Summary
Her rapporterer vi fælles metoder til at analysere funktionen fagocyterende murine alveolær makrofager og bakteriel clearance fra lungen. Disse metoder studere in vitro-fagocytose af fluorescein isothiocyanat perler og in vivo fagocytose af Pseudomonas aeruginosa grøn fluorescerende proteiner. Vi beskriver også en metode til at rydde P. aeruginosa i mus.
Abstract
Alveolær makrofager (AMs) bevogte den alveolære rum af lungen. Fagocytose af AMs spiller en afgørende rolle i forsvaret mod invaderende patogener, fjernelse af døde celler eller fremmede partikler, og i beslutningsforslaget af inflammatoriske respons og væv remodellering, processer der er medieret af forskellige overflade receptorer af AMs. Her rapporterer vi metoder til analyse af AMs ved hjælp af in vitro- og in vivo assays og eksperimenterende strategier til at skelne mellem den mønster anerkendelse receptor-, supplere receptor- og Fc gamma receptor-medieret fagocyterende funktion fagocytose. Endelig vil diskutere vi en metode til at etablere og karakterisere en P. aeruginosa lungebetændelse model i mus at vurdere bakteriel clearance in vivo. Disse assays repræsenterer de mest almindelige metoder til at evaluere AM funktioner og kan også bruges til at studere makrofag funktion og bakteriel clearance i andre organer.
Introduction
AMs er de store hjemmehørende fagocytter i alveolerne på den hvilende fase og en af de store aktører i medfødte immun svar gennem anerkendelse og internalisering af inhaleret patogener og fremmede partikler1,2. Det er blevet rapporteret, at AMs er afgørende for den hurtig clearance af mange pulmonal patogener som P. aeruginosa og Klebsiella lungebetændelse3,4, så en mangel i AM fagocytose resulterer ofte i luftvejene infektioner, såsom akut lungebetændelse, som forårsager højere dødelighed og sygelighed satser.
AMs også indlede medfødte inflammatoriske respons i lungen ved produktion af cytokiner og kemokiner såsom TNF-α og IL-1β, hvilke krydstale med andre celler af alveolær miljøet at producere kemokiner og rekruttere inflammatoriske neutrofiler, monocytter, og Adaptive immunceller i lunge5. For eksempel, hjælper IL-1β produceret af AMs til prime frigivelsen af den neutrofile chemokine CXCL8 fra epitelceller6. Derudover bidrage AMs til fagocytose af apoptotiske polymorfnukleære leukocytter (PMNs), hvilket fører til vedvarende udsivning af intracellulære enzymer fra PMNs manglende omkringliggende væv, resulterer i vævsskader og langvarig inflammation 7 , 8 , 9.
Fagocytose af AMs er medieret af en direkte anerkendelse af patogen-associeret molekylære mønstre på patogen overfladen af mønster anerkendelse receptorer (PRRs) af AMs eller ved binding af opsonized patogener med immun effektor receptorer af AMs 10. for sidstnævnte, AMs kan genkende mål opsonized med immunoglobulin (IgG) gennem deres Fcγ receptorer (FcγR) eller patogener belagt med supplement fragmenter, C3b og C3bi, gennem deres supplement receptorer (CR)11. Blandt supplement receptorer, CR af immunoglobulin superfamilien (CRIg) er selektivt udtrykt i væv makrofager12, og en nylig har konstateret fremhævet rollen, som CRIg i AM fagocytose i forbindelse med P. aeruginosa lungebetændelse 13.
Mange oprindelige undersøgelser bruge metoder til at vurdere makrofag fagocytose for at beskrive de molekylære mekanismer af makrofag funktion14,15. Metoder som in vivo fagocytose kræver imidlertid en præcis kvantificering af fagocytose. Her, vi opsummere en detaljeret metode til in vitro- og in vivo fagocytose ved hjælp af fluorescein isothiocyanat (FITC)-glas perler og P. aeruginosa grøn fluorescerende proteiner (NGL), henholdsvis. Derudover forklarer vi metode til skelne blandt PRR-, CR- og FcγR-medieret fagocytose. Endelig vil rapportere vi en metode til at karakterisere bakteriel clearance i mus med hensyn til P. aeruginosa lungebetændelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger retningslinjerne i den institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af østlige Virginia Medical School.
1. fluorescerende perler fagocytose
- Aflive mus (C57BL/6J, 6 uger gamle, kvindelige) af CO2 kvælning som pr IACUC protokoller for den etiske eutanasi af dyr.
- Lå musen mave-up på en dissektion bord dækket med papirservietter. Indkredse sine poter med dens lemmer spread-eagle og krog en streng under dens forreste tænder til at trække hovedet tilbage at luftrøret er placeret lige og niveau.
- Våd musens hals, bryst og mave med 70% ethanol til at desinficere og forhindre pels klistrer til værktøjer.
- Ved hjælp af regelmæssig pincet, trække op i huden på midterlinjen af kroppen, og skæres med en kirurgisk saks op midten til toppen af halsen.
- Brug den stumpe ende standard kirurgisk saks, omhyggeligt scenowe muskel og bindevæv på halsen og bruge foråret saks (microscissors) til at udsætte luftrøret.
- Gribende en brusk ring med pincet, omhyggeligt gør et lille snit (~1.5 mm), ved hjælp af microscissors, i ventrikel ansigtet af luftrøret og indsætte en 18 G kanyle ind i luftrøret.
- Forsigtigt lavage 3 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS), 1 mL ad gangen. Hver gang forsigtigt trække væsken ind i sprøjten og reinfuse den tilbage i lungen, 3 x i træk. Efter at indsamle BALF, udføre cervikal dislokation for at sikre aktiv dødshjælp. Overføre de indsamlede PBS (~2.8 mL), som er bronchoalveolar lavage væske (BALF), til et rør, der centrifugeres ved 1.000 x g i 10 min., og indsamle pelleten. Der tilsættes 1 mL frisk PBS til tube og centrifugeres ved 1.000 x g i 10 min. til vask af snavs og indsamle de pelleted alveolære makrofager.
- Resuspenderes i 2 mL af Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) med 10% nonheat-inaktiverede føtal bovint serum (FBS) og kultur primære alveolær makrofager i de samme medier i 2 dage på en glas-bund fad ved 37 ° C i en fugtig atmosfære.
- Opsug den gamle medier, vaske det med 1 mL PBS, og der tilsættes 2 mL frisk medier. Tilføje FITC perler (carboxylated latex perler, 2 µm i diameter, 50 perler/celle) og Inkuber i 1 time ved 37 ° C i en fugtig atmosfære.
- Vask grundigt med PBS (1 mL ad gangen, for i alt fem vasker) for at fjerne ekstracellulære perler. Billede 100 celler tilfældigt og tælle celler med intracellulære perler (488 nm).
Bemærk: Phagocytic indeks er antallet af indtagne perler divideret med det samlede antal af makrofager; procentdelen af fagocyterende celler er antallet af makrofager at indtager mindst én perle divideret med det samlede antal af makrofager16.- Alternativt, efter en 1 h inkubationen med perler, cellerne vaskes med 3 mL PBS og behandler dem til flowcytometri for kvantificering af fagocytose. Ligeledes behandle AMs uden perler som unstained celler eller celler, kontrol. Beregn procentdel positivitet og betyde fluorescens intensitet, ved hjælp af flow flowcytometri software, ved at vælge disse indstillinger i softwaren.
2. FcγR - og CR-medieret fagocytose
- For hjælp, der inkuberes 2 x 108 får røde blodlegemer (SRBCs) med 50 µL af kanin anti-SRBC-IgM eller 50 µL af kanin anti-SRBC-IgG i 30 min. ved stuetemperatur11.
- Inkuber IgM-opsonized SRBCs med 50 µL af C5-mangel (C5D) humant serum i 30 minutter ved 37 ° C for at løse supplement fragmenter C3b og C3bi på IgM-belagt SRBCs.
- Seed murine makrofager celler (MH-S celler) (10.000 celler/brønd) i en 96-brønd plade, og der inkuberes natten over for at få et ~ 70% sammenløb. Tilsæt 100 µL 1 x 107/mL opsonized SRBCs til hver brønd af MH-S celler og Inkuber i 1 time ved 37 ° C. Vask ubundne SRBCs meget hurtigt (~ 1 min) med 100 µL af ammoniumklorid-kalium (ACK) lysisbuffer.
- Lyse celler med 0,1% SDS og tilsæt 50 µL af 2,7-diaminofluorene (DAF) der indeholder 3% brintoverilte og 6 M urinstof. Absorbansen af hæmoglobin-katalyseret Fluoren blå dannelse på 620 nm.
- Bestem antallet af SRBCs ved hjælp af en standardkurve på 620 nm absorbans værdier med et kendt antal SRBCs. Tilsvarende proces Skadhauge cellerne inkuberes med nonopsonized SRBCs at bruge som negative kontroller.
3. PRR-medieret fagocytose
- Følg trin 1.1-1,9 til isolering og dyrkning af musen primære alveolær makrofager.
- Efter 2 dage, fjerne medier, cellerne vaskes med 1 mL PBS og tilsættes 500 µL af friske medier indeholdende Alexa Fluor-488-konjugeret zymosan-en bioparticles (100 partikler/parabol).
- Inkuber i 1 time ved 37 ° C. Stop fagocytose ved at tilføje 500 µL af iskold PBS.
- Cellerne vaskes grundigt med PBS (1 mL ad gangen, for i alt fem vasker). Fix cellerne med 4% PARAFORMALDEHYD i 10 min ved stuetemperatur.
- Cellerne vaskes grundigt med PBS (1 mL ad gangen, for i alt fem vasker) og holde cellerne i 500 µL af PBS.
- Billede celler under differential interferens kontrast og en fluorescerende kanal på 488 nm. Tælle AMs indeholdende zymosan-en bioparticles og bestemme procentdelen af fagocytose.
4. in Vivo fagocytose af alveolær makrofager
Bemærk: Podes P. aeruginosa normal god landbrugspraksis på et næringsstof agar plade og inkuberes plade ved 37 ° C natten over. Den næste dag, podes enkelt kolonien til 2 mL af næringsstof bouillon og vokse bakterier ved 37° C natten over.
- Den næste dag, bedøver mus med en intraperitoneal indgift af 100 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazin. Bekræfte ordentlig anesthetization via en mangel på reaktion på tå knivspids.
- Lægge musen på et fladt bræt med en elastik på tværs af de øverste fortænder og placere det i en semirecumbent (45°) position med den ventrale overflade og talerstol opad. Bruger buet pincet, delvist trække tungen. Ved hjælp af en microsprayer, intratracheally administrere 50 µL (5 x 106 kolonidannende enheder [CFU])17 af P. aeruginosa normal god landbrugspraksis i lungerne på de bedøvede mus.
- Efter 1 time af infektion, følge trin 1.1-1.7.
- Resuspend celler i PBS og cytocentrifuge dem (1.000 x g, 1 min. ved stuetemperatur) på et glas dias.
- Varierende pletten cytospin dias for alveolær makrofager, neutrofiler og lymfocytter, ifølge producentens anvisninger.
- Tilfældigt vælge 100 AMs, tælle AMs indeholdende intracellulære bakterier og bestemme procentdelen af fagocytose.
5. in Vivo bakterier regnskabsafslutningen ved hjælp af P. aeruginosa
- Podes P. aeruginosa på en P. aeruginosa isolation agar plade og inkuberes plade ved 37 ° C natten over. Podes enkelt kolonien til 2 mL lysogeny bouillon (LB) og vokse bakterier ved 37° C natten over. Beregne CFU, ved hjælp af følgende formel.
CFU/mL = (antal kolonier x fortyndingsfaktoren) / volumen af kultur plade.
Fortynd kultur med PBS til at få den ønskede CFU/mL. - I forsøg 1, intratracheally indsprøjte en subletale dosis af ~2.5 x 105 CFU/mL P. aeruginosa i bedøvede vildtype (WT) og TRIM72KO musene, som anført i trin 4.2. Måle kropsvægten dagligt i 6 dage.
- I forsøg 2, indsprøjtes en anden dosis af P. aeruginosa (5 x 105 CFU/mL) ind i musene at overlevet i forsøg 1 og måle kropsvægt i 4 dage.
- I forsøg 3, ved hjælp af et andet sæt af mus, injicere WT og TRIM72KO mus med en dødelig dosis (3 x 107 CFU/mL) af P. aeruginosa og optage dødeligheden senest 2 dage efter injektionen. Dyr, der viser tegn på alvorlig stress som væsentlig krop vægttab, vil krum ryg, anoreksi eller dyspnø blive vurderet af de behandlende dyrlæger. Uhelbredelige dyr ofres straks.
- Enten ved død eller efter eutanasi på dag 2 efter injektion, indsamle de hele lungevæv til kvantificering af lunge bakteriel byrde på peak infektion.
- For at teste den lunge bakterielle byrde, tilføje 200 µL af normale saltvand til lungevæv og homogeniseres dem, ved hjælp af en tidligere testet indstilling på en elektronisk homogeniseringsapparat, der helt forstyrrer lungevæv uden at bryde bakterier. Justere det samlede volumen af lunge homogenatet til 1 mL og pladen 100 µL af lunge lysate på Pseudomonas isolation agar plader på 10-fold serielle fortyndinger.
- Inkuber plader ved 37 ° C i 24 timer og kolonierne bakteriel Bestem CFU pr. hele lungen.
6. den statistiske analyse
- Bruge Student's t-test til at bestemme den statistiske signifikans af forskellen mellem de to grupper. Overveje en forskellen statistisk signifikant Hvornår p < 0,05. Alle data præsenteres som middel ± standardfejl af middelværdien (SEM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi uropført eksperiment for at analysere fagocytose af musen primære AMs. Hele alle analyser sammenlignede vi AMs isoleret fra WT og TRIM72KO mus. Som vist i figur 1A, afslørede Fluorescens mikroskopi at fagocytose af FITC-glasperler med musen primære AMs opstår efter 1 h inkubation. Figur 1 B viser analysen af fagocytose ved flowcytometri. Kvantificering af fagocytose målt ved mikroskopi og flowcytometri er repræsenteret i figur 1C og figur 1D, henholdsvis. FcγR - og CR-medieret fagocytose af MH-S celler er repræsenteret i figur 2A, og figur 2B viser kvantificering. Disse resultater viser, at udtryk for TRIM72 i MH-S celler resulterede i en mere end femdoblet nedgang i supplement fagocytose. Repræsentative billeder af Alexa Fluor-488-konjugeret zymosan-en partikel indtagelse af primære AMs isoleret fra WT eller TRIM72KO mus er vist i figur 2C, og kvantificering er præsenteret i figur 2D . In vivo fagocytose resultater er repræsenteret i figur 3. Figur 3 A viser differential farvning at identificere tilstedeværelsen af AMs, neutrofiler, og lymfocytter og normal god landbrugspraksis+ fagocyterende celler. Procentdelen af BALF celler og kvantificering af fagocytose er repræsenteret i figur 3B og figur 3C, henholdsvis. Procentdelen af kroppen vægttab i mus efter intratrakeal administration af en subletale dosis af P. aeruginosa er vist i figur 4A, og andelen af overlevelse af mus på dag 2 efter en dødelig dosis af P. aeruginosa fremgår af figur 4B. Figur 4 C viser en scatter plot for hele-lunge bakteriel byrde på død eller på dag 2 efter P. aeruginosa infektion i mus.
Figur 1 : Fagocytose i musen primære alveolær makrofager. (A) repræsentative billeder af lav versus høj phagocytic indeks viser primære AMs indeholdende grønne fluorescent perler (venstre); repræsentative billeder viser lave og høje procenter af fagocyterende AMs. Pile: lav phagocytic index AMs; pilespidser: højt phagocytic index AMs. Skalalinjen = 25 µm til venstre to billeder og 50 µm for de lige to billeder. (B) repræsentant trykforøgelsesanlæg flowcytometri påvisning af phagocytizing celler i no-beads kontrol, WT + perler og TRIM72KO + perler AMs. Barer udskriftsområdet perle-holdige celle befolkning (i procent) og den gennemsnitlige fluorescence intensitet (MFI). (C) statistikker over den gennemsnitlige phagocytic indeks og procentdelen af fagocyterende AMs i WT og TRIM72KO AMs; n = 5 for begge grupper, *p < 0,05. (D) statistikker af trykforøgelsesanlæg flowcytometri MFI og procentdelen af FITC+ celler i WT og TRIM72KO AMs; n = 3 for begge grupper, *p < 0,05. Dette tal er genoptrykt med tilladelse fra American Thoracic Society13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : FcγR - og CR-medieret fagocytose. (A) repræsentative billeder af opsonized får røde blodlegemer (SRBCs) fagocytose af MH-S celler. Pilene peger på nogle SRBCs. Skalalinjen = 25 µm. (B) Quantification af SRBCs fagocytose af MH-S celler overekspression TRIM72 (TRIM72OE) IgG (FcγR-medieret fagocytose) eller IgM (CR-medieret fagocytose); n = 6 for hver gruppe, *p < 0,05 og **p < 0,005 sammenlignet med WT kontrol. (C) repræsentative billeder af Alexa Fluor-488-konjugeret zymosan partikel indtagelse af primære AMs isoleret fra WT eller TRIM72KO mus. Pilene i panelet A og B angiver zymosan + celler. Skalalinjen = 50 µm. (D) statistiske resultater af procentdelen af zymosan-holdige AMs; n = 3 for hver gruppe, p > 0,05. Dette tal er genoptrykt med tilladelse fra American Thoracic Society13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: In vivo fagocytose af P. aeruginosa normal god landbrugspraksis. (A) repræsentative billeder af bronchoalveolar lavage væske (BALF) celle cytospin slides fra WT og TRIM72KO mus 1 h efter injektion af P. aeruginosa normal god landbrugspraksis. Kwik-Diff farvning identificerer AMs (store, runde celler) og neutrofile; Normal god landbrugspraksis identificerer fagocyterende celler (hvide pile) og normal god landbrugspraksis+ differential interferens kontrast (DIC) identificerer internaliseret normal god landbrugspraksis bakterier (sorte pile) i AMs. Skala barer = 50 µm. (B) kvantificering af procentdelen af AMs og neutrofile i BALF i WT og TRIM72KO mus 1 h efter P. aeruginosa injektion. (C) kvantificering af procentdelen af fagocyterende AMs i WT og TRIM72KO mus n = 3 for hver gruppe, *p < 0,05. Dataene præsenteres som mener (± SEM). Dette tal er genoptrykt med tilladelse fra American Thoracic Society13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : In vivo bakterier regnskabsafslutningen ved hjælp af P. aeruginosa (PA). (A) procentdelen af kroppen-vægttab (B.W.) af naive WT og TRIM72KO mus efter den første intraperitoneal injektion 2.5 x 105 CFU/mL PAO1 (en klinisk isolat af P. aeruginosa); n = 13 for WT (sorte firkanter), n = 8 for TRIM72KO (røde cirkler), *p < 0,05, **p < 0,005 sammenlignet med WT. (B) procentdelen af overlevelse på dag 2 efter 3 x 107 CFU/mL P. aeruginosa intraperitoneal injektion; n = 10 for WT (solid sorte cirkler) og TRIM72KO (solid røde firkanter), *p < 0,05 for WT versus TRIM72KO grupper. (C) en scatter plot af hele-lunge bakteriel byrde på dag 2 af P. aeruginosa injektion i WT og TRIM72KO. Den grå stiplede linje angiver den injicerede bakterielle dosis; ^ betegner mus, der er døde. For WT versus TRIM72KO grupper, p < 0,05. Dette tal er genoptrykt med tilladelse fra American Thoracic Society13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens de udfører en gas udveksling funktion, konfronterer lungen vedvarende fremmede partikler, patogener og allergener. AMs giver den første linje i forsvaret i kraft af deres hovedfunktion, nemlig fagocytose. AMs også koordinere med andre immunceller i ødelægger patogener og i løsningen af betændelse. Her, beskrevet vi metoder til konkret vurdering fagocytose af AMs isoleret fra mus lunge. Protokollen præsenteret i dette manuskript forklarer en detaljeret undersøgelse af fagocytose både in vivo og in vitro, som også kan bruges til at studere makrofag funktion og bakteriel clearance i andre organer.
Den beskrevne in vitro-fagocytose beror på den enkle idé af inkubere serum-behandlede FITC perler eller opsonized SRBCs med kulturperler AMs at indlede fagocytose. Denne metode omfatter trin af omfattende vask og lysis af nonphagocytized røde blodlegemer til at reducere baggrunden. Pleje skal tages ikke at løsrive de overholdt AMs. Vask skridt involverer ACK lysis løsning bør ske inden for 1 min, som en længere vask tid fører til lysering af makrofager.
Derudover i imaging ende kendetegnet vi både procentdelen af phagocytizing celler og phagocytic indeks til at få et overblik over AM fagocytose funktion. Vi har også forklaret metoden til at skelne mellem PRR-, FcγR- og CR-medieret fagocytose i murine makrofager Skadhauge cellelinie. I forbindelse med genetiske graduering er dette trin nyttigt, når du forsøger at få mekanistiske indblik på den specifikke fagocytose pathway, der blev ramt af genmanipulation mål.
Tidligere rapporter dokumenterede metoder til at evaluere den bakterielle optagelse; den mest bemærkelsesværdige metode er gentamicin beskyttelse assay14. I protokollen præsenteres her, har vi også vist en tænkelig metode til at måle in vivo fagocytose. Der er et par vigtige faktorer, der gør denne metode bedre i forhold til de tidligere udgivne metoder. Den metode beskrevet her indebærer en intratrakeal indsprøjtning af P. aeruginosa NGL efterfulgt af differential farvning af BALF celler. Denne metode fremhæver anvendelse af fluorescerende bakterier, som hjælper med at identificere indtaget bakterier i fagocytter. Derudover hjælper differential farvning af BALF celler at differentiere specifikt AMs fra andre immunceller i in vivo miljøet fagocyterende kapacitet og til at vurdere den relative bidrag af forskellige fagocytter at rydde bakterielle belastninger fra lungen. En mindre begrænsning af denne metode er, at det kræver en omhyggelig intratrakeal administration at undgå variabiliteten mellem mus.
Vi forklarede, metoden for at etablere en P. aeruginosa bakterier clearance i mus i forbindelse med lungebetændelse. For at karakterisere denne metode, vi bestemt organ vægttab og dødelighed efter intratrakeal administration af P. aeruginosa og anvendes en kvantitativ analyse til at bestemme den lunge bakterier byrde. Dødelighed er en vigtig parameter at vurdere det omfattende immunresponset i kroppen. Vi brugte lunge prøver fra dette eksperiment for at vurdere bakteriel byrde. Bakteriel byrde kan dog også bestemmes fra lunge prøver høstet inden for 48 timer efter ikke-dødelige dosis af bakteriel injektion. Succes i analysen vil blive bestemt af en standardisering af timingen af injektion, kvaliteten af patogenet og dosis af injektion, og optimering af en homogenisering metode, der helt forstyrrer lungen uden at bryde bakterielle cellens membran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes af grant R01HL116826 til X. Zhao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
| 2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
| 70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
| 96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
| Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
| C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
| Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
| DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
| Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
| FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
| GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
| Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
| High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
| Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
| Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
| Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
| MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
| rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
| rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
| Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
| Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
| sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
| Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |
References
- Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).
- Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease. Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).
- Broug-Holub, E., et al. Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival. Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).
- Knapp, S., et al. Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).
- Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).
- Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).
- Greenlee-Wacker, M. C. Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation. Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).
- Haslett, C. Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).
- Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).
- Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages. Current Protocols in Immunology. , CHAPTER: Unit-14.27 (2011).
- He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation. Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).
- Nagre, N., et al. Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Su, H., Chen, H., Jen, C. J. Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).
- Amiel, E., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression. Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).
- Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).
