Summary
Her rapporterer vi vanlige metoder for å analysere phagocytic funksjon murine alveolar makrofager og bakteriell klaring fra lungene. Disse metodene studere i vitro fagocytose av fluorescein isothiocyanate perler og i vivo fagocytose Pseudomonas aeruginosa Green fluorescerende protein. Vi har også beskriver en metode for å fjerne P. aeruginosa i mus.
Abstract
Alveolar makrofager (AMs) vakt alveolar løpet av lungene. Fagocytose av AMs spiller en avgjørende rolle i forsvaret mot invaderende patogener, fjerning av død celler eller fremmede partikler og i oppløsning av inflammatoriske svar og vev remodeling, behandler som er formidlet av ulike overflate reseptorer av AMs. Her rapporterer vi metoder for analyse av den phagocytic AMs bruker i vitro og in vivo analyser og eksperimentelle strategier for å skille mellom den mønster anerkjennelse reseptor - supplement reseptor- og Fc gamma reseptor-mediert fagocytose. Til slutt, vi diskuterer en metode for å etablere og karakterisere P. aeruginosa lungebetennelse modell i mus å vurdere bakteriell klarering i vivo. Disse analyser representerer de vanligste metodene for å evaluere AM funksjoner og kan også brukes til å studere macrophage funksjon og bakteriell klarering i andre organer.
Introduction
AMs er de store bosatt phagocytes i alveoli hvile scenen og en av de store aktørene av medfødte immunreaksjoner gjennom erkjennelsen og internalization inhalert patogener og fremmede partikler1,2. Det har blitt rapportert at AMs er avgjørende for den raske klarering av mange lunge patogener som P. aeruginosa og Klebsiella lungebetennelse3,4, så en mangel på AM fagocytose ofte resulterer i luftveiene infeksjoner, som akutt lungebetennelse, som forårsake høyere dødelighet og sykelighet priser.
AMs også starte medfødte inflammatorisk svar i lungene ved å produsere cytokiner og chemokines som TNF-α og IL-1β, hvilke crosstalk med andre celler av alveolar miljøet å produsere chemokines og rekruttere inflammatorisk nøytrofile, monocytter, og adaptive immunceller i lungene5. For eksempel, hjelper IL-1β produsert av AMs Prime utgivelsen av nøytrofile chemokine CXCL8 fra epitelceller6. Videre bidra AMs til fagocytose av apoptotisk polymorfonukleære leukocytter (PMNs), feil som fører til vedvarende lekkasje av intracellulær enzymer fra PMNs til omkringliggende vev, som resulterer i skade på vev og langvarig betennelse 7 , 8 , 9.
Fagocytose av AMs er formidlet av en direkte anerkjennelse av patogen-forbundet molekylær mønster på patogen overflaten av mønster anerkjennelse receptors (PRRs) av AMs eller ved binding av opsonized patogener med immun effektor reseptorer av AMs 10. for sistnevnte AMs kan gjenkjenne mål opsonized med immunglobulin (IgG) gjennom deres Fcγ reseptorer (FcγR) eller patogener belagt med supplement fragmenter, C3b og C3bi, gjennom deres supplement reseptorer (CR)11. Blant supplement reseptorer, CR av immunglobulin gruppe (CRIg) er uttrykt selektivt i vev makrofager12, og en siste finne valgte CRIg i AM fagocytose i sammenheng med P. aeruginosa lungebetennelse 13.
Mange opprinnelige studier bruk metoder for å vurdere macrophage fagocytose å beskrive molekylære mekanismer macrophage funksjon14,15. Men krever metodene som i vivo fagocytose en presis kvantifisering av fagocytose. Her vi oppsummere en detaljert metodikk for både i vitro og in vivo fagocytose bruker fluorescein isothiocyanate (FITC)-glass perler og P. aeruginosa grønne fluorescerende protein (GFP), henholdsvis. Videre forklare vi metoden skille blant PRR - CR- og FcγR-mediert fagocytose. Til slutt, vi rapportere en metode for å beskrive bakteriell klaring musen med hensyn til P. aeruginosa lungebetennelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen følger retningslinjene for institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) i øst Virginia Medical School.
1. fluorescerende perler fagocytose
- Euthanize musen (C57BL/6J, 6 ukens gamle, kvinnelige) av CO2 kvelning som IACUC protokoller for den etiske euthanasia dyr.
- Lå musen buk-up på en disseksjon bord dekket med papirhåndklær. PIN potene med sine lemmer spread-eagle og koble en streng under sine fortenner å trekke hodet slik at luftrøret plasseres rett og nivå.
- Våt musen er halsen, brystet og magen med 70% etanol å desinfisere og hindre at pelsen stikker til verktøy.
- Bruke vanlig tang, trekke opp huden på midtlinjen av kroppen og kuttet med kirurgisk saks opp midtlinjen til toppen av halsen.
- Bruker sløv slutten standard kirurgisk saks, nøye scenowe muskel- og bindevev på halsen og bruke vår saks (microscissors) til å vise luftrøret.
- Gripende en brusk ring med tang, nøye lag et lite innsnitt (~1.5 mm), med microscissors, på ventrikkel ansiktet av trachea og en 18 G kanyle inn i luftrøret.
- Forsiktig lavage 3 mL fosfat-bufret saltvann (PBS), 1 mL samtidig. Hver gang trekke forsiktig væsken i sprøyten og reinfuse den tilbake i lungene, 3 x i rekkefølge. Etter samle BALF, utføre cervical forvridning slik euthanasia. Overføre samlet PBS (~2.8 mL), som er bronchoalveolar lavage væske (BALF), slik sentrifuge 1000 x g for 10 min, og samle pellet. Legg til 1 mL av fersk PBS rør og sentrifuger 1000 x g i 10 min å vaske rusk og samle de pelleted alveolar makrofagene.
- Resuspend pellet i 2 mL Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM) med 10% nonheat-inaktivert fosterets bovin serum (FBS) og kultur primære alveolar makrofager i samme medium for 2 dager på et glass-bottom rett på 37 ° C i en fuktet atmosfære.
- Sug opp den gamle mediet, vask den med 1 mL av PBS og legge 2 mL frisk media. Legg FITC perler (carboxylated latex perler, 2 µm i diameter, 50 perler/cell) og ruge 1t på 37 ° C i en fuktet atmosfære.
- Vask grundig med PBS (1 mL samtidig, totalt fem vasker) fjerne ekstracellulære perler. Image 100 celler tilfeldig og telle celler med intracellulære perler (488 nm).
Merk: Phagocytic indeksene er antall inntatt perler delt på totalt antall makrofager; prosentandelen av phagocytic cellene er antall makrofager som ingest minst en perle delt på totalt antall makrofager16.- Eventuelt etter en 1t inkubasjon med perler, vask cellene med 3 mL PBS og behandle dem for flowcytometri for kvantifisering av fagocytose. Tilsvarende behandle AMs uten perler som unstained kvinne celler eller kontroll celler. Beregne prosentandel positivitet og mener fluorescens intensitet, bruker flyt cytometri programvare, ved å velge disse alternativene i programvaren.
2. FcγR - og CR-mediert fagocytose
- For opsonization, ruge 2 x 108 sauer røde blodlegemer (SRBCs) med 50 µL av kanin anti-SRBC-IgM eller 50 µL av kanin anti-SRBC-IgG i 30 min ved romtemperatur11.
- Inkuber IgM-opsonized SRBCs med 50 µL av C5-mangelfull (C5D) humant serum for 30 min på 37 ° C for å fikse fragmenter komplement C3b og C3bi på IgM-belagt SRBCs.
- Frø murine macrophage celler (MH-S celler) (10 000 celler/vel) i en 96-brønns plate og ruge over natten for å få en ~ 70% samløpet. Legg 100 µL av 1 x 107/mL opsonized SRBCs i hver brønn MH-S celler og ruge 1t på 37 ° C. Vask ubundet SRBCs raskt (~ 1 min) med 100 µL av salmiakk-kalium (ACK) lyseringsbuffer.
- Lyse cellene med 0,1% SDS og legge 50 µL av 2,7-diaminofluorene (DAF) som inneholder 3% hydrogen peroxide og 6 M urea. Måle absorbansen av hemoglobin-katalysert fluorene blå formasjonen på 620 nm.
- Bestemme antall SRBCs ved hjelp av en standard kurve på 620 nm absorbansen verdier med et kjent antall SRBCs. Tilsvarende prosessen MH-S celler inkubert med nonopsonized SRBCs å bruke som negative kontroller.
3. PRR-mediert fagocytose
- Følg trinnene 1.1-1.9 for isolasjon og dyrking av musen primære alveolar makrofager.
- Etter 2 dager, fjerne media, vaske cellene med 1 mL av PBS og legge 500 µL frisk medietyper som inneholder Alexa Fluor-488-konjugerte zymosan-A bioparticles (100 partikler/dish).
- Inkuber 1t på 37 ° C. Stopp fagocytose ved å legge 500 µL av iskalde PBS.
- Vask cellene mye med PBS (1 mL samtidig, totalt fem vasker). Fastsette cellene med 4% paraformaldehyde i 10 min ved romtemperatur.
- Vask cellene mye med PBS (1 mL samtidig, totalt fem vasker) og holde cellene i 500 µL av PBS.
- Bilde cellene i differensial forstyrrelser kontrast og en fluorescerende kanal på 488 nm. Telle AMs som inneholder zymosan-A bioparticles og finne ut prosentandelen av fagocytose.
4. i Vivo fagocytose av Alveolar makrofager
Merk: Vaksinere P. aeruginosa GFP på en nærings agar plate og ruge platen på 37 ° C over natten. På den neste dagen, vaksinere enkelt kolonien til 2 mL av næringsstoffer kjøttkraft og vokse bakterier på 37° C over natten.
- Neste dag, bedøve mus med en intraperitoneal administrasjon av 100 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazine. Bekrefte riktig anesthetization via en mangel på respons til tå klemme.
- Lå musen på et flatt bord med en gummi band over øvre fortenner og plasser den i semirecumbent (45°) stilling ventrale overflaten og talerstol vendt oppover. Bruke buede tang, delvis trekke tungen. Intratracheally bruker en microsprayer, og administrere 50 µL (5 x 106 colony-forming enheter [CFU])17 av P. aeruginosa GFP inn i lungene of bedøvet musene.
- Etter 1 h infeksjon, følger du trinnene 1.1-1.7.
- Resuspend cellene i PBS og cytocentrifuge dem (1000 x g, 1 min ved romtemperatur) på et glass lysbilde.
- Ulikt flekken cytospin lysbilder for alveolar makrofager, nøytrofile og lymfocytter, i henhold til produsentens instruksjoner.
- Tilfeldig velge 100 AMs, telle AMs inneholder intracellulære bakterier og finne ut prosentandelen av fagocytose.
5. i Vivo bakterier klaring bruker P. aeruginosa
- Vaksinere P. aeruginosa på en P. aeruginosa isolasjon agar plate og ruge platen på 37 ° C over natten. Vaksinere enkelt kolonien til 2 mL av lysogeny kjøttkraft (LB) og vokse bakterier på 37° C over natten. Beregne CFU, ved hjelp av følgende formel.
CFU/mL (antall kolonier x fortynningsfaktoren) / volumet av kultur plate.
Fortynne kulturen med PBS å få den ønskede CFU/mL. - I rettssaken 1 intratracheally injisere en sublethal dose ~2.5 x 105 CFU/mL P. aeruginosa i bedøvet vill-type (WT) og TRIM72KO mus, som nevnt i trinn 4.2. Måle kroppsvekten daglig for 6 dager.
- I rettssaken 2, injisere en andre dose av P. aeruginosa (5 x 105 CFU/mL) i musene som overlevde i rettssaken 1 og måle kroppsvekten for 4 dager.
- I rettssaken 3, med en annen mus, injisere WT og TRIM72KO mus med en dødelig dose (3 x 107 CFU/mL) P. aeruginosa og registrere dødeligheten innen 2 dager etter injeksjon. Dyr viser tegn på alvorlig stress som betydelig kropp vekttap, vil bøyd tilbake, anoreksi eller dyspné vurderes av delta veterinærer. Botemiddel dyr vil bli ofret umiddelbart.
- Enten ved død eller etter euthanasia på dag 2 etter injeksjon, samle hele-lunge vev for kvantifisering av lunge bakteriell byrden på topp infeksjon.
- Teste lunge bakterielle belastningen, legge til 200 µL av normal saline på lunge vev og homogenize dem, en tidligere testet skjerminnstilling på en elektronisk homogenizer som helt forstyrrer lungevev uten å bryte bakterier. Juster det totale volumet av lunge homogenate til 1 mL og plate 100 µL av lunge lysate på Pseudomonas isolasjon agar plater på 10 ganger føljetong fortynninger.
- Inkuber platene på 37 ° C i 24 timer og telle bakteriell koloniene for å fastslå CFU per hele lunge.
6. statistisk analyse
- Bruke Student t-test for å fastslå den statistiske betydningen av forskjellen mellom de to gruppene. Vurdere en forskjell statistisk signifikant når p < 0,05. Alle data presenteres som betyr ± standardfeil av gjsnitt (SEM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi først fremført eksperimentet å analysere fagocytose av musen primære AMs. Gjennom alle analyser sammenlignet vi AMs isolert fra WT og TRIM72KO mus. Som vist i figur 1A, avslørt fluorescens mikroskopi at fagocytose av FITC glass perler av musen primære AMs oppstår etter 1 time med inkubering. Figur 1 B viser analyse av fagocytose av flowcytometri. Kvantifisering av fagocytose målt ved mikroskopi og flowcytometri er representert i figur 1C og figur 1D, henholdsvis. FcγR - og CR-mediert fagocytose av MH-S celler er representert i figur 2Aog figur 2B viser kvantifiseringen. Disse resultatene viser at uttrykk for TRIM72 i MH-S celler resulterte i en mer enn femdoblet nedgang i supplement fagocytose. Representant bilder av Alexa Fluor-488-konjugerte zymosan-en partikkel inntak av primære AMs isolert fra WT eller TRIM72KO mus er vist i figur 2Cog kvantifiseringen vises i figur 2D . In vivo fagocytose resultatene vises i Figur 3. Figur 3 En viser differensial flekker identifisere tilstedeværelsen av AMs, nøytrofile, og lymfocytter og GFP+ phagocytic cellene. Prosentandelen av BALF celler og måling av fagocytose er representert i Figur 3B og Figur 3C, henholdsvis. Prosenten av kropp vekttap i mus etter intratracheal administrasjon av en sublethal dose av P. aeruginosa vises i figur 4A, og prosentandelen av overlevelse av mus på dag 2 etter en dødelig dose av P. aeruginosa angitt i figur 4B. Figur 4 Viser et spredningsdiagram for hele-lunge bakterielle belastningen på død eller på dag 2 etter P. aeruginosa infeksjon hos mus.
Figur 1 : Fagocytose i musen primære alveolar makrofager. (A) representant bilder av lav versus høy phagocytic indekser viser primære AMs som inneholder grønn fluorescent perler (venstre); representant bilder viser lave og høye prosenter av phagocytic AMs. Piler: lav phagocytic indeks AMs; pilspisser: høy phagocytic indeks AMs. Baren skala = 25 µm for venstre to bilder og 50 µm for rett to bilder. (B) representant flow cytometri påvisning av phagocytizing celler i no-perler kontroll, WT + perler og TRIM72KO + perler AMs. Barer define perle-inneholder celle befolkningen (i prosent) og betyr fluorescence intensitet (MFI). (C) statistikken for gjennomsnittlig phagocytic indeksen og prosentandelen av phagocytic AMs i WT og TRIM72KO AMs; n = 5 for begge grupper, *p < 0,05. (D) statistikk over flow cytometri MFI og andelen av FITC+ celler i WT og TRIM72KO AMs; n = 3 for begge grupper, *p < 0,05. Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra American Thoracic Society13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : FcγR - og CR-mediert fagocytose. (A) representant bilder av opsonized sauer røde blodlegemer (SRBCs) fagocytose av MH-S celler. Pilene peker til noen SRBCs. Baren skala = 25 µm. (B) Quantification av SRBCs fagocytose av MH-S celler overexpressing TRIM72 (TRIM72OE) i nærvær av IgG (FcγR-mediert fagocytose) eller IgM (CR-mediert fagocytose); n = 6 for hver gruppe, *p < 0,05 og **p < 0.005 sammenlignet med WT kontroll. (C) representant bilder av Alexa Fluor-488-konjugerte zymosan partikkel inntak av primære AMs isolert fra WT eller TRIM72KO mus. Pilene i panelet A og B angi zymosan + celler. Baren skala = 50 µm. (D) statistiske resultater for andelen zymosan inneholder AMs; n = 3 for hver gruppe, p > 0,05. Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra American Thoracic Society13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: I vivo fagocytose av P. aeruginosa GFP. (A) representant bilder av bronchoalveolar lavage væske (BALF) cellen cytospin lysbilder fra WT og TRIM72KO mus 1t etter injeksjon av P. aeruginosa GFP. Kwik-Diff flekker identifiserer AMs (store, runde celler) og nøytrofile; GFP identifiserer phagocytic celler (hvite piler) og GFP+ differensial forstyrrelser kontrast (DIC) identifiserer internalisert GFP bakterier (svart piler) i AMs. Skala barer = 50 µm. (B) kvantifisering av prosentandelen av AMs og nøytrofile i BALF av WT og TRIM72KO mus 1t etter P. aeruginosa injeksjon. (C) kvantifisering av andelen phagocytic AMs i WT og TRIM72KO mus; n = 3 for hver gruppe, *p < 0,05. Dataene presenteres som betyr (± SEM). Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra American Thoracic Society13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : In vivo bakterier klaring bruker P. aeruginosa (PA). (A) prosenten av kropp vekt (B.W.) tap naiv WT og TRIM72KO mus etter første intraperitoneal injeksjon av 2.5 x 105 CFU/mL PAO1 (en kliniske isolere av P. aeruginosa); n = 13 for WT (svarte firkanter), n = 8 for TRIM72KO (røde sirkler), *p < 0,05, **p < 0.005 sammenlignet med WT. (B) prosentandelen av overlevelse på dag 2 etter 3 x 107 CFU/mL P. aeruginosa intraperitoneal injeksjon; n = 10 for WT (solid svart sirkler) og TRIM72KO (solid røde firkanter), *p < 0,05 for WT versus TRIM72KO grupper. (C) en spredningsdiagram av hele-lunge bakteriell byrden på dag 2 av P. aeruginosa injeksjon i WT og TRIM72KO. Grå stiplede linjen angir injisert bakteriell dosen; ^ Angir mus som har dødd. For WT versus TRIM72KO grupper, p < 0,05. Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra American Thoracic Society13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Når du utfører en gass exchange funksjon, konfronterer lungene vedvarende fremmede partikler, patogener og allergener. AMs gir den første linjen i forsvaret i kraft av deres viktigste funksjon, nemlig fagocytose. AMs også koordinere med andre immunceller i ødelegge patogener og oppløsningen av betennelse. Her beskrevet vi metoder for å vurdere spesielt fagocytose av AMs isolert fra mus lungene. Protokollen presentert i dette manuskriptet forklarer en detaljert studie av fagocytose både i vivo og in vitro, som også kan brukes å studere macrophage funksjon og bakteriell klarering i andre organer.
Beskrevet i vitro fagocytose avhengig av enkle ideen om rugende serum-behandlet FITC perler eller opsonized SRBCs med kulturperler AMs starte fagocytose. Denne metoden inneholder trinn av omfattende vask og lysis av nonphagocytized RBCs å redusere bakgrunnen. Hensyn må tas ikke å løsne adhered AMs. Wash trinn som involverer ACK lysis løsning bør gjøres innen 1 min, som en lengre vask tid fører til lysis av makrofagene.
I tillegg i tenkelig analysen karakteriserte vi både prosentandelen av phagocytizing celler og phagocytic indeks til å få en omfattende visning av funksjonen AM fagocytose. Vi har også forklart metoden å skille mellom PRR-, FcγR- og CR-mediert fagocytose i murine macrophage MH-S cellen linje. I forbindelse med genetisk modulasjon er dette nyttig når du prøver å få mekanistisk innsikt på spesifikk fagocytose veien som ble berørt av det målet.
Tidligere rapporter dokumenterte metoder for å evaluere bakteriell opptaket; den mest kjente metoden er gentamicin beskyttelse analysen14. I protokollen presenteres her, har vi også vist en bildebehandling metode for å måle i vivo fagocytose. Det er noen viktige faktorer som gjør denne metoden bedre i forhold til tidligere publiserte metodene. Metoden beskrevet her innebærer en intratracheal injeksjon av P. aeruginosa GFP etterfulgt av differensial farging av BALF celler. Denne metoden fremhever bruk av fluorescerende bakterier, som bidrar til å identifisere inntatt bakterier i phagocytes. I tillegg hjelper den differensial flekker av BALF celler å skille spesifikt phagocytic kapasitet av AMs fra andre immunceller i i vivo miljøet og å vurdere ulike phagocytes fjerne bakterielle relative bidrag laster fra lungene. En mindre begrensning av denne metoden er at det krever en forsiktig intratracheal administrasjonen for å unngå variasjon mellom mus.
Videre forklart metoden for å etablere en P. aeruginosa bakterier klaring i mus i sammenheng med lungebetennelse. Betegner denne metoden, vi bestemt kroppen vekttap og dødelighet etter intratracheal administrasjon av P. aeruginosa og brukt en kvantitativ analyse for å bestemme lunge bakterier byrden. Dødeligheten er en viktig parameter å vurdere omfattende immunforsvaret i kroppen. Vi brukte lunge prøver fra dette eksperimentet for å vurdere bakteriell byrden. Imidlertid kan bakterielle belastningen også fastslås fra lunge prøver høstes innen 48 timer etter ikke-dødelig dose av bakteriell injeksjon. Suksessen av analysen vil bli bestemt av en standardisering av tidspunktet for injeksjon, kvaliteten av patogen og dosen av injeksjon, og optimalisering av homogenisering metode som helt forstyrrer lungene uten å bryte bakterielle cellemembranen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet av grant R01HL116826 til X. Zhao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
| 2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
| 70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
| 96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
| Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
| C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
| Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
| DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
| Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
| FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
| GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
| Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
| High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
| Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
| Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
| Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
| MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
| rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
| rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
| Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
| Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
| sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
| Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |
References
- Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).
- Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease. Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).
- Broug-Holub, E., et al. Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival. Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).
- Knapp, S., et al. Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).
- Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).
- Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).
- Greenlee-Wacker, M. C. Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation. Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).
- Haslett, C. Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).
- Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).
- Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages. Current Protocols in Immunology. , CHAPTER: Unit-14.27 (2011).
- He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation. Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).
- Nagre, N., et al. Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Su, H., Chen, H., Jen, C. J. Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).
- Amiel, E., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression. Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).
- Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).
