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Immunology and Infection

चूहों में वेलोलर मैक्रोफेज फैगोसाइटोसिस और बैक्टीरिया निकासी

Published: March 2, 2019 doi: 10.3791/59088
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Physiological Sciences, Eastern Virginia Medical School

Summary

यहाँ हम सामान्य तरीकों की रिपोर्ट करते हैं, जो फेफड़ों से मूरीन अल्वओलर मैक्रोफेज और बैक्टीरियल क्लीयरेंस के फेगोसाइटिक फंक्शन का विश्लेषण करते हैं । इन पद्धतियों में फ्लोरेसेइन आइसोथियोसाइनेट मोतियों के विट्रो भगोसायटोसिस में और स्यूडोंमोनास एरुगिनोसा ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के vivo फेगोसाइटोसिस में अध्ययन करते हैं । हम भी चूहों में पी एरुगिनोसा समाशोधन के लिए एक विधि का वर्णन ।

Abstract

वायुकोशीय मैक्रोफेज (एंस) फेफड़ों की वायुकोशीय अंतरिक्ष गार्ड । एंस द्वारा फैगोसाइटोसिस हमलावर रोगजनकों के खिलाफ रक्षा में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, मृत कोशिकाओं या विदेशी कणों को हटाने, और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं और ऊतक remodeling के संकल्प में, प्रक्रियाओं है कि विभिन्न सतह रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता कर रहे हैं एम्स । यहां, हम एंस के भक्षकाण्विक समारोह के विश्लेषण के लिए तरीकों की रिपोर्ट में विट्रो में और vivo assays और प्रयोगात्मक रणनीतियों पैटर्न मांयता रिसेप्टर के बीच अंतर करने के लिए-, रिसेप्टर पूरक-, और एफसी गामा रिसेप्टर-mediated phagocytosis. अंत में, हम एक विधि पर चर्चा करने के लिए स्थापित करने और एक पी एरुगिनोसा निमोनिया मॉडल की विशेषता चूहों में विवो में बैक्टीरिया की निकासी का आकलन करने के लिए । ये assays AM कार्यों का मूल्यांकन करने के लिए सबसे आम तरीकों का प्रतिनिधित्व करते हैं और अन्य अंगों में मैक्रोफेज समारोह और बैक्टीरियल निकासी का अध्ययन करने के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

एंस आराम चरण में एल्वियोली में प्रमुख निवासी फ़ैगोसाइट और मांयता और सांस रोगजनकों और विदेशी कणों1,2के internalization के माध्यम से जंमजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के प्रमुख खिलाड़ियों में से एक हैं । यह बताया गया है कि एम्स में कई फुफ्फुसीय रोगजनकों की तेजी से निकासी के लिए जरूरी हैं जैसे कि पी. एरुगिनोसा और क्लेबसिएला निमोनिया3,4, इसलिए एएम फैगोसाइटोसिस में एक कमी अक्सर श्वसन में परिणाम संक्रमण, जैसे तीव्र निमोनिया, जो उच्च मृत्यु दर और रुग्णता दरों का कारण है ।

एंस भी साइटोकिन्स और ऐसे tnf-α और आईएल-1β, जो वायुकोशीय पर्यावरण की अंय कोशिकाओं के साथ crosstalk के रूप में chemokines उत्पादन और भड़काऊ न्यूट्रोफिल, monocytes भर्ती द्वारा फेफड़ों में जन्मजात भड़काऊ प्रतिक्रियाओं आरंभ, और फेफड़ों में अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं5. उदाहरण के लिए, आईएल-1β एंस द्वारा उत्पादित उपकला कोशिकाओं6से न्युट्रोफिल chemokine CXCL8 की रिहाई के लिए प्रधानमंत्री मदद करता है । इसके अलावा, एम्स एपोप्टोटिक पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर ल्यूकोसाइट्स (pmns) के फैगोसाइटोसिस में योगदान देता है, जिसमें विफलता से आसपास के ऊतकों में pmns से इंट्राकोशिलर एंजाइम की निरंतर रिसाव होता है, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक क्षति और लंबे समय तक सूजन होती है । 7 , 8 , 9.

एंस द्वारा फैगोसाइटोसिस को एम्स के पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (prrs) द्वारा रोगजनक सतह पर रोगज़नक़-संबद्ध आणविक पैटर्न की प्रत्यक्ष मान्यता के द्वारा मध्यस्थता की जाती है या एम्स के प्रतिरक्षा effector रिसेप्टर्स के साथ opsonized रोगजनकों के बंधन द्वारा 10. उत्तरार्द्ध के लिए, एम्स उनके fcγ रिसेप्टर्स (fcγr) या उनके पूरक रिसेप्टर्स (सीआर)11के माध्यम से पूरक टुकड़े, C3b और C3bi के साथ लेपित रोगजनकों के माध्यम से इम्युनोग्लोबुलिन (igg) के साथ opsonized लक्ष्यों को पहचान सकते हैं । पूरक रिसेप्टर्स के बीच, इम्यूनोग्लोबुलिन सुपरफैमिली के सीआर (crig) चुनिंदा ऊतक मैक्रोफेज12में व्यक्त किया जाता है, और हाल ही में एक खोज पी के संदर्भ में phagocytosis में crig की भूमिका पर प्रकाश डाला. एरुगिइनोसा निमोनिया 13.

कई मूल अध्ययनों से मैक्रोफेज समारोह के आणविक तंत्र का वर्णन करने के लिए बृहदभक्षी फैगोसाइटोसिस का मूल्यांकन करने के तरीकों का उपयोग करें14,15. हालांकि, वीवो फेगोसाइटोसिस में तरीकों को फैगोसाइटोसिस के सटीक प्रमाणन की आवश्यकता होती है । यहां, हम दोनों के लिए एक विस्तृत पद्धति संक्षेप में विट्रो में और vivo phagocytosis में फ्लोरेसेइन आइसोथियोसायनेट (fitc) का उपयोग-कांच के मोती और पी एरुगिनोसा ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (gfp), क्रमशः. इसके अलावा, हम prr-, CR-, और fcγr-मध्यस्थता phagocytosis के बीच अंतर करने की विधि की व्याख्या । अंत में, हम पी एरुगिनोसा निमोनिया के संबंध में माउस में बैक्टीरियल निकासी की विशेषता के लिए एक विधि की रिपोर्ट ।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल पूर्वी वर्जीनिया मेडिकल स्कूल के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (iacuc) के दिशानिर्देशों का पालन करता है ।

1. फ्लोरोसेंट मोती फेगोसाइटोसिस

  1. जानवरों के नैतिक इच्छामृत्यु के लिए iacuc प्रोटोकॉल के अनुसार CO2 asphyxiation द्वारा माउस (C57BL/6j, 6 सप्ताह पुराना, महिला) euthanize ।
  2. माउस पेट एक विच्छेदन कागज तौलिए के साथ कवर बोर्ड पर रखना । इसके पंजे अपने अंगों के प्रसार के साथ नीचे पिन-ईगल और उसके सामने दांत के नीचे एक स्ट्रिंग हुक ताकि श्वासनली सीधे और स्तर पर तैनात है ।
  3. गीला माउस के गले, छाती, और ७०% इथेनॉल के साथ पेट कीटाणुरहित करने के लिए और उपकरणों के लिए चिपके से फर को रोकने के ।
  4. नियमित रूप से forceps का उपयोग करना, शरीर के centerline पर त्वचा खींचो, और सर्जिकल कैंची से गले के शीर्ष करने के लिए centerline के साथ कट.
  5. मानक सर्जिकल कैंची के कुंद अंत का उपयोग करना, सावधानी से गले पर मांसपेशी और संयोजी ऊतकों को दूर ले जाएं और श्वासनली को बेनकाब करने के लिए स्प्रिंग कैंची (माइक्रोकैंची) का उपयोग करें ।
  6. forceps के साथ एक उपास्थि अंगूठी मनोरंजक, ध्यान से एक छोटा सा चीरा बनाने (~ १.५ मिमी), microscissors का उपयोग, श्वासनली के वेंट्रिकले चेहरे पर और श्वासनली में एक 18 ग्राम प्रवेशनी डालें ।
  7. धीरे एक बार में फास्फेट-buffered खारा (pbs), 1 मिलीलीटर के 3 मिलीलीटर लेवेज । हर बार धीरे सिरिंज में तरल पदार्थ को वापस लेने और यह वापस फेफड़ों में reinfuse, उत्तराधिकार में 3x. balf इकट्ठा करने के बाद, इच्छामृत्यु सुनिश्चित करने के लिए गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन । एकत्र pbs (~ २.८ मिलीलीटर), जो bronchoalveolar लवाज द्रव (balf) है, एक ट्यूब के लिए स्थानांतरण, 10 मिनट के लिए १,००० एक्स जी में अपकेंद्रिकी, और गोली इकट्ठा । मलबे को धोने के लिए 10 मिनट के लिए ट्यूब और सेंपेरेज में १,००० एक्स जी के लिए ताजा पीबीएस की 1 मिलीलीटर जोड़ें और प्लेटेड एल्विओलर मैक्रोफेज इकट्ठा करें ।
  8. एक गिलास नीचे डिश पर 2 दिनों के लिए एक ही मीडिया में 10% nonheat-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (fbs) और संस्कृति प्राथमिक वायुकोशीय मैक्रोफेज के साथ dulbecco के संशोधित ईगल के मध्यम (dmem) के 2 मिलीलीटर में गोली resuspend एक humidified वातावरण में ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
  9. पुराने मीडिया महाप्राण, यह pbs के 1 मिलीलीटर के साथ धोने, और ताजा मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें । fitc मोती जोड़ें (carboxylated लेटेक्स मोती, व्यास में 2 μm, ५० मोती/सेल) और 1 एच के लिए सेते ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified वातावरण में.
  10. pbs के साथ बड़े पैमाने पर धोने (एक समय में 1 मिलीलीटर, पांच washes की कुल के लिए) extracellular मोती को दूर करने के लिए. छवि १०० कोशिकाओं को बेतरतीब ढंग से और इंट्राकोशिकीय मोती (४८८ एनएम) के साथ कोशिकाओं की गणना ।
    नोट: फैगोसाइटिक इंडेक्स मैक्रोफेज की कुल संख्या से विभाजित घूस मोती की संख्या हैं; फागोसाइटिक कोशिकाओं का प्रतिशत मैक्रोफेज की कुल संख्या से विभाजित कम से एक मनका में सबसे अधिक है कि मैक्रोफेज की संख्या है16.
    1. वैकल्पिक रूप से, मोतियों के साथ एक 1 एच ऊष्मायन के बाद, pbs के 3 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोने और उन्हें फैगोसाइटोसिस के परिमाणन के लिए प्रवाह cytometry के लिए प्रक्रिया । इसी तरह, unstained कोशिकाओं या नियंत्रण कोशिकाओं के रूप में मोती के बिना प्रक्रिया एम्स । प्रतिशत सकारात्मकता और मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता, प्रवाह cytometry सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, सॉफ्टवेयर में उन विकल्पों का चयन करके गणना ।

2. fcγr-और सीआर-मध्यस्थता फैगोसाइटोसिस

  1. opsonization के लिए, 2 एक्स 108 भेड़ लाल रक्त कोशिकाओं (srbcs) खरगोश विरोधी srbc के ५० μl के साथ-igm या खरगोश विरोधी srbc-igm के ५० μl कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए11।
  2. इंसेबेट igm-opsonized srbcs के साथ ५० μl C5-की कमी (C5D) मानव सीरम के लिए 30 मिनट ३७ डिग्री सेल्सियस पर पूरक टुकड़े C3b और C3bi को ठीक करने के लिए igm-लेपित srbcs.
  3. बीज मरीन मैक्रोफेज कोशिकाओं (MH-S कोशिकाओं) एक ९६-अच्छी थाली में (१०,००० कोशिकाओं/अच्छी तरह से) और एक ~ ७०% संगम पाने के लिए रातोंरात सेते । MH-S कोशिकाओं के प्रत्येक कूप के लिए 1 x 107/mL opsonized srbcs की १०० μl जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए सेते हैं । अबाध्य srbcs बहुत जल्दी (~ 1 मिनट) अमोनियम क्लोराइड के १०० μl-पोटेशियम (ACK) lysis बफर के साथ धो लें ।
  4. ०.१% sds के साथ कोशिकाओं को लाइज़ करें और 2, 7-डाईमिनोफ्लोरीन (डीएएफ) 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड और 6 मीटर यूरिया युक्त ५० μl जोड़ें । ६२० एनएम पर हीमोग्लोबिन-उत्प्रेरित फ्लोरीन ब्लू गठन के अवशोषण को मापने ।
  5. srbcs की ज्ञात संख्या के साथ ६२० एनएम absorbance मानों पर मानक वक्र का उपयोग करके srbcs की संख्या निर्धारित करें । इसी तरह, महाराष्ट्र-एस की प्रक्रिया नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए nonopsonized srbcs के साथ incubated कोशिकाओं ।

3. prr-मध्यस्थता फैगोसाइटोसिस

  1. के लिए कदम का पालन करें 1.1-1.9 अलगाव के लिए और माउस प्राथमिक वायुकोशीय मैक्रोफेज की संवर्धन.
  2. 2 दिनों के बाद, मीडिया को हटाने, pbs के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोने, और ताजा मीडिया के ५०० μl जोड़ने Alexa fluor-४८८-संयुग्मित zymosan-एक bioparticles (१०० कणों/
  3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए सेते । आइस-कोल्ड पीबीएस के ५०० μl जोड़कर फैगोसाइटोसिस को रोकें ।
  4. कोशिकाओं को बड़े पैमाने पर पीबीएस (एक समय में 1 मिलीलीटर, पांच washes की कुल के लिए) के साथ धो लें । कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मालडिहाइड के साथ कोशिकाओं को ठीक करें ।
  5. कोशिकाओं को बड़े पैमाने पर पीबीएस (एक समय में 1 मिलीलीटर, पांच washes की कुल के लिए) के साथ धो लें और पीबीएस के ५०० μl में कोशिकाओं को रखें ।
  6. छवि विभेदकों हस्तक्षेप कन्ट्रास्ट और ४८८ एनएम पर एक फ्लोरोसेंट चैनल के तहत कोशिकाओं । zymosan युक्त एम्स की गणना-एक bioparticles और phagocytosis का प्रतिशत निर्धारित करते हैं ।

4. वेलोलर मैक्रोफेज द्वारा Vivo फैगोसाइटोसिस में

नोट: एक पोषक तत्व आगर थाली पर inoculate पी एरुगिनोसा gfp और 37 ° c रातोंरात पर थाली सेते हैं । अगले दिन, सिंगल कॉलोनी को पोषक शोरबा के 2 मिलीलीटर में इनोकुलेट करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया विकसित करें ।

  1. अगले दिन, १०० मिलीग्राम की एक intraperitoneal प्रशासन के साथ चूहों एनेस्थेटिज/केजी केटामाइन और 10 मिलीग्राम/ पैर की अंगुली चुटकी करने के लिए प्रतिक्रिया की कमी के माध्यम से उचित एनेस्थेटाइजेशन की पुष्टि करें ।
  2. ऊपरी छेदक भर में एक रबर बैंड के साथ एक फ्लैट बोर्ड पर माउस रखना और एक semirecumbent (४५ °) अधर सतह और ऊपर का सामना करना पड़ चबूतरा के साथ स्थिति में जगह है । घुमावदार forceps का उपयोग, आंशिक रूप से जीभ वापस लेना. एक microsprayer का उपयोग करना, intratracheally प्रशासित ५० μl (5 x 106 कॉलोनी बनाने इकाइयों [cfu] ) 17 P. एरुगिनोसा gfp के फेफड़ों में एनेस्थेटिज्ड चूहों.
  3. संक्रमण के 1 ज के बाद, 1.1-1.7 चरणों का पालन करें ।
  4. pbs में कोशिकाओं resuspend और उंहें (१,००० एक्स जी, कमरे के तापमान पर 1 मिनट) एक गिलास स्लाइड पर cytocentrifuge ।
  5. विनिर्माता के निर्देशों के अनुसार, अल्विओलर मैक्रोफेज, न्यूट्रोफिल, और लिम्फोसाइटों के लिए अलग से साइटोस्पिन स्लाइड्स को दाग देता है ।
  6. बेतरतीब ढंग से का चयन करें १०० एंस, इंट्रासेलुलर बैक्टीरिया युक्त एम्स की गणना, और फैगोसाइटोसिस के प्रतिशत का निर्धारण ।

5. वीवो बैक्टीरिया क्लीयरेंस में P. एरुगिनोसा का उपयोग

  1. एक पी एरुगिनोसा अलगाव आगर थाली पर inoculate पी एरुगिनोसा और 37 ° c रात भर में थाली सेते हैं । लिसोगेनी शोरबा (पौंड) के 2 मिलीलीटर तक सिंगल कॉलोनी का निवेश करें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया बढ़ाएं । निम्न सूत्र का उपयोग करते हुए, cfu परिकलित करें.

    cfu/mL = (कालोनियों एक्स तनुकरण कारक की संख्या) संस्कृति प्लेट की मात्रा/

    pbs के साथ संस्कृति को पतला वांछित cfu प्राप्त करने के लिए/
  2. परीक्षण 1 में, intrracheally ~ २.५ x 105 cfu/mL P. एरुगिनोसा (wt) और TRIM72KO चूहों में, के रूप में चरण ४.२ में कहा गया है की एक अवघातक खुराक सुई । 6 दिनों के लिए दैनिक शरीर के वजन को मापने ।
  3. परीक्षण 2 में, चूहों कि परीक्षण 1 में जीवित है और 4 दिनों के लिए शरीर के वजन को मापने में P. एरुगिनोसा (5 x 105 cfu/एमएल) की एक दूसरी खुराक सुई ।
  4. परीक्षण 3 में, चूहों का एक अलग सेट का उपयोग कर, एक घातक खुराक के साथ wt और TRIM72KO चूहों सुई (3 x 107 cfu/ P. एरुगिनोसा के एमएल) और इंजेक्शन के 2 दिनों के भीतर मृत्यु दर रिकॉर्ड. ऐसे महत्वपूर्ण शरीर के वजन घटाने के रूप में गंभीर तनाव के लक्षण दिखा जानवरों, वापस hunched, आहार, या डिस्पने भाग vets द्वारा मूल्यांकन किया जाएगा । बिना इलाज वाले पशुओं की तुरंत बलि दी जाएगी ।
  5. या तो मौत पर या इंजेक्शन के बाद 2 दिन में इच्छामृत्यु के बाद, पीक संक्रमण में फेफड़ों के जीवाणु बोझ के परिप्रमाणन के लिए पूरे फेफड़ों के ऊतकों को इकट्ठा करें ।
  6. फेफड़ों के जीवाणु बोझ का परीक्षण करने के लिए, फेफड़ों के ऊतकों में सामान्य खारा के २०० μl जोड़ें और उन्हें homogenize, एक पहले से परीक्षण किया है कि पूरी तरह से बैक्टीरिया को तोड़ने के बिना फेफड़ों के ऊतकों को बाधित एक इलेक्ट्रॉनिक homogenize पर सेटिंग का उपयोग कर । 10 गुना सीरियल dilutions पर स्यूडमोनास अलगाव आगर प्लेटों पर फेफड़ों lysate की 1 मिलीलीटर और प्लेट १०० μl के लिए एक फेफड़ों homogenate की कुल मात्रा समायोजित करें ।
  7. 24 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों सेते और बैक्टीरिया की कालोनियों गिनती पूरे फेफड़ों प्रति cfu निर्धारित करने के लिए ।

6. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. दो समूहों के बीच अंतर के सांख्यिकीय महत्व को निर्धारित करने के लिए छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करें । सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर पर विचार करें जब p < ०.०५ । सभी डेटा माध्य (SEM) के ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं ।

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Representative Results

हम पहली बार प्रयोग प्रदर्शन के लिए माउस प्राथमिक AMs द्वारा phagocytosis का विश्लेषण । सभी विश्लेषण के दौरान, हम wt और TRIM72KO चूहों से अलग एम्स की तुलना में । जैसा कि चित्रा 1एमें दिखाया गया है, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी से पता चला कि माउस प्राथमिक एंस द्वारा fitc-कांच के मनकों की फैगोसाइटोसिस ऊष्मायन के 1 एच के बाद होता है । चित्रा 1 B फ्लो साइटोमेट्री द्वारा फेगोसाइटोसिस के विश्लेषण को दर्शाता है । माइक्रोस्कोपी द्वारा मापा गया फैगोसाइटोसिस का परिमाणन और प्रवाह साइटोमेट्री को क्रमशः चित्रा 1सी और चित्रा 1डीमें दर्शाया गया है । MH-S कोशिकाओं द्वारा fcγr-और सीआर-मध्यस्थता फैगोसाइटोसिस चित्रा 2एमें प्रस्तुत किया जाता है, और चित्रा 2बी परिमाणन से पता चलता है। इन परिणामों से पता चलता है कि MH-S कोशिकाओं में TRIM72 की अभिव्यक्ति में फागोसाइटोसिस के पूरक में एक से अधिक की कमी हुई है । Alexa fluor के प्रतिनिधि छवियों-४८८-संयुग्मित zymosan-प्राथमिक AMs से एक कण घूस wt या TRIM72KO चूहों से अलग चित्रा 2सीमें दिखाया गया है, और परिमाणन चित्रा 2डी में प्रस्तुत किया है . विवो फेगोसाइटोसिस परिणामों में चित्रा 3में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । चित्रा 3 एंस, न्यूट्रोफिल, और लिम्फोसाइटों की उपस्थिति, और जीएफपी+ फैगोसाइटिक कोशिकाओं की पहचान करने में अंतर को दर्शाता है । बाल्फ कोशिकाओं का प्रतिशत और फैगोसाइटोसिस की मात्रा क्रमशः चित्रा 3बी और चित्रा 3सीमें दर्शाया गया है । p. एरुगिनोसा की एक अवघातक खुराक के intrracheal प्रशासन के बाद चूहों में शरीर के वजन घटाने का प्रतिशत चित्रा 4aमें दिखाया गया है, और पी एरुगिनोसा की एक घातक खुराक के बाद 2 दिन में चूहों के अस्तित्व का प्रतिशत है चित्रा 4bमें दर्शाया गया है । चित्रा 4 सी मौत पर पूरे फेफड़ों बैक्टीरियल बोझ के लिए एक तितर बितर साजिश से पता चलता है या 2 दिन में चूहों में पी एरुगिनोसा संक्रमण के बाद ।

Figure 1
चित्रा 1 : माउस प्राथमिक वायुकोशीय मैक्रोफेज में फागोसाइटोसिस । (क) उच्च फैगोसाइटिक अनुक्रमित के प्रतिनिधि छवियों प्राथमिक एंस हरी फ्लोरोसेंट मोती (बाएं) युक्त दिखा; फेगोसाइटिक एम्स के कम और उच्च प्रतिशत दिखा प्रतिनिधि छवियों । तीर: कम फैगोसाइटिक सूचकांक AMs; arrowheads: उच्च फैगोसाइटिक सूचकांक AMs । स्केल बार = बाईं दो छवियों के लिए 25 μm और सही दो छवियों के लिए ५० μm । (ख) नहीं-मोती नियंत्रण, wt + मोती, और TRIM72KO + मोती AMs में phagocytizing कोशिकाओं की प्रतिनिधि प्रवाह cytometry का पता लगाने । सलाखों के मनका युक्त सेल जनसंख्या को परिभाषित (प्रतिशत में) और प्रतिदीप्ति तीव्रता (mfi) का मतलब है । (ग) औसत भगोसाईटिक सूचकांक के आँकड़े और डब्ल्यूटी और TRIM72को एंस में फैगोसाइटिक एम्स का प्रतिशत; n = 5 दोनों समूहों के लिए, *p < ०.०५ । (घ) प्रवाह cytometry mfi के आंकड़े और fitc के प्रतिशत+ wt और TRIM72KO एम्स में कोशिकाओं; n = 3 दोनों समूहों के लिए, *पी < ०.०५ । यह आंकड़ा अमेरिकी वक्ष सोसायटी13की अनुमति के साथ reprinted है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : fcγr-और सीआर-मध्यस्थता फैगोसाइटोसिस । (क) opsonized भेड़ लाल रक्त कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों ' (srbcs) MH-S कोशिकाओं द्वारा phagocytosis. तीर कुछ srbcs को इंगित करते हैं । स्केल बार = 25 μm. (ख) MH-S कोशिकाओं द्वारा एसआरबीसी फेगोसाइटोसिस का परिमाणन आईजीजी (fcγr-मध्यस्थता फैगोसाइटोसिस) की उपस्थिति में TRIM72 (TRIM72OE) को व्यक्त करता है या आईजीएम (सीआर-मध्यस्थता फैगोसाइटोसिस); n = 6 प्रत्येक समूह के लिए, *p < ०.०५ और * *p < ०.००५ wt नियंत्रण के साथ तुलना में । (ग) Alexa fluor के प्रतिनिधि छवियों-४८८-conjugated zymosan कण घूस प्राथमिक AMs द्वारा wt या TRIM72KO चूहों से अलग । पैनल ए और बी में तीर zymosan + कोशिकाओं से संकेत मिलता है । स्केल बार = ५० μm. (घ) zymosan युक्त एम्स के प्रतिशत के सांख्यिकीय परिणाम; n = 3 प्रत्येक समूह के लिए, p > ०.०५ । यह आंकड़ा अमेरिकी वक्ष सोसायटी13की अनुमति के साथ reprinted है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: पी. एरुगिनोसा जीएफपी के विवो फागोसाइटोसिस में । (क) ब्रोन्कोएल्विओलर लेवेज द्रव (balf) सेल साइटोस्पिन स्लाइड से wt और TRIM72KO चूहों 1 ज के प्रतिनिधि छवियों P. एरुगिनोसा gfp के इंजेक्शन के बाद । kwik-diff धुंधला (बड़े, गोल कोशिकाओं) और न्यूट्रोफिल की पहचान करता है; gfp, फैगोसाइटिक कोशिकाओं (सफेद तीर) और gfp+ अंतर हस्तक्षेप कन्ट्रास्ट (DIC) को दिखाता है कि एम्स में भली भांति gfp बैक्टीरिया (काले तीर) की पहचान करता है । पैमाने सलाखों = ५० μm. (ख) पीएरुगिनोसा इंजेक्शन के बाद wt और TRIM72KO चूहों 1 h के balf में एम्स और न्यूट्रोफिल के प्रतिशत का परिमाणन । (ग) डब्ल्यूटी और TRIM72KO चूहों में भक्षकाण्विक एम्स के प्रतिशत का परिमाणन; n = 3 प्रत्येक समूह के लिए, *p < ०.०५ । डेटा को माध्य (± SEM) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है । यह आंकड़ा अमेरिकी वक्ष सोसायटी13की अनुमति के साथ reprinted है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4 : वीवो बैक्टीरिया क्लीयरेंस में P. एरुगिनोसा (प्रति वर्ष) का उपयोग कर । (a) २.५ x 105 cfu/mL PAO1 के पहले intraperitoneal इंजेक्शन के बाद शरीर के वजन (बीवीएससी) के नुकसान भोले wt और TRIM72KO चूहों का प्रतिशत (एक नैदानिक पृथक P. एरुगिनोसाके); n = 13 wt (काले चौकों) के लिए, n = 8 के लिए TRIM72KO (लाल हलकों), *पी < ०.०५, * *पी < ०.००५ wt के साथ तुलना में. (ख) 3 x 107 cfu के बाद 2 दिन में जीवित रहने का प्रतिशत/ एरुगिनोसा इंटरपेरिटोनियल इंजेक्शन; n = 10 wt के लिए (ठोस काले घेरे) और TRIM72ko (ठोस लाल चौकों), *p < wt बनाम TRIM72ko समूहों के लिए ०.०५ । (ग) पी. एरुगिनोसा इंजेक्शन के 2 दिन में पूरे फेफड़ों के जीवाणु बोझ का एक तितर बितर भूखंड wt और TRIM72KOमें । ग्रे डैश्ड लाइन इंजेक्शन बैक्टीरियल खुराक designates; ↑ चूहों को नियत करता है जो मर चुके हैं. wt बनाम TRIM72KO समूह के लिए, पी < ०.०५ । यह आंकड़ा अमेरिकी वक्ष सोसायटी13की अनुमति के साथ reprinted है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

एक गैस विनिमय समारोह प्रदर्शन करते समय, फेफड़ों लगातार विदेशी कणों, रोगजनकों, और एलर्जी का सामना । AMs उनके मुख्य समारोह के आधार पर रक्षा की पहली पंक्ति, अर्थात् phagocytosis प्रदान करते हैं । एंस भी रोगजनकों को नष्ट करने में और सूजन के समाधान में अंय प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ समंवय । यहाँ, हम विशेष रूप से माउस फेफड़ों से अलग एम्स द्वारा phagocytosis का आकलन करने के लिए तरीकों का वर्णन किया. इस पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रोटोकॉल दोनों vivo में और विट्रो, जो भी मैक्रोफेज समारोह और अन्य अंगों में जीवाणु निकासी का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है में phagocytosis का एक विस्तृत अध्ययन बताते हैं ।

विट्रो भगोसाइटोसिस में वर्णित सीरम-इलाज fitc मोती इनक्यूबेटिंग के सरल विचार या सुसंस्कृत एंस के साथ opsonized srbcs फागोसाइटोसिस आरंभ करने के लिए पर निर्भर करता है । इस विधि में व्यापक धुलाई के चरण और पृष्ठभूमि को कम करने के लिए नॉनफेगोसाइटिज्ड rbcs के lysis शामिल हैं । ध्यान का पालन किया AMs अलग नहीं लिया जाना चाहिए । एक लंबी धुलाई समय के रूप में 1 मिनट के भीतर किया जाना चाहिए, जिसमें ACK lysis समाधान शामिल धोने कदम मैक्रोफेज के lysis की ओर जाता है ।

इसके अलावा, इमेजिंग विश्लेषण में, हम दोनों phagocytizing कोशिकाओं के प्रतिशत और भक्षकाण्विक सूचकांक AM phagocytizing समारोह का एक व्यापक दृष्टिकोण हासिल करने के लिए विशेषता । हम यह भी विधि के बीच अंतर करने के लिए समझाया है prr-, fcγr-, और सीआर-मध्यस्थता के भगोसाइटोसिस में मुरीन मैक्रोफेज MH-S सेल लाइन. आनुवंशिक मॉडुलन के साथ संयोजन के रूप में, यह कदम उपयोगी है जब लक्ष्य जीन हेरफेर से प्रभावित किया गया था कि विशिष्ट phagocytosis मार्ग पर यंत्रवत अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए कोशिश कर रहा है ।

पिछली रिपोर्ट में बैक्टीरिया का मूल्यांकन करने के तरीकों को दर्ज़ किया गया है; सबसे उल्लेखनीय विधि जेंटॅमाइसिन संरक्षण परख14है । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, हमने विवो फैगोसाइटोसिस में मापने के लिए एक इमेजिंग विधि भी दिखाई है । वहां कुछ प्रमुख कारक है कि इस विधि पहले प्रकाशित तरीकों की तुलना में बेहतर बना रहे हैं । यहाँ वर्णित विधि में पी. एरुगिनोसा जीएफपी का अंतरराचेअल इंजेक्शन शामिल है जिसके बाद balf कोशिकाओं का अंतर धुंधला हो जाता है । यह विधि फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया के उपयोग पर प्रकाश डालती है, जो फेगोसाइट्स के भीतर घूस बैक्टीरिया की पहचान करने में मदद करता है । इसके अलावा, balf कोशिकाओं के विभेदकों धुंधला विशेष रूप से vivo वातावरण में अंय प्रतिरक्षा कोशिकाओं से एम्स की भँगोसाइटिक क्षमता में अंतर करने में मदद करता है और बैक्टीरिया को स्पष्ट करने के लिए विभिन्न भक्षकाण्विक के सापेक्ष योगदान का मूल्यांकन करने के लिए फेफड़ों से भार । इस विधि की एक छोटी सी सीमा है कि यह चूहों के बीच परिवर्तनशीलता से बचने के लिए एक सावधान अंतर्वर्ती प्रशासन की आवश्यकता है.

इसके अलावा, हमने निमोनिया के संदर्भ में चूहों में एक पी. एरुगिनोसा बैक्टीरिया निकासी स्थापित करने की विधि को समझाया । इस विधि की विशेषता के लिए, हम शरीर के वजन घटाने और मृत्यु दर पी एरुगिनोसा के intrracheal प्रशासन के बाद निर्धारित किया है और एक मात्रात्मक परख इस्तेमाल के लिए फेफड़ों के बैक्टीरिया का बोझ निर्धारित करते हैं । मृत्युदर शरीर की व्यापक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है । हम जीवाणु बोझ का आकलन करने के लिए इस प्रयोग से फेफड़ों के नमूनों का इस्तेमाल किया । हालांकि, बैक्टीरियल बोझ भी बैक्टीरियल इंजेक्शन की गैर घातक खुराक के बाद 48h भीतर काटा फेफड़ों के नमूनों से निर्धारित किया जा सकता है । परख की सफलता इंजेक्शन के समय का मानकीकरण द्वारा निर्धारित किया जाएगा, रोगज़नक़ की गुणवत्ता और इंजेक्शन की खुराक, और एक एकरूपता विधि के अनुकूलन कि पूरी तरह से बैक्टीरिया को तोड़ने के बिना फेफड़ों को बाधित कोशिका झिल्ली ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह कार्य करने के लिए X. zhao R01HL116826 अनुदान द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18-G Needle Nipro Medical  CI+1832-2C Molecular Biology grade
2,7-diaminofluorene (DAF) Sigma-Aldrich D17106 Molecular Biology grade
70% Ethanol Decon Labs Inc. 18C27B Analytical grade
96-well plate Corning 3603 Cell Biology grade
ACK lysis buffer Life Technologies A10492 Molecular Biology grade
Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle Thermofisher Scientific Z23373 Molecular Biology grade
C5 deficient serum  Sigma-Aldrich C1163 Biochemical reagent
Centrifuge Labnet International C0160-R
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermofisher Scientific A78300101 Issue 11
DMEM Cell Culture Media Gibco 11995-065 Cell Biology grade
FBS Atlanta Biologicals S11550 Cell Biology grade
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur
Flow Jo Software FlowJo, LLC
Forceps Dumont 0508-SS/45-PS-1 Suitable for laboratory animal dissection
FITC-carboxylated latex beads Sigma-Aldrich L4530 Cell Biology grade
GFP-P. aeruginosa ATCC 101045GFP Suitable for  cell infection assays
Glass bottom dish MatTek Corp. P35G-0.170-14-C Cell Biology grade
High-Pressure Syringe Penn-Century FMJ-250 Suitable for laboratory animal use
Homogenizer Omni International TH-01
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich H1009 Analytical grade
Inverted Fluorescence Microscope Olympus IX73
Ketamine Hydrochloride Hospira CA-2904 Pharmaceutical grade
Shandon Kwik-Diff Stains Thermofisher Scientific 9990700 Cell Biology grade
LB Agar Fisher Scientific BP1425 Molecular Biology grade
LB Broth Fisher Scientific BP1427 Molecular Biology grade
MicroSprayer Aerosolizer Penn-Century IA-1C Suitable for laboratory animal use
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Reagent grade
PBS Gibco 20012-027 Cell Biology grade
rabbit anti-SRBC-IgG  MP Biomedicals 55806 Suitable for immuno-assays
rabbit anti-SRBC-IgM  Cedarline Laboratories CL9000-M Suitable for immuno-assays
Scissors Miltex 5-2 Suitable for laboratory animal dissection
Small Animal Laryngoscope Penn-Century LS-2 Suitable for laboratory animal use
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) BioRad 1610301 Analytical grade
Spring Scissors (Med) Fine Science Tools 15012-12 Suitable for laboratory animal dissection
Spring Scissors (Small) Fine Science Tools 91500-09 Suitable for laboratory animal dissection
sheep red blood cells (SRBCs)  MP Biomedicals 55876 Washed, preserved SRBCs
Urea Sigma-Aldrich U5378 Molecular Biology grade
Xylazine  Akorn Animal Health 59399-110-20 Pharmaceutical grade

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण इश्यू १४५ एल्वेओलर मैक्रोफेज फैगोसाइटोसिस इन विट्रो में vivo में बैक्टीरियल निकासी निमोनिया
चूहों में वेलोलर मैक्रोफेज फैगोसाइटोसिस और बैक्टीरिया निकासी
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Nagre, N., Cong, X., Pearson, A. C., … More

Nagre, N., Cong, X., Pearson, A. C., Zhao, X. Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice. J. Vis. Exp. (145), e59088, doi:10.3791/59088 (2019).

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