Summary
ここでマウス肺胞マクロファージおよび肺から細菌クリアランスの貪食能を分析するための一般的な方法を報告します。これらのメソッドは、フルオレセイン イソチオ シアン酸ビーズの貪食および緑膿菌緑色蛍光タンパク質の生体内で貪食能を検討します。マウスで膿をクリアするための方法について述べる。
Abstract
肺胞マクロファージ (AMs) は、肺の肺胞腔をガードします。AMs によって貪食病原体、死んだ細胞や異物の除去に侵入戦防衛で重要な役割を果たしている、炎症反応、組織改造の解像度では、処理の様々 な表面の受容器によって仲介されます。AMs。ここで、in vitro および in vivo アッセイおよび実験的戦略を使用してパターン認識受容体-、補体受容体 - と受容体を介した Fc ガンマを区別する AMs の貪食能の分析方法を報告します。貪食。最後に、我々 は確立し体内細菌クリアランスを評価するためにマウスで膿性肺炎モデルを特徴付ける方法をについて説明します。これらの試金は午前の機能を評価する最も一般的な方法を表し、マクロファージの機能と他の臓器に細菌クリアランスの勉強にも使えます。
Introduction
AMs は、休止期、1 つ認識を介して免疫反応の主要なプレーヤーと吸入の病原体や異物1,2の内面化、肺胞で主要な居住者食です。午前貪食の欠乏はしばしば呼吸の結果、AMs が膿やクレブシエラ肺炎3,4など多くの肺病原体の迅速なクリアランスに欠かせないことが報告されています。などの感染症、急性肺炎死亡率と罹患率を引き起こす。
AMs は、サイトカインやケモカイン TNF α、il-1、ケモカインを生成し、炎症性好中球、単球を集める歯槽の環境の他の細胞のクロストークなどを生産することによって肺で生得的な炎症反応を開始するも、肺5適応免疫細胞。たとえば、AMs によって生成される il-1 は主要な上皮細胞6から好中球ケモカイン CXCL8 のリリースに役立ちます。また、AMs はアポトーシス多形核白血球 (Pmn) の貪食能、周囲の組織、組織の損傷の結果、長期の炎症細胞内酵素の持続的な漏出につながる Pmn からの失敗に貢献します。7,8,9。
AMs が貪食は、AMs のパターン認識受容器 (PRRs)、オプソニン病原体の AMs の免疫エフェクター受容体との結合による病原体の表面に病原体関連分子パターンの直接認識によって媒介されます。10します。 後者の AMs は、Fcγ 受容体 (FcγR) で免疫グロブリン (IgG) とオプソニン ターゲットを認識できるまたは補体の断片、C3b と発見及び C3bi、補体受容体を介して病原体被覆 (CR)11。補体受容体の中で免疫グロブリン スーパーファミリー (CRIg) の CR は組織マクロファージ12で選択的に発現し、最近の知見膿肺炎のコンテキストで午前食から CRIg の役割を強調表示13。
元の多くの研究は、マクロファージ機能14,15の分子メカニズムを記述するのにマクロファージ貪食能を評価するのにメソッドを使用します。しかし、生体内で貪食能のようなメソッドは、貪食の正確な定量を必要です。ここで、かに (FITC) を使用して生体外でそして生体内で貪食能の詳細な方法については要約-ガラス ビーズと膿緑色蛍光タンパク質 (GFP)、それぞれ。さらに、PRR、CR、および FcγR を介した細胞貪食の間で区別する方法をについて説明します。最後に、P.緑膿菌肺炎に関してマウスにおける細菌クリアランスをキャラクタライズ手法を報告する.
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Protocol
このプロトコルの制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 東バージニア医学校のガイドラインに従います。
1. 蛍光ビーズ貪食
- マウスを安楽死させる (c57bl/6 j、6 週齢、女性) 動物の倫理的な安楽死のため IACUC プロトコルに従って CO2窒息により。
- ペーパー タオルで覆われて解剖基板上腹のマウスを置きます。その手足をイナバウアーで前足をダウンピンし、その気管がまっすぐ配置されて、戻ってくる、その頭をプルする前に歯とレベル下で文字列をフックします。
- マウスの喉、胸、腹を 70% エタノール消毒や毛皮がツールにくっつかないように濡れています。
- 定期的な鉗子を使用すると、体の中心線で皮膚を引き上げ、喉の上に中心線を手術用はさみでカットします。
- 標準的な外科はさみの鈍い端を使用して、慎重に喉の筋肉や結合組織を離れ、春はさみ (刀) を使用して、気管を公開します。
- 軟骨輪を鉗子で把持、慎重に気管の心室の顔に、刀を用いた小切開 (~1.5 mm) を行い 18 G カニューレを気管に挿入します。
- 優しく洗浄リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、一度に 1 mL を 3 mL。たびには優しく注射器と肺に reinfuse に、羊水を抜き取る連続 3 x。BALF を収集した後、安楽死できるように頚部転位を実行します。1,000 x g で 10 分間遠心チューブに気管支肺胞洗浄液 (BALF) で、収集された PBS (~2.8 mL) を転送し、ペレットを収集します。チューブと破片を洗浄し、ペレットの肺胞マクロファージを収集 10 分 1,000 x gで遠心分離機に新鮮な PBS の 1 mL を追加します。
- 加湿雰囲気で 37 ° C でガラス底皿の上 2 日間ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 10% 特性不活化ウシ胎児血清 (FBS) と同じメディアの文化主な肺胞マクロファージの 2 mL にペレットを再懸濁します。
- 古いメディアを吸引、1 mL の PBS で洗浄し、新鮮なメディアの 2 mL を追加します。FITC ビーズ (ミクロス ラテックス ビーズ、直径 2 μ m、50 ビーズ/セル) を追加し、加湿雰囲気で 37 ° C で 1 時間インキュベートします。
- 細胞ビーズを削除する PBS (合計 5 つの洗浄のための時間で 1 mL) で広範囲を洗浄します。100 セルをランダムに画像し、細胞内のビーズでセルをカウント (488 nm)。
注: 貪食能インデックスは、マクロファージの数の合計で割った値摂取のビーズの数貪食細胞の割合は、マクロファージの16の合計数で割った値が少なくとも 1 つのビードを摂取するマクロファージの数です。- また、ビーズで 1 時間培養後 3 ml の PBS のセルを洗浄して、処理する貪食能の定量化のためのフローサイトメトリー用。同様に、無染色の細胞または制御の細胞としてビーズしないで AMs を処理します。割合陽性を計算し、ソフトウェアでこれらのオプションを選択することによって流れ cytometry ソフトウェアを使用して蛍光強度を意味します。
2 媒介 FcγR と CR の貪食。
- オプソニン、ウサギ抗 SRBC IgM の 50 μ L または室温11時 30 分の抗 SRBC IgG ウサギの 50 μ L を 2 × 108羊赤血球 (SRBCs) を孵化させなさい。
- 37 ° C で 30 分間 C5 欠損 (C5D) ひと血清の 50 μ L で IgM コーティング SRBCs 上の C3b と発見及び C3bi 補体の断片を修正する SRBCs を IgM オプソニンを孵化させなさい。
- マウスのマクロファージ細胞 (MH S 細胞) を種子 (10,000 細胞/ウェル) 96 ウェル プレートで 〜 70% の合流点を得るために一晩を孵化させなさいと。MH S セルの各ウェルに SRBCs をオプソニン 1 x 107/mL の 100 μ L を追加し、37 ° C で 1 時間インキュベート洗浄は非常に迅速に SRBCs を非連結 (~ 1 分) アンモニウム塩化カリウム (ACK) 換散バッファーの 100 μ L で。
- 0.1 %sds の細胞を溶解し、50 μ L 2, 7-diaminofluorene (DAF) 3% 過酸化水素と 6 M 尿素を含むを追加します。620 でヘモグロビン触媒フルオレン系青色層の吸光度を測定 nm。
- SRBCs の知られている数と 620 nm の吸光度値に標準曲線を使用して、SRBCs の数を決定します。同様に、プロセス MH S 細胞リセプター SRBCs ネガティブ コントロールとして使用すると孵化します。
3. PRR を介した貪食
- 手順 1.1 1.9 分離、マウス プライマリ肺胞マクロファージの培養するために従います。
- 2 日後に、メディアを取り出し、1 ml の PBS のセルを洗浄して Alexa Fluor 488 共役ザイモザン A バクテリア (100 粒子/料理) を含む新鮮なメディアを 500 μ l 添加します。
- 37 ° C で 1 時間インキュベートします。500 μ L の氷冷 PBS の追加によって貪食を停止します。
- PBS (合計 5 つの洗浄のための時間で 1 mL) で広範囲のセルを洗浄します。室温で 10 分間 4% パラホルムアルデヒドとセルを修正します。
- PBS (合計 5 つの洗浄のための時間で 1 mL) で広範囲のセルを洗浄して、500 μ L の PBS で細胞を保ちます。
- 微分干渉コントラストと 488 で蛍光チャネルの下のセルを画像 nm。ザイモザン A バクテリアを含む AMs をカウントし、貪食の割合を決定します。
4.生体内で肺胞マクロファージによる貪食
注: 寒天プレートに膿GFP を接種して、37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。次の日に 2 mL 栄養流体培養基に単一のコロニーを接種して 37 ° C でバクテリアを一晩。
- 次の日は、100 mg/kg 10 mg/kg とケタミン ・ キシラジンの腹腔内投与によるマウスを麻酔します。つま先のピンチに反応の欠如によって適切な anesthetization を確認します。
- 上顎前歯部にゴムバンドで平らな板にマウスを置くし、腹側表面と上向き演壇 semirecumbent (45 °) の位置に配置します。鉗子を使用して、部分的に舌を引っ込めます。気管内投与管理、50 μ L (5 x 106コロニー形成単位 [CFU])17 膿GFP の麻酔下のマウスの肺に、microsprayer を使用して、します。
- 後感染の 1 h は、1.1 から 1.7 の手順に従います。
- PBS および収集に細胞を再懸濁しますスライド ガラスにそれら (1,000 × g室温で 1 分)。
- 製造元の指示に従って肺胞マクロファージ、好中球とリンパ球の cytospin スライドを特異的染色します。
- ランダムに 100 の AMs を選択、細胞内の細菌を含む AMs をカウント、貪食の割合を決定します。
5.体内細菌クリアランスを使用して膿
- 膿分離寒天プレートの膿を接種し、37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。ホストゲノム スープ (LB) 2 mL に単一のコロニーを接種し、37 ° C でバクテリアを一晩。次の数式を使用して、CFU を計算します。
CFU/mL = (x の希釈倍率のコロニーの数)/培養プレートのボリューム。
必要な CFU/mL を取得する PBS の文化を希釈します。 - トライアル 1 気管内注入 ~2.5 x 105 CFU/mL膿の致死線量麻酔下の野生型 (WT) と TRIM72KOマウス、4.2 の手順に記載されているようです。6 日間、毎日体重を測定します。
- トライアル 2 で試用 1 で生き残ったし、4 日間の体重を測定するマウスに膿(5 x 105 CFU/mL) の 2 回目を挿入します。
- マウスの異なるセットを使用して、試用版の 3 で膿の致死量 (3 x 107 CFU/mL) の WT と TRIM72 のKOマウスを注入し、注入の 2 日以内死亡率を記録します。動物は、有意な体重減少などの重度のストレスの兆しを見せて、呼吸困難や食欲不振、背を丸めてバック参加獣医によって評価されます。すぐに治療不可能な動物が犠牲になります。
- 死または注射後 2 日目で安楽死した後、ピーク感染で肺の細菌負荷の定量化のため肺全体を収集します。
- 肺の細菌負荷をテストするためには、肺組織に生理食塩水入りの 200 μ L を追加し、完全に細菌を壊すことがなく肺組織を混乱させる電子のホモジナイザーで以前にテストした設定を使用して、それらを均質化します。肺の 10 倍のシリアル希薄で緑膿菌分離寒天の溶解液の 1 mL とプレート 100 μ L に肺ホモジネートの総量を調整します。
- 24 h の 37 ° C で版を孵化させなさいそして全肺あたり CFU を決定する細菌のコロニーをカウントします。
6. 統計解析
- 学生のtを使用して、-2 つのグループ間の差の統計的有意性を調べるテスト。とき統計的に有意な違いを考慮するp < 0.05。(SEM) 平均値 ± 標準誤差を手段として、すべてのデータが掲載されています。
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Representative Results
まずマウスで貪食能を分析する実験を行った主な AMs。すべての解析を通して WT ・ TRIM72KOマウスから分離した AMs を比較しました。図 1Aのように、蛍光顕微鏡プライマリ AMs 発生 1 時間後のマウスで FITC ガラスビーズの貪食能を明らかにしました。図 1Bは、フローサイトメトリーによる貪食の分析を示しています。貪食能の定量化測定顕微鏡やフローサイトメトリーはそれぞれ図 1Cと図 1Dで表されます。図 2Aで MH S 細胞による貪食を媒介 FcγR と CR を表し、図 2Bに示します.の定量化これらの結果は、MH S 細胞における TRIM72 の発現が補完食の 5 倍以上減少の結果を表示します。WT または TRIM72KOマウスから分離されたプライマリ ams Alexa Fluor 488 共役ザイモザン A 粒子摂取の代表的な画像、図 2Cに示すように、図 2D で定量化を提示.生体内で貪食能結果は、図 3で表されます。図 3A差動汚損 GFP+貪食細胞とリンパ球、好中球、AMs の存在を識別するを示しています。BALF 細胞の割合と貪食能の定量化は、それぞれ図 3B 図 3Cで表されます。緑膿菌の致死線量の気管内投与後の体重減少の割合は、図 4 aに示すように、膿の致命的な線量の後 2 日目でマウスの生存率の割合図 4 bに示されています。図 4Cは、死、またはマウスで膿感染後 2 日目で全肺の細菌負荷の散布を示しています。
図 1: プライマリ肺胞マクロファージの貪食します。(A) 代表的な画像と高い貪食能インデックス (左); 緑蛍光ビーズを含むプライマリの AMs を示す低貪食の AMs の低と高のパーセンテージを示す代表的なイメージ。矢印: 低貪食能インデックス AMs;矢印: 高い貪食能インデックス AMs。スケール バー = 左の 2 つのイメージのため 25 μ m、右側の 2 つの画像を 50 μ m。(B) 代表流量フローサイトメトリー検出なしビーズ コントロール、WT + ビーズと TRIM72島+ ビーズ AMs のセルをとり込んだの。(パーセンテージ) でバー ビードを含む格子セル人口と平均 fluorescence 強度 (MFI)。(C) 統計平均の貪食能指数と WT で貪食 AMs と TRIM72島AMs; の割合n両方のグループ 5 を = *p < 0.05。流れ cytometry MFI の (D) 統計量および FITC+ WT TRIM72KO AMs; 細胞の割合n両方のグループ 3 を = *p < 0.05。この図は、米国胸部学会13の許可を得て転載します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 媒介 FcγR と CR 貪食します。オプソニン羊赤血球 (SRBCs) の (A) 代表的な画像 MH S 細胞によって貪食。矢印は、いくつかの SRBCs をポイントします。スケール バー = 25 μ m。 (B) ・定量化の SRBCs TRIM72 を過剰発現 MH S 細胞によって貪食 (TRIM72OE) IgG (FcγR を介した食作用) や IgM (CR による食作用)。n = 各グループの 6 *p < 0.05 と * *p < 0.005 WT コントロールと比較します。(C) WT または TRIM72KOマウスから分離されたプライマリ ams Alexa Fluor 488 共役ザイモサン粒子摂取の代表的なイメージ。パネル A と B の矢印は、ザイモザン + 細胞を示しています。スケールバー = 50 μ m (D) 統計結果の割合のザイモサン含む AMs;n = p > 0.05 は、各グループの 3。この図は、米国胸部学会13の許可を得て転載します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:生体内で貪食膿 GFP 。(A) 気管支肺胞洗浄液 (BALF) セル cytospin スライド WT ・ TRIM72KOマウス膿GFP の注入後 1 h からの代表的なイメージ。AMs (大きい、円形細胞) や好中球; 識別 Kwik Diff 染色GFP は、貪食細胞 (白い矢印) を識別し、GFP+差動干渉の対照 (DIC) が AMs の内面化された GFP 細菌 (黒矢印) を識別します。スケールバー = 50 μ m。 (B)膿噴射後 AMs および BALF の WT と TRIM72KOマウス 1 h における好中球の割合の定量化。(C) WT ・ TRIM72KOマウス; で貪食 AMs の割合の定量化n = 3、グループごとに *p < 0.05。データは、(± SEM) を意味するように表示されます。この図は、米国胸部学会13の許可を得て転載します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 体内細菌クリアランスの膿(年率) を使用します。素朴な WT ・ TRIM72KOマウス 2.5 x 10 の最初の腹腔内投与後の体重 (帯域幅) 減少の割合 (A)5 CFU/mL PAO1 (緑膿菌臨床分離)。n WT (黒い正方形)、 n = 13 = 8 TRIM72 の島(赤丸) *p < 0.05 * * 3 x 107 CFU/mL P. 後 2 日目で生存の割合の重量 (B) と比較してp < 0.005緑膿菌腹腔内投与。n = 10 WT (固体黒い円) および TRIM72 の島(赤い四角)、*p < 0.05 WT TRIM72 対の島グループ。(C) A WT ・ TRIM72島で膿噴射の 2 日目で全部肺細菌負荷の散布。灰色の点線示す注入細菌線量;^ 死亡しているマウスを指定します。TRIM72 対 WT の島グループ、 p < 0.05。この図は、米国胸部学会13の許可を得て転載します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ガス交換機能を実行している間肺永続的異物、病原体、およびアレルゲンを直面しています。AMs は、主な機能、すなわち貪食のおかげで防衛の最初の行を提供します。AMs はまた他の免疫細胞が病原体を破壊して炎症の解像度を調整します。ここでは、具体的にはマウス肺から分離された AMs によって貪食能を評価する方法について述べる。本稿で提示されたプロトコルは、マクロファージの機能と他の臓器に細菌クリアランスの勉強にも使えます in vivo と in vitro 貪食の詳細な研究を説明します。
説明の in vitro 貪食 FITC ビーズの血清治療の培養のシンプルなアイデアに依存しているまたはオプソニン貪食を開始する培養 AMs の SRBCs。このメソッドには、広範な洗浄の手順と背景を減らすために nonphagocytized 赤血球の溶解が含まれます。付着の AMs を切り離すことには、注意が必要です。ACK 換散ソリューションを含む洗浄ステップを行う必要があります 1 分以内として長く洗濯時間につながる大食細胞の換散。
また、イメージング解析で我々 は貧食細胞の割合と午前の貪食機能の包括的なビューを得るために良いインデックスの両方を特徴しました。私達はまた PRR ・ FcγR ・ CR を介した貪食マクロファージ MH S セルの行を区別する方法を説明しました。遺伝的変調に伴い、この手順は、ターゲット遺伝子操作によって影響を受けた特定貪食経路の力学的洞察を得るためにしようとしているときに便利です。
以前のレポートは、細菌の取り込みを評価する方法を文書化最も顕著な方法であるゲンタマイシンの保護試金14。ここで提示されたプロトコル、私たちはまた生体内で貪食能を測定するイメージング法を示しています。このメソッドが以前に発行された方法と比較して良く、いくつかの重要な要因があります。ここで説明した方法は、BALF の細胞の差動汚損によって続いて膿GFP の気管内投与を含みます。このメソッドは、食細胞内で摂取した細菌を識別するのに役立ちます蛍光細菌の使用を強調表示します。また、具体的には体内環境の他の免疫細胞から AMs の貪食能力を区別するために、細菌をオフに異なる食細胞の相対的貢献度を評価するために役立ちます BALF の細胞の差動汚損肺から読み込みます。このメソッドのマイナーな制限は、マウス間の変動を避けるために慎重な気管内投与が必要なことです。
さらに、肺炎でマウス緑膿菌クリアランスを確立する方法を説明しました。このメソッドを特徴付ける、膿の気管内投与後の体重と死亡率を決定し、肺の細菌負荷を決定する定量的アッセイを使用します。死亡率は、体の包括的な免疫反応を評価する重要なパラメーターです。細菌負荷を評価するためにこの実験から肺のサンプルを使いました。ただし、細菌の負担は次の細菌の注入の非致死量 48 h 以内に収穫肺サンプルからも決定できます。アッセイの成功を注入、病原体の品質と注射の投与量と完全に細菌を壊すことがなく肺を混乱させる均質化法の最適化のタイミングの標準化によって決定されます。細胞膜。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、R01HL116826 X. Zhao への交付金によってサポートされます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
| 2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
| 70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
| 96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
| Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
| C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
| Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
| DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
| Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
| FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
| GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
| Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
| High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
| Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
| Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
| Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
| MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
| rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
| rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
| Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
| Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
| sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
| Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |
References
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