zu bewerten. Wir nutzten Lunge Proben aus diesem Experiment um bakterielle Belastung zu beurteilen. Bakterielle Belastung kann jedoch auch aus Lunge Proben innerhalb von 48 h nach nicht-tödliche Dosis von bakteriellen Injektion geerntet ermittelt werden. Der Erfolg des Assays wird bestimmt durch eine Standardisierung der Zeitpläne für die Injektion, die Qualität des Erregers und die Dosis der Injektion und die Optimierung einer Homogenisierung-Methode, die völlig die Lunge stört, ohne zu brechen die bakterielle Zellmembran.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird unterstützt durch Zuschuss R01HL116826 an X. Zhao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
| 2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
| 70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
| 96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
| Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
| C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
| Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
| DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
| Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
| FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
| GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
| Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
| High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
| Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
| Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
| Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
| MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
| rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
| rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
| Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
| Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
| sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
| Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |
References
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