Summary
Burada fare alveoler makrofajlar ve akciğer üzerinden bakteriyel Temizleme fagositik işlevi analiz etmek için ortak yöntemleri raporu. Bu yöntemler floresein isothiocyanate boncuk tüp bebek fagositoz ve Pseudomonas aeruginosa yeşil flüoresan protein içinde vivo fagositoz çalışma. Biz de P. aeruginosa farelerde temizlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Alveoler makrofajlar (AMs) akciğer alveoler alan koru. Fagositoz AMs tarafından istila karşı patojenler, ölü hücreleri veya yabancı parçacıklar kaldırılmasını savunmak için kritik bir rol oynamaktadır ve inflamatuar yanıt ve doku remodeling çözünürlüğünde, işler bu tarafından çeşitli yüzey reseptörlerinin aracılı AMs. Burada, desen tanıma reseptör-, Kompleman reseptör- ve Fc gama reseptör aracılı arasında ayırt etmek için tüp bebek ve içinde vivo deneyleri ve deneysel stratejiler kullanarak AMs fagositik fonksiyonu analizi için yöntemler raporu fagositoz. Son olarak, biz bir yöntem oluşturmak ve P. aeruginosa pnömoni manken bakteriyel yetkisi içinde vivo değerlendirmek farelerde karakterize tartışıyorlar. Bu deneyleri AM işlevleri değerlendirmek için en yaygın yöntemleri temsil ve makrofaj işlevi ve diğer organlarda bakteriyel Temizleme çalışması için de kullanılabilir.
Introduction
AMs büyük ikamet fagositler alveoller içinde dinlenme sahne ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtı tanıma yoluyla büyük oyuncular ve inhale patojenler ve yabancı parçacıklar1,2içselleştirilmesi vardır. Bu yüzden AM fagositoz bir eksikliği genellikle solunum içinde sonuçları AMs P. aeruginosa ve Klebsiella zatürre3,4gibi birçok akciğer patojenlerin hızlı geçiş izni için gerekli olan bildirilmiştir yüksek mortalite ve morbidite oranları neden enfeksiyonlar, akut pnömoni gibi.
AMs Ayrıca akciğer doğuştan gelen inflamatuar yanıt sitokinler ve TNF-α ve IL-1β, hangi crosstalk kemokinler üretmek ve inflamatuar nötrofil, monosit, askere alveoler çevrenin diğer hücrelerle gibi kemokinler üreterek başlatmak ve edinilmiş bağışıklık hücreleri akciğer5. Örneğin, IL-1β AMs tarafından üretilen nötrofil Kemokin CXCL8 yayın epitel hücreleri6hazırlamak için yardımcı olur. Ayrıca, hücre içi enzimler sürekli kaçağı neden PMNs gelen başarısızlık çevreleyen doku, doku hasarı sonucu ve uzun süreli iltihap fagositoz apoptotik polimorfonükleer lökositlerin (PMNs), AMs katkıda 7 , 8 , 9.
AMs tarafından fagositoz yanında kalıplarının patojen ilişkili moleküler patojen yüzeyi AMs desen tanıma reseptörleri (PRRs) veya opsonized patojenler bağlama AMs bağışıklık efektör reseptörleri ile doğrudan bir Tanıma aracılık ettiği 10. için ikinci, AMs immünglobulin (IgG) ile opsonized hedefleri onların Fcγ reseptörleri (FcγR) algılayabilir veya patojenler (CR)11tamamlayıcı parçaları, C3b ve C3bi, onların tamamlayıcı reseptörleri ile kaplanmış. Kompleman reseptörü arasında immünglobulin süper (CRIg) CR doku makrofajlar12' seçmeli olarak ifade edilir ve son bulma AM fagositoz bağlamında P. aeruginosa pnömoni, CRIg rolü vurgulanacak 13.
Birçok özgün çalışma yöntemleri makrofaj işlevi14,15moleküler mekanizmaları açıklamak için makrofaj fagositoz değerlendirmek için kullanın. Ancak, içinde vivo fagositoz gibi yöntemler fagositoz kesin bir miktar gerektirir. Burada, tüp bebek ve içinde vivo fagositoz floresein isothiocyanate (FITC) kullanarak için detaylı bir metodoloji özetlemek-cam boncuk ve P. aeruginosa yeşil flüoresan protein (GFP), anılan sıraya göre. Ayrıca, biz PRR, CR ve FcγR-aracılı fagositoz arasında differentiating yöntemi açıklar. Son olarak, bakteriyel temizleme Mouse P. aeruginosa pnömoni ile ilgili olarak niteleyen bir yöntemi bildirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu iletişim kuralı kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Doğu Virginia Tıp Fakültesi kuralları izler.
1. floresan boncuk fagositoz
- Fare ötenazi (C57BL/6J, 6 hafta yaşlı, kadın) hayvanların IACUC iletişim kuralları etik ötenazi için göre CO2 boğulma tarafından.
- Kağıt havlu ile kaplı bir diseksiyon tahta üzerinde fareyi atmasından yatıyordu. Onun pençeleri ile onun bacaklarda spread-eagle pin ve böylece geri nefes borusunu düz konumlandırılmış başını çekmeye ön dişler ve düzeyi altında bir dize kanca.
- Fare boğaz, göğüs ve karın dezenfekte ve kürk araçlar yapışmasını önlemek için % 70 etanol ile ıslak.
- Düzenli forseps kullanarak, Cilt, vücut merkez yukarı çekin ve Merkez Cerrahi makas ile boğaz üstüne kesmek.
- Standart Cerrahi makas künt sonuna kullanarak, dikkatle kas ve bağ dokusu üzerinde boğaz uzaklaşmaya ve trakea ortaya çıkarmak için Bahar makas (microscissors) kullanabilirsiniz.
- Kıkırdak halka Forseps ile sürükleyici, dikkatle microscissors, nefes borusu ventrikül yüzünde kullanarak küçük bir insizyon attım (~1.5 mm), yapmak ve bir 18 G kanül nefes borusu yerleştirin.
- Yavaşça lavaj fosfat tamponlu tuz (PBS), bir seferde 1 mL 3 mL. Her zaman hafifçe şırınga ve akciğer geri reinfuse içine sıvı geri art arda 3 x. BALF topladıktan sonra ötenazi sağlamak için servikal çıkığı gerçekleştirin. Pelet toplamak ve toplanan PBS bronchoalveolar lavaj sıvısı (BALF) olan (~2.8 mL), bir tüp, 10 dk 1000 x g, santrifüj transfer. Taze PBS 1 mL tüp ve santrifüj 1000 x g enkaz yıkama ve pelleted alveoler makrofajlar toplamak için 10 dakika için de ekleyin.
- Pelet 2 ml % 10 nonheat inaktive fetal sığır serum (FBS) ve kültür birincil alveoler makrofajlar aynı medya ile Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM) 2 gündür oksijen bir atmosferde 37 ° C'de bir cam alt çanak üzerinde resuspend.
- Eski medya Aspire edin, PBS 1 mL ile yıkayın ve 2 mL taze medya ekleyin. FITC boncuk (Karboksile lateks boncuk, çapı 2 µm, 50 boncuk/hücre) ekleyin ve oksijen bir atmosferde 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya.
- Kapsamlı ekstraselüler boncuk kaldırmak için PBS (toplam beş yıkamak için bir defada 1 mL) ile yıkayın. 100 hücreleri Rastgele Resim ve hücre içi boncuk ile hücreleri saymak (488 nm).
Not: Phagocytic dizinler hafızanın boncuk makrofajlar toplam numarasına göre bölünmüş vardır; Fagositik hücreleri makrofajlar16toplam numarasına göre bölünmüş en az bir boncuk yemek makrofajlar sayısı yüzdesidir.- Alternatif olarak, 1 h kuluçka boncuk ile sonra PBS 3 mL hücrelerle yıkama ve onları fagositoz miktar için Akış Sitometresi için süreç. Benzer şekilde, AMs günahı hücreleri veya kontrol hücreleri olarak boncuk olmadan işlem. Yüzde pozitifliği hesaplamak ve floresan yoğunluğu, Akış Sitometresi yazılım, yazılımın bu seçenekleri seçerek kullanarak demek.
2. FcγR ve CR aracılı fagositoz
- Opsonizasyonla için 2 x 108 koyun kırmızı kan hücreleri (SRBCs) ile 50 µL tavşan anti-Hazırlanan-IgM ya da tavşan anti-Hazırlanan-IgG için oda sıcaklığında1130 dk 50 µL kuluçkaya.
- SRBCs ile 50 µL 37 ° C'de 30 dk için C5-eksik (C5D) insan serum IgM opsonized tamamlayıcı parçaları C3b ve C3bi IgM kaplı SRBCs düzeltmek için kuluçkaya.
- Tohum fare makrofaj hücreleri (MH-S hücreleri) (10.000 hücre/de) bir 96-şey plaka ve ~ %70 izdiham almak için bir gecede kuluçkaya. 1 x 107/mL 100 µL SRBCs MH-S hücreleri her şey için opsonized ekleyin ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya Yıkama bağlı olmayan SRBCs çok hızlı (~ 1 dk) amonyum klorür-potasyum (ACK) lizis arabelleği 100 µL ile.
- % 0.1 SDS içeren hücreleri parçalayıcı ve 2,7-diaminofluorene (DAF) %3 hidrojen peroksit ve 6 M üre içeren 50 µL ekleyin. 620, fluorene mavi hemoglobin katalize oluşumu Absorbans ölçmek nm.
- Standart bir eğri 620 nm Absorbans değerleriyle SRBCs bilinen bir dizi kullanarak SRBCs sayısını belirleyin. Benzer şekilde, işlem MH-S hücreleri negatif denetimlerini kullanmak için nonopsonized SRBCs ile inkübe.
3. PRR aracılı fagositoz
- 1.1-1.9 yalıtım ve fare birincil alveoler makrofajlar kültür için adımları izleyin.
- 2 gün sonra medyayı çıkarın, PBS 1 mL hücrelerle yıkayın ve taze medya Alexa Fluor 488 Birleşik zymosan-A bioparticles (100 parçacıklar/çanak) içeren 500 µL ekleyin.
- 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya Fagositoz buz gibi PBS 500 µL ekleyerek durdurmak.
- PBS (toplam beş yıkamak için bir defada 1 mL) yoğun hücrelerle yıkayın. %4 paraformaldehyde oda sıcaklığında 10 dakika ile hücreleri tamir.
- PBS (toplam beş yıkamak için bir defada 1 mL) yoğun hücrelerle yıkama ve hücreleri PBS 500 µL içinde tutmak.
- Hücreleri farklı girişim kontrast ve 488 floresan bir kanalda altında görüntü nm. Zymosan-A bioparticles içeren AMs saymak ve fagositoz yüzdesini belirlemek.
4. içinde Vivo fagositoz alveoler makrofajlar tarafından
Not: P. aeruginosa GFP besin agar tabağa aşılamak ve 37 ° C'de plaka gecede kuluçkaya. Ertesi gün, koloni besin suyu 2 ml aşılamak ve 37 ° C'de bakteri gecede büyümek.
- Ertesi gün, 100 mg/kg ketamin ve 10 mg/kg xylazine mayi bir yönetim ile fareler anestezi. Uygun anesthetization yanıt-e doğru ayak parmağı çimdik eksikliği ile onaylayın.
- Fareyi düz bir tahta üzerinde bir lastik bant ile üst kesici dişler arasında yatıyordu ve menfez yüzey ve yukarı bakacak şekilde Kürsüsü ile semirecumbent (45 °) pozisyonda yerleştirin. Eğri forseps kullanarak, kısmen dil geri çek. Bir microsprayer kullanarak, intratracheally 50 µL (5 x 106 koloni oluşturan birimler [CFU])17 / P. aeruginosa GFP imzalat farelerin ciğerlerine yönetmek.
- Enfeksiyon 1 saat sonra adımları 1.1-1.7.
- PBS ve cytocentrifuge hücrelerde resuspend bir cam slayt üzerine onları (1000 x g, oda sıcaklığında 1 dk).
- Differentially alveoler makrofajlar, nötrofiller ve lenfositler, cytospin slaytlarını üreticinin yönergelerine göre leke.
- Rastgele 100 AMs seçin, hücre içi bakteri içeren AMs saymak ve fagositoz yüzdesini belirlemek.
5. Vivo içinde bakteri izni kullanarak P. aeruginosa
- P. aeruginosa P. aeruginosa yalıtım agar tabağa aşılamak ve 37 ° C'de plaka gecede kuluçkaya. Koloni lysogeny suyu (LB) 2 ml aşılamak ve 37 ° C'de bakteri gecede büyümek. CFU, aşağıdaki formülü kullanarak hesaplar.
CFU/mL = (kolonileri seyreltme faktörü x sayısı) / kültür plaka hacmi.
İstenen CFU/mL almak için PBS ile Kültür sulandırmak. - Deneme 1'de, intratracheally enjekte ~2.5 x 105 CFU/mL P. aeruginosa sublethal bir doz imzalat vahşi-türü (WT) ve TRIM72KO fareler, adım 4.2 belirtildiği gibi. Vücut ağırlığı her gün 6 gündür ölçmek.
- Deneme 2'de, P. aeruginosa (5 x 105 CFU/mL) ikinci bir doz deneme 1'hayatta ve vücut ağırlığı 4 gündür ölçmek fareler içine enjekte.
- Deneme 3, fareler, farklı bir dizi kullanarak WT ve TRIM72KO fareler bir öldürücü doz P. aeruginosa ile (3 x 107 CFU/mL) enjekte ve mortalite enjeksiyon 2 gün içinde kaydedin. Önemli vücut kilo kaybı gibi ciddi stres belirtileri gösteren hayvanlar, kambur sırt, anoreksiya veya Dispne uzman veterinerler tarafından değerlendirilecektir. Tedavi edilemez hayvanlar hemen kaldırılır.
- Ya ölüm ya da ötenazi, enjeksiyon sonra 2 gün sonra bütün akciğer dokusu miktar itibariyle en yüksek enfeksiyon akciğer bakteriyel yükünün için toplamak.
- Akciğer bakteriyel yük sınamak için akciğer dokusu normal salin 200 µL eklemek ve onları, bakteri bozmadan akciğer dokusu tamamen bozan bir elektronik homogenizer üzerinde daha önce test ayarı kullanarak homojenize. Akciğer homogenate 1 mL ve plaka 100 µL akciğer Pseudomonas yalıtım agar plakaları 10 kat seri dilutions adlı lysate için toplam ses düzeyini ayarlayın.
- Plakayı 24 h 37 ° C'de kuluçkaya ve bütün akciğer başına CFU belirlemek için bakteri kolonileri say.
6. istatistiksel analiz
- Kullanın bir öğrenci t-testi iki grup arasındaki fark istatistiksel anlamlılık belirlemek için. İstatistiksel olarak anlamlı bir fark ne zaman düşünün p < 0,05. Tüm verileri (SEM) ortalama ± standart hatasını aracı olarak sunulmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fagositoz fare tarafından analiz için deney yapılan ilk birincil AMs. Tüm analizleri AMs WT ve TRIM72KO fareler izole karşılaştırıldığında. Şekil 1içindeAgösterildiği gibi Floresans mikroskobu o fagositoz FITC-cam boncuk birincil AMs oluşur kuluçka 1 h sonra fare tarafından saptandı. Resim 1 B Akış Sitometresi tarafından fagositoz analizini gösterir. Mikroskopi tarafından fagositoz miktar ölçülebilir ve Akış Sitometresi şekil 1C ve şekil 1D, sırasıyla temsil edilir. Şekil 2içindeAFcγR ve CR aracılı fagositoz MH-S hücreleri tarafından temsil edilir ve Şekil 2B miktar. gösterir Bu sonuçlar TRIM72 MH-S hücrelerdeki ifade tamamlayıcı fagositoz daha--dan beş kat azalma sonucunda göster. Birincil AMs WT veya TRIM72KO fareler izole tarafından Alexa Fluor 488 Birleşik zymosan-bir parçacık yenmesi temsilcisi görüntülerini Şekil 2' deCgösterilir ve miktar Şekil 2' deD sunulur . İn vivo fagositoz sonuçları şekil 3' te temsil edilir. Şekil 3 A AMs, nötrofiller ve lenfositler ve GFP+ Fagositik hücreleri varlığı tanımlayan boyama fark gösterir. BALF hücre yüzdesi ve fagositoz miktar şekil 3B ve şekil 3C, sırasıyla temsil edilir. Vücut kilo kaybı P. aeruginosa sublethal bir doz boğaza yönetim sonra farelerde yüzde şekil 4Agösterilir ve 2 gün sonra öldürücü bir doz P. aeruginosa , farelerin yaşam yüzdesidir şekil 4B' belirtti. Şekil 4 C dağılım çizim bütün akciğer bakteri yükü için ölüm veya farelerde P. aeruginosa enfeksiyon sonra 2 gün gösterir.
Resim 1 : Fare birincil alveoler makrofajlar içinde fagositoz. (A)temsilcisi görüntülerini düşük yüksek phagocytic yeşil fluorescent boncuk (sol); içeren birincil AMs gösterilen dizinler karşı fagositik AMs düşük ve yüksek oranlarda gösterilen temsilcisi görüntüler. Okları: phagocytic dizin AMs düşük; Ok uçları: yüksek phagocytic dizin AMs. Ölçek çubuğu sol iki görüntüler için 25 µm ve şu iki görüntüler için 50 µm =. Hayır-boncuk denetim, WT + boncuk ve TRIM72KO + boncuk AMs hücrelerde phagocytizing (B) temsilcisi flow sitometresi algılama. Barlar define boncuk içeren hücre kalabalıkta (yüzde) ve ortalama fluorescence yoğunluğu (MFI). (C) istatistik ortalama phagocytic dizin ve fagositik AMs WT ve TRIM72KO AMs yüzdesi; n = 5 her iki grup için *p < 0,05. flow sitometresi MFI (D) istatistikler ve WT ve TRIM72KO AMs FITC+ hücrelerde yüzdesi; n = 3 için her iki grup, *p < 0,05. Bu rakam Amerikan Toraks Derneği13izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : FcγR ve CR aracılı fagositoz. (A)temsilcisi opsonized koyun kırmızı kan hücreleri (SRBCs) görüntülerini fagositoz MH-S hücreleri tarafından. Okları üzerine gelin biraz SRBCs. Ölçek çubuğu 25 µm. (B) SRBCs Quantification fagositoz TRIM72 overexpressing MH-S hücreleri tarafından = (TRIM72OE) huzurunda IgG (FcγR-aracılı fagositoz) veya IgM (CR-aracılı fagositoz); n = 6 her grup için *p < 0,05 ve **p < 0,005 WT denetimi ile karşılaştırıldığında. (C) temsilcisi zymosan Alexa Fluor 488 Birleşik parçacık yenmesi birincil AMs tarafından görüntülerini WT veya TRIM72KO fareler izole. A ve B panelinde oklar, zymosan + hücreleri gösterir. Ölçek çubuğu 50 µm. (D) istatistiksel sonuçlarını yüzdesi = zymosan içeren-AMs; n = 3 için her grup, p > 0.05. Bu rakam Amerikan Toraks Derneği13izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: içinde vivo fagositoz, P. aeruginosa GFP. (A)bronchoalveolar lavaj sıvı (BALF) hücre cytospin slaytlarının WT ve TRIM72KO fareler 1 h P. aeruginosa GFP enjeksiyon sonra üzerinden temsilcisi resimlerini. Kwik-Diff boyama AMs (büyük hücreler,) ve nötrofil tanımlar; GFP Fagositik hücreleri (beyaz ok) tanımlar ve içselleştirilmiş GFP (siyah oklar) bakterilerde AMs GFP+ fark girişim kontrast (DIC) tanımlar. Ölçek çubukları 50 µm. (B) = AMs ve nötrofil farelerde WT BALF ve TRIM72KO 1 h yüzdesi miktar P. aeruginosa enjeksiyon sonra. (C) miktar WT ve TRIM72KO farelerde fagositik AMs yüzdesi; n = 3 her grup için *p < 0,05. Verileri (± SEM) demek gibi sunulmaktadır. Bu rakam Amerikan Toraks Derneği13izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : P. aeruginosa (PA) kullanarak In vivo bakteri izni. (A) saf WT ve TRIM72KO fareler 2.5 x 10 ilk mayi enjeksiyon sonra vücut ağırlığı (BW) kaybı yüzdesi5 CFU/mL PAO1 ( P. aeruginosa, klinik bir izole); n = 13 için WT (siyah kareler), n = 8 TRIM72 için (kırmızı daireler),KO *p < 0,05, **p < 0,005 WT ile (B) günde 2 3 x 107 CFU/mL s. sonra hayatta kalma yüzdesi ile karşılaştırıldığında aeruginosa mayi enjeksiyon; n = 10 WT (katı siyah daireler) ve TRIM72 (katı kırmızı kareler),KO *p < 0,05 WT TRIM72 karşı için gruplarıKO . (C) A dağılım çizim P. aeruginosa yerleştirmeye WT ve TRIM72KO2 gün itibariyle bütün akciğer bakteriyel yükünün. Gri Kesikli çizgi enjekte bakteriyel doz belirler; ^ ölen fareler belirler. WT TRIM72 karşı için gruplarıKO , p < 0,05. Bu rakam Amerikan Toraks Derneği13izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gaz değişimi işlevi yerine getirirken, akciğer ısrarla yabancı parçacıklar, patojenler ve alerjenleri yüzleşir. AMs onların ana işlevi, yani fagositoz gereğince savunma ilk satırı sağlar. AMs da diğer bağışıklık hücreleri patojenleri yok ve inflamasyon çözünürlük ile koordine. Burada, biz yöntemleri özellikle fare akciğer izole AMs tarafından fagositoz değerlendirmek için nitelendirdi. Bu el yazması sunulan Protokolü makrofaj işlevi ve diğer organlarında bakteri izni çalışmaya da kullanılabilecek fagositoz içinde vivo ve in vitro ayrıntılı bir çalışma açıklar.
Açıklanan tüp bebek fagositoz serum tedavi FITC boncuk kuluçka basit fikri üzerine dayanır veya fagositoz başlatmak için kültürlü AMs ile SRBCs opsonized. Bu yöntem geniş çamaşır adımlardan ve arka plan azaltmak için nonphagocytized RBCs lizis içerir. Yapıştırılan AMs ayırmaz için özen göstermelidir. ACK lizis çözüm içeren yıkama adım yapılmalıdır 1 dk içinde olarak daha uzun bir çamaşır zaman makrofajlar lizis için yol açar.
Buna ek olarak, görüntü analiz, biz phagocytizing hücre yüzdesi ve AM fagositoz fonksiyonu kapsamlı bir görünümünü elde etmek için phagocytic dizin ile karakterizedir. Ayrıca PRR, FcγR ve fare makrofaj MH-S hücre kültürünü CR-aracılı fagositoz arasında ayırt etmek için yöntem anlatmıştır. Genetik modülasyon ile birlikte, bu adım hedef gen manipülasyon tarafından etkilenen belirli fagositoz yolu mekanik anlayışlar kazanmak çalışırken kullanışlıdır.
Önceki raporlar bakteriyel alımını değerlendirmek için yöntemler dokümante; gentamisin koruma tahlil14en önemli yöntemdir. Burada sunulan iletişim kuralında, da içinde vivo fagositoz ölçmek için bir görüntüleme yöntemi göstermiştir. Bu yöntem daha önce yayımlanmış yöntemleri ile karşılaştırıldığında daha iyi yapmak birkaç anahtar faktörler vardır. Burada anlatılan yöntem boğaza enjeksiyonu P. aeruginosa GFP fark BALF hücreleri boyama tarafından takip içerir. Bu yöntem fagositler içinde alınan bakteri belirlemeye yardımcı olur floresan bakteri, kullanımı vurgulamaktadır. Buna ek olarak, fark BALF hücreleri boyama özellikle AMs diğer bağışıklık hücreleri içinde vivo ortamda fagositik kapasite ayırt etmek ve bakteriyel temizlemek için farklı fagositler göreli katkısını değerlendirmek için yardımcı olur Akciğer üzerinden yükler. Bu yöntemin küçük bir sınırlama fareler arasında değişkenlik önlemek için dikkatli boğaza yönetim gerektirmesidir.
Ayrıca, biz bir P. aeruginosa bakteri izni farelerde pnömoni bağlamında yöntem açıkladı. Bu yöntem karakterize etmek için vücut kilo kaybı ve ölüm P. aeruginosa boğaza yönetim sonra belirlenen ve nicel tahlil akciğer bakteri yükünü belirlemek için kullanılan. Ölüm vücudun kapsamlı bağışıklık yanıtı değerlendirmek için önemli bir parametredir. Bu deneyi akciğer örnekleri bakteri yükü değerlendirmek için kullanılır. Ancak, bakteri yükü akciğer örneklerinden 48 saat içinde ölümcül bakteriyel enjeksiyon doz takip hasat da belirlenebilir. Tahlil başarısı enjeksiyon, patojen kalitesini ve enjeksiyon doz ve tamamen bakteriyel bozmadan akciğer bozan bir homojenizasyon yöntemin en iyi duruma getirme zamanlaması standardizasyon tarafından belirlenecektir Hücre zarı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser grant R01HL116826 için X. Zhao tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
| 2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
| 70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
| 96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
| Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
| C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
| Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
| DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
| Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
| FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
| GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
| Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
| High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
| Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
| Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
| Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
| MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
| rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
| rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
| Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
| Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
| sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
| Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |
References
- Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).
- Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease. Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).
- Broug-Holub, E., et al. Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival. Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).
- Knapp, S., et al. Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).
- Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).
- Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).
- Greenlee-Wacker, M. C. Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation. Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).
- Haslett, C. Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).
- Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).
- Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages. Current Protocols in Immunology. , CHAPTER: Unit-14.27 (2011).
- He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation. Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).
- Nagre, N., et al. Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Su, H., Chen, H., Jen, C. J. Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).
- Amiel, E., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression. Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).
- Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).
