Summary
Här rapporterar vi gemensamma metoder för att analysera fagocytisk funktion murina alveolära makrofager och bakteriell clearance från lungan. Dessa metoder studera in vitro-fagocytos av fluorescein Isotiocyanat pärlor och Invivo fagocytos av Pseudomonas aeruginosa grönt fluorescerande Protein. Vi beskriver också en metod för att rensa P. aeruginosa hos möss.
Abstract
Alveolära makrofager (AMs) vakt alveolära utrymmet i lungan. Fagocytos av AMs spelar en avgörande roll i försvaret mot invaderande patogener, borttagning av döda celler eller främmande partiklar, och i resolutionen av inflammatoriskt svar och vävnad remodeling, processer som förmedlas av olika yta receptorer av AMs. Här, rapporterar vi metoder för analys av AMs med in vitro- och in vivo analyser och experimentella strategier för att skilja mellan de mönster erkännande receptor-, Komplettera receptor- och Fc gamma receptor-medierad fagocytos funktion fagocytos. Slutligen diskuterar vi en metod för att fastställa och karaktärisera en P. aeruginosa lunginflammation modell i möss att bedöma bakteriell clearance Invivo. Dessa analyser representerar de vanligaste metoderna för att utvärdera AM funktioner och kan också användas för att studera makrofag funktion och bakteriell clearance i andra organ.
Introduction
AMs är stora bosatt fagocyter i alveolerna vilande skedet, och en av de största aktörerna av medfödda immunsvaret genom erkännandet och internalisering av inhalerade patogener och främmande partiklar1,2. Det har rapporterats att AMs är avgörande för snabb clearance av många pulmonell patogener såsom P. aeruginosa och Klebsiella pneumoni3,4, så en brist i AM fagocytos ofta resulterar i luftvägarna infektioner, såsom akut lunginflammation, som orsakar dödlighet och sjuklighet högre.
AMs också initiera medfödda inflammatoriskt svar i lungan genom att producera cytokiner och chemokiner såsom TNF-α och IL-1β, som överhörning med andra celler av alveolära miljön att producera chemokiner och rekrytera inflammatorisk neutrofiler, monocyter, och adaptiv immunceller i lungan5. Till exempel, hjälper IL-1β produceras av AMs till prime frisläppandet av de neutrofila chemokine CXCL8 från epitelceller6. Dessutom bidra AMs till fagocytos av apoptotiska polymorfonukleära leukocyter (PMNs), bristande vilket leder till ihållande läckage av intracellulära enzymer från PMNs till omgivande vävnad, vilket resulterar i vävnadsskada och långvarig inflammation 7 , 8 , 9.
Fagocytos av AMs medieras av ett direkt erkännande av patogen-associerade molekylära mönster på patogen ytan av de mönster erkännande receptorsna (PRRs) av AMs eller bindning av opsonized patogener med immun effektor receptorer av AMs 10. det senare, AMs kan känna igen de mål som opsonized med immunglobulin (IgG) genom deras Fcγ-receptorer (FcγR) eller patogener belagda med komplement fragment, C3b och C3bi, genom deras komplement receptorer (CR)11. Bland komplement receptorer, CR av immunglobulin superfamiljen (CRIg) uttrycks selektivt i vävnad makrofager12, och en nyligen upptäckt markeras rollen av CRIg i AM fagocytos i samband med P. aeruginosa lunginflammation 13.
Många ursprungliga studierna använder metoder för att utvärdera makrofag fagocytos för att beskriva de molekylära mekanismerna makrofag funktion14,15. Metoder som i vivo fagocytos kräver dock en exakt kvantifiering av fagocytos. Här sammanfattar vi en detaljerad metod för både in vitro- och in vivo fagocytos med fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC)-glas pärlor och P. aeruginosa grönt fluorescerande protein (GFP), respektive. Dessutom förklarar vi metoden för att skilja mellan PRR-, CR- och FcγR-medierad fagocytos. Slutligen rapporterar vi en metod att karakterisera bakteriell clearance i musen med avseende på P. aeruginosa lunginflammation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer riktlinjerna i den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) i östra Virginia Medical School.
1. fluorescerande pärlor fagocytos
- Avliva musen (C57BL/6J, 6 veckor gammal, kvinnliga) av CO2 kvävning enligt IACUC protokoll för den etiska eutanasi av djur.
- Lägg musen magen upp på en dissekering styrelsen täckt med pappershanddukar. Fästa sina tassar med dess lemmar spread-eagle och krok en sträng under dess framtänder att dra huvudet tillbaka så att luftstrupen är placerad rakt och nivå.
- Våt musens halsen, bröstkorgen och magen med 70% etanol att desinficera och förhindra pälsen klibbar till verktyg.
- Använder vanlig tång, dra upp huden vid mittlinjen av kroppen, och klipp med kirurgisk sax upp mittlinjen till toppen av halsen.
- Med den trubbiga änden standarden kirurgisk sax, försiktigt flytta bort muskel och bindväv på halsen och använda våren sax (microscissors) för att exponera luftstrupen.
- Gripande en brosk ring med tången, noggrant göra ett litet snitt (~1.5 mm), med microscissors, i ventrikeln ansiktet av luftstrupen och infoga en 18 G kanyl i luftstrupen.
- Försiktigt lavage 3 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 1 mL i taget. Varje gång försiktigt dra upp vätskan i sprutan och förnya det tillbaka in i lungen, 3 x i följd. Efter att samla BALF, utföra cervikal Dislokation för att säkerställa dödshjälp. Överföra insamlade PBS (~2.8 mL), som är bronkoalveolär lavage vätska (BALF), till ett rör, Centrifugera vid 1 000 x g i 10 minuter och samla pelleten. Tillsätt 1 mL färsk PBS till rör och centrifugera vid 1 000 x g i 10 min att tvätta skräp och samla pelleterat alveolära makrofager.
- Återsuspendera pelleten i 2 mL Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM) med 10% nonheat-inaktiverat fetalt bovint serum (FBS) och kultur primära alveolära makrofager i samma media för 2 dagar på en glasbotten maträtt vid 37 ° C i en fuktad atmosfär.
- Aspirera gamla media, tvätta med 1 mL PBS och tillsätt 2 mL av färska media. Lägg till FITC pärlor (carboxylated latex pärlor, 2 µm i diameter, 50 pärlor/cell) och inkubera i 1 timme vid 37 ° C i en fuktad atmosfär.
- Tvätta i stor utsträckning med PBS (1 mL i taget, för sammanlagt fem tvättar) ta bort extracellulära pärlor. Bild 100 celler slumpmässigt och räkna cellerna med intracellulära pärlor (488 nm).
Obs: Phagocytic index är antalet intagna pärlor dividerat med det totala antalet makrofager; procentandelen av Fagocytos celler är antalet makrofager som äter minst en pärla dividerat med det totala antalet makrofager16.- Alternativt efter en 1 h inkubation med pärlor, tvätta cellerna med 3 mL PBS och bearbeta dem för flödescytometri för kvantifiering av fagocytos. På samma sätt bearbeta AMs utan pärlor som ofärgade celler eller kontroll celler. Beräkna det procentuella positivitet och menar fluorescensintensiteten, med flöde flödescytometri programvara, genom att välja dessa alternativ i programvaran.
2. FcγR - och CR-medierad fagocytos
- För opsonization, Inkubera 2 x 108 får röda blodkroppar (SRBCs) med 50 µL kanin anti-SRBC-IgM eller 50 µL kanin anti-SRBC-IgG under 30 minuter vid rumstemperatur11.
- Inkubera IgM-opsonized SRBCs med 50 µL av C5-brist (C5D) humant serum under 30 minuter vid 37 ° C för att fixa komplement fragment C3b och C3bi på IgM-belagd SRBCs.
- Utsäde murina makrofagceller (MH-S celler) (10 000 celler per brunn) i en plattan med 96 brunnar och inkubera över natten för att få en ~ 70% sammanflödet. Tillsätt 100 µL av 1 x 107/ml opsonized SRBCs till varje brunn av MH-S celler och inkubera i 1 timme vid 37 ° C. Tvätta obundna SRBCs mycket snabbt (~ 1 min) med 100 µL av ammoniumklorid-kalium (ACK) lyseringsbuffert.
- Lysera cellerna med 0,1% SDS och tillsätt 50 µL av 2,7-diaminofluorene (DAF) som innehåller 3% väteperoxid och 6 M urea. Mät absorbansen hos hemoglobin-katalyseras fluoren blå bildandet på 620 nm.
- Fastställa antalet SRBCs genom att använda en standardkurva på 620 nm absorptionsvärden med ett känt antal av SRBCs. Likaså process MH-S cellerna inkuberas med nonopsonized SRBCs att använda som negativa kontroller.
3. PRR-medierad fagocytos
- Följ steg 1,1-1,9 för isolering och odling av mus primära alveolära makrofager.
- Efter 2 dagar, ta bort materialet, tvätta cellerna med 1 mL PBS och tillsätt 500 µL av färska media som innehåller Alexa Fluor-488-konjugerad zymosan-A biopartiklar (100 partiklar/maträtt).
- Inkubera i 1 timme vid 37 ° C. Stoppa fagocytos genom att lägga till 500 µL av iskall PBS.
- Tvätta cellerna med PBS (1 mL i taget, för sammanlagt fem tvättar). Fixa cellerna med 4% paraformaldehyd under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta cellerna med PBS (1 mL i taget, för sammanlagt fem tvättar) och hålla cellerna i 500 µL av PBS.
- Bild cellerna under differentiell störningar kontrast och en fluorescerande kanal på 488 nm. Räkna AMs som innehåller zymosan-A biopartiklar och bestämma procentandelen av fagocytos.
4. in Vivo fagocytos av alveolära makrofager
Obs: Inokulera P. aeruginosa GFP på en näringsagar tallrik och inkubera plattan vid 37 ° C över natten. På nästa dag, Inokulera den enda kolonin till 2 mL av näringsämne buljong och växa bakterier vid 37° C under natten.
- Nästa dag, söva möss med en intraperitoneal administrering av 100 mg/kg Ketamin och 10 mg/kg xylazin. Bekräfta rätt anesthetization via en brist på svar på tå nypa.
- Lägg musen på en platt bräda med ett gummiband över de övre framtänderna och placera den i en semirecumbent (45°) position med den ventrala ytan och talarstol uppåt. Använda böjda pincetten, återkalla delvis tungan. Intratracheally med en microsprayer, och administrera 50 µL (5 x 106 kolonibildande enheter [CFU])17 av P. aeruginosa GFP i lungorna de sövda möss.
- Efter 1 h av infektion, anvisningarna 1.1-1.7.
- Att resuspendera cellerna i PBS och cytocentrifuge dem (1000 x g, 1 min i rumstemperatur) på en glasskiva.
- Differentially fläcken cytospin bilderna för alveolära makrofager, neutrofiler och lymfocyter, enligt tillverkarens instruktioner.
- Slumpmässigt väljer 100 AMs, räkna AMs som innehåller intracellulära bakterier och bestämma procentandelen av fagocytos.
5. in Vivo bakterier Clearance med P. aeruginosa
- Inokulera P. aeruginosa på en P. aeruginosa isolering agarplatta och inkubera plattan vid 37 ° C under natten. Inokulera den enda kolonin till 2 mL av lysogeny buljong (LB) och växa bakterier vid 37° C under natten. Beräkna den CFU, med följande formel.
CFU/mL = (antal kolonier x utspädningsfaktor) / volym av kultur plattan.
Späd kulturen med PBS att få den önska CFU/mL. - Prov 1, intratracheally injicera en subletala DOS ~2.5 x 105 CFU/mL P. aeruginosa sövda vildtyp (WT) och TRIM72KO möss, som anges i steg 4,2. Mäta kroppsvikt dagligen i 6 dagar.
- I rättegång 2, injicera en andra dos av P. aeruginosa (5 x 105 CFU/mL) i möss som överlevt i prov 1 och mäta kroppsvikt i 4 dagar.
- I prövning 3, använda en annan uppsättning möss, injicera WT och TRIM72KO möss med en dödlig dos (3 x 107 CFU/mL) av P. aeruginosa och registrera dödligheten inom 2 dagar efter injektion. Djur som visar tecken på svår stress såsom betydande viktminskning, kommer krökt rygg, anorexi eller dyspné att bedömas av behandlande veterinärer. Icke behandlingsbar djur kommer att offras omedelbart.
- Antingen vid död eller efter dödshjälp på dag 2 efter injektionen, samla hela-lungvävnad för kvantifiering av lung bakteriell bördan på peak infektion.
- Testa den bakteriella bördan som lungcancer, tillsätt 200 µL av fysiologisk koksaltlösning till lung vävnader och homogenisera dem, med en tidigare testade inställning på en elektronisk Homogenisatorer som helt stör lungvävnad utan att bryta bakterier. Justera den totala volymen av lung Homogenatet till 1 mL och platta 100 µL av lung lysate på Pseudomonas isolering agarplattor på 10-faldig seriespädningar.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C under 24 h och räkna de bakteriella kolonierna för att avgöra CFU per hela lungan.
6. statistisk analys
- Använd Student's t-test för att fastställa statistiska betydelsen av skillnaden mellan de två grupperna. Överväga en skillnaden statistiskt signifikant när p < 0,05. Alla data presenteras som betyder ± standardavvikelsen för medelvärdet (SEM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi först utfört experimentet för att analysera fagocytos av mus primära AMs. I hela alla analyser jämförde vi AMs isolerade från WT och TRIM72KO möss. Som visas i figur 1A, avslöjade fluorescensmikroskopi att fagocytos av FITC-glaspärlor av mus primära AMs inträffar efter 1 h inkubation. Figur 1 B visar analysen av fagocytos av flödescytometri. Kvantifiering av fagocytos mäts av Mikroskopi och flödescytometri är representerade i figur 1C och figur 1D, respektive. FcγR - och CR-medierad fagocytos av MH-S cellerna representeras i figur 2och figur 2B visar kvantifiering. Dessa resultat visar att uttrycket av TRIM72 i MH-S celler resulterade i en mer än femdubblades minskning komplement fagocytos. Representativa bilder av Alexa Fluor-488-konjugerad zymosan-en partikel intag av primära AMs isolerade från WT eller TRIM72KO möss visas i figur 2C, och kvantifiering presenteras i figur 2D . In vivo fagocytos resultat är representerade i figur 3. Figur 3 A visar differentiell färgning att identifiera närvaron av AMs och lymfocyter, neutrofiler, och god Jordbrukarsed+ Fagocytos celler. Procentandelen av BALF celler och kvantifiering av fagocytos är representerade i figur 3B och figur 3C, respektive. Procentandelen av viktminskning hos möss efter administrering av en subletala dos av P. aeruginosa intratrakeal visas i figur 4Aoch andelen överlevnad möss vid dag 2 efter en dödlig dos av P. aeruginosa är som anges i figur 4B. Figur 4 C visar ett spridningsdiagram för hela-lung bakteriell bördan på döden eller på dag 2 efter P. aeruginosa infektion hos möss.
Figur 1 : Fagocytos i mus primära alveolära makrofager. (A) representativa bilder av låg jämfört med hög phagocytic index visar primära AMs som innehåller grön fluorescerande pärlor (vänster); representativa bilder visar låga och höga procentsatser av fagocytos AMs. Pilar: låg phagocytic index AMs; pilspetsar: hög phagocytic index AMs. Skalstapeln = 25 µm för vänster två bilderna och 50 µm för just två bilder. (B) representant flöde flödescytometri detektion av phagocytizing celler i nr-pärlor kontroll, WT + pärlor och TRIM72KO + pärlor AMs. Barer define den pärla som innehåller cell befolkningen (i procent) och genomsnittlig fluorescence intensiteten (MFI). (C) statistik av genomsnittliga phagocytic index och procentandelen fagocytos AMs i WT och TRIM72KO AMs; n = 5 för båda grupper, *p < 0,05. (D) statistik flöde flödescytometri MFI och procentandelen av FITC+ celler i WT och TRIM72KO AMs; n = 3 för båda grupper, *p < 0,05. Denna siffra är omtryckt med tillåtelse av American Thoracic Society13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : FcγR - och CR-medierad fagocytos. (A) representativa bilder av opsonized får röda blodkroppar (SRBCs) fagocytos av MH-S celler. Pilarna pekar på vissa SRBCs. Skalstapeln = 25 µm. (B) Quantification av SRBCs fagocytos av MH-S celler överuttryck av TRIM72 (TRIM72OE) i närvaro av IgG (FcγR-medierad fagocytos) eller IgM (CR-medierad fagocytos); n = 6 för varje grupp, *p < 0,05 och **p < 0,005 jämfört med WT kontroll. (C) representativa bilder av Alexa Fluor-488-konjugerad zymosan partikel intag av primära AMs isolerade från WT eller TRIM72KO möss. Pilarna i panelen A och B anger zymosan + celler. Skalstapeln = 50 µm. (D) statistiska resultat av procentandelen zymosan-innehållande AMs; n = 3 för varje grupp, p > 0,05. Denna siffra är omtryckt med tillåtelse av American Thoracic Society13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Invivo fagocytos av P. aeruginosa GFP. (A) representativa bilder av bronkoalveolär lavage vätska (BALF) cell cytospin bilder från WT och TRIM72KO möss 1 h efter injektion av P. aeruginosa GFP. Kwik-Diff färgning identifierar AMs (stora, runda celler) och neutrofiler; GFP identifierar Fagocytos celler (vita pilar) och god Jordbrukarsed+ differential störningar kontrast (DIC) identifierar internaliserade GFP bakterier (svarta pilar) i AMs. Skala barer = 50 µm. (B) kvantifiering av procentandelen av AMs och neutrofiler i BALF av WT och TRIM72KO möss 1 h efter P. aeruginosa injektionen. (C) kvantifiering av procentandelen av fagocytos AMs i WT och TRIM72KO möss; n = 3 för varje grupp, *p < 0,05. Data presenteras som menar (± SEM). Denna siffra är omtryckt med tillåtelse av American Thoracic Society13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : In vivo bakterier clearance med P. aeruginosa (P.A.). (A), andelen viktminskning (B.W.) på naiva WT och TRIM72KO möss efter första intraperitoneal injektion av 2,5 x 105 CFU/mL PAO1 (en kliniska isolat av P. aeruginosa); n = 13 för WT (svarta fyrkanter), n = 8 för TRIM72KO (röda cirklar), *p < 0,05, **p < 0,005 jämfört med WT (B) andelen överlevnad vid dag 2 efter den 3 x 107 CFU/mL s. aeruginosa intraperitoneal injektion; n = 10 för WT (solid svart cirklar) och TRIM72KO (fast röda fyrkanter), *p < 0,05 för WT kontra TRIM72KO grupper. (C), en scatter plot av hela-lung bakteriell bördan på dag 2 av P. aeruginosa injektionen i WT och TRIM72KO. Den grå streckade linjen designerar den injicerade bakteriella dosen; ^ designerar möss som har dött. För WT kontra TRIM72KO grupper, p < 0,05. Denna siffra är omtryckt med tillåtelse av American Thoracic Society13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan du utför en gas exchange funktion, konfronterar lungan envist främmande partiklar, patogener och allergener. AMs ger den första försvarslinjen enligt deras huvuduppgift, nämligen fagocytos. AMs också samordna med andra immunceller förstöra patogener och i resolutionen av inflammation. Här, beskrivs vi metoder för att särskilt bedöma fagocytos av AMs isolerade från mus lungan. Det protokoll som presenteras i detta manuskript förklarar en detaljerad studie av fagocytos både in vivo och in vitro som också kan användas för att studera makrofag funktion och bakteriell clearance i andra organ.
Den beskrivna in vitro-fagocytos bygger på den enkla idén av ruvning serum-behandlade FITC pärlor eller opsonized SRBCs med odlade AMs att inleda fagocytos. Metoden innehåller steg av omfattande tvätt och Lys av nonphagocytized röda blodkropparna att minska bakgrunden. Försiktighet måste iakttas inte att lossa klibbade AMs. Tvättningen som involverar ACK lysis lösning bör ske inom 1 min, som en längre tvätt tid leder till Lys av makrofager.
Dessutom i bildanalys kännetecknas vi både procentandelen av phagocytizing celler och phagocytic index att få en heltäckande bild av funktionen AM fagocytos. Vi har också förklarat metoden att skilja mellan PRR-, FcγR- och CR-medierad fagocytos i murina makrofag MH-S cellinje. I samband med genetisk modulering är detta steg användbar när du försöker få mekanistiska insikter i specifika fagocytos gångstig som påverkades av mål genen manipulation.
Tidigare rapporter dokumenterade metoder för att utvärdera bakteriell upptaget; den mest anmärkningsvärda metoden är gentamicin protection assay14. I protokollet presenteras här, har vi också visat en tänkbar metod att mäta Invivo fagocytos. Det finns några viktiga faktorer som gör denna metod bättre jämfört med de tidigare publicerade metoderna. Den metod som beskrivs här innebär en intratrakeal injektion av P. aeruginosa GFP följt av differentiell färgning av BALF celler. Denna metod belyser användning av fluorescerande bakterier, vilket hjälper till att identifiera intagna bakterier inom fagocyter. Dessutom differentiell färgningen av BALF celler bidrar till att specifikt skilja AMs från andra immunceller i Invivo miljön fagocytos kapacitet och utvärdera olika fagocyter att rensa bakteriella relativa bidrag laster från lungan. En mindre begränsning med denna metod är att den kräver en noggrann intratrakeal administration att undvika variabiliteten mellan möss.
Vi förklarade vidare, metoden för att fastställa en P. aeruginosa bakterier clearance hos möss i samband med lunginflammation. För att karakterisera denna metod, vi bestämt viktminskning och dödlighet efter intratrakeal administrering av P. aeruginosa och används en kvantitativ analys för att fastställa bördan som lungcancer bakterier. Dödligheten är en viktig parameter att bedöma omfattande immunförsvaret av kroppen. Vi använde lung prover från detta experiment för att bedöma bakteriell bördan. Dock kan bakteriell bördan också bestämmas från lungan prover skördats inom 48h följande icke-dödlig dos av bakteriell injektion. Framgången av analysen kommer att fastställas genom en standardisering av tidpunkten för injektionen, kvaliteten på patogenen och dosen av injektion samt optimering av en homogenisering metod som helt stör lungan utan att bryta bakteriella cellmembranet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av grant R01HL116826 till X. Zhao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
| 2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
| 70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
| 96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
| Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
| C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
| Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
| DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
| Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
| FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
| GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
| Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
| High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
| Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
| Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
| Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
| MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
| rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
| rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
| Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
| Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
| sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
| Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |
References
- Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).
- Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease. Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).
- Broug-Holub, E., et al. Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival. Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).
- Knapp, S., et al. Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).
- Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).
- Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).
- Greenlee-Wacker, M. C. Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation. Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).
- Haslett, C. Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).
- Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).
- Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages. Current Protocols in Immunology. , CHAPTER: Unit-14.27 (2011).
- He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation. Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).
- Nagre, N., et al. Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Su, H., Chen, H., Jen, C. J. Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).
- Amiel, E., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression. Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).
- Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).
