Summary
כאן אנחנו מדווחים על שיטות נפוצות כדי לנתח את הפונקציה phagocytic של מקרופאגים מכתשי מאתר ואישור חיידקים מן הריאות. שיטות אלה לומדים phagocytosis במבחנה של חרוזים isothiocyanate fluorescein ו- phagocytosis ויוו של Pseudomonas aeruginosa חלבון פלואורסצנטי ירוק. אנו גם מתארים שיטה לניקוי aeruginosa פ בעכברים.
Abstract
עיצור מכתשי, מקרופאגים (AMs) השומרים את החלל מכתשי של הריאה. Phagocytosis מאת AMs משחק תפקיד קריטי בהגנה נגד הפולשים פתוגנים, הסרת תאים מתים או חלקיקים זרים, ומעבד בהחלטה תגובות דלקתיות ושחזור רקמות, מתווכת על ידי רצפטורים משטח שונים של AMs. כאן, אנחנו מדווחים שיטות לניתוח של הפונקציה phagocytic של AMs באמצעות מבחני במבחנה, ויוו ואסטרטגיות ניסיוני כדי להבדיל בין דפוס זיהוי הקולטן-, המשלים קולטן-Fc גמא קולטן בתיווך phagocytosis. לבסוף, נדון שיטה ליצירה ולקביעת לאפיין את מודל דלקת ריאות aeruginosa פ בעכברים כדי להעריך ויוו חיידקי סיווג. מבחני אלה מייצגים את השיטות הנפוצות להערכת AM פונקציות, יכול לשמש גם ללמוד מקרופאג פונקציה ו סיווג חיידקי באיברים אחרים.
Introduction
AMs הינם phagocytes תושב הגדולות ב alveoli השלב מנוחתו, אחד השחקנים הראשיים של תגובות מערכת החיסון המולדת דרך ההכרה, הפנמה של פתוגנים בשאיפה וחלקיקים זרים1,2. בעבר דווח כי AMs הם חיוניים עבור פינוי מהיר של פתוגנים ריאתי רבים כגון aeruginosa פ ודלקת ריאות קלבסיאלה3,4, אז חוסר AM phagocytosis לעתים קרובות התוצאות הנשימה זיהומים, כגון דלקת ריאות חריפה, הגורמים שיעור גבוה של תמותה ותחלואה קרדיווסקולרית.
AMs גם ליזום תגובות דלקתיות מולדת בריאה על ידי ייצור ציטוקינים ו נוגדנים כגון TNF-α ו- IL-1β, אשר crosstalk עם תאים אחרים של הסביבה מכתשי לייצר נוגדנים, לגייס נויטרופילים דלקתיות, ומונוציטים, ו תאים חיסוניים מסתגלת ב- ריאות5. לדוגמה, IL-1β המיוצר על ידי AMs מסייעת פריים לשחרור נויטרופילים כימוקין CXCL8 לתאי האפיתל6. יתר על כן, AMs לתרום phagocytosis אפופטוטיים להיפגע אורך חייהם יצירת לויקוציטים (PMNs), כשל של כשבסופו לדליפת מתמשכת של אנזימים תאיים מ PMNs הרקמה שמסביב, והתוצאה היא נזק לרקמות, דלקת ממושכת 7 , 8 , 9.
Phagocytosis מאת AMs מתווך על ידי הכרה ישירה של פתוגן-הקשורים דפוסי מולקולרית על פני השטח הפתוגן קולטני זיהוי דפוס (PRRs) של AMs או על ידי האיגוד של פתוגנים opsonized עם אפקטור החיסון רצפטורים של AMs 10. עבור האחרון, AMs יכול לזהות את המטרות opsonized עם אימונוגלובולינים (IgG) דרך רצפטורים Fcγ שלהם (FcγR) או פתוגנים מצופה המשלים שברים, C3b, C3bi, דרך רצפטורים המשלים שלהם (CR)11. בין רצפטורים המשלים, הכי טובים ביותר של superfamily אימונוגלובולינים (CRIg) מתבטאת באופן סלקטיבי רקמות מקרופאגים12, והדגשתי ממצא האחרונות בתפקיד CRIg ב AM phagocytosis בהקשר של דלקת ריאות aeruginosa פ 13.
מחקרים מקוריים רבים להשתמש בשיטות להעריך מקרופאג phagocytosis כדי לתאר את המנגנונים המולקולריים של מקרופאג פונקציה14,15. עם זאת, שיטות כמו phagocytosis ויוו לדרוש כימות מדויק של phagocytosis. כאן, אנו מסכמים מתודולוגיה מפורט phagocytosis ויוו והן במבחנה באמצעות fluorescein isothiocyanate (FITC)-זכוכית חרוזים, חלבון פלואורסצנטי aeruginosa פ ירוק (GFP), בהתאמה. עוד, נסביר את שיטת המבדילים בין PRR - CR-, בתיווך FcγR phagocytosis. בסופו של דבר, אנחנו מדווחים על שיטה לאפיון סיווג חיידקי עכבר ביחס פ aeruginosa דלקת ריאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה עוקב אחר הקווים המנחים של טיפול בעלי חיים מוסדיים ושל שימוש הוועדה (IACUC) של הספר לרפואה במזרח וירג'יניה.
1. פלורסנט חרוזים Phagocytosis
- המתת חסד העכבר (C57BL/6J, בן, 6 שבועות נקבה) על ידי חנק2 CO לפי IACUC פרוטוקולים עבור המתת החסד האתית של בעלי חיים.
- הנח העכבר הפאזלים על קרש חיתוך מכוסה מגבות נייר. לרתק כפותיו אבריה פרוש לעשוק מחרוזת תחת השיניים הקדמיות כדי להוציא את הראש שלו חזרה, כך קנה הנשימה ממוקם ישר ורמת שלה.
- להרטיב את הגרון של העכבר, החזה, הבטן עם 70% אתנול כדי לחטא ולמנוע את הפרווה נדבקת על הכלים.
- בעזרת מלקחיים רגיל, תמשוך בעור האמצע של הגוף, לגזור עם מספריים כירורגיים עד האמצע לחלק העליון של הגרון.
- באמצעות הצד הקהה של מספריים כירורגיים סטנדרטי, בזהירות להזיז משם את השריר ורקמות על הגרון, להשתמש במספריים האביב (microscissors) כדי לחשוף את קנה הנשימה.
- כשתפסת טבעת סחוס עם המלקחיים, עושים חתך קטן (~1.5 מ מ), באמצעות microscissors, על פני החדר של קנה הנשימה ובזהירות להוסיף של 18 גרם בצינורית לתוך קנה הנשימה.
- בעדינות שטיפה 3 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS), 1 מ"ל בכל פעם. בכל פעם למשוך בעדינות את הנוזל לתוך מזרק reinfuse אותו בחזרה לתוך הריאות, x 3 ברצף. לאחר איסוף של BALF, לבצע פריקה צוואר הרחם כדי להבטיח המתת חסד. להעביר את PBS שנאספו (~2.8 מ"ל), שהוא נוזל שטיפה bronchoalveolar (BALF), צינור, צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 10 דקות, ולאסוף את גלולה. להוסיף 1 מ"ל של PBS טריים שפופרת ואת צנטריפוגה ב x 1000 g 10 דקות לשטוף את ההריסות ולאסוף את המקרופאגים מכתשי pelleted.
- Resuspend בגדר ב mL 2 בינוני הנשר של Dulbecco ששונתה (DMEM) עם 10% nonheat-לא פעיל העובר שור סרום (FBS) ו מקרופאגים מכתשי ראשי תרבות בתקשורת אותו במשך יומיים על צלחת זכוכית-התחתון על 37 ° C באווירה humidified.
- וארוקן את המדיה הישנה, לשטוף אותו עם 1 מ"ל ל- PBS, ולהוסיף 2 מ"ל של מדיה חדשה. להוסיף חרוזים FITC (חרוזים לטקס carboxylated, 2 מיקרומטר בקוטר 50 חרוזים/תא), תקופת דגירה של h 1 ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified.
- לשטוף בהרחבה עם PBS (1 מ"ל בו-זמנית, עבור סכום כולל של חמישה שוטף) כדי להסיר את החרוזים חוץ-תאית. תמונה 100 תאים באופן אקראי ולספור את התאים עם חרוזים תאיים (488 ננומטר).
הערה: אינדקסים Phagocytic הם מספר חרוזים בלע מחולק על ידי המספר הכולל של מקרופאגים; האחוז של תאים phagocytic הוא המספר של מקרופאגים זה להבלע חרוז אחד לפחות לחלק את המספר הכולל של מקרופאגים16.- לחלופין, לאחר דגירה 1 h עם חרוזים, לשטוף את התאים עם 3 מ"ל של PBS, לעבד אותם עבור cytometry זרימה עבור כימות של phagocytosis. בדומה לכך, תהליך AMs בלי חרוזים כמו תאים וללא רבב או תאים שליטה. לחשב את הגישה החיובית אחוז ואני מתכוון עוצמת קרינה פלואורסצנטית, באמצעות תוכנה cytometry זרימה, על-ידי בחירת אפשרויות אלה התוכנה.
2. FcγR ו- CR-בתיווך Phagocytosis
- עבור opsonization, דגירה 2 x 108 כבשים תאי דם אדומים (SRBCs) עם 50 µL של הארנב anti-SRBC-IgM או µL 50 של ארנב anti-SRBC-אג למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר11.
- דגירה IgM-opsonized SRBCs עם µL 50 של C5 לקויה (C5D) בנסיוב אדם למשך 30 דקות ב 37 ° C כדי לתקן את השברים המשלים C3b, C3bi על SRBCs מצופים IgM.
- זרע תאי מקרופאג מאתר (MH-S תאים) (10,000 תאים טוב) לתוך צלחת 96-ובכן דגירה לילה כדי לקבל זרימה ~ 70%. להוסיף 100 µL של עונה 1 פרק 107/mL opsonized SRBCs על כל טוב של תאים MH-S, תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס. שטיפה לא מאוגדים SRBCs מהר מאוד (~ 1 דקות) עם 100 µL אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK) פירוק המאגר.
- Lyse התאים עם 0.1% מרחביות ולהוסיף 50 µL של 2, 7-diaminofluorene (הדף היומי) המכילה מי חמצן 3%, אוריאה 6 מ'. למדוד את ספיגת של היווצרות מזורז-המוגלובין fluorene הכחול-620 ננומטר.
- לקבוע את מספר SRBCs באמצעות עיקול רגיל ב- nm 620 ספיגת ערכים עם מספר ידוע של SRBCs. באופן דומה, תהליך MH-S תאי הדגירה עם SRBCs nonopsonized להשתמש כפקדים שלילי.
3. PRR בתיווך Phagocytosis
- בצעו את צעדים 1.1-1.9 הבידוד, culturing של העכבר הראשי מכתשי מקרופאגים.
- לאחר יומיים, מסיר את המדיה, לשטוף את התאים עם 1 מ"ל ל- PBS, וכן להוסיף 500 µL של המדיה טריים המכילה bioparticles zymosan-A עבור חיל הים אלקסה-488-מצומדת (חלקיקים 100/תבשיל).
- תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס. לעצור את phagocytosis על-ידי הוספת µL 500 ל- PBS קר כקרח.
- לשטוף את התאים בהרחבה עם PBS (1 מ"ל בו-זמנית, עבור סכום כולל של חמישה שוטף). לתקן את התאים עם 4% paraformaldehyde 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את התאים בהרחבה עם PBS (1 מ"ל בו-זמנית, עבור סכום כולל של חמישה שוטף) ולשמור את התאים ב- 500 µL ל- PBS.
- תמונה התאים תחת התערבות דיפרנציאלית ניגודיות וכן ערוץ פלורסנט-488 ננומטר. לספור AMs המכיל bioparticles zymosan-A, לקבוע את אחוזי phagocytosis.
4. in Vivo Phagocytosis על ידי מקרופאגים מכתשי
הערה: לחסן aeruginosa פ GFP על צלחת אגר מזין, דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ביום הבא, לחסן את המושבה יחיד 2 מ ל מרק מזין ולגדול החיידק ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- למחרת, עזים ומתנגד עכברים עם ממשל בקרום הבטן של 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 10 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים. לאשר ההרדמה המתאים באמצעות חוסר התגובה ה"צביטה הבוהן.
- להניח את העכבר על לוח שטוח עם גומייה מעבר החותכות העליונות ולמקם אותו בעמדה semirecumbent (45 מעלות) עם גחוני ואת פניו פונה כלפי מעלה. באופן חלקי באמצעות מלקחיים מעוקל, משכי הלשון. שימוש microsprayer, intratracheally לנהל 50 µL (5 x 106 המושבה יוצרי יחידות [CFU])17 פ aeruginosa GFP לתוך הריאות של העכברים anesthetized.
- לאחר h 1 לזיהום, בצע את שלבים 1.1-1.7.
- Resuspend התאים PBS, cytocentrifuge אותם (1,000 x גרם, 1 דקות בטמפרטורת החדר) על זכוכית.
- כתם באופן שונה את השקופיות cytospin מקרופאגים מכתשי, נויטרופילים של לימפוציטים, על פי הוראות היצרן.
- באופן אקראי בחר 100 AMs, לספור את AMs המכיל חיידקים תאיים, לקבוע את אחוזי phagocytosis.
5. in Vivo חיידקים באמצעות סיווג aeruginosa פ
- לחסן aeruginosa פ על צלחת אגר פ aeruginosa בידוד, דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לחסן את המושבה יחיד 2 מ ל מרק lysogeny (LB), לגדל את החיידקים ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לחשב את CFU, באמצעות הנוסחה הבאה.
CFU/מ"ל = (מספר מושבות x פקטור דילול) / אמצעי האחסון של צלחת תרבות.
לדלל את התרבות עם PBS להשיג את הרצוי CFU/mL. - 1 משפט, intratracheally מזריקים מנה לא קטלני של ~2.5 x 105 CFU/mL aeruginosa פ לתוך ומורדמת פראי-סוג (WT) ו- TRIM72קו עכברים, כאמור בשלב 4.2. מודדים את משקל הגוף מדי יום במשך 6 ימים.
- 2 משפט, מזריקים מנה שנייה של פ aeruginosa (5 x 105 CFU/mL) לתוך העכברים זה שרד ניסיון 1 ולמדוד את משקל הגוף במשך 4 ימים.
- 3 משפט, באמצעות קבוצה שונה של עכברים, להזריק WT ו- TRIM72קו עכברים עם מנה קטלנית (3 x 107 CFU/mL) של aeruginosa פ ולהקליט את התמותה בתוך 2 ימי של הזרקת. חיות מראה סימנים של לחץ קשה כגון ירידה במשקל גוף משמעותי, הגב הכפוף, אנורקסיה או קוצר נשימה ייבחנו על ידי הוטרינרים המטפל. חיות חשוכת יוקרב מיד.
- מוות או לאחר המתת חסד-יום 2 אחרי הזריקה, לאסוף את הרקמה כולה-לונג על כימות של הנטל ריאות חיידקית-שיא זיהום.
- כדי לבדוק את הנטל ריאות חיידקית, להוסיף 200 µL של תמיסת לרקמות ריאות, homogenize אותם, שימוש בהגדרה נבדקו בעבר על מהמגן אלקטרונית זה משבש לחלוטין רקמת הריאה בלי לשבור את החיידקים. התאם את הנפח הכולל של homogenate הריאות כדי µL 100 מ ל 1 וצלחת של הריאות lysate על פלטות אגר בידוד Pseudomonas -דילולים טורי 10-fold.
- דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה, לספור מושבות חיידקים כדי לקבוע את CFU לכל כל הריאה.
6. ניתוח סטטיסטי
- השתמש הסטודנט t-test כדי לקבוע את משמעות ההבדל בין שתי הקבוצות הסטטיסטיות. שקול הבדל משמעותי סטטיסטית כאשר p < 0.05. כל הנתונים מוצגים כפי שאומר ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנחנו בוצע לראשונה את הניסוי כדי לנתח phagocytosis על ידי העכבר הראשי AMs. לאורך כל הבדיקות, השווינו AMs מבודד מןKO עכברים WT ו- TRIM72. כפי שמוצג באיור 1א, פלורסצנטיות מיקרוסקופ חשף את phagocytosis מחרוזי זכוכית FITC על ידי העכבר AMs העיקרית מתרחשת אחרי h 1 של דגירה. איור 1 B מציגה הניתוח של phagocytosis באמצעות cytometry זרימה. כימות של phagocytosis נמדד על ידי מיקרוסקופ, cytometry זרימה מיוצג באיור 1C ואיור 1D, בהתאמה. FcγR ו- CR-בתיווך phagocytosis על ידי תאים MH-S מיוצג באיור 2א, ומציג איור 2B כימות. תוצאות אלו מראות כי הביטוי של TRIM72 בתאים MH-S, גרמו לירידה יותר עושי phagocytosis המשלים. להחליפן בתמונות של חלקיקים zymosan-A עבור חיל הים אלקסה-488-מצומדת בליעה על ידי ראשי AMs מבודד מןKO עכברים WT או TRIM72 מוצגים באיור 2C, כימות מוצגת באיור 2D . תוצאות phagocytosis in vivo מיוצגים באיור3. איור 3 א מראה דיפרנציאלית צביעת זיהוי הנוכחות של AMs, נויטרופילים, ו לימפוציטים ותאים GFP+ phagocytic. האחוז של תאים BALF, כימות של phagocytosis מיוצג באיור 3B ואיור 3Cבהתאמה. האחוז של ירידה במשקל הגוף בעכברים לאחר מתן של intratracheal של מנה לא קטלני של aeruginosa פ מוצג באיור 4A, אחוז ההישרדות של עכברים-יום 2 אחרי מנה קטלנית של aeruginosa פ שצוינו 4B איור. איור 4 ג מראה מגרש פיזור על העול חיידקי כל-לונג על מוות או יום 2 לאחר ההדבקה aeruginosa פ בעכברים.
איור 1 : Phagocytosis ב מקרופאגים מכתשי העיקרי העכבר. (א) להחליפן בתמונות של נמוך לעומת אינדקסים phagocytic גבוהה מציג AMs ראשי המכילה חרוזים ירוקים fluorescent (משמאל). נציג תמונות מציג אחוזי phagocytic AMs נמוך וגבוה. חצים: נמוך phagocytic אינדקס AMs; ראשי חץ: phagocytic הגבוה במדד AMs. סרגל קנה מידה = מיקרומטר 25 עבור שתי תמונות שמאל ו- 50 מיקרומטר עבור שתי תמונות. (B) נציג flow cytometry הזיהוי של phagocytizing תאים לא-חרוזים השליטה, WT + חרוזים, TRIM72קו + חרוזים AMs. האוכלוסייה תא define המכילים חרוז ברים (באחוזים) לבין עוצמת fluorescence רשע (MFI). (ג) נתונים סטטיסטיים של מדד phagocytic הממוצע ואת אחוז AMs phagocytic ב WT ו- AMsקו TRIM72; n = 5 לשתי הקבוצות, *p < 0.05. (ד) הסטטיסטיקה של flow cytometry MFI ואת אחוז התאים FITC+ ב WT ו- AMsקו TRIM72; n = 3 לשתי הקבוצות, *p < 0.05. איור זה הוא הודפס מחדש באישור של האגודה האמריקנית בית החזה13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : FcγR ו- CR-בתיווך phagocytosis. (א) להחליפן בתמונות של כבשים opsonized כדוריות דם אדומות (SRBCs) phagocytosis על ידי תאים MH-S. החצים הצבע קצת SRBCs. סרגל קנה מידה = 25 Quantification של SRBCs phagocytosis מיקרומטר. (B) על ידי תאים MH-S overexpressing TRIM72 (TRIM72OE) בנוכחות IgG (phagocytosis בתיווך FcγR) או IgM (phagocytosis בתיווך CR); n = 6 עבור כל קבוצה, * 0.05 <p ו * *p < 0.005 לעומת WT שליטה. (ג) להחליפן בתמונות של אלקסה עבור חיל הים-488-מצומדת zymosan בליעה החלקיקים על ידי ראשי AMs מבודד מןKO עכברים WT או TRIM72. החיצים בלוח A ו- B מציינים zymosan + תאים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (D) סטטיסטי תוצאות של האחוז zymosan המכילים AMs; n = 3 עבור כל קבוצה, p > 0.05. איור זה הוא הודפס מחדש באישור של האגודה האמריקנית בית החזה13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ויוו phagocytosis של aeruginosa פ GFP. (א) תמונות נציג של bronchoalveolar שטיפה נוזל (BALF) תא cytospin שקופיות מחלוקה WT ו- TRIM72קו עכברים h 1 לאחר ההזרקה של aeruginosa פ GFP. צביעת Kwik-דיפ מזהה AMs (גדול, עגול תאים) ואת נויטרופילים; GFP מזהה תאים phagocytic (החצים הלבנים) ומזהה GFP+ התערבות דיפרנציאלית ניגודיות (DIC) חיידקים GFP למביטה (חיצים שחורים) ב AMs. פסי בקנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) כימות אחוזי AMs ו נויטרופילים בעכברים BALF של WT ו- TRIM72קו 1 h לאחר הזריקה aeruginosa פ . (ג) כימות אחוזי AMs phagocytic בעכברים WT ו- TRIM72קו ; n = 3 עבור כל קבוצה, *p < 0.05. הנתונים מוצגים אומר (± SEM). איור זה הוא הודפס מחדש באישור של האגודה האמריקנית בית החזה13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : חיסול חיידקים In vivo באמצעות פ aeruginosa (כריזה). (א) האחוז של הגוף (B.W.) במשקל של תמים WT ו- TRIM72קו עכברים לאחר הזריקה הראשונה בקרום הבטן של 2.5 10x5 PAO1 CFU/mL (בידוד קליני של aeruginosa פ); n = 13 עבור WT (ריבועים שחורים), n = 8 עבור TRIM72KO (עיגולים אדומים), *p < 0.05, * *p < 0.005 לעומת WT. (B) את אחוזי הישרדות-יום 2 אחרי 3 x 107 CFU/mL פ aeruginosa הזרקת בקרום הבטן; n = 10 WT (עיגולים שחור מוצק), TRIM72KO (ריבועים אדומים מוצק), *p < 0.05 עבור WT לעומת TRIM72KO קבוצות. (ג) A עלילה פיזור של הנטל חיידקי כל-לונג-יום 2 של הזריקה aeruginosa פ ב WT ו- TRIM72קו. הקו המקווקו אפור מייעד את המינון חיידקי מוזרק; ^ מייעד העכברים שמתו. עבור WT לעומת TRIM72 קבוצותKO , p < 0.05. איור זה הוא הודפס מחדש באישור של האגודה האמריקנית בית החזה13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תוך כדי ביצוע פונקציה חילופי גז, הריאה בהתמדה מתעמת עם חלקיקים זרים, פתוגנים, אלרגנים. AMs לספק את השורה הראשונה של הגנה מכוח תפקידם העיקרי, כלומר phagocytosis. AMs גם לתאם עם תאים חיסוניים אחרים להרוס פתוגנים, הרזולוציה של דלקת. כאן, אנחנו תיאר שיטות להערכת במיוחד phagocytosis מאת AMs מבודד מן הריאות העכבר. פרוטוקול שהוצגו בכתב יד זה מסביר מחקר מפורט של phagocytosis ויוו והן במבחנה, אשר יכול לשמש גם כדי לחקור את תפקוד מקרופאג ואת הסיווג חיידקי באיברים אחרים.
Phagocytosis במבחנה תיאר מסתמך על רעיון פשוט המקננת שטופלו סרום חרוזים FITC או opsonized SRBCs עם AMs בתרבית ליזום phagocytosis. שיטה זו כוללת צעדים של כביסה מקיף את פירוק של nonphagocytized RBCs לצמצום את הרקע. חייבים להקפיד לא לנתק את AMs מודבקת. הצעד שטיפת מעורבים ACK פירוק פתרון צריך להיעשות בתוך 1 דקות, כמו כביסה יותר זמן מוביל פירוק של המקרופאגים.
בנוסף, בניתוח הדמיה, אנחנו מאופיין האחוז של תאים phagocytizing והן את האינדקס phagocytic כדי לקבל תצוגה מקיפה של הפונקציה phagocytosis AM. גם הסברנו את השיטה כדי להבדיל בין PRR - FcγR-, בתיווך CR phagocytosis ב מקרופאג מאתר שורת התאים MH-S. בשילוב עם אפנון גנטי, השלב זה שימושי כאשר מנסים להשיג תובנות מכניסטית על מסלול מסוים phagocytosis שהושפעו מניפולציה ג'ין היעד.
בדו"חות קודמים תיעדו שיטות להערכת תפיסה חיידקי; השיטה הבולטים היא גנטמיצין הגנה assay14. בפרוטוקול המובאת כאן, אנחנו הראו גם שיטת הדמיה כדי למדוד phagocytosis ויוו. ישנם מספר גורמים מרכזיים, ההופכות שיטה זו יותר לעומת השיטות שפורסמו בעבר. השיטה המתוארת כאן כרוכה זריקה intratracheal של GFP aeruginosa פ ואחריו מכתים דיפרנציאלית של תאים BALF. שיטה זו מדגיש את השימוש פלורסנט חיידקים, אשר מסייע לזהות חיידקים בלע בתוך phagocytes. בנוסף, ההכתמה דיפרנציאלית של תאים BALF מסייעת להבחין באופן ספציפי את יכולת phagocytic של AMs של תאים חיסוניים אחרים בסביבה ויוו, כדי להעריך את התרומה היחסית של phagocytes שונים כדי לנקות את בקטריאלי . תדחפי אותו לתוך הריאות. מגבלה מינור של שיטה זו הוא כי הוא דורש ניהול זהיר intratracheal כדי להימנע השתנות בין עכברים.
עוד, הסברנו את השיטה כדי ליצור סיווג חיידקים aeruginosa פ בעכברים בהקשר של דלקת ריאות. כדי לאפיין בשיטה זו, אנו נחוש את הירידה במשקל הגוף ואת התמותה לאחר מתן של intratracheal של aeruginosa פ , לקביעת assay כמותית של הנטל חיידקים ריאות. התמותה היא פרמטר חשוב כדי להעריך את התגובה החיסונית מקיף של הגוף. השתמשנו ריאות דגימות הניסוי הזה כדי להעריך את הנטל חיידקי. עם זאת, נטל חיידקי יכול להיקבע גם מדגימות ריאות שנקטפו בתוך 48 שעות לאחר קטלניים במינון של הזרקת חיידקים. ההצלחה של וזמינותו ייקבעו על ידי סטנדרטיזציה העיתוי של הזריקה, האיכות של המחלה, את המינון של הזרקת, אופטימיזציה של פעולת שירות המגון לחלוטין משבש את הריאה מבלי לשבור את בקטריאלי קרום התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמך על ידי מענק R01HL116826 X. Zhao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
| 2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
| 70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
| 96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
| Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
| C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
| Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
| DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
| Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
| FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
| GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
| Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
| High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
| Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
| Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
| Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
| MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
| rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
| rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
| Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
| Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
| sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
| Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |
References
- Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).
- Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease. Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).
- Broug-Holub, E., et al. Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival. Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).
- Knapp, S., et al. Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).
- Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).
- Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).
- Greenlee-Wacker, M. C. Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation. Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).
- Haslett, C. Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).
- Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).
- Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages. Current Protocols in Immunology. , CHAPTER: Unit-14.27 (2011).
- He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation. Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).
- Nagre, N., et al. Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Su, H., Chen, H., Jen, C. J. Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).
- Amiel, E., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression. Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).
- Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).
