Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

التلاعب بالجينات الدالة في كافيفيش المكسيكي

Published: April 22, 2019 doi: 10.3791/59093
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 1,2, 2,3
1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University, 2Jupiter Life Science Initiative, Florida Atlantic University, 3Harriet L. Wilkes Honors College, Florida Atlantic University

Summary

يمكننا وصف النهج للتلاعب بالجينات في النظام النموذجي التطوري مكسيكي أستياناكس. ويرد وصف ثلاث تقنيات مختلفة: ترانسجينيسيس Tol2 بوساطة، وتستهدف التلاعب جينوم استخدام كريسبر/Cas9، وضربه قاضية للتعبير باستخدام مورفولينوس. وينبغي تيسير هذه الأدوات التحقيق المباشر للجينات الكامنة وراء الاختلاف بين أشكال السطح والكهوف السكنية.

Abstract

الحيوانات كهف توفير نظام مقنعة للتحقيق في آليات تطورية والأسس الوراثية الكامنة وراء التغييرات في العديد من الصفات المعقدة، بما في ذلك ضمور العين، المهق، وفقدان النوم، هايبرفاجيا، وتجهيز الحسية. عرض الأنواع من كافيفيش من جميع أنحاء العالم بتطور متقاربة من الصفات المورفولوجية والسلوكية بسبب الضغوط البيئية المشتركة بين النظم المختلفة كهف. وقد درست الأنواع المتنوعة من كهف في إعداد مختبر. تترا المكسيكية، أستياناكس مكسيكي، مع أشكال المبصرين والمكفوفين، وقدمت أفكاراً فريدة من نوعها في العمليات البيولوجية والجزيئية الكامنة وراء تطور السمات المعقدة ويستعد جيدا كنظام نموذجي ناشئة. بينما تم تحديد الجينات مرشح تنظيم تطور العمليات البيولوجية المتنوعة في ألف مكسيكي، القدرة على التحقق من صحة للجينات الفردية دوراً محدودا. تطبيق ترانسجينيسيس وتكنولوجيا الجينات تحرير لديه القدرة للتغلب على هذا العائق الكبير والتحقيق الآليات الكامنة وراء تطور السمات المعقدة. وهنا يصف لنا منهجية مختلفة للتلاعب بالجينات في ألف مكسيكي. تشمل نهج استخدام مورفولينوس، ترانسجينيسيس Tol2 ، ونماذج نظم تحرير الجينات والزرد المستخدمة عادة في الأسماك الأخرى، التعامل مع وظيفة الجينات في ألف مكسيكي. تتضمن هذه البروتوكولات وصفاً مفصلاً لتربية توقيت الإجراءات، وجمع البويضات المخصبة، والحقن، واختيار الحيوانات المحورة وراثيا. سوف تسمح هذه الأساليب المنهجية لتحقيق الآليات العصبية والوراثية الكامنة وراء تطور الصفات المتنوعة في ألف مكسيكي.

Introduction

منذ داروين أصل الأنواع1، اكتسبت العلماء رؤى عميقة في كيف تتشكل السمات تقحم في الاستجابة للضغوط البيئية والإيكولوجية المحددة، وبفضل الكهف الكائنات الحية2. تترا المكسيكية، ألف مكسيكي، يتكون من العينين السكان 'السطحية' الأسلاف التي تسكن الأنهار في جميع أنحاء المكسيك وتكساس الجنوبية والسكان معزولة جغرافيا على الأقل 29 نقراً الكهف المشتقة التي تسكن العبرة ديل سييرا و مناطق أخرى من شمال شرق المكسيك3. قد حددت عددا من الصفات المرتبطة بكهف في مكسيكي (أ)، بما في ذلك استهلاك الأوكسجين غيرت، تصبغ، وفقدان للعيون، وغيرت تغذية وتستخدم علفاً للسلوك4،،من56، 7،،من89. ألف مكسيكي ويعرض نموذج قوي للتحقيق بشكل مستقل في آليات التطور متقاربة بسبب تاريخ تطورية محددة تحديداً جيدا، ووصف مفصل للبيئة الإيكولوجية، والوجود تطور الكهف السكان10،11. العديد من الصفات المشتقة من الكهوف التي موجودة في كافيفيش، بما في ذلك فقدان العين، النوم فقدان، زيادة التغذية وفقدان التعليم المدرسي، وخفض العدوان، وخفض الإجهاد الاستجابات، تطورت عدة مرات من خلال أصول مستقلة، وكثيراً ما تستخدم مسارات مختلفة الوراثية بين الكهوف8،،من1213،،من1415. وكرر هذا تطور جانبا قوية لنظام مكسيكي (أ) ويمكن أن توفر قد قلق أعمق لمسألة أعم من النظم الوراثية كيف لتوليد تعمل مماثلة.

في حين اقتصر تطبيق التكنولوجيا الوراثية للتحقيق آليا في وظيفة الجينات في العديد من أنواع الأسماك (بما في ذلك (أ) مكسيكي)، التقدم الذي أحرز مؤخرا في الزرد توفر أساسا لتطوير التكنولوجيا الوراثية في الأسماك 16،17،18،19،20. العديد من أدوات تستخدم على نطاق واسع في الزرد للتلاعب بالجينات، وقد تم توحيد تنفيذ هذه الإجراءات منذ فترة طويلة. على سبيل المثال، حقن morpholino أوليجوس (MOs) في مرحلة وحيدة الخلية بشكل انتقائي كتل الجيش الملكي النيبالي ويمنع الترجمة لنافذة زمنية قصيرة خلال التنمية21،22. وبالإضافة إلى ذلك، نهج تحرير الجينات، مثل تجمع بانتظام إينتيرسباسيد يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر)/المرتبطة كريسبر البروتين 9 (Cas9) والنسخ الشبيهة بالمنشط المستجيب نوكلاس (TALEN)، التي تسمح لتوليد المعرفة الحذف أو، في بعض الحالات، عمليات الإدراج عن طريق جزئ في جينومات19،20،،من2324. يتم استخدام ترانسجينيسيس التعامل مع التعبير الجيني مستقرة أو الدالة بطريقة محددة من نوع خلية. ويستخدم النظام Tol2 فعالة لتوليد الحيوانات المحورة وراثيا عن طريق كوينجيكتينج ترانسبوساسي مرناً مع بلازميد الحمض النووي Tol2 التي تحتوي على25،التحوير26. ويستخدم نظام Tol2 ترانسبوساسي Tol2 من الميداكا لتوليد الملاحق germline مستقرة من construct17 المعدلة وراثيا. ينطوي على توليد الوراثي Tol2 كوينجيكتينج بلازميد يحتوي على التحوير محاط بمواقع التكامل Tol2 ومرناً ل Tol2 ترانسبوساسي17. وقد استخدم هذا النظام لإنشاء صفيف خطوط معدلة وراثيا في الزرد واستعماله اتسع مؤخرا لنظم نموذجية طارئة إضافية، بما في ذلك cichlids، killifish، ستيكليباك، وفي الآونة الأخيرة، كافيفيش المكسيكية27، 28,29,30.

في حين كافيفيش نظام بيولوجي رائعة لتوضيح آليات التطور سمة، قد لا تم تسخير قدرتها الكاملة كنموذج تطوري تماما. لقد كان هذا جزئيا بسبب عدم قدرة على التعامل مع الوراثية والخلوية تعمل مباشرة31. تم التعرف على الجينات مرشح تنظيم السمات المعقدة باستخدام السمات الكمية المكاني (QTL) دراسات، ولكن تم التحقق من هذه الجينات المرشحة صعبة32،33،34. في الآونة الأخيرة، ضربة قاضية عابر باستخدام مورفولينوس، الجينات تحرير باستخدام نظم كريسبر و TALEN، واستخدام Tol2-ترانسجينيسيس الوساطة قد استخدمت للتحقيق أساسا الوراثية الكامنة وراء عدد من الصفات35،36،37 ،38. تنفيذ وتوحيد هذه التقنيات تسمح بالتلاعب باستجواب الأسس الجزيئية والعصبية للصفات البيولوجية، بما في ذلك التلاعب بوظيفة الجينات، ووسم السكان خلية محددة، و التعبير عن الصحفيين الوظيفية. بينما قد ثبت التنفيذ الناجح لهذه الأدوات الجينية للتلاعب بالجينات أو وظيفة الخلوية في نظم نموذجية ناشئة، يزال يفتقر إلى بروتوكولات مفصلة في ألف مكسيكي.

ألف مكسيكي التبصير الحرجة على آليات التطور في الاستجابة لبيئة متغيرة ويقدم الفرصة لتحديد الجينات الجديدة التي تنظم مختلف الصفات. هناك عدد من العوامل تشير إلى أن ألف مكسيكي نموذجا بالغ المرونة لتطبيق المنشأة الجينوم الأدوات المتاحة حاليا في النماذج الوراثية المتبعة، بما في ذلك القدرة على بسهولة الحفاظ على الأسماك في المختبرات، كبيرة الحجم الحضنة، الشفافية وتسلسل الجينوم، وفحوصات سلوكية محددة39. وهنا يصف لنا منهجية لاستخدام مورفولينوس، ترانسجينيسيس، وتحرير الجينات في سكان سطح، وكهف مكسيكي (أ). التطبيق الأوسع نطاقا لهذه الأدوات في مكسيكي (أ) سيسمح بإجراء تحقيق آليا في العمليات الجزيئية الكامنة وراء تطور الفوارق التنموية والفسيولوجية والسلوكية بين كافيفيش والأسماك السطحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-Morpholino اليغو التصميم

ملاحظة: تسلسل مكسيكي (أ) متوفرة من خلال "المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية" (نكبي) الجينات ونكبي SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)، وكذلك من مستعرض الجينوم انسيمبل (https://www.ensembl.org). عند تصميم morpholino للاستخدام في كل أشكال السطح والكهوف السكنية، من المهم تحديد أي الاختلاف الجيني بين نقراً في هذه المرحلة، حتى يمكن تجنب هذه المناطق الجينية كأهداف مورفولينوس. يمكن أن يؤدي أي اختلاف الأشكال داخل موقع المستهدف morpholino إلى الربط غير فعال. التصميم مماثل لأنظمة الأسماك الأخرى، مثل الزرد، وقد تبين سابقا على العمل بفعالية في مكسيكي ألف-21،،من3640.

  1. تصميم لحجب الترجمة مورفولينوس
    ملاحظة: حجب الترجمة مورفولينوس بلوك الترجمة بالربط إلى موقع البداية الذاتية وتعرقل إليه متعدية الجنسيات من ربط تسلسل مرناً من خلال عوائق الفراغية.
    1. تحديد منطقة ترميز الجينات الهدف بدءاً من الموقع بدء ATG.
    2. سجل أزواج قاعدة 25 أولاً من تسلسل المستهدفة بواسطة نسخ ولصق التسلسل في دفتر ملاحظات المعمل أو محرر نص.
    3. باستخدام برنامج على الإنترنت (مثلاً، http://reverse-complement.com) أو الترجمة اليدوية، تولد تكملة عكس التسلسل المستهدفة. حفظ تكملة عكس الناتجة في محرر نص أو دفتر ملاحظات المعمل.
    4. تأمر morpholino مع تكملة عكس التسلسل من شركة التي تقوم بإنشاء النوكليوتيد morpholino. انظر الجدول للمواد للشركات.
  2. تصميم لحجب الوصلة مورفولينوس
    ملاحظة: مورفولينوس حظر لصق كتلة الربط و، وبالتالي، منع تشكيل جزيء مرناً ناضجة. وهذا يوفر طريقة بديلة لضربة قاضية عندما لا تكون محددة تحديداً جيدا المواقع ابدأ، أو اتباع نهج أكثر أمثل عند التحقق من صحة من ضربة قاضية عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو المطلوب. هذا الاستحقاق لحظر لصق مورفولينوس (أكثر من حجب ATG MOs) هو أن استبعاد إكسون أو يمكن تقييم إدراج إنترون سهولة بعكس المنتسخة (RT)-بكر وحجم الخلافات التي تصور في هلام. التفريد RT-PCR وجل لتحديد فعالية morpholino ينبغي أن يتم استخدام الإجراءات المختبرية القياسية.
    1. تحديد تسلسل الجين المستهدف قبل مرناً. الاستفادة من المعلومات المتاحة من الجينوم مكسيكي (أ) عن طريق نكبي أو انسيمبل لتحديد حدود إنترون-إكسون33.
    2. استهداف إكسون-إنترون (المانحة لصق) أو إنترون-إكسون الحدود (لصق يقبلون) مواقع لاستبعاد إدراج أو إكسون إنترون.
      ملاحظة: سبليسيوسومي الأهداف عادة تسلسل "غو" (الهدف U1) في إنترون في موقع الوصلة 5 'وتسلسل AG'' ''في موقع الوصلة إينترونيك 3' (U2 الهدف). في ظل الظروف العادية، سبليسيوسومي U1 و U2 مفارز ربط هذه المواقع المستهدفة في التسلسل قبل مرناً للربط السليم أن يحدث. ومع ذلك، إذا كان أي من هذه التسلسلات مستهدفة محظور بواسطة morpholino، سبليسيوسومي تنتقل إلى القادمة متاح U1 أو U2 الموقع، مما تسبب في استبعاد إنترون أو إكسون في تسلسل مرناً. وسيشمل هذا التخطيط/الأمثل، تبعاً لطبيعة الجينات الهدف21. حظر موقع U1 داخلي الموجهات عموما، الوصلة إلى موقع U1 المتاحة التالية، مما تسبب ختان إكسون. بدلاً من ذلك، حجب تقاطع الوصلة الأولى أو الأخيرة أسباب إدراج إنترون لأنه لا يوجد أي موقع آخر لإعادة توجيه الوصلة إلى. استخدام البرمجيات تسلسل للتنبؤ بتأثير مختلف الاستثناءات مقابل المشمولات. يمكن أن تشير إلى التوقعات المحتملة فراميشيفتس أو codons توقف سابق لأوانه، مشيراً إلى موقع هدف أكثر فعالية لتعطيل مرناً.
    3. حالما يتم تحديد موقع الهدف، سجل التسلسل في كتاب نص محرر أو مختبر. تأكد من أن الموقع المستهدف 25 زوج قاعدي (bp) طويلة.
    4. باستخدام برنامج على الإنترنت (مثلاً، http://reverse-complement.com) أو الترجمة اليدوية، تولد تكملة عكس التسلسل المستهدفة. سجل التسلسل في كتاب نص محرر أو مختبر.
    5. تأمر morpholino مع تكملة عكس التسلسل من شركة التي تقوم بإنشاء النوكليوتيد morpholino. انظر الجدول للمواد لشركات العينة.

2-مورفولينوس للحقن

ملاحظة: سوف تحتاج عدة تركيزات أو وحدات التخزين لحقن مو التي يتعين القيام بها لوضع التركيز الأمثل لحقن. كميات حقن النموذجية هي 400 – 800 خريج من mo. أثر morpholino ضربة قاضية يمكن أن تستمر لمدة تصل إلى 6 أيام بوستينجيكتيون.

  1. الحصول على morpholino الأسهم. ويصل morpholino الأسهم المجففة بالتبريد. هيدرات أنه مع العقيم ح2س قبل استخدامها في تركيز المخزون المطلوب (مثلاً، 4 مم). تخزين في-20 درجةمئوية حتى الاستخدام.

3-كريسبر جرنا التصميم والنسخ في المختبر، وإعداد

  1. تصميم جرنة كريسبر
    ملاحظة: جرناس تم إنشاؤها باستخدام الأبحاث المنشورة سابقا واسطة فارشنيي et al.40 و41من ويرسون وآخرون.
    1. استخدام مستعرض جينوم، تحديد منطقة ترميز الجينات للفائدة. باستخدام تسلسل الجينوم، تحديد تسلسل الهدف جرنة داخل إكسون بالبحث عن 20 شركة بريتيش بتروليوم النوكليوتيدات هدف تسلسل بداية مع زز وتليها تسلسل بام (نج). منطقة الجين بعد البدء (ATG) سيكونون مستهدفين.
      ملاحظة: إذا تعذر العثور على تسلسل مستهدفة مع زز في نهاية 5 'إكسون المرجوة من الجينات، واحد أو كلا من ز's يمكن أن تحل محل النيوكليوتيدات الأولى والثانية في 5 ' نهاية التسلسل. ومع ذلك، ز اثنين's يجب إدراجها في اليغو، كهذه مطلوبة من أجل النسخ T7.
    2. تصميم وترتيب اليغنوكليوتيد الخاصة بالجينات (اليغو ج: 5 '--تاتاكجاكتكاكتاتاجنينننننننننننننننننجتتتاجاجكتاجااتاجك-3'). إضافة الجينات الخاصة 20 شركة بريتيش بتروليوم جرنا الهدف تسلسل (الغامق) دون تسلسل بام بين تسلسل مروج T7 (أحمر) وتسلسل تداخل المستخدمة يصلب اليغنوكليوتيد ثانية (أزرق). يصلب وتضخيم (راجع الخطوة 3.2.1) هذا اليغو A ومن اليغو ثانية (اليغو ب: 5 '--آكتتجكتاتتكتاجكتكتاااك جاتككجكاككجاكتكجتجككاكتتتتكاجتجاتاكجاكتاجككتاتتت-3') لتوليد جرنة القالب المستخدم للنسخ.
      ملاحظة: ب اليغو هو نفسه بالنسبة لكل رد فعل وتحتاج فقط أن تأمر 1 x.
  2. إعداد جرنا والنسخ
    1. يصلب وتضخيم في أوليجوس. تشمل الإشعال التالية تضخيم في جرنة من أجل زيادة الغلة:-تاتاكجاكتكاكتاتا 5 '-3' (T7 التمهيدي)-جاتككجكاككجاكتكجتج 5 '-3' (جرنة التمهيدي 3 '). إجراء PCR استخدام بوليميراز كوداكاراينسيس ثيرموكوكوس (رمز).
      ملاحظة: لكلا كبسولة تفجير في اليغو أ وب اليغو، ينصح 10 دورات لعائد جيد. يمكن العثور على بروتوكول مفصل في ويرسون et al.41.
    2. نسخ جرنا استخدام مجموعات النسخ في المختبر المتوفرة تجارياً (انظر الجدول للمواد). ويتم ذلك من خلال إدخال تعديلات على الشركة المصنعة'بروتوكول s نشرتها كلاسين et al.42.
    3. يعجل واغسل ريسوسبيند جرنة كما وصفها كلاسين et al.42.
      ملاحظة: يجب حراكه جرنا في المياه خالية من رناسي للحيلولة دون تدهور.
    4. سجل تركيز جرنة، الذي يمكن تحديده باستخدام جهاز المطياف الضوئي. تقييم نوعية الجيش الملكي النيبالي بتشغيل 2 ميليلتر على [اغروس] هلام. الكوة الحمض النووي الريبي لتجنب تجميد/ذوبان الجليد وتخزينها في-80 درجةمئوية حتى قبل الحقن مباشرة.
  3. إعداد Cas9 والنسخ
    1. Cas9 مرناً يمكن نسخها باستخدام مجموعات النسخ في المختبر المتوفرة تجارياً (انظر الجدول للمواد) كما هو موضح سابقا43. استخدام الإصدار nls-Cas9-nls43.
    2. سجل تركيز جرنا وتقييم نوعيته عن طريق تشغيل 2 ميليلتر على [اغروس] هلام. رنا الكوة لتجنب التحلل التي تنشأ من خلال دورات تجميد أذاب متعددة، وتخزين مختبرين في-80 درجةجيم

4-إعداد ثوابت Tol2 وترانسبوساسي Tol2 وترانسجينيسيس

  1. إعداد Tol2 بنيات التحوير للحقن.
    ملاحظة: أننا قد استخدمت بنجاح الزرد نشرت/المتاحة ويبني الميداكا في ألف مكسيكي. هذه الثوابت تعمل بكامل طاقتها في ألف مكسيكي، احتمالاً بسبب ارتفاع مستوى التماثل تسلسل (أرجع إلى مستودع أدجيني وقواعد البيانات "شبكة المعلومات الزرد" [زفين] لثوابت المتوفرة). أبدت الشظايا المروج الزرد المتسلسلات في أنسجة المتوقعة عند استخدامها في مكسيكي أ.
    1. الحصول على Tol2 بنيات أو توليد بلازميد مع مروج الأنسجة على حدة، والتحوير المرغوب، والأسلحة Tol2 (انظر كوان et al.44). عند استلام، التسلسل في بناء للتحقق من صحة بلازميد.
    2. أداء ميديبريب نيات وفقا للشركة المصنعة'ق المبادئ التوجيهية. الوتي بلازميد النهائي في خالية رناسي ح2س، وتحديد التركيز مع جهاز المطياف الضوئي، وتخفف من التركيز على 100–300 نانوغرام/μL، وقاسمه ومخزن بنيات في جيم-20 °
  2. هضم بلازميد ترانسبوساسي Tol2، وتوليف مرناً.
    1. الحصول على نسخة من بلازميد ترانسبوساسي Tol2 (أجهزة الكمبيوتر--zT2TP) كقالب لتوليد مرناً Tol245.
    2. ميديبريب أجهزة الكمبيوتر--zT2TP بناء وفقا للشركة المصنعة'ق المبادئ التوجيهية. الوتي ذلك في انخفاض حجم المياه خالية من رناسي أو المخزن المؤقت (~ 50 ميكروليتر). تخزين مختبرين في جيم-20 °
    3. هضم بلازميد Tol2 استخدام إنزيم التقييد.
      1. تنفيذ خلاصة قيد على 10 ميكروغرام من بلازميد دائري أجهزة الكمبيوتر--zT2TP باستخدام الجدول 1.
      2. تقسيم رد فعل إلى 2–50 ميكروليتر من ردود الفعل، واحتضان ردود الفعل بين عشية وضحاها في 37 °ج في cycler حرارية.
      3. اليوم التالي، إلغاء تنشيط الإنزيم بالتدفئة إلى 65 درجةمئوية لمدة 20 دقيقة.
      4. تنقية بلازميد خطية فور الخلاصة، استخدام المتاحة تجارياً PCR تنقية مجموعات (انظر الجدول للمواد) كل المبادئ التوجيهية الصانعين' . الوتي بلازميد في 15 ميكروليتر خالية رناسي ح2س وتحديد تركيز المنتج باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
      5. تشغيل 1 ميكروليتر من بلازميد هضمها وميكروليتر 1 من بلازميد تقطيعه على 1.5% [اغروس] هلام لتأكيد بلازميد خطية.
    4. القيام نسخ في المختبر مرناً Tol2.
      1. استخدام 1 ميكروغرام من بلازميد خطية أجهزة الكمبيوتر--zT2TP كقالب للنسخ. تتبع الشركة المصنعة'ق المبادئ التوجيهية للنسخ في المختبر (انظر الجدول للمواد) كما هو موضح في الجدول 2.
      2. احتضان في 37 درجةمئوية في cycler حرارية الواحدة بمصنّع'ق المبادئ التوجيهية.
      3. إضافة 1 ميليلتر من الدناز، واحتضان أنه في 37 درجةمئوية في cycler حرارية الواحدة بمصنّع'ق المبادئ التوجيهية.
      4. أداء ترسيب كلوريد الليثيوم كل بروتوكول مجموعة النسخ. ريسوسبيند بيليه الجيش النيبالي الملكي في–~ 20 ميكروليتر 30 ح خالية رناسي2o.
      5. تحديد تركيز المنتج باستخدام جهاز المطياف الضوئي وتسجيل نوعية الجيش الملكي النيبالي.
      6. تمييع المنتج إلى–300 نانوغرام/ميليلتر وقاسمه ~ 100 إلى 5 عينات 10 ميكروليتر–لتجنب تجميد أذاب المتكررة. تخزينها في-80 درجةمئوية حتى الاستخدام.
        ملاحظة: من الممكن أن تحقق 1–2 ميليلتر من المنقي Tol2 مرناً لتشويه/الفرقة مع هلام التفريد.

5-ميكروينجيكشنز

  1. إعداد الأدوات العامة للحقن
    ملاحظة: وقد وصف الإجراءات المذكورة في هذا المقطع بالتفصيل كووالكو et al.46، ويقدم نظرة عامة مع تعديلات طفيفة هنا.
    1. إنشاء لوحات الحقن بصب الحارة 3% [اغروس] يذوب في الماء نظام الأسماك إلى 100 مل طبق بيتري. بعناية وضع قالب حقن بيض في سكب طازجة [اغروس] جعل آبار لبيض السمك. وضع الجانب من العفن في أجار بزاوية 45درجة ، وبعد ذلك، انخفاض ببطء في [اغروس]؛ يخفض ببطء العفن في زاوية يتجنب الهواء الوقوع تحت العفن. إزالة العفن برفق مرة واحدة هو توطد [اغروس]. ويمكن تخزين اللوحات، مختومة، على 4 درجةمئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
    2. سحب الإبر من زجاج البورسليكات الشعيرات الدموية للحقن في ساحبة كهربائي/إبرة وفقا للشركة المصنعة'ق المبادئ التوجيهية. هذا البروتوكول سوف تختلف الواحدة ساحبة ماصة؛ ومع ذلك، يمكن الاطلاع على برنامج إبرة سحب عينة في الجدول 3.
      ملاحظة: الاستفادة المثلى من الإبرة مهم للحقن، الإبر التي تكون طويلة جداً ينحني بدلاً من اختراق البويضة نظيفة.
    3. لجعل الماصات الزجاجية الكبيرة تتحمل نقل البيض عن طريق كسر الماصات الزجاجية القياسية حتى يتم فتح كبيرة بما يكفي للبيض. استخدام موقد بنسن، البولندية نهاية كسر الزجاج بتعريض نهاية الماصات المكسورة على اللهب حتى تصبح ناعمة.
  2. تربية الإعداد
    ملاحظة: هناك العديد من البروتوكولات المختلفة المستخدمة لتربية مكسيكي (أ). لبروتوكول مفصلة، راجع بوروسكي39. بدء تشغيل برنامج الإعداد تربية 1 أسبوع قبل الحقن.
    1. في اليوم 1، وضع الإناث اثنين إلى ثلاثة ذكور وثلاث إلى أربع في صهريج واحد جالون 10 الإبقاء على 24 ± 1 °C.
    2. في الأيام 1–7، زيادة تغذية ~ 3 × يوميا. ضمان النظام الغذائي يشمل الغذاء الحي، مثل الديدان السوداء والماء المالح الروبيان.
    3. في يوم 6، إضافة سخان خزان واحد تعيين إلى 27 °مختبر جيم يمكن أن تختلف درجات الحرارة للدبابات؛ ولذلك، سيكون هذا زيادة قدرها–2 3 °ج النسبي لدرجة الحرارة العادية للدبابات.
    4. في مساء يوم 7، وهو مساء ليلة حقن (زيتجيبير [ZT] 9–11)، دقة تنظيف الخزانات مع اسفنجة غارقة في المياه وإزالة أي فائض الغذاء أو الحطام باستخدام شباك غرامة أو سيفون.
    5. في ليلة يوم 7، بدء التحقق من بيض السمك السطحي في ZT15 والاستمرار في فحص كل 15–30 دقيقة حتى ZT18. بدء التحقق من البيض في ZT17 cavefish، والاستمرار في فحص كل 15–30 دقيقة حتى ZT20.
      ملاحظة: تستند الأوقات 14:10 ح الضوء: الظلام دورة استخدام الوقت زيتجيبير. أوقات تربية تقديرات ومختبرات الفردية يجب تحديد الأوقات الدقيقة. من المهم لجمع البيض بعد فترة وجيزة من هم صدر/المخصبة من أجل حقن لهم في مرحلة وحيدة الخلية.
  3. جمع البيض المرحلة خلية واحدة
    1. في الليلة التي يتوقع تربية، دراسة الدبابات كل 15–30 دقيقة ورصد للبيض في الجزء السفلي من الخزان. البيض تظهر شفافة، قياس حوالي 1 ملم في القطر.
    2. استخدام سمكة مش الجميلة صافية لجمع البيض ونقلها إلى وعاء زجاج مليئة بالأسماك الطازجة نظام المياه. فحص البيض تحت مجهر للتأكد من أن البيض في مرحلة واحدة-الخلية.
    3. استخدام الماصات الزجاجية، نقل البيض خلية واحدة إلى لوحات الحقن. الماصات الزجاجية المطلوبة في هذه المرحلة كما البيض سوف تتمسك بالبلاستيك.
    4. استخدام ماصة، بعناية إطلاق البيض في الآبار التي بليت حقن [اغروس] من قسم 5.1. تعبئة صفوف لوحة حقن بريوارميد (في درجة حرارة الغرفة) مع الحد الأقصى لعدد البيض (30–40 في الصف الواحد، وما يصل إلى خمسة صفوف). صفوف كاملة تساعد على إبقاء البيض من التحرك أثناء الحقن. الحفاظ على البيض رطب على لوحة حقن مع كمية صغيرة من الأسماك نظام المياه حتى أداء الحقن.
  4. الإعداد بيكو-حقن وحقن عامة تحسين المبادئ التوجيهية
    1. الردم إبر الحقن باستخدام أما ماصة هلام-تحميل نصائح التي تناسب داخل الشعرية أو استخدام نصائح ميكروبيبيتي القياسية وإضافة–2 ميليلتر 4 بولس إلى النهاية. حالما يتم شغل الإبرة، استخدام الملقط لتقليم طول الزائدة من إبرة حقن.
    2. أداء ميكروينجيكشنز باستخدام إبرة مثبتة في ميكرومانيبولاتور، متصلاً ميكروينجيكتور بيكوليتير.
    3. تعيين وقت الحقن إلى 0.03 s والضغط بها على هذه المبادرة ~0.0. ضغط الحقن سوف تختلف تبعاً لذلك مع اختلافات بسيطة بين الإبر، حتى الأمثل لتحقيق ~1.0 nL حقن بلعه.
      ملاحظة: ضغط الحقن غالباً في النطاق ~ 10–30 رطل/بوصة مربعة.
    4. توحيد بلعه الحقن بحقن في الزيوت المعدنية وقياس بولس في الحجم مع ميكرومتر شريحة تحقيق ~ 1–حجم الحقن nL 1.5. قم بضبط ضغط الحقن (psi) لزيادة أو إنقاص حجم بلعه.
    5. رسم المياه قبالة أعلى جداً من البيض باستخدام مختبر أنسجة.
      ملاحظة: المشيمة بيضة أستياناكس قليلاً أكثر صرامة لاختراق من البيض الزرد. ونجد أن الرسم في المياه قبالة الجزء العلوي من البيض يساعد على تسهيل اختراق الإبرة البيضة. يمكن أن تسمح لوحة الأمثل للبيض ~ 200 على لوح واحد.
    6. استخدام ميكرومانيبولاتور اختراق كل بيضة بالإبرة، وحقن مباشرة في صفار البيض. بمجرد وضعه في صفار البيض، حقن البيض بالضغط على دواسة القدم الحقن أو زر إدخال.
      ملاحظة: يمكن حقن لوحة كاملة داخل ~ 15 دقيقة. وتستمر مرحلة خلية واحدة ل ~ 40 دقيقة.
  5. حقن مورفولينوس
    ملاحظة: سوف تحتاج إلى مبلغ morpholino اللازمة لضربة قاضية دون أن تسبب سمية الأمثل للجينات المستهدفة؛ ومع ذلك، بتركيز 400 pg مكان جيد للبدء.
    1. تحضير morpholino حيث سيتم حقن 400 بيكوغرام من morpholino كل بيضة. Morpholino ذوبان الجليد على الجليد. الحل الحقن يتكون من morpholino (في تركيز المطلوب)، خالية من رناسي ح2س أو دانو'حل s، والفينول الأحمر (10% الحجم النهائي). للحصول على مثال، راجع الجدول 4.
    2. حقن 1 nL للجنين.
  6. حقن كريسبر
    1. إعداد الجيش الملكي النيبالي بحيث سيتم حقن pg 25 من جرنة و 300 خريج من مرناً Cas9 مجموع كل الأجنة. لخليط حقن كريسبر/Cas9 عينة، انظر الجدول 5.
    2. حقن 2 nL من جرنا/Cas9 مرناً للجنين مباشرة إلى الجنين.
  7. حقن ترانسبوساسي Tol2 وبلازميد يحف Tol2 ترانسجينيسيس
    1. ذوبان الجليد ترانسبوساسي مرناً وبلازميد Tol2 على الجليد. الجمع بين Cas9 مرناً (في 25 نانوغرام/ميليلتر)، والمطلوب Tol2 بناء (في 25 نانوغرام/μL)، والفينول الأحمر (≤10% من الحجم النهائي) في المياه خالية من رناسي. لخليط حقن ترانسجينيسيس Tol2 عينة، انظر الجدول 6.
    2. يبقى الحل الحقن والإبر على الجليد لتجنب تدهور مرناً. حقن 1 nL في وحدة التخزين في الجنين.

6-تربية والفحص حقن الأسماك

  1. تربية الأسماك حقن
    1. بعد أن يتم حقن البيض، فور نقلها إلى الأوعية الزجاجية (10 × 5 سم) مليئة ~ 200 مل من الأسماك نظام المياه. البيض هي تشطف بسهولة بغمس لوحات الحقن في أوعية مملوءة بالأسماك الماء والشطف البيض مع ماصة.
    2. ضع ~ 50–80 حقن الأجنة كل وعاء والخلفي منها في 22–24 °C.
    3. تنظيف الأطباق مع حقن الأسماك 2 x يوميا إزالة أجنة ميتة وتغيير ~ 20 ٪ المياه على أساس يومي.
    4. وتتم تربية إضافية وفقا للبروتوكولات المنشورة سابقا39.
  2. فحص الأفراد حقن morpholino
    1. تصور الحيوانات تحت ستيريوميكروسكوبي على الشاشة لتعمل. يمكن أن يستمر تأثير مورفولينوس يصل إلى ~ 5 أيام بوستينجيكشن21.
    2. قياس السلوكية تعمل في بوستينجيكشن 4 أيام.
  3. الكشف عن إينديلس كريسبر
    1. تصميم كبسولة تفجير لتضخيم الحمض النووي حول الموقع المستهدف. تصميم كبسولة تفجير بحيث أن المنتج بكر الهدف هو حوالي 100–125 شركة بريتيش بتروليوم.
      ملاحظة: على سبيل المثال، لموضع oca2 ، المنطقة المحيطة بموقع الهدف جرنة اتسع نطاق استخدام التمهيدي إلى الأمام 5 '-كتككتكتجتكاجكتجتجك-3' وعكس التمهيدي 5 '-جاجججاتجتجتكتاتجاجك-3' لطول منتج بكر 105 بي بي.
    2. التضحية بالأجنة أو زعنفة قصاصة الأسماك الكبار وفقا لبروتوكول الحيوان المؤسسية.
    3. جمع الأجنة أو زعانف تشريح إلى أنابيب PCR واستخراج الحمض النووي وتنفيذ بروتوكولات بكر تقارير إتمام المشروعات. عينة يمكن الاطلاع على الإشعال الخاصة بالجينات في Ma et al.35.
    4. تقييم للطفرات، تشغيل 5 ميليلتر منتج بكر على 3% [اغروس] هلام في 70 الخامس حاء 3 البرية من نوع الحمض النووي (نونموتاجينيزيد) سيؤدي إلى منتج PCR كعصابة متميزة. سيؤدي إلى الحمض النووي المسخ في فرقة ملطخ في الهلام.
    5. لتحديد تسلسل الآليلات متحولة، استنساخ تا المنتج بكر وفقا للشركة المصنعة'تعليمات s، اختيار المستعمرات، والثقافات مينيبريب. إرسال الحمض النووي الناتجة للتسلسل.
    6. إنشاء وصيانة خطوط الأسماك تحيل الآليلات متحولة، عبور الأسماك حقن البالغين للأسماك البرية من نوع، وشاشة 5–10 أجنة لتحديد إذا كان أي من ذرية تحمل اليل متحولة من الجينات 6.3.1-6.3.6 الخطوات التالية.
      ملاحظة: يمكن أن تحمل الأفراد1 و مختلفة من الأسماك مؤسس0 و نفس الطفرات المختلفة. ضمان خطوط متحولة هي متتابعة للحصول على الطفرات التي من المتوقع أن تنتج الآليلات التي خارج الإطار.
    7. التعرف على الأسماك التي تحمل اليل متحولة ببكر باستخدام مقايسة الفرقة ملطخ (الخطوات 6.3.1-6.3.6) أو بواسطة تصميم كبسولة تفجير PCR اليل المحددة التي سيتم تضخيم المسخ وعصابات البرية من نوع (الشكل 2).
    8. حالما يتم إنشاء خط للأسماك، هوموزيجوسي الآليلات متحولة ﻻختبار لتعمل المتنحية.
  4. الكشف عن الأفراد الإيجابية المعدلة وراثيا
    ملاحظة: استخدام بنيات التي تحتوي على صانع فلورسنت يوصي لتبسيط الفحص للأفراد الإيجابية المعدلة وراثيا. ومع ذلك، يمكن استخدام PCR القياسية فحص أساليب للشاشة لانتقال العدوى.
    1. تصور البروتينات الفلورية الأنسجة على حدة في السمك0 و أقرب وقت بوستينجيكشن يومين، مع ابيفلوريسسينسي تشريح نطاق.
      ملاحظة: التعبير في اليرقات0 و الفسيفساء، والأفراد الإيجابية قد تكون طائفة من التعبير تعمل.
    2. تبقى الأفراد الإيجابية و0 مؤسس الأسماك.
    3. عندما ق0و تصل إلى مرحلة النضج، باككروس الأسماك مؤسسا للأفراد نونترانسجينيك المستمدة من نفس الرصيد السكاني/المختبر. و الشاشة1 ذرية باستخدام البروتوكول نفسه كما هو موضح في الخطوة 6، 2.
      ملاحظة: التعبير في اليرقات1 و هو موحد ويضمن الاتساق بين الأشقاء و1 .
    4. التكامل Tol2 ليس الموقع بوساطة والتكامل يمكن أن تختلف بين مؤسسي، وحدد الأشقاء1 و المستمدة مؤسس0 و واحد وهجن معربا عن الإيجابية و1 الأشقاء لتوليد و2s. هذا الذرية سيكون الأساس لخط ثابت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إظهار عدة السكان تعيش في كهف مكسيكي (أ) انخفاض النوم واليقظة/النشاط المتزايد بالنسبة إلى على سطح منزل conspecifics14. هيبوكريتين/اوركسين (هكرت) هو neuropeptide مصانة عالية، مما يعمل على زيادة اليقظة، وتسبب الانحرافات في مسار هكرت الخدار في البشر وغيرها من الثدييات4847،. وقد أثبتنا سابقا أن الكهف مكسيكي (أ) زادت التعبير عن هكرت الببتيد، مما يوحي بأن زيادة تعبير عن هذا الببتيد قد تكمن وراء فقدان النوم في كافيفيش38. ضربة قاضية مو التعبير هكرت يوفر نهج قوية لدراسة تأثير زيادة هكرت التعبير فقدان النوم في كافيفيش بوساطة مباشرة.

لدراسة العلاقة بين التعبير هكرت والسكون، قمنا بتصميم morpholino حجب الترجمة. بدء bp أهداف 25 أول مو من إكسون أحد، بما في ذلك ATG الموقع (الشكل 1 أ،ب). كعنصر تحكم، نحن تستخدم عنصر تحكم مو مجمعة متاحة تجارياً (الشكل 1B). باستخدام خوارزمية الانفجار على نكبي، أكدنا أن هناك أية تأثيرات خارج الهدف لأي مو طوال الجينوم (البيانات لا تظهر). كانت ولدت ألف مكسيكي الأسماك السطحية وكافيفيش Pachón وجمعت بيضها وثم حقن 400 بيكوغرام من مو في nL 1-وحدة تخزين في مرحلة واحدة--الخلية (الشكل 1،د). كانت الأسماك إلى 4 إدارة الشرطة الاتحادية وثم قياس لنشاط وسلوك النوم.

كهف مكسيكي ألف- حقن بمراقبة النشاط الحركي أكثر إلى حد كبير مو معروضة وتقليل النوم على مدى فترة 24 ساعة مقارنة بالأسماك السطحية أيضا حقن مو المجمعة (الشكل 1E،F)، مما يوحي بأي تأثير التحكم في حقن morpholino النتائج تتماشى مع أنماط النشاط والنوم المنشورة سابقا في كل مورفوتيبي (t = 5.021، مدافع = 88، ف < 0.0001). حقن هكرت-مو أثر ضئيل على النوم في الأسماك السطحية بالمقارنة بحقن مراقبة صيد الأسماك (t = 0.17، مدافع = 88, p > 0.99). وفي المقابل، قد هكرت ضربة قاضية عبر حقن مو أثر كبير على النوم في الأسماك تعيش في كهف. Pachón cavefish اليرقات أظهر أقل من تخفيض أربعة إضعاف في النشاط الحركي، والنوم تقريبا مرتين أكثر من السيطرة على اليرقات Pachón (الشكل 1E،و؛ t = 2.694، مدافع = 88، ف < 0.05). وكشفت مقارنة بين النشاط الحركي والنوم في الأسماك تعيش في سطح، وكهف مو-ضربة قاضية المبالغ المقارنة الحركة والسكون (الشكل 1E، و). هذه البيانات بتوفير ارتباط مباشر بين التعبير هكرت وفقدان النوم وتوفر طريقة استجواب الآليات البيولوجية لفقدان النوم في نقراً تعيش في كهف تقحم المشتقة.

فقدان تصبغ السمة مميزة للكائنات الحية الكهف، والسكان أستياناكس تعيش في كهف متعددة تثبت فقدان تصبغ. تم تعيين المهق في كافيفيش مولينو و Pachón باستخدام رسم الخرائط QTL لمنطقة الجينوم المحتوية على الجينات، المهق بصري 2 (oca2)، مما يوحي بالطفرات في oca2 تكمن وراء المهق في كافيفيش6.

للتحقق من صحة oca2 كموضع المسبّب المهق في كهف Pachón نقراً، نحن تستخدم كريسبر/Cas9 تحرير الجينات تتحول هذه المنطقة في التجمعات السمكية السطحية. حيث يتم حذف إكسون 21 في Molino الأسماك6، صممنا جرنة لاستهداف هذه المنطقة من الجينات (الشكل 2A). تسلسل الجينوم، بما في ذلك تسلسل الهدف جرنة وبام (الغامق)، هو 5 '-جتكاتجتججتكتكاجكتتج-3'. تم استخدام هذا التسلسل المستهدفة (بدون تسلسل بام) لتوليد جرنا للطفرات المستهدفة. مربي السطحية رفيقه، وتم جمع الأجنة الناتجة في مرحلة واحدة-الخلية. تم حقن الأجنة مرحلة خلية واحدة مع Cas9 مرناً و استهداف جرنة oca2، وأثيرت حقن الحيوانات لمرحلة البلوغ43. البالغين حقن قدمت إلى رفيقه إلى البرية من نوع الأسماك السطحية، والأجنة من هذه الصلبان جينوتيبيد لتحديد انتقال جرثومة-خط، استخدام كبسولة تفجير من الخطوة 6.3.1. نحن متسلسلة اليل متحولة oca2 وحددت حذف بي بي 2 الجرثومية-خط-أحال في oca2 (الشكل 2،ج). تيسيرا للتنميط، قمنا بتصميم كبسولة تفجير اليل على حدة لتحديد الآليلات البرية من نوع والمسخ (الشكل 2D) والأسماك جينوتيبيد، باستخدام PCR تليها هلام استشراد (الشكل 2E). ونحن إينكروسيد الأسماك السطحية متخالف لهذا اليل متحولة oca2. كانت مصطبغة ذرية الناتجة أو ألبينو (الشكل 2 واو--أنا). وكانت الأفراد المصطبغة البرية من نوع أو متخالف في محور oca2، بينما كان الأفراد ألبينو المسخ متماثل (الشكل 2E). توفر هذه البيانات ارتباط مباشر بين موضع الجينات oca2 والمهق في كافيفيش ألف مكسيكي .

تختلف عدد لا يحصى من السلوكيات مثل النوم، والتغذية، والإجهاد في cavefish مكسيكي (أ) بالنسبة إلى conspecifics السطحية، بعد المقومات العصبية الأساسية بين نقراً ما زالت غير واضحة. تصوير الدماغ كل الكالسيوم يوفر نهجاً غير متحيزة قوية لدراسة العلاقات المتبادلة بين النشاط العصبي تغيير وتعديل السلوك. نحن تولد الأسماك السطحية وكافيفيش مع تعبير العصبية قرب كل مكان المؤشر الكالسيوم وراثيا المرمزة، GCaMP6s، باستخدام الكواشف المستخدمة على نطاق واسع في البحوث الزرد. مثل الصفحة الخاصة بالخلايا العصبية الحمض النووي الريبي ملزمة البروتين 3 يتم التعبير عن اندوجينوسلي في الخلايا العصبية حديثا متباينة في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي49 (elavl3) وقد استخدمت في الزرد إلى محرك التعبير عن البروتينات طوال غالبية العصبي50. حصلنا على بنية Tol2 يحتوي على ~2.8 كيلو بايت الزرد elavl3 المروج النسخ المنبع المؤشر الكالسيوم وراثيا المرمزة GCaMP6s (مزيج من البروتينات الفلورية الخضراء [بروتينات فلورية خضراء] وكالمودولين M13، تسلسل ببتيد من الميوسين النور-سلسلة كيناز)، الذي كان واقفاً في نهايات 5 'و 3' مع مواقع Tol2 (Tol2-elavl3:GCaMP6s-Tol2)51.

ألف مكسيكي الأسماك السطحية و cavefish مولينو قد ولدت، وكانت كوينجيكتيد الأجنة الناتجة في مرحلة وحيدة الخلية مع 25 نانوغرام/ميكروليتر من Tol2-elavl3:GCaMP6s-Tol2 بناء و 25 نانوغرام/ميكروليتر Tol2 ترانسبوساسي مرناً (الشكل 3A). في 24 – 48 إدارة الشرطة الاتحادية، تم فحص يرقات لتعبير العصبية عابر من GCaMP6s. رفع إلى مرحلة البلوغ هذه الأجنة (F0) حقن مع تعبير عن GCaMP6s وباككروسيد مع الكبار البرية من نوع مشتقة من نفس النسب من الأسماك السطحية أو كافيفيش. تم فحص الكبار F1 الناتجة لتعبير عن GCaMP6s التعبير بشكل مستقر، وأبقى على تلك اليرقات لتوليد خطوط مستقرة (الشكل 3،ج). لأن كل الكبار F1 مع تعبير مستقر قد يحتمل المتكاملة Tol2-elavl3: GCaMP6s-Tol2 في مواقع مختلفة في الجينوم، عينت كل F1 اليل مختلفة. باستخدام هذا النهج، ونحن قد ولدت F1s مستقرة للأسماك السطحية ومولينو كافيفيش السكان (الشكل 3،ج)، وبالتالي تمكين الكالسيوم يعيش التصوير للكشف عن الفروق في نشاط الخلايا العصبية بوساطة التغيرات السلوكية في كهف البيئة (الشكل 3 ج،د). علاوة على ذلك، هذا النهج يرسي الأساس للتعبير عن العديد من المتسلسلات إضافية توصيف ومعالجة وظيفة الجينات في ألف مكسيكي.

Figure 1
الشكل 1: Morpholino ضربة قاضية هكرت يقلل من النشاط ويزيد من النوم في كافيفيش- (أ) حظر الترجمة بي بي الأهداف 25 أول morpholino من هكرت الترميز تسلسل، بما في ذلك موقع بدء ATG. (ب) هكرت morpholino اليغو (مو) وتسلسلات تحكم. (ج) محاذاة ~ 200 خلية واحدة البيض في قوالب البيض [اغروس] للحقن. (د) Microinjection 1.0 nL حقن خليط مع مؤشر أحمر الفينول للتصور. شريط مقياس = 0.5 مم. (ﻫ) Morpholino ضربة قاضية هكرت يقلل من النشاط (المسافة الإجمالية سافر) من كافيفيش Pachón (t = 5.021، مدافع = 88، ف < 0.0001) ولكن ليس من الأسماك السطحية (t = 1.318، مدافع = 88، ف > 0.72). ضربة قاضية (F) يزيد من النوم في كافيفيش Pachón (t = 2.694، مدافع = 88، ف < 0.05) ولكن ليس له تأثير على الأسماك السطحية (t = 0.17، مدافع = 88, p > 0.99). شريط المقياس = 1 مم. مجالات الخطأ في لوحات هاء وواو تدل على الخطأ المعياري للوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الرقم 2: كريسبر جين-تحرير oca2 يدخل المهق في السطح-مسكن مكسيكي أ. التخطيطي (A) oca2 ترميز المناطق ودليل الحمض النووي الريبي (جرنا) استهداف إكسون 21 لتحرير كريسبر بوساطة الجينات. (ب) تسلسل chromatogram من البرية من نوع Oca2 + و (ج) متحولة Oca2- الآليلات. مربع أحمر في لوحة ب يشير إلى تسلسل بي بي 2، ومفقود في المسخ Oca2- اليل صورت في لوحة ج. (د) "استهدفت كريسبر" يدخل حذف بي بي 2، تحريف Oca2 الدالة. كبسولة تفجير صممت لفحص قد حذف بي بي 2 في ذرية F0. التفريد (ﻫ) PCR وجل من Oca2 في البرية من نوع الأسماك السطحية (الفرقة الحجم = 134 bp) وحقن كريسبر F0 ذرية (الفرقة الحجم = 133 bp). هي مصطبغة الأفراد متماثل أو متخالف للبديل البرية من نوع من Oca2 (Oca2 +)، بينما F0s متماثل لحذف بي بي 2 (Oca2-) ميناء المهق. (و) صور كامل الجسم من البرية من نوع سطح الأسماك و (ز) من الأسماك السطحية بوساطة كريسبر المهق. شريط المقياس = 5 ملم. (حاء و طاء) ماجنيفيد عرض الرؤساء للأفراد التي صورت في لوحات F G، على التوالي. شريط المقياس = 2 مم- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: ترانسجينيسيس Tol2 من GCAMP6s الخلايا العصبية القومية يمكن تصوير مباشر لنشاط الدماغ في مكسيكي أ. (أ) ترانسجينيسيس Tol2 بوساطة في ألف مكسيكي. كوينجيكشن مرناً Tol2 و Tol2-elav3l: يدمج بلازميد GCAMP6s-Tol2 GCAMP6s التحوير في مؤسسي F0. باككروسينج للأسهم الأصلية من الأسماك البرية من نوع غلة الأفراد F1 مع تعبير عموم العصبية مستقرة من GCAMP6s. (ب وج) ذرية الناتجة يتم فحصهم لتعبير مستقر باستخدام التشريح والفحص المجهري [كنفوكل]. مستقرة تجاستي(elav3l: GCaMP6s) أنشئت الأفراد F1 لكل سطح-(يصور في لوحة ب) وتعيش في كهف مورفوتيبيس (يصور في لوحة ج). شريط المقياس = 200 ميكرومتر.  الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

كاشف الحجم أو الكمية
ميكروغرام 10.0 من أجهزة الكمبيوتر--zT2TP بلازميد الحمض النووي X μl
NEB كوتسمارت المخزن المؤقت ميكروليتر 10.0
نوتي-HF الإنزيم ميكروليتر 2.0
خالية من نوكلاس ح2س X μl
جيش صرب البوسنة ميكروليتر 1.0
المجموع 100 ميكروليتر

الجدول 1: ملخص القيد من بلازميد Tol2.

كاشف الحجم أو الكمية
ميكروغرام 1.0 لأجهزة الكمبيوتر--zT2TP خطيا بلازميد الحمض النووي X μl
10 س رد فعل المخزن المؤقت ميكروليتر 2.0
2 × NTP/CAP ميكروليتر 10.0
ميكس إنزيم SP6 ميكروليتر 2.0
خالية من رناسي ح2س X μl
المجموع دي تو زيرو ميكروليتر

الجدول 2: توليف مرناً Tol2 في المختبر.

اسم الإعداد قيمة الإعداد
الحرارة 510
سحب 55
السرعة 100
الوقت 40
الضغط 500
منحدر 534

الجدول 3: نموذج سحب ماصة البروتوكول. 

كاشف الحجم أو الكمية
Morpholino (المخزون المجمد @ 4 مم) ميكروليتر 1.0
خالية من نوكلاس دانو للحل أو ح2س ميكروليتر 17.0
أحمر الفينول ميكروليتر 2.0
المجموع 20 ميكروليتر

الجدول 4: Morpholino حقن الخليط.

كاشف حجم المبلغ
جرنا (تركيز العامل النهائي @ 100ng/ميكروليتر) 1 ميكروليتر
Cas9 مرناً (تركيز العامل النهائي @ 1200ng/ميكروليتر) 1 ميكروليتر
خالية من رناسي ح2س 2 ميكروليتر
المجموع 4 ميكروليتر

الجدول 5: نموذج كريسبر/Cas9 حقن الخليط.

كاشف حجم المبلغ
بلازميد Tol2 (تركيز العامل النهائي @ 25ng/ميكروليتر) X μl
Tol2 مرناً (تركيز العامل النهائي @ 25ng/ميكروليتر) X μl
أحمر الفينول ميكروليتر 1.0
خالية من رناسي ح2س X μl
المجموع 15 ميكروليتر

الجدول 6: نموذج Tol2 ترانسجينيسيس حقن الخليط

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وهنا، قدمنا منهجية للتلاعب بالجينات دالة باستخدام مورفولينوس، وجين كريسبر/Cas9 التحرير، ومنهجية ترانسجينيسيس. يرجح أن ثروة التكنولوجيا الوراثية وتعظيم الاستفادة من هذه النظم في الزرد سيسمح بنقل هذه الأدوات إلى ألف مكسيكي مع سهولة52. النتائج الأخيرة استخدمت هذه النهج في مكسيكي (أ)، ولكنها لا تزال غير مستغلة في مجال التحقيق في مختلف الصفات المورفولوجية وإنمائي والسلوكية في هذا النظام30،،من3642 , 53.

مورفولينوس قد استخدمت على نطاق واسع في البحوث الزرد إلى ضربة قاضية الجينات. النهج السطحية وينتج ضربة قاضية قوية التعبير. ومع ذلك، كانت الآثار خارج الهدف موثقة على نطاق واسع22،53؛ وهكذا، ينبغي أن ترصد بعناية الحيوانات التي قد تم حقن مورفولينوس لأي22،تعمل غير متوقعة55. عندما يكون ذلك ممكناً، ينبغي التحقق من صحة النتائج التي تم الحصول عليها من morpholino ضربة قاضية من خلال استخدام أساليب أخرى، مثل النهج خروج المغلوب كريسبر/Cas9-بوساطة. بينما تسمح مورفولينوس بضربه قاضية قوية التعبير الجيني، ضربة قاضية بوساطة morpholino عابرة. وهكذا، تحليل تعمل الكبار من غير الممكن عند استخدام هذا الأسلوب.

ويقدم الطفرات كريسبر/Cas9-بوساطة المعالجة المباشرة لجينات محددة. علاوة على ذلك، خلافا لوساطة morpholino ضربة قاضية، يسمح الطفرات كريسبر/Cas9 لتحليل تعمل متحولة إلى مرحلة البلوغ. لمنع حدوث آثار خارج الهدف كريسبر/Cas9، ينبغي أن أووتكروسيد خطوط متحولة عدة أجيال، وعندما يكون ذلك ممكناً، ينبغي الحصول على اليل واحد أو أكثر واختبارها. ويوفر النظام كريسبر/Cas9 أيضا الإمكانات لاستخدام نهج تحرير الجينات لضرب-في الآليلات أو لإنتاج التغييرات الوراثية المحددة. نظام كريسبر/Cas9 قد استخدمت في الزرد لإنتاج تكاملات محددة خارجية الحمض النووي وتولد الطفرات الدقيقة19،20،56،،من5758، 59-مع تسلسل الجينوم كافيفيش، من الممكن الآن تحديد مجمع الأشكال المتعددة النوكليوتيدات واحدة (بطانات) أو غيرها من التغييرات الوراثية خفية بين الأسماك السطحية و السكان كافيفيش33. تطبيق تحرير الجينات كريسبر/Cas9 يوفر الفرصة لتبادل الآليلات بين الأسماك السطحية وكافيفيش، أو بين مختلف قطاعات السكان من كافيفيش، دراسة دور هذه التغيرات الوراثية في العمليات الإنمائية المختلفة.

النهج ترانسجينيسيس الموصوفة في هذا البروتوكول يوفر طريقة بسيطة وقوية للدراسات مكسب لوظيفة وإيجاد أدوات لتغيير العمليات البيولوجية وراثيا. نظام Tol2 يستخدم على نطاق واسع في البحوث الزرد، وإننا قد أظهرت أنها قوية وبالمثل في ألف مكسيكي. وعلاوة على ذلك، أثبتنا بنية المعدلة وراثيا التي تم إنشاؤها في الزرد التي يستخدم مروج الزرد، ويجمل التعبير الذاتية في ألف مكسيكي. وقد وجدنا أربعة مروجين الأخرى المعزولة من الزرد هذا التعبير الخاصة بالانسجة محرك الأقراص كما هو متوقع في ألف مكسيكي (البيانات لا تظهر). منذ المروجين الزرد الخص أنماط التعبير مصانة في مكسيكي، وهذا يوحي بأن العديد من الأدوات الجينية التي يمكن نقلها مباشرة من الزرد إلى مكسيكي دون الحاجة للتعديل مع أ مكسيكي بروموتورس. وعلاوة على ذلك، مع التقدم في تكنولوجيا التسلسل في مكسيكي ألف-33، سوف تسمح نهج محوره وراثيا الموصوفة هنا مستقبل قوية للتحقيق في المنشطات والمروجين التي قد تلعب دوراً في الاختلاف بين أشكال السطح والكهف. وأخيراً، أدوات قوية للتحوير الوراثي للعمليات البيولوجية التي جعلت الزرد قيمة نفس القدر من الأهمية في مكسيكي ألف-60،61،62،63. التأكيد على الاختلافات في السمات السلوكية المتنوعة، مثل النوم، والتغذية،، والعدوان، وبين أشكال مسكن سطح، وكهف مكسيكي (أ) كانت موثقة على نطاق واسع12،14،15 ،،من3864، بعد الكامنة وراء يرتبط العصبية ليست مفهومة جيدا. وسوف تسمح أدوات مثل Tg(elavl3:GCaMP6s) تشريح كيف ترتبط مع الاختلافات في السلوك اختلافات في نشاط الخلايا العصبية على مستوى الدماغ وتقدم نظرة فريدة في كيفية الدماغ قد يكون تعديل تقحم.

أخذت معا، تستعد مكسيكي (أ) لتصبح نموذجا رائدا للتحقيق في تطور مجموعة متنوعة من الصفات المورفولوجية والسلوكية. الاختلافات المتنوعة في العمليات البيولوجية المعقدة في مكسيكي (أ) توفير منبر للتحقيق في آليات التطور السمات الوراثية. قد يساعد تطبيق أدوات للتلاعب بالجينات مهمة وضع هذا الكائن في نموذج التي يمكن تطبيقها على التحقيق في الأمراض البيولوجية المتصلة بضمور العين والتشوهات النمائية، والأرق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

نشكر واضعي ثاكور سونيشكا لمساعدتها في التنميط والتصوير oca2 الأسماك المسخ هو مبين في الشكل 2. وأيده هذا العمل جائزة مؤسسة العلوم الوطنية (NSF) 1656574 للكلية، وجبهة الخلاص الوطني جائزة 1754321 جي والكلية، والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) جائزة R21NS105071 للكلية و E.R.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fish breeding & egg supplies
Fine mesh fish net Penn Plax BN4
Fish tank heater Aqueon 100106108
Egg traps Custom made NA Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs
Glass pipettes Fisher Scientific 13-678-20C
Pipette bulbs Fisher Scientific 03-448-21
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Egg molds Adaptive Science Tools TU-1
Morpholino supplies
Control Morpholino Gene Tools, LLC Standard control olio
Custom Morpholino Gene Tools, LLC NA
Phenol Red Sigma Aldrich P0290-100ML
CRISPR supplies
Cas9 Plasmid AddGene 46757
GoTaq DNA Polymerase Promega M3001
KOD Hot Start Taq EMD Millipore 71-842-3
Primers Integrated DNA Technologies Custom
T7 Megascript Kit Ambion/Thermofisher AM1333
miRNeasy Kit Qiagen 217004
mMessage mMachine T3 kit Ambion/Thermofisher AM1348
MinElute Kit Qiagen 28204
Tol2 transgenesis supplies
pCS-zT2TP plasmid Kawakami et al., 2004 Request from senior author
CutSmart Buffer New England Biolabs B7204
NotI-HF Restriction Enzyme New England Biolabs R3189
PCR purification Kit Qiagen 28104
SP6 mMessenger Kit Ambion/Thermofisher AM1340
Microinjection supplies
Glass Capillary Tubes Sutter Instruments BF100-58-10
Pipette puller Sutter Instruments P-97
Picoinjector Warner Instruments PLI-100A
Micromanipulator World Precision Instruments M3301R
Micromanipulator Stand World Precision Instruments M10
Micmanipulator Base World Precision Instruments Steel Plate Base, 10 lbs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Darwin, C. On the Origin of Species by Means of Natural Selection. , D. Appleton and Company. (1859).
  2. Culver, D. C., Pipan, T. The Biology of Caves and Other Subterranean Habitats. , Oxford University Press. New York, NY. (2009).
  3. Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. Mexican Eyeless Characin Fishes, Genus Astyanax: Environment, Distribution, and Evolution. , (1977).
  4. Huppop, K. Oxygen consumption of Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces): A comparison of epigean and hypogean populations. Environmental Biology of Fishes. 17, 299-308 (1986).
  5. Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican Cavefish Save Energy by Eliminating the Circadian Rhythm in Metabolism. PLoS ONE. 9 (9), e107877 (2014).
  6. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature genetics. 38, 107-111 (2006).
  7. Wall, A., Volkoff, H. Effects of fasting and feeding on the brain mRNA expressions of orexin tyrosine hydroxylase (TH), PYY and CCK in the Mexican blind cavefish (Astyanax fasciatus mexicanus). General and Comparative Endocrinology. 183, 44-52 (2013).
  8. Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
  9. Yoshizawa, M., Gorički, Š, Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
  10. Jeffery, W. R. Regressive Evolution in Astyanax Cavefish. Annual Review of Genetics. 43, 25-47 (2009).
  11. Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evolutionary Biology. 12, 105 (2012).
  12. Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
  13. Kowalko, J. E. J., et al. Loss of schooling behavior in cavefish through sight-dependent and sight-independent mechanisms. Current Biology. 23 (19), 1874-1883 (2013).
  14. Duboué, E. R. E. R., Keene, A. C. A. C., Borowsky, R. L. R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
  15. Chin, J. S., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. , (2018).
  16. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
  17. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (21), 11403-11408 (2000).
  18. Balciunas, D., et al. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. , (2004).
  19. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
  20. Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. I. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, (2014).
  21. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A Primer for Morpholino Use in Zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  22. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene “knockdown” in zebrafish. Nature Genetics. , (2000).
  23. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
  24. Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
  25. Kawakami, K. Transposon tools and methods in zebrafish. Developmental Dynamics. 234 (2), 244-254 (2005).
  26. Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition. Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).
  27. Juntti, S. A., Hu, C. K., Fernald, R. D. Tol2-Mediated Generation of a Transgenic Haplochromine Cichlid, Astatotilapia burtoni. PLoS ONE. 8 (10), (2013).
  28. Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish. Nature Protocols. 11 (10), 2010-2028 (2016).
  29. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks. Journal of Visualized Experiments. (111), e54055 (2016).
  30. Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
  31. Keene, A., Yoshizawa, M., McGaugh, S. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , Academic Press. New York, NY. (2015).
  32. Casane, D., Rétaux, S. Evolutionary Genetics of the Cavefish Astyanax mexicanus. Advances in Genetics. 95, 117-159 (2016).
  33. Mcgaugh, S., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, 5307 (2014).
  34. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), (2015).
  35. Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
  36. Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS ONE. 8 (11), e80823 (2013).
  37. Alie, A., et al. Developmental evolution of the forebrain in cavefish: from natural variations in neuropeptides to behavior. eLife. 7, e32808 (2018).
  38. Jaggard, J. B., et al. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. 7, e32637 (2018).
  39. Borowsky, R. Handling Astyanax mexicanus eggs and fry. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
  40. Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Advances in Genetics. 92, 1-52 (2015).
  41. Wierson, W. A., et al. GeneWeld: a method for efficient targeted integration directed by short homology. BioRxiv. , (2018).
  42. Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. , (2018).
  43. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  44. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  45. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  46. Kowalko, J., Ma, L., Jeffery, W. Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs). Journal of Visualized Experiments. (112), e54113 (2016).
  47. Nishino, S., Ripley, B., Overeem, S., Lammers, G. J., Mignot, E. Hypocretin (orexin) deficiency in human narcolepsy. Lancet. , (2000).
  48. Lin, L., et al. The sleep disorder canine narcolepsy is caused by a mutation in the hypocretin (orexin) receptor 2. Cell. , (1999).
  49. Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic Zebrafish with fluorescent neurons. Developmental Biology. 227 (2), 279-293 (2000).
  50. Higashijima, S., Masino, M. A., Mandel, G., Fetcho, J. R. Imaging Neuronal Activity During Zebrafish Behavior With a Genetically Encoded Calcium Indicator. Journal of Neurophysiology. , (2003).
  51. Vladimirov, N., et al. Light-sheet functional imaging in fictively behaving zebrafish. Nature Methods. 11 (9), 883-884 (2014).
  52. Halpern, M. E., et al. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).
  53. Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. bioRxiv. 7, e32637 (2018).
  54. Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Briefings in Functional Genomics. , (2011).
  55. Robu, M. E., et al. p53 activation by knockdown technologies. PLoS Genetics. , (2007).
  56. Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841 (2015).
  57. Prykhozhij, S., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Res. 46 (17), (2018).
  58. Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
  59. Armstrong, G., Liao, M., You, Z., Lissouba, A., Chen, B., Drapeau, P. Homology Directed Knockin of Point Mutations in the Zebrafish tardbp and fus Genes in ALS Using the CRISPR/Cas9 System. PLoS ONE. 11 (3), (2016).
  60. Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit Neuroscience in Zebrafish. Current Biology. 20 (8), (2010).
  61. Friedrich, R. W., Genoud, C., Wanner, A. A. Analyzing the structure and function of neuronal circuits in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  62. Scott, E. K., et al. Targeting neural circuitry in zebrafish using GAL4 enhancer trapping. Nature Methods. 4 (4), 323-326 (2007).
  63. Asakawa, K., Kawakami, K. Targeted gene expression by the Gal4-UAS system in zebrafish. Development Growth and Differentiation. , (2008).
  64. Lloyd, E., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. , (2018).

Tags

علم الوراثة، العدد 146، علوم الحياة، علوم الحياة (العامة)، كافيفيش، كريسبر، تحرير الجينات، ترانسجينيسيس، morpholino، ضربة قاضية
التلاعب بالجينات الدالة في كافيفيش المكسيكي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stahl, B. A., Jaggard, J. B., Chin,… More

Stahl, B. A., Jaggard, J. B., Chin, J. S. R., Kowalko, J. E., Keene, A. C., Duboué, E. R. Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish. J. Vis. Exp. (146), e59093, doi:10.3791/59093 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter