Summary
Aquí divulgamos los métodos comunes para analizar la función fagocitaria de los macrófagos alveolares murinos y de remoción bacteriana de los pulmones. Estos métodos de estudian de fagocitosis in vitro de granos de isotiocianato de fluoresceína y la fagocitosis in vivo de la proteína fluorescente verde de Pseudomonas aeruginosa . También se describe un método para despejar a p. aeruginosa en ratones.
Abstract
Los macrófagos alveolares (AMs) guardan el espacio alveolar del pulmón. Fagocitosis por AMs juega un papel fundamental en la defensa contra los invasores patógenos, la eliminación de células muertas o partículas extrañas y en la resolución de las respuestas inflamatorias y la remodelación tisular, procesos que son mediados por receptores distintos de la superficie de las AMs. Aquí, Divulgamos los métodos para el análisis de la función fagocítica de AMs usando estrategias experimentales y ensayos in vitro e in vivo para diferenciar entre el receptor de reconocimiento patrón-, receptor de complemento- y Fc gamma mediada por receptor fagocitosis. Finalmente, se discute un método para establecer y caracterizar un modelo de neumonía de p. aeruginosa en ratones para evaluar in vivo la eliminación bacteriana. Estos ensayos representan los métodos más comunes para evaluar las funciones de AM y también pueden utilizarse para estudiar la función de macrófagos y de remoción bacteriana en otros órganos.
Introduction
AMs son los principales fagocitos residente en los alvéolos en la etapa de descansa y uno de los principales actores de la respuesta inmune innata a través del reconocimiento y la internalización de patógenos inhalados y partículas1,2. Se ha reportado que AMs son esencial para la separación rápida de muchos patógenos pulmonares, como p. aeruginosa y Klebsiella pneumoniae3,4, por lo que una deficiencia en la fagocitosis de AM con frecuencia resulta en respiratorias infecciones, como neumonía aguda, que causan mayores tasas de mortalidad y morbilidad.
AMs también iniciar innatas respuestas inflamatorias en el pulmón mediante la producción de citoquinas y quimioquinas como TNF-α y IL-1β, que interferencia con otras células del ambiente alveolar para producir quimiocinas y reclutar inflamatorias neutrófilos, monocitos, y células inmunes adaptantes en el pulmón5. Por ejemplo, IL-1β producido por AMs ayuda a la liberación de lo neutrófilo chemokine CXCL8 de células epiteliales6. Por otra parte, el AMs contribuyen a la fagocitosis de la apoptosis de leucocitos polimorfonucleares (PMNs), fracaso del que conduce a la pérdida sostenida de enzimas intracelulares de PMNs al tejido circundante, resultando en daño tisular y la inflamación prolongada 7 , 8 , 9.
Fagocitosis por las AMs está mediada por un reconocimiento directo de patrones moleculares asociados a patógenos en la superficie de patógeno por los receptores de reconocimiento de patrón (PRRs) de las AMs o por la Unión de patógenos opsonizadas con receptores inmunes efectoras de las AMs 10. para este último, AMs puede reconocer los objetivos opsonizadora con inmunoglobulina (IgG) a través de sus receptores de Fcγ (FcγR) o los patógenos recubiertos de fragmentos del complemento, C3b y C3bi, a través de sus receptores de complemento (CR)11. Entre los receptores del complemento, el CR de la superfamilia de las inmunoglobulinas (CRIg) se expresa selectivamente en los macrófagos de tejido12, y un reciente hallazgo destacó el papel del CRIg en fagocitosis de AM en el contexto de la pulmonía de p. aeruginosa 13.
Muchos estudios originales utilizan métodos para evaluar la fagocitosis de macrófagos para describir los mecanismos moleculares de la función de macrófagos14,15. Sin embargo, métodos como la fagocitosis in vivo requieren una cuantificación precisa de la fagocitosis. Aquí, se resume una metodología detallada para la fagocitosis in vitro e in vivo con isotiocianato de fluoresceína (FITC)-cristal granos y proteína de p. aeruginosa verde fluorescente (GFP), respectivamente. Además, se explica el método de diferenciar entre PRR, CR y fagocitosis mediada por FcγR. Por último, se presenta un método para caracterizar la remoción bacteriana en ratón con respecto a p. aeruginosa neumonía.
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Protocol
Este protocolo sigue las pautas de la institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de Eastern Virginia Medical School.
1. fluorescente granos fagocitosis
- Eutanasia el ratón (C57BL/6J, 6 semanas de edad, mujer) por CO2 asfixia según protocolos IACUC para la eutanasia ética de los animales.
- Coloque el ratón pique en una tabla de disección cubierta con toallas de papel. Precisar sus patas con sus extremidades spread-eagle y enganchar una cadena bajo sus dientes delanteros tirando su cabeza hacia atrás para que la tráquea quede recto y nivel.
- Mojar la garganta, pecho y vientre con etanol al 70% para desinfectar y evitar que la piel se pegue a las herramientas del ratón.
- Con fórceps regular, tire de la piel en la línea central del cuerpo y cortar con tijeras quirúrgicas para arriba de la línea central a la parte superior de la garganta.
- Cuidadosamente con el extremo despuntado de tijeras quirúrgicas estándar, alejar el músculo y los tejidos conectivos en la garganta y utilizar tijeras de primavera (microscissors) para exponer la tráquea.
- Agarrar un anillo de cartílago con las pinzas, con cuidado haga una pequeña incisión (~1.5 mm), con microscissors, en la cara del ventrículo de la tráquea e Inserte una cánula 18 G en la tráquea.
- Lavado cuidadosamente 3 mL de tampón fosfato salino (PBS), 1 mL a la vez. Cada vez que retire suavemente el líquido en la jeringa y el infundir de nuevo en el pulmón, 3 x en la sucesión. Después de recoger el BALF, realizar la dislocación cervical para asegurar la eutanasia. El PBS recogido (~2.8 mL), que es el lavado broncoalveolar (BALF), la transferencia a un tubo, centrifugar a 1.000 x g durante 10 min y recoger el diábolo. Añadir 1 mL de PBS fresco al tubo y centrifugar a 1.000 x g durante 10 minutos lavar los residuos y recoger los alimentos peletizados macrófagos alveolares.
- Resuspender el precipitado en 2 mL de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% inactivado le suero bovino fetal (FBS) y macrófagos alveolares primarios de la cultura en los mismos medios por 2 días en un plato de fondo de cristal a 37 ° C en un ambiente humidificado.
- Aspirar viejos media, lave con 1 mL de PBS y añadir 2 mL de medio fresco. Añadir granos FITC (cuentas de látex carboxilado, 2 μm de diámetro, 50 perlas/célula) e Incube por 1 h a 37 ° C en un ambiente humidificado.
- Lavar exhaustivamente con PBS (1 mL a la vez, para un total de cinco lavados) para quitar granos extracelulares. Imagen 100 células al azar y contar las células con los granos intracelulares (488 nm).
Nota: fagocítico índices son el número de granos ingeridos dividido por el número de macrófagos; el porcentaje de células fagocíticas es el número de macrófagos que ingieren al menos una bola dividida por el número total de macrófagos16.- Alternativamente, después de una incubación de 1 h con los granos, lavar las células con 3 mL de PBS y procesarlas para citometría de flujo para la cuantificación de la fagocitosis. Del mismo modo, proceso, AMs sin granos sin manchas de células como las células del control. Calcular el porcentaje de positividad y media intensidad de fluorescencia, utilizando software de citometría de flujo, seleccionando las opciones en el software.
2. fagocitosis mediada por FcγR y CR
- Para la opsonización, incubar 2 x 108 ovejas células de sangre rojas (SRBCs) con 50 μl de conejo anti-anuarios-IgM o 50 μl de conejo anti-anuarios-IgG durante 30 min a temperatura ambiente11.
- Incubar SRBCs IgM opsonizadora con 50 μl de suero humano C5-deficientes (C5D) durante 30 min a 37 ° C para fijar los fragmentos del complemento C3b y C3bi en SRBCs cubierto de IgM.
- Macrófagos murinos (células MH-S) de la semilla (10.000 células/pocillo) en una placa de 96 pocillos y se incuba durante la noche para conseguir una confluencia de ~ 70%. Añadir 100 μl de 1 x 107/ml opsonizadora SRBCs en cada pocillo de las células de MH-S e incubar 1 h a 37 ° C. Lavado sin consolidar SRBCs muy rápidamente (~ 1 min) con 100 μl de tampón de lisis (ACK) de cloruro de amonio y potasio.
- Lyse las células con el 0,1% de SDS y añadir 50 μl de 2, 7-diaminofluorene (DAF) que contiene 6 M urea y peróxido de hidrógeno 3%. Medir la absorbancia de la formación de la hemoglobina-catalizada fluoreno azul a 620 nm.
- Determinar el número de SRBCs utilizando una curva estándar en los valores de absorbancia de 620 nm con un número conocido de SRBCs. Del mismo modo, proceso MH-S células incuban con nonopsonized SRBCs para usar como controles negativos.
3. PRR-mediada por la fagocitosis
- Siga los pasos 1.1-1.9 para el aislamiento y cultivo de macrófagos alveolares primarios de ratón.
- Después de 2 días, eliminar los medios de comunicación lavan las células con 1 mL de PBS y agregar 500 μl de medios frescos que contienen biopartículas zymosan-A Alexa Fluor 488 conjugado (100 partículas/plato).
- Incubar durante 1 h a 37 ° C. Añadir 500 μl de PBS helada para detener la fagocitosis.
- Lavar las células con PBS (1 mL a la vez, para un total de cinco lavados). Fijar las células con paraformaldehído al 4% por 10 min a temperatura ambiente.
- Lavar las células con PBS (1 mL a la vez, para un total de cinco lavados) y mantener las células en 500 μl de PBS.
- Imagen de las células en contraste de interferencia diferencial y un canal fluorescente en 488 nm. AMs con zymosan-A biopartículas y determinar el porcentaje de fagocitosis.
4. en Vivo la fagocitosis por los macrófagos alveolares
Nota: p. aeruginosa GFP de inocular en una placa de agar nutritivo e incubar la placa a 37 ° C durante la noche. Al día siguiente, inocular la Colonia solo a 2 mL de caldo nutritivo y crecen las bacterias a 37° C durante la noche.
- Al día siguiente, anestesiar ratones con administración intraperitoneal de 100 mg/kg ketamina y 10 mg/kg xilacina. Confirmar la anestesia adecuada a través de una falta de respuesta a la presión del dedo del pie.
- Coloque el ratón sobre un tablero plano con una banda elástica sobre los incisivos superiores y coloque en una posición semisentada (45°) con la superficie ventral y hacia arriba de la tribuna. Con unas pinzas curvas, parcialmente retrae la lengua. Usando un microsprayer, PCSC administrar 50 μl (5 x 106 unidades formadoras de colonias [CFU])17 de p. aeruginosa GFP en los pulmones de los ratones anestesiados.
- Después de 1 h de la infección, siga los pasos 1.1-1.7.
- Resuspender las células en PBS y Citocentrifuga ellos (1.000 x g, 1 min a temperatura ambiente) en un portaobjetos de vidrio.
- Diferencialmente la mancha cytospin algunas diapositivas de los macrófagos alveolares, neutrófilos y linfocitos, según las instrucciones del fabricante.
- Al azar seleccione 100 AMs cuenta AMs que contienen bacterias intracelulares y determinar el porcentaje de fagocitosis.
5. en Vivo bacterias separación usando el p. aeruginosa
- P. aeruginosa de inocular en una placa de agar de aislamiento de p. aeruginosa e incubar la placa a 37 ° C durante la noche. Inocular la Colonia solo 2 ml de caldo de lisogenia (LB) y crecen las bacterias a 37° C durante la noche. Calcular la UFC, utilizando la siguiente fórmula.
UFC/mL = (número de colonias x factor de dilución) / volumen de la placa de cultivo.
Diluir la cultura con PBS para obtener las UFC/mL deseada. - En el ensayo 1, PCSC inyectar una dosis subletal de ~2.5 x 105 UFC/mL de p. aeruginosa anestesiado wild-type (WT) y TRIM72 ratonesKO , como se indica en el paso 4.2. Medir el peso corporal diariamente durante 6 días.
- En el ensayo 2, inyectar una segunda dosis de p. aeruginosa (5 x 105 UFC/mL) en los ratones que sobrevivieron en 1 prueba y medir el peso corporal durante 4 días.
- En el ensayo 3, utilizando un conjunto diferente de ratones, ratonesKO de WT y TRIM72 se inyectan con una dosis letal (3 x 107 UFC/mL) de p. aeruginosa y registrar la mortalidad dentro de 2 días de la inyección. Animales que muestren signos de estrés severo como pérdida de peso significativa, espalda jorobada, anorexia y disnea será evaluada por los veterinarios asistentes. Animales serán sacrificados inmediatamente.
- En la muerte o después de la eutanasia en el día 2 después de la inyección, recoger el tejido pulmonar total para la cuantificación de la carga bacteriana del pulmón en infección de pico.
- Para probar la carga bacteriana del pulmón, añadir 200 μL de solución salina normal a los tejidos pulmonares y homogeneizarlas, utilizando un ajuste previamente probado en un homogeneizador electrónico que interrumpe totalmente el tejido pulmonar sin romper las bacterias. Ajustar el volumen total del homogeneizado de pulmón a 1 mL y la placa de 100 μl de pulmón lisado en placas de agar de aislamiento de Pseudomonas en diluciones en serie 10 veces.
- Incubar las placas a 37 ° C durante 24 horas y contar las colonias bacterianas para determinar la UFC por pulmón entero.
6. estadístico análisis
- Uso del estudiante t-pruebas para determinar la significación estadística de la diferencia entre los dos grupos. Considerar una diferencia estadísticamente significativa cuando p < 0.05. Todos los datos se presentan como medios ± error estándar de la media (SEM).
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Representative Results
Primero realizamos el experimento para analizar fagocitosis por ratón AMs primarias. A lo largo de todos los análisis, se compararon las AMs aislados de ratonesKO de WT y TRIM72. Como se muestra en la figura 1A, microscopía de fluorescencia reveló la fagocitosis de FITC-abalorios por ratón AMs primarias ocurre después de 1 h de incubación. Figura 1 B muestra el análisis de la fagocitosis mediante citometría de flujo. La cuantificación de la fagocitosis medido por microscopia y citometría de flujo se representa en la figura 1C yDde la figura 1, respectivamente. FcγR y CR-mediada por la fagocitosis por las células de MH-S se representa en la figura 2Ay 2 de la figuraB muestra la cuantificación. Estos resultados muestran que la expresión de TRIM72 en células de MH-S dio lugar a una disminución de más de cinco veces la fagocitosis complemento. Imágenes representativas de la ingestión de partículas de zymosan-A Alexa Fluor 488 conjugado por AMs primarios aislado de ratonesKO WT o TRIM72 se muestran en la figura 2C, y la cuantificación se presenta en la figura 2D . Resultados de la fagocitosis in vivo están representados en la figura 3. Figura 3 A muestra diferencial coloración identificar la presencia de AMs, neutrófilos, linfocitos y células fagocíticas GFP+ . El porcentaje de células BALF y la cuantificación de la fagocitosis se representan en la figura 3B yCde la figura 3, respectivamente. En la Figura 4Ase muestra el porcentaje de pérdida de peso corporal en ratones después de la administración de una dosis subletal de p. aeruginosa , y el porcentaje de supervivencia de ratones en el día 2 después de una dosis letal de p. aeruginosa es indicado en la Figura 4B. Figura 4 C muestra un diagrama de dispersión de la carga bacteriana pulmonar total en muerte o en el día 2 después de la infección por p. aeruginosa en ratones.
Figura 1 : Fagocitosis de los macrófagos alveolares primarios de ratón. (A) imágenes representativas de baja versus alta índices fagocítico mostrando AMs primarias que contiene granos de fluorescent verde (izquierdos); imágenes representativas con porcentajes bajos y altos de AMs fagocíticas. Flechas: bajo índice fagocítico AMs; puntas de flecha: alto índice fagocítico AMs. La barra de escala = 25 μm para las dos imágenes de la izquierda y 50 para las derecha dos imágenes. (B) representante flujo cytometry detección de phagocytizing células en granos no control, WT + granos y TRIM72KO + granos de AMs. La población de la célula de definir las cuentas que contienen bares (en porcentaje) y la intensidad de la medias fluorescence (IMF). (C) estadísticas del promedio índice fagocítico y el porcentaje de AMs fagocíticas en WT y TRIM72KO AMs; n = 5 para ambos grupos, *p < 0.05. (D) las estadísticas de flujo cytometry MFI y el porcentaje de células FITC+ en peso y TRIM72KO AMs; n = 3 para ambos grupos, *p < 0.05. Esta figura es reimpreso con permiso de la American Thoracic Society13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Fagocitosis mediada por FcγR y CR. (A) imágenes representativas de ovejas opsonizadas glóbulos rojos (SRBCs) fagocitosis por las células S MH. Las flechas señalan a algunos SRBCs. La barra de escala = 25 μm. (B) Quantification de SRBCs la fagocitosis por las células S MH overexpressing TRIM72 (TRIM72OE) en presencia de IgG (fagocitosis mediada por FcγR) o IgM (fagocitosis mediada por el CR); n = 6 para cada grupo, *p < 0.05 y **p < 0.005 en comparación con el control de peso. (C) imágenes representativas de la ingestión de partículas de zymosan Alexa Fluor 488 conjugado por AMs primarios aislado de ratonesKO WT o TRIM72. Las flechas en el panel A y B indican células + zymosan. La barra de escala = 50 μm. (D) resultados estadísticos del porcentaje de zymosan-que contiene AMs; n = 3 para cada grupo, p > 0.05. Esta figura es reimpreso con permiso de la American Thoracic Society13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: fagocitosis In vivo de p. aeruginosa GFP. (A) imágenes representativas de broncoalveolar lavado líquido (BALF) célula cytospin diapositivas de ratonesKO WT y TRIM72 1 h después de la inyección de p. aeruginosa GFP. Tinción de Diff Kwik identifica AMs (grandes, células redondas) y neutrófilos; GFP identifica células fagocíticas (flechas blancas) y contraste de interferencia diferencial de GFP+ (DIC) identifica bacterias internalizadas de GFP (flechas negras) en AMs. Las barras de escala = 50 μm. (B) cuantificación del porcentaje de AMs y neutrófilos en ratonesKO BALF de WT y TRIM72 1 h después de la inyección de p. aeruginosa . (C) la cuantificación del porcentaje de AMs fagocíticas en ratonesKO WT y TRIM72; n = 3 para cada grupo, *p < 0.05. Los datos se presentan como media (± SEM). Esta figura es reimpreso con permiso de la American Thoracic Society13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Separación de las bacterias In vivo utilizando p. aeruginosa (P.A.). (A) el porcentaje de pérdida de peso (B.W.) de ingenuo WT TRIM72KO ratones y después de la primera inyección intraperitoneal de 2.5 x 105 UFC/mL PAO1 (una cepa clínica de p. aeruginosa); n = 13 para WT (cuadrados negros), n = 8 para TRIM72KO (círculos rojos), *p < 0.05, **p < 0.005 comparado con pesos (B) el porcentaje de supervivencia en el día 2 después de 3 x 107 CFU/mL P. aeruginosa inyección intraperitoneal; n = 10 para el peso (los círculos negros sólidos) y TRIM72KO (los cuadrados rojo sólidos), *p < 0.05 para WT versus TRIM72 gruposKO . (C) A diagrama de dispersión de la carga bacteriana pulmonar total en el día 2 de la inyección de p. aeruginosa en WT y TRIM72KO. La línea punteada gris señala la dosis inyectada bacteriana; ^ señala ratones que han muerto. Para WT versus TRIM72 gruposKO , p < 0.05. Esta figura es reimpreso con permiso de la American Thoracic Society13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Al realizar una función de intercambio de gas, el pulmón persistente se enfrenta a alérgenos, agentes patógenos y partículas extrañas. AMs proporcionan la primera línea de defensa en virtud de su función principal, es decir, fagocitosis. AMs también coordinar con otras células a destruir los patógenos y en la resolución de la inflamación. Aquí, hemos descrito los métodos para evaluar específicamente la fagocitosis por AMs aislada del pulmón del ratón. El protocolo presentado en este manuscrito, explica un estudio detallado de la fagocitosis in vivo e in vitro, que puede utilizarse también para estudiar la función del macrófago y la remoción bacteriana en otros órganos.
La fagocitosis in vitro descrita se basa en la simple idea de incubación granos tratados con suero FITC u opsonizadora SRBCs con AMs cultivos para iniciar la fagocitosis. Este método incluye los pasos de lavado amplia y la lisis de glóbulos rojos nonphagocytized a reducir el fondo. Debe tener cuidado de no separar las AMs adheridos. La etapa de lavado con solución de lisis ACK debe hacerse dentro de 1 minuto, como un lavado largo tiempo conduce a la lisis de los macrófagos.
Además, en el análisis de imágenes, nos caracteriza el porcentaje de células phagocytizing y el índice fagocítico para obtener una visión integral de la función de fagocitosis de AM. También hemos explicado el método para distinguir entre PRR, FcγR y fagocitosis mediada por CR en el macrófago murino MH línea celular. En conjunción con la modulación genética, este paso es útil al tratar de ganar penetraciones mecánicas en la vía fagocitosis específica que fue afectado por la manipulación de genes objetivo.
Informes anteriores documentan métodos para evaluar la captación bacteriana; el método más notable es la gentamicina protección ensayo14. En el protocolo presentado aquí, también hemos demostrado un método de imagen para medir fagocitosis in vivo. Hay algunos factores claves que hacen que este método mejor en comparación con los métodos previamente publicados. El método aquí descrito implica una inyección intratraqueal de GFP de p. aeruginosa , seguido por la coloración diferencial de células BALF. Este método destaca el uso de bacterias fluorescentes, que ayuda a identificar las bacterias ingeridas dentro de los fagocitos. Además, la tinción diferencial de células BALF ayuda a diferenciar específicamente la capacidad fagocitaria de AMs de otras células inmunes en el ambiente en vivo y a evaluar la contribución relativa de diferentes fagocitos para eliminar las bacterias cargas del pulmón. Una menor limitación de este método es que requiere una cuidado de la administración para evitar la variabilidad entre ratones.
Además, nos explicó el método para establecer una separación de las bacterias p. aeruginosa en ratones en el contexto de la neumonía. Para caracterizar este método, determina la pérdida de peso corporal y la mortalidad después de la administración intratraqueal de p. aeruginosa y utiliza un ensayo para determinar la carga de las bacterias del pulmón. La mortalidad es un parámetro importante para evaluar la respuesta inmunitaria general del cuerpo. Utilizamos muestras de pulmón de este experimento para evaluar la carga bacteriana. Sin embargo, también se puede determinar carga bacteriana de las muestras de pulmón cosechadas dentro de 48h después de dosis no mortal de la inyección de bacteria. El éxito del ensayo se determinará por una estandarización de la sincronización de la inyección, la calidad del patógeno y la dosis de la inyección y la optimización de un método de homogeneización que interrumpe totalmente el pulmón sin romper el bacteriano membrana de la célula.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por beca R01HL116826 a X. Zhao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
| 2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
| 70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
| 96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
| Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
| C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
| Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
| DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
| Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
| FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
| GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
| Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
| High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
| Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
| Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
| Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
| MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
| rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
| rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
| Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
| Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
| sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
| Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |
References
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