Summary
Qui segnaliamo i metodi comuni per analizzare la funzione fagocitica dei macrofagi alveolari murini e lo spazio batterico dal polmone. Questi metodi di studio in vitro fagocitosi dei branelli di isotiocianato di fluorescina e fagocitosi in vivo di Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. Inoltre descriviamo un metodo per l'eliminazione di p. aeruginosa nei topi.
Abstract
I macrofagi alveolari (ma) guardia spazio alveolare del polmone. Fagocitosi di AMs svolge un ruolo critico nella difesa contro l'invasione di agenti patogeni, la rimozione delle cellule morte o particelle estranee e nella risoluzione della risposta infiammatoria e rimodellamento del tessuto, i processi che sono mediati dai vari recettori di superficie di L'AMs. Qui, segnaliamo i metodi per l'analisi della funzione fagocitica di AMs utilizzando saggi in vitro e in vivo e strategie sperimentali per differenziare il modello riconoscimento del recettore - complemento recettore- e Fc gamma ricevitore-mediata fagocitosi. Infine, si discute un metodo per stabilire e caratterizzare un modello di polmonite di p. aeruginosa nei topi per valutare la clearance batterica in vivo. Questi saggi rappresentano i metodi più comuni per valutare le funzioni AM e possono anche essere utilizzati per studiare la funzione del macrofago e lo spazio batterico in altri organi.
Introduction
AMs sono i fagociti residenti principali negli alveoli in fase di riposa e uno dei principali attori della risposta immunitaria innata attraverso il riconoscimento e interiorizzazione degli agenti patogeni per via inalatoria e particelle estranee1,2. È stato segnalato che AMs sono essenziali per la rapida clearance di molti agenti patogeni polmonari come p. aeruginosa e Klebsiella polmonite3,4, quindi una carenza nella fagocitosi AM si traduce spesso in respiratoria infezioni, come la polmonite acuta, che causano più alti tassi di mortalità e morbosità.
AMs anche avviare le risposte infiammatorie innate nel polmone con la produzione di citochine e chemochine come TNF-α e IL-1 β, quale area interattiva con altre cellule dell'ambiente alveolare per produrre chemochine e reclutare infiammatori neutrofili, monociti, e cellule immuni adattive nel polmone5. Per esempio, IL-1 β prodotto da AMs aiuta per innescare il rilascio di neutrofili chemochina CXCL8 da cellule epiteliali6. Inoltre, AMs contribuiscono alla fagocitosi di apoptotic leucociti polimorfonucleari (PMNs), di che conduce alla perdita sostenuta di enzimi intracellulari da PMNs mancato il tessuto circostante, con conseguente danno tissutale e l'infiammazione prolungata 7 , 8 , 9.
Fagocitosi di AMs sono mediato da un diretto riconoscimento di pattern molecolari associati alla superficie dell'agente patogeno da recettori di riconoscimento di pattern (PRRs) dell'AMs o dall'associazione di agenti patogeni opsonized con i recettori immuni effettrici dell'AMs 10. per quest'ultimo, AMs può riconoscere i bersagli opsonized con immunoglobuline (IgG) attraverso i loro recettori Fcy (FcγR) o gli agenti patogeni rivestiti con frammenti di complemento, C3b e C3bi, attraverso i loro recettori del complemento (CR)11. Tra i recettori del complemento, il CR della superfamiglia delle immunoglobuline (CRIg) è espressa selettivamente nel tessuto macrofagi12, e una recente scoperta ha evidenziato il ruolo di CRIg nella fagocitosi AM nel contesto della polmonite di p. aeruginosa 13.
Molti studi originali utilizzano metodi per valutare la fagocitosi del macrofago per descrivere i meccanismi molecolari del macrofago funzione14,15. Tuttavia, i metodi come fagocitosi in vivo richiedono una precisa quantificazione della fagocitosi. Qui, riassumiamo una metodologia dettagliata per fagocitosi sia in vitro che in vivo utilizzando isotiocianato di fluorescina (FITC)-microsfere di vetro e proteina di p. aeruginosa verde fluorescente (GFP), rispettivamente. Inoltre, spieghiamo il metodo della differenziazione fra PRR-, CR- e fagocitosi mediata da FcγR. Infine, segnaliamo un metodo per caratterizzare lo spazio batterico nel topo rispetto alla polmonite di p. aeruginosa .
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Protocol
Questo protocollo segue le linee guida della cura degli animali istituzionali e uso Committee (IACUC) della Eastern Virginia Medical School.
1. fluorescente perline fagocitosi
- Eutanasia il mouse (C57BL/6J, vecchio 6 settimane, femmina) di CO2 asfissia secondo protocolli IACUC per l'eutanasia etico degli animali.
- Appoggiare il mouse pancia-up su una tavola di dissezione coperta con carta da cucina. Fissare le zampe con le sue membra spread-eagle e gancio una stringa sotto i suoi denti anteriori per tirare la testa indietro in modo che la trachea è ben diritta e livello.
- Bagnato il mouse gola, petto e pancia con etanolo al 70% per disinfettare e prevenire la pelliccia di attaccarsi agli strumenti.
- Usando il forcipe regolare, tirare la pelle in corrispondenza dell'asse del corpo e tagliare con forbici chirurgiche fino alla linea d'asse alla parte superiore della gola.
- Utilizzando l'estremità smussata di forbici chirurgiche standard, allontanare il muscolo e dei tessuti connettivi sulla gola e attentamente utilizzare forbici di primavera (microforbici) per esporre la trachea.
- Accuratamente con le pinze di presa un anello di cartilagine, praticare una piccola incisione (~1.5 mm), utilizzando microforbici, sul viso ventricolo della trachea e inserire una cannula 18 G nella trachea.
- Delicatamente il lavaggio 3 mL di tampone fosfato salino (PBS), 1 mL alla volta. Ogni volta che aspirare delicatamente il liquido nella siringa e reinfuse indietro nel polmone, 3 volte consecutivamente. Dopo aver raccolto il BALF, eseguire dislocazione cervicale per garantire l'eutanasia. Trasferire il PBS raccolto (~2.8 mL), che è il fluido di lavaggio broncoalveolare (BALF), in una provetta, centrifugare a 1.000 x g per 10 min e raccogliere il pellet. Aggiungere 1 mL di PBS fresco per la provetta e centrifugare a 1.000 x g per 10 min lavare i detriti e raccogliere i macrofagi alveolari pellettati.
- Risospendere il pellet in 2 mL di medium dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM) con 10% nonheat-inattivato siero bovino fetale (FBS) e macrofagi alveolari primario di cultura nello stesso supporto per 2 giorni su un piatto di vetro-inferiore a 37 ° C in atmosfera umidificata.
- Aspirare i vecchi media, lavare con 1 mL di PBS e aggiungere 2 mL di terreno fresco. Aggiungere perline FITC (granuli di lattice carboxylated, 2 µm di diametro, 50 Perline/cella) e incubare per 1h a 37 ° C in atmosfera umidificata.
- Lavare estesamente con PBS (1 mL in un momento, per un totale di cinque lavaggi) per rimuovere cordoni di extracellulare. Immagine 100 cellule in modo casuale e contare le celle con i branelli intracellulare (488 nm).
Nota: gli indici fagocitico sono il numero di perle ingeriti diviso per il numero totale dei macrofagi; la percentuale delle cellule fagocitiche è il numero di macrofagi che ingerire almeno un branello diviso per il numero totale di macrofagi16.- In alternativa, dopo un'incubazione di 1 h con perline, lavare le cellule con 3 mL di PBS ed elaborarli per citometria a flusso per la quantificazione della fagocitosi. Allo stesso modo, è possibile elaborare AMs senza perle come le celle non macchiate o controllo. Calcolare la percentuale di positività e significare l'intensità di fluorescenza, utilizzando software di citometria a flusso, selezionando le opzioni del software.
2. fagocitosi mediata da FcγR e CR
- Per l'opsonizzazione, incubare 2 x 108 pecore globuli rossi (SRBCs) con 50 µ l di coniglio anti-SRBC-IgM o 50 µ l di coniglio anti-IgG SRBC per 30 min a temperatura ambiente11.
- Incubare IgM-opsonized SRBCs con 50 µ l di siero umano C5-carenti (C5D) per 30 min a 37 ° C per correggere i frammenti del complemento C3b e C3bi su rivestite con IgM SRBCs.
- Seme dei macrofagi murini cellule (MH-S) (10.000 cellule/pozzetto) in una piastra a 96 pozzetti e incubare durante la notte per ottenere una confluenza di ~ 70%. Aggiungere 100 µ l di 1 x 107/ml opsonized SRBCs in ciascun pozzetto della cellule MH-S e incubare per 1h a 37 ° C. Lavare unbound SRBCs molto rapidamente (~ 1 min) con 100 µ l di tampone di lisi di cloruro di ammonio e potassio (ACK).
- Lisare le cellule con 0,1% SDS e aggiungere 50 µ l di 2,7-diaminofluorene (DAF) contenente perossido di idrogeno 3% e 6 M urea. Misurare l'assorbanza della formazione di emoglobina-catalizzata fluorene blu a 620 nm.
- Determinare il numero di SRBCs con una curva standard a 620 nm assorbanza valori con un numero noto di SRBCs. Allo stesso modo, il processo MH-S cellule incubate con nonopsonized SRBCs da utilizzare come controlli negativi.
3. PRR-mediata fagocitosi
- Procedura il 1.1-1.9, per l'isolamento e la coltura dei macrofagi alveolari primario del mouse.
- Dopo 2 giorni, rimuovere il supporto, lavare le cellule con 1 mL di PBS e aggiungere 500 µ l di fresco che contenevano Alexa Fluor-488-coniugato zymosan-A bioparticelle (100 particelle/piatto).
- Incubare per 1 h a 37 ° C. Fermare la fagocitosi aggiungendo 500 µ l di PBS ghiacciata.
- Lavare le cellule estesamente con PBS (1 mL in un momento, per un totale di cinque lavaggi). Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 10 min a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule estesamente con PBS (1 mL in un momento, per un totale di cinque lavaggi) e mantenere le cellule in 500 µ l di PBS.
- Immagine le cellule sotto contrasto differenziale di interferenza e un canale fluorescente a 488 nm. Contare AMs contenente zymosan-A bioparticelle e determinare la percentuale di fagocitosi.
4. in Vivo fagocitosi dai macrofagi alveolari
Nota: Inoculare p. aeruginosa GFP su una piastra di agar nutriente e incubare la piastra a 37 ° C durante la notte. Il giorno successivo, inoculare la singola Colonia a 2 mL di brodo nutritivo e crescere i batteri a 37° C durante la notte.
- Il giorno successivo, anestetizzare i topi con una somministrazione intraperitoneale di 100 mg/kg ketamina e 10 mg/kg xylazina. Confermare il corretto amputate tramite una mancanza di risposta per il pizzico di punta.
- Posare il mouse su una tavola piatta con un elastico tra gli incisivi superiori e collocarlo in una posizione semirecumbent (45°) con la superficie ventrale e rostro rivolto verso l'alto. Utilizzando forcipe curvo, ritrarre parzialmente la lingua. Utilizzando un microsprayer, vari amministrare 50 µ l (5 x 106 unità formanti colonie [CFU])17 di p. aeruginosa GFP nei polmoni dei topi anestetizzati.
- Dopo 1 h di infezione, come segue: 1.1-1.7.
- Risospendere le cellule in PBS e citocentrifuga li (1.000 x g, 1 min a temperatura ambiente) su una lastra di vetro.
- Differenzialmente colorare i vetrini cytospin per alveolari macrofagi, neutrofili e linfociti, secondo le istruzioni del produttore.
- In modo casuale selezionare 100 AMs, contare l'AMs contenente batteri intracellulari e determinare la percentuale di fagocitosi.
5. in Vivo batteri Clearance utilizzando p. aeruginosa
- Inoculare in p. aeruginosa su una piastra di agar isolamento di p. aeruginosa e incubare la piastra a 37 ° C durante la notte. Inoculare la singola Colonia a 2 mL di brodo di Lisogenesi (LB) e crescono i batteri a 37° C durante la notte. Calcolare il CFU, utilizzando la seguente formula.
CFU/mL = (numero di colonie x fattore di diluizione) / volume della piastra di coltura.
Diluire la cultura con PBS per ottenere il desiderato CFU/mL. - Nella prova 1, vari iniettare una dose subletale di ~2.5 x 105 CFU/mL p. aeruginosa in anestetizzati wild-type (WT) e TRIM72KO topi, come indicato al punto 4.2. Misurare il peso corporeo al giorno per 6 giorni.
- Nella prova 2, iniettare una seconda dose di p. aeruginosa (5 x 105 CFU/mL) in topi che è sopravvissuto in prova 1 e misurano il peso corporeo per 4 giorni.
- In prova 3, utilizzando un diverso insieme di topi, topi WT e TRIM72KO di iniettare con una dose letale (3 x 107 CFU/mL) di p. aeruginosa e registrare la mortalità entro 2 giorni dall'iniezione. Gli animali che presentano segni di grave stress quali perdita di peso significativa, gobba, anoressia o dispnea sarà valutata dai veterinari che frequentano. Intrattabili animali saranno sacrificati immediatamente.
- Morte o dopo l'eutanasia al giorno 2 dopo l'iniezione, raccogliere il tessuto intero-polmone per la quantificazione degli oneri batterica polmonare all'infezione di picco.
- Per verificare la carica batterica polmonare, aggiungere 200 µ l di soluzione salina normale per i tessuti polmonari e omogeneizzarle, utilizzando un'impostazione precedentemente testata su un omogeneizzatore elettronico che interrompe completamente il tessuto polmonare senza rompere i batteri. Regolare il volume totale dell'omogeneato del polmone a 1 mL e piastra 100 µ l del lisato su piastre di agar Pseudomonas isolamento alle 10 volte diluizioni seriali del polmone.
- Incubare le piastre a 37 ° C per 24 h e conta delle colonie batteriche per determinare il CFU per intero polmone.
6. elaborazione statistica
- Utilizzare di Student t-test per determinare la significatività statistica della differenza tra i due gruppi. Si consideri una differenza statisticamente significativa quando p < 0.05. Tutti i dati sono presentati come mezzi ± errore standard della media (SEM).
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Representative Results
Abbiamo effettuato prima l'esperimento per analizzare fagocitosi da mouse primario AMs. Nel corso di tutte le analisi, abbiamo confrontato AMs isolati da topi WT e TRIM72KO . Come illustrato nella Figura 1A, microscopia di fluorescenza ha rivelato che fagocitosi di FITC-vetro perline da mouse AMs primario si verifica dopo 1 h di incubazione. Figura 1 B Mostra l'analisi della fagocitosi tramite flusso cytometry. La quantificazione della fagocitosi misurata da microscopia e citometria a flusso è rappresentato in Figura 1C e Figura 1D, rispettivamente. Fagocitosi di FcγR - e CR-mediata da cellule MH-S sono rappresentato in Figura 2Ae 2 di figuraB Mostra la quantificazione. Questi risultati indicano che l'espressione di TRIM72 in cellule MH-S ha provocato una diminuzione più di cinque volte nella fagocitosi di complemento. Immagini rappresentative di ingestione di Alexa Fluor-488-coniugato zymosan-A particella primaria AMS isolati da topi WT o TRIM72KO sono illustrati nella Figura 2Ce la quantificazione è presentata nella Figura 2D . Fagocitosi in vivo risultati sono rappresentati nella Figura 3. Figura 3 A Mostra differenziale macchiatura identificazione della presenza di AMs, neutrofili, linfociti e cellule fagocitiche GFP+ . La percentuale delle cellule BALF e la quantificazione della fagocitosi è rappresentati in Figura 3B e Figura 3C, rispettivamente. La percentuale di perdita di peso corporeo nei topi dopo somministrazione di una dose subletale di p. aeruginosa intratracheale è mostrata in Figura 4A, e la percentuale di sopravvivenza dei topi al giorno 2 dopo una dose letale di p. aeruginosa è indicato in Figura 4B. Figura 4 C Mostra un grafico a dispersione per la carica batterica del intero-polmone alla morte o al giorno 2 dopo l'infezione di p. aeruginosa nei topi.
Figura 1 : Fagocitosi in macrofagi alveolari primario mouse. (A) immagini rappresentative di basso contro elevati indici di fagocitico risultati AMs primario contenente microsfere di fluo verde (sinistra); immagini rappresentative, mostrando alte e basse percentuali di AMs fagocitica. Frecce: basso indice fagocitico AMs; punte di freccia: alto indice fagocitico AMs. La barra della scala = 25 µm per le due immagini sinistra e 50 µm per le immagini in due. (B) rappresentante flusso citometria a rilevazione di phagocytizing cellule in controllo no-perline, WT + perline e TRIM72KO + perline AMs. La popolazione delle cellule di definire la perlina contenenti barre (in percentuale) e l'intensità media fluorescenti (MFI). (C) statistiche dell'indice fagocitico media e la percentuale di AMs fagocitica in WT e TRIM72KO AMs; n = 5 per entrambi i gruppi, *p < 0.05. (D) Statistiche di flusso cytometry MFI e la percentuale delle cellule FITC+ in WT e TRIM72KO AMs; n = 3 per entrambi i gruppi, *p < 0.05. Questa figura è ristampata con il permesso dell' American Thoracic Society13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Fagocitosi mediata da FcγR e CR. (A) immagini rappresentative di pecore opsonized globuli rossi (SRBCs) fagocitosi dalle cellule MH-S. Le frecce indicano alcuni SRBCs. La barra della scala = 25 µm. (B) Quantification del SRBCs fagocitosi dalle cellule MH-S che overexpressing TRIM72 (TRIM72OE) in presenza di IgG (FcγR-mediata fagocitosi) o IgM (fagocitosi CR-mediata); n = 6 per ogni gruppo, *p < 0.05 e * *p < 0,005 rispetto a controllo WT. (C) immagini rappresentative di ingestione di particelle zymosan Alexa Fluor-488-coniugato di AMs primari isolati da topi WT o TRIM72KO . Le frecce nel pannello A e B indicano zymosan + cellule. La barra della scala = 50 µm. (D) risultati statistici della percentuale di zymosan-contenente AMs; n = 3 per ogni gruppo, p > 0.05. Questa figura è ristampata con il permesso dell' American Thoracic Society13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: fagocitosi In vivo di p. aeruginosa GFP. (A) immagini rappresentative di diapositive di cytospin fluidi del cellulare (BALF) di broncoalveolare lavaggio da topiKO WT e TRIM72 1 h dopo l'iniezione di p. aeruginosa GFP. Kwik-Diff colorazione identifica AMs (grandi, cellule rotonde) e neutrofili; GFP identifica le cellule fagocitiche (frecce bianche) e contrasto differenziale di interferenza di GFP+ (DIC) identifica batteri interiorizzati GFP (frecce nere) in AMs. Le barre di scala = 50 µm. (B) quantificazione della percentuale di AMs e neutrofili in topiKO BALF di WT e TRIM72 1 h dopo l'iniezione di p. aeruginosa . (C) quantificazione della percentuale di AMs fagocitica in topiKO WT e TRIM72; n = 3 per ogni gruppo, *p < 0.05. I dati sono presentati come media (± SEM). Questa figura è ristampata con il permesso dell' American Thoracic Society13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Liquidazione di batteri In vivo usando p. aeruginosa (P.A.). (A) la percentuale di perdita di peso corporeo del corpo di ingenuo topi WT e TRIM72KO dopo la prima iniezione intraperitoneale di 2,5 x 105 CFU/mL PAO1 (un isolato clinico di p. aeruginosa); n = 13 per WT (quadrati neri), n = 8 per TRIM72KO (cerchi rossi), *p < 0,05, * *p < 0,005 confrontato con WT (B) la percentuale di sopravvivenza al giorno 2 dopo la 3 x 107 CFU/mL pag. aeruginosa iniezione intraperitoneale; n = 10 per WT (cerchi neri tinta) e TRIM72KO (quadrati rossi pieni), *p < 0,05 per WT contro TRIM72KO gruppi. (C) A dispersione del carico batterico intero-polmone al 2 ° giorno dell'iniezione di p. aeruginosa in WT e TRIM72KO. La linea grigia tratteggiata indica la dose iniettata batterica; ^ indica topi che sono morti. Per WT contro TRIM72KO gruppi, p < 0.05. Questa figura è ristampata con il permesso dell' American Thoracic Society13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Durante l'esecuzione di una funzione di scambio di gas, il polmone si confronta con insistenza allergeni, agenti patogeni e particelle estranee. AMs rappresentano la prima linea di difesa in virtù della loro funzione principale, vale a dire la fagocitosi. AMs anche coordinare con altre cellule immuni a distruggere gli agenti patogeni e nella risoluzione di infiammazione. Qui, abbiamo descritto metodi per valutare specificamente la fagocitosi di AMs isolato dal polmone del topo. Il protocollo presentato in questo manoscritto spiega uno studio dettagliato della fagocitosi sia in vivo che in vitro, che possono essere utilizzato anche per studiare la funzione del macrofago e lo spazio batterico in altri organi.
La fagocitosi in vitro descritta si basa sulla semplice idea di incubazione del siero-trattati perline FITC o opsonized SRBCs con AMs coltivate per avviare la fagocitosi. Questo metodo include passaggi di lavaggio estesa e la lisi dei globuli rossi nonphagocytized per ridurre il fondo. Deve prestare attenzione a non staccare l'AMs aderito. La fase di lavaggio che coinvolgono la soluzione di lisi ACK dovrebbe essere fatto entro 1 min, come un lavaggio più lungo tempo conduce per la lisi dei macrofagi.
Inoltre, l'analisi di imaging, abbiamo caratterizzato sia la percentuale di cellule fagocitanti e l'indice fagocitico per ottenere una visione completa della funzione di fagocitosi AM. Abbiamo anche spiegato il metodo per distinguere tra PRR-, FcγR- e CR-mediata fagocitosi in macrofago murino linea cellulare MH-S. In concomitanza con modulazione genetica, questo passaggio è utile quando si cerca di guadagnare le comprensioni meccanicistiche sulla via di fagocitosi specifico che è stato influenzato tramite la manipolazione del gene bersaglio.
I rapporti precedenti documentato metodi per valutare l'assorbimento batterica; il metodo più notevole è la gentamicina protezione saggio14. Nel protocollo presentato qui, abbiamo anche mostrato un metodo di imaging per misurare in vivo fagocitosi. Ci sono alcuni fattori chiave che rendono questo metodo migliore rispetto ai metodi precedentemente pubblicati. Il metodo qui descritto comporta un'iniezione intratracheale di p. aeruginosa GFP seguita da colorazione differenziale delle cellule BALF. Questo metodo mette in evidenza l'uso di batteri fluorescenti, che aiuta a identificare batteri ingeriti all'interno i fagociti. Inoltre, la colorazione differenziale delle cellule BALF aiuta a differenziare specificamente la capacità fagocitica di AMs da altre cellule immuni nell'ambiente in vivo e per valutare il contributo relativo dei diversi fagociti per cancellare il batterico carichi da polmone. Una minore limitazione di questo metodo è che richiede una gestione attenta intratracheale per evitare la variabilità fra i topi.
Ulteriormente, abbiamo spiegato il metodo per stabilire una clearance di batteri di p. aeruginosa nei topi nel contesto della polmonite. Per caratterizzare questo metodo, abbiamo determinato la perdita di peso corporeo e la mortalità dopo la somministrazione intratracheale di p. aeruginosa e utilizzato un dosaggio quantitativo per determinare l'onere di batteri del polmone. La mortalità è un parametro importante per valutare la risposta immunitaria completa del corpo. Abbiamo usato campioni del polmone da questo esperimento per valutare la carica batterica. Tuttavia, carica batterica può essere determinato anche da campioni del polmone raccolti all'interno di 48h dopo la dose non letale di iniezioni dei batteri. Il successo del test sarà determinato da una normalizzazione dei tempi di iniezione, la qualità dell'agente patogeno e la dose di iniezione e l'ottimizzazione di un metodo di omogeneizzazione che sconvolge completamente il polmone senza rompere il batterico della membrana cellulare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato da grant R01HL116826 a X. Zhao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
| 2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
| 70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
| 96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
| Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
| C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
| Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
| DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
| Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
| FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
| GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
| Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
| High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
| Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
| Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
| Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
| MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
| rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
| rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
| Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
| Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
| sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
| Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |
References
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