Summary
يمكن التعرف عليه المنتجة أثناء النسخ المتماثل فيروسات الرنا الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل بنمط الاعتراف مستقبلات للحث استجابة المناعية فطرية. للبحث عن فيروسات الحمض النووي الريبي الشعور السلبي، التفاعل بين دسرنا ذات المستوى المنخفض وبرس مازال غير واضح. قمنا بتطوير أسلوب الفحص المجهري [كنفوكل] لتصور دسرنا أرينافيروس وبر في الخلايا الفردية.
Abstract
مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل (ds) الجيش الملكي النيبالي ينتج متوسطة replicative أثناء الإصابة بفيروسات الرنا. الاعتراف دسرنا بالمضيف نمط الاعتراف مستقبلات (برس) مثل حمض الريتينويك (تلاعب-أنا) مثل مستقبلات (رلرس) تلاعب-وسرطان الجلد المرتبطة بالتمايز البروتين 5 (نجمة داود الحمراء-5) يؤدي إلى تحريض الاستجابة المناعية الفطرية. تشكيل وتوزيع داخل الخلايا دسرنا في الإصابة بفيروسات الرنا إيجابية بمعنى جيد اتسم بالفحص المجهري. تؤدي العديد من فيروسات الحمض النووي الريبي الشعور السلبي، بما في ذلك بعض أرينافيروسيس، الاستجابة المناعية الفطرية أثناء الإصابة. ومع ذلك، يعتقد فيروسات الرنا سلبي بمعنى إنتاج مستويات منخفضة من دسرنا، مما يعوق الدراسة التصوير بر الاعتراف دسرنا الفيروسية. بالإضافة إلى ذلك، يجب إجراء تجارب العدوى مع أرينافيروسيس شديدة العدوى في مرافق مستوى السلامة الأحيائية الاحتواء عالية (BSL-4). التفاعل بين الجيش الملكي النيبالي الفيروسية وبرس لفيروسات الرنا شديد العدوى غير معروف إلى حد كبير نظراً للتحديات التقنية الإضافية التي يحتاج الباحثون مواجهة في مرافق BSL-4. في الآونة الأخيرة، تم العثور على جسم [مونوكلونل] (ماب) (استنساخ 5 9) في الأصل تستخدم للكشف عن الفيروس المعوي عموم على وجه التحديد الكشف عن دسرنا مع حساسية أعلى من الأجسام المضادة-دسرنا J2 أو K1 التقليدية. هنا، باستخدام 5 9 جسم، يمكننا وصف بروتوكول الفحص المجهري [كنفوكل] التي استخدمت بنجاح لتصور دسرنا والبروتينات الفيروسية وبر في نفس الوقت في الخلايا الفردية بالعدوى عن طريق أرينافيروس. البروتوكول أيضا مناسبة للتصوير الدراسات دسرنا وتوزيع بر في خلايا أرينافيروس المسببة للأمراض بالعدوى في مرافق BSL4.
Introduction
الخطوة الأولى في تنظيم دورات تعريفية للاستجابة المناعية الفطرية المضيف اعتراف مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل (ds) الجيش الملكي النيبالي المستقبلات التعرف على نمط (برس) مثل حمض الريتينويك (تلاعب-أنا) مثل مستقبلات (رلرس) تلاعب-وسرطان الجلد المرتبط بتمايز البروتين 5 (نجمة داود الحمراء-5)1. للبحث عن فيروسات الرنا إيجابية، بمعنى، دسرنا يمكن عادة يسهل الكشف عن استخدام J2 أو K1 مونوكلونل (ماب) مكافحة دسرنا2. التفاعل بين دسرنا وبرس في فيروسات الرنا حبلا إيجابية، مثل بيكورنافيروس، اتسم باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]3. ومع ذلك، للنفي بمعنى فيروسات الرنا، التصور والوصف للتفاعل بر ودسرنا عرقل عدم وجود الأجسام المضادة حساسة إلى دسرنا. الجيش الملكي النيبالي فلوري التهجين في الموقع (الأسماك) قد طبق على التصور من الجيش الملكي النيبالي وبرس الفيروسية4. على الرغم من ذلك، يتطلب معرفة الهدف تسلسل الحمض النووي الريبي المنهجية الأسماك وقد لا تكون متوافقة مع بر تلطيخ المشترك. في الآونة الأخيرة، 5 9 ماب، التي وضعت أصلاً لتشخيص الإصابة بالفيروس المعوي عموم، وجد أن تكون أكثر حساسية من ماب J2 ويمكن أن يسهل الكشف عن دسرنا السلبية-معنى الإصابة بفيروسات الرنا5،6. وهكذا، هو ماب 5 9 رواية وأداة مفيدة لدراسة النسخ المتماثل الفيروسية والتفاعل بين بر والجيش الملكي النيبالي الفيروسية لفيروسات الرنا بمعنى سلبي.
أرينافيروسيس هي عائلة من فيروسات الحمض النووي الريبي المفرد-الذين تقطعت بهم السبل، والسلبية، بمعنى، التي تشمل عدة مسببات الأمراض البشرية، مثل الفيروسات آسا (لاسف) وفيروس جونين (جانف) وفيروس ماتشوبو (مكف)، التي تسبب أمراض الحمى النزفية الحادة في البشر7. البيانات السريرية من حالات حادة وقاتلة من الحمى النزفية الأرجنتينية الناجمة عن أرينافيروس العالمي الجديد جانف يحمل مستويات عالية على نحو غير عادي للمصل IFN-α8،9. وقد أظهرنا أن أرينافيروسيس NW المسببة للأمراض (جانف ومكف)، ولكن ليس الممرضة العالم القديم أرينافيروس، لاسف، الحث على نوع أنا استجابة انترفيرون (IFN) في الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الوحيدات10. وعلاوة على ذلك، تلاعب-يعتبر من أجهزة الاستشعار التوسط للنوع الأول استجابة IFN في الخلايا المصابة جانف11. كما وجدنا أن تنشيط مستقبلات البروتين كيناز R (PKR)، الذي يعرف تقليديا للاعتراف دسرنا، في أرينافيروس شمال غرب الممرضة العدوى12. زيادة فهم إليه استجابة IFN الخاصة بالفيروس أثناء الإصابة أرينافيروس، كنا نهدف إلى وضع بروتوكول لتصور التفاعل بين دسرنا الفيروسية وبرس هيولى.
تجارب العدوى مع الممرضة جانف، مكف ولاسف قد يكون أداؤها في السلامة الأحيائية من المستوى 4 (BSL-4) المرافق. وهكذا، بالإضافة إلى يفترض أن انخفاض مستوى دسرنا شكلت في الإصابة أرينافيروس، الوفاء بمتطلبات السلامة البيولوجية تقنية تحد آخر عند إجراء دراسات التصوير لهذه الفيروسات المسببة للأمراض عالية. باستخدام 5 9 جسم وسلالة اللقاح Candid1 # من جانف، بروتوكول المستندة إلى الفحص المجهري [كنفوكل] المبين في هذا التقرير، وقد استخدمت بنجاح لتصور دسرنا والبروتينات الفيروسية وبر في الخلايا المصابة التي أرينافيروس في واحد مختبرات BSL2. البروتوكول أيضا مناسبة للتصور للتوزيع داخل الخلايا دسرنا وبر خلال العدوى أرينافيروس المسببة للأمراض في مرافق BSL4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد خلايا A549 والعدوى جونف
- البذور 2 × 105 الرئة البشرية A549 الخلايا الظهارية على بولي-د-يسين (PDL) مغلفة بالزجاج كوفيرسليبس في لوحات 12-جيدا في 24 ساعة قبل الإصابة.
- تحضير مختبرين 150 مل من جانف13 في مضاعفة الإصابة (وزارة الداخلية) 1.0 البلاك تشكيل وحدة كل خلية مخفف في وسائل الإعلام المتوسطة (دميم) "تعديل النسر" دولبيكو تستكمل مع 2% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين 1% وستربتوميسين (P/S ).
- قم بإزالة الوسائط من زراعة الخلايا. إضافة فيروس العدوى في كل ساترة التي تتضمن أيضا واحتضانها ح 1.5 عند 37 درجة مئوية. اهتز لوحات كل 15 دقيقة.
- إزالة العدوى الفيروس، إضافة 1 مل دميم وتستكمل مع 5% FBS و 1% P/س. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لنقطة في الوقت المطلوب.
2. تثبيت وإيمونوستينينج
- نضح وسائط الإعلام. شطف الخلايا بإضافة 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تستكمل مع الكالسيوم والمغنيسيوم لكل بئر.
- قم بإزالة برنامج تلفزيوني. أضف 1 مل ميثانول (ميوه) مبردة مسبقاً في-20 درجة مئوية، واحتضان في-20 درجة مئوية أو على الثلج الجاف لمدة 15 دقيقة.
- إزالة ميوه.
- أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني لكل بئر، وعينات المياه والصرف الصحي في 4 درجات مئوية مع هزاز لطيف للحد الأدنى 5 تكرار الغسيل لما مجموعة 4 مرات.
- تغسل الخلايا الثابتة في كوفيرسليبس في 1 مل من 0.2% t-أوكتيلفينوكسيبوليثوكسييثانول لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية، مع هزاز لطيف.
- أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني لكل بئر. تغسل العينات عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق مع هزاز لطيف. كرر الخطوة الغسيل لما مجموعة 4 مرات.
- كشف دسرنا و MDA5 واحتضان عينات في 200 مل من الأجسام المضادة الأساسي المخفف في ألبومين المصل البقري 3% (BSA). تمييع الأجسام المضادة-دسرنا 5 9 في إضعاف 1:2 وتمييع الأجسام المضادة-جمعية نجمة داود الحمراء--5 في 1: 250. احتضان مع هزاز لطيف في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- إزالة الأجسام المضادة الأولية وتغسل كل جيدا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق مع لطيف هزاز في تكرار الرايت هذا أغسل أربع مرات أكثر.
- إضافة 200 مل من الأجسام المضادة الثانوية (1:2، 000 تمييع) المخفف في جيش صرب البوسنة 3% واحتضان في RT ح 1.
- إزالة الأجسام المضادة الثانوية وتغسل كل جيدا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق مع لطيف هزاز في تكرار الرايت هذا أغسل أربع مرات أكثر.
- للكشف عن البروتين النووي جانف (NP) وتلاعب-الأول وإضافة 200 مل من الأجسام المضادة مترافق المخفف في جيش صرب البوسنة 3%. تمييع NP جانف المضادة مترافق (AG-12) في 1:1,000، واحتضان عينات ح 2 في الرايت مع هزاز لطيف. تمييع مترافق الأجسام المضادة-ريج--أنا في 1: 500 واحتضان في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها مع هزاز لطيف.
- إزالة الأجسام المضادة مترافق وتغسل كل جيدا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق مع لطيف هزاز في تكرار الرايت هذا أغسل أربع مرات أكثر.
- كونتيرستين كوفيرسليبس مع DAPI (1:1، 000) لمدة 3 دقائق مع هزاز لطيف في الرايت
- تغسل في كوفيرسليبس 3 مرات، كل مرة لمدة 5 دقائق في 1 مل من 0.5% t-أوكتيلفينوكسيبوليثوكسييثانول مع هزاز لطيف في الرايت
- تغسل مرتين في 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في كل مرة مع هزاز لطيف في الرايت
- أغسل مرة واحدة في 1 مل من ddH2س لمدة 1 دقيقة على RT، تعصف بلطف.
- جبل كوفيرسليبس على الشرائح الزجاجية باستخدام وسائل الإعلام المتزايدة. واسمحوا علاج بين عشية وضحاها.
- ختم الشرائح مع طلاء الأظافر والهواء الجاف ح 1.
- الصورة على مجهر [كنفوكل] مع 60 x/1.42 الفتحة العددية النفط غمر عدسة استخدام الانبعاثات الليزر نفسه لكل عينة.
- عند تحليل البيانات، إذا لزم الأمر، إجراء تعديلات للسطوع والتباين باستخدام نفس التعديل الخطي لجميع العينات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تطبيق هذا البروتوكول لدراسة التوزيع وكولوكاليزاتيون بين رلرس (تلاعب-أنا ونجمة داود الحمراء--5) ودسرنا في الخلايا المصابة جونف. كما هو مبين في الشكل 1 و الشكل 2، يزيد من تراكم دسرنا مع مرور الوقت كما تقدم العدوى الفيروسية. ركزت جمعية نجمة داود الحمراء-5 (الشكل 1)، وتلاعب-الأولى (الشكل 2) إشارات عثر على كولوكاليزيد مع بنيات الشروريه NP ودسرنا.
رقم 1: دورة الوقت دسرنا وتشكيل NP جانف وتوزيع جمعية نجمة داود الحمراء-5- خلايا A549 جونف المصابين والمصابات بصورية كانت ثابتة والملون وتصويرها وفقا للبروتوكول في 24 و 36 و 48 ساعة بعد الإصابة (HPI). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: دورة الوقت دسرنا وتشكيل NP جانف وتوزيع الزي--أولاً خلايا A549 جونف المصابين والمصابات بصورية كانت ثابتة والملون وتصويرها وفقا للبروتوكول في 24 و 36 و 48 HPI. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فيروسات الرنا إيجابية بمعنى والفيروسات dsDNA، يتم الكشف عن سهولة دسرنا مع الأضداد المضادة-دسرنا J2 المستخدمة على نطاق واسع. ومع ذلك، يعتقد فيروسات الرنا سلبية، بمعنى إنتاج دسرنا في مستوى منخفض، أو دون مستوى الكشف عن استخدام جسم نفس2. وبالتالي، العديد من جوانب التفاعل الجيش الملكي النيبالي وبر الفيروسية غير واضحة إلى حد كبير بحثاً عن فيروسات الرنا الشعور السلبي. حاولنا وصمة عار دسرنا في الإصابة أرينافيروس استخدام جسم J2 ولكن الإشارات الأسفار التي لم تكن اختلاف مقارنة بالعدوى وهمية. ماب 5 9، تستخدم أصلاً للكشف عن الفيروس المعوي عموم، وجد أن تكون محددة دسرنا وأكثر حساسية من جسم J25. هذه الأجسام المضادة استخدمت بنجاح للكشف عن دسرنا الفيروسية خلال سلبي بمعنى الإصابة بفيروسات الرنا، بما في ذلك نموذج أرينافيروس تشوريومينينجيتيس اللمفاوية فيروس5،،من614. وبناء على ذلك، كنا ماب 5 9 شارك وصمة عار لوجود دسرنا والفيروسية التي أرستها برس لزيادة فهم التوزيع والتفاعل في الخلايا الفردية أثناء الإصابة أرينافيروس.
وهناك عدة أساليب التثبيت التي يمكن استخدامها للحفاظ على هيكل الخلية. يعمل التثبيت مع ميوه بعجل البروتينات، بينما البروتينات crosslinks بارافورمالدهيد والفورمالين. ميوه هو أكثر فعالية من الألدهيدات في المحافظة على الأحماض النووية في الخلايا، ويوفر خلفية منخفضة إيمونوستينينج. كما يزيل الدهون من خلايا الميثانول وهكذا بيرميبيليزيس أغشية الخلايا في نفس الوقت15. في هذا البروتوكول، ثابتة في الخلايا باستخدام ميوه المثلج. كما حاول أساليب التثبيت الأخرى، بما في ذلك تحديد العينات مع بارافورمالدهيد 4 ٪، فورمالين، بارافورمالدهيد تليها الميثانول والميثانول تليها بارافورمالدهيد. ومع ذلك، لوحظ عالية القاعدية مستوى غير محددة تلطيخ في الخلايا المصابة وهمية عندما استخدمت بارافورمالدهيد أو الفورمالين. أسلوب التثبيت الأمثل التثبيت مع ميوه في-20 درجة مئوية استناداً إلى الحساسية والنوعية للنتائج. قبل تلطيخ جسم الأولية، حجب عينة مع جيش صرب البوسنة 3%، 5% جيش صرب البوسنة، ومصل الماعز 10% أو 5% لاختبار 30 دقيقة إلى ساعة واحدة، ولكن جميع أسفرت غير محددة، خلفية تلطيخ. وتحققت أفضل النتائج دون عرقلة الخطوة ومباشرة باستخدام جيش صرب البوسنة 3% في تخفيف تركيز الأجسام المضادة. الخطوات الحاسمة في تقليل الإشارات الخلفية برنامج تلفزيوني ويغسل تي-أوكتيلفينوكسيبوليثوكسييثانول بعد التثبيت. بينما المباشر 5 9 المتاحة تجارياً هي تضعف جسم من بائع وجاهزة للاستخدام، إضعاف الجسم مع جيش صرب البوسنة 3% 1:2 كما عملت بشكل جيد. في حالة أن إشارة دسرنا ضعيف، يمكن استخدام جسم دون تمييع.
ويمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة التفاعل بين دسرنا وبرس في الإصابة أرينافيروس. في حين وضعت هذه المنهجية في بيئة BSL-2، يسمح التثبيت الميثانول الموضحة هنا المنظمة كاملة من أرينافيروس. ولذلك، يمكن تطبيق البروتوكول نفسه إلى دراسة التصوير لشديد العدوى أرينافيروسيس (أي لاسف، جانف ومكف) في منشأة BSL-4. من الممكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول على دراسات أخرى فيروسات الرنا. لتحقيق أفضل النتائج، قد يلزم إدخال تعديل على البروتوكول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
نود أن نشكر يزيد التصوير المرافق الأساسية وايفانيكوف مكسيم على مساعدة مجهر.
هذا العمل كان تدعمها "خدمة الصحة العامة" منح منحت RO1AI093445 و RO1AI129198 إلى SP، يزيد التزام الصندوق P84373 للفصل، و AI007526 T32 إلى م.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit | Invitrogen | A10475 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | 1:1,000 dilution |
| Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-11058 | 1:2,000 dilution; Lot #: 1454437 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Goat-anti mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | 1:2000 dilution; Lot #: 1874804 |
| Human lung epithelial A549 cells | ATCC | CCL-185 | |
| Methanol | Fisher | A412 | Stored at -20 °C |
| Mouse MAb anti-JUNV NP | BEI | NA05-AG12 | Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution |
| Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent | Millipore Sigma | 3361 | ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445 |
| PBS supplemented with Ca and Mg | Corning | 21-030-CV | |
| PDL Coated coverslips | Neuvitro | H-12-1.5-pdl | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P10144 | |
| Rabbit MAb MDA-5 | Abcam | ab126630 | 1:250 dilution; Lot #: GR97758-7 |
| recombiant Candid#1 strain of JUNV | Lab generated | Lab generated | As previously described in reference 13. |
| RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594 | Santa Cruz | sc-376845 | 1:1000 dilution; Lot #: AO218 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
References
- Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
- Weber, F., Wagner, V., Rasmussen, S. B., Hartmann, R., Paludan, S. R. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 6 (2006).
- Triantafilou, K., Vakakis, E., Kar, S., Richer, E., Evans, G. L., Triantafilou, M. Visualisation of direct interaction of MDA5 and the dsRNA replicative intermediate form of positive strand RNA viruses. Journal of Cell Science. 125, 4761-4769 (2012).
- Onomoto, K., et al. Critical role of an antiviral stress granule containing RIG-I and PKR in viral detection and innate immunity. PLoS One. 7, e43031 (2012).
- Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-stranded RNA is detected by immunofluorescence analysis in RNA and DNA virus infections, including those by negative-sense RNA viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
- Mateer, E. J., Paessler, S., Huang, C. Visualization of double-stranded RNA colocalizing with pattern recognition receptors in arenavirus infected cells. Frontiers Cellular and Infection Microbiology. 8, 251 (2018).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J. Arenavirdae: The viruses and their replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
- Levis, S. C., et al. Endogenous interferon in Argentine hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 149, 428-433 (1984).
- Levis, S. C., et al. Correlation between endogenous interferon and the clinical evolution of patients with Argentine hemorrhagic fever. Journal of Interferon Research. 5, 383-389 (1985).
- Huang, C., et al. Highly pathogenic new world and old world human arenaviruses induce distinct interferon response in human cells. Journal of Virology. 89, 7079-7088 (2015).
- Huang, C., et al. Junin virus infection activates the type I interferon pathway in a RIG-I-dependent manner. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1659 (2012).
- Huang, C., Kolokoltsova, O. A., Mateer, E. J., Koma, T., Paessler, S. Highly pathogenic new world arenavirus infection activates the pattern recognition receptor protein kinase R without attenuating virus replication in human cells. Journal of Virology. 91, 20 (2017).
- Emonet, S. F., et al. Rescue from cloned cDNAs and in vivo characterization of recombinant pathogenic Romero and live-attenuated Candid#1 strains of Junin virus, the causative agent of Argentine hemorrhagic fever disease. Journal of Virology. 85 (4), 1473-1483 (2011).
- Child, S. J., et al. Antagonism of the protein kinase R pathway in human cells by Rhesus Cytomegalovirus. Journal of Virology. 92, 6 (2018).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
![تصوير [كنفوكل] الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل ونمط الاعتراف مستقبلات في الإصابة بفيروسات الرنا الشعور السلبي](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/59095.jpg)
