Summary
डबल-कतरा आरएनए के दौरान उत्पादित आरएनए वायरस प्रतिकृति पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स द्वारा पहचाना जा सकता है एक सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पैदा करने के लिए. नकारात्मक-भाव आरएनए वायरस के लिए, निम्न स्तर के dsRNA और PRRs के बीच बातचीत अस्पष्ट बनी हुई है । हम व्यक्तिगत कोशिकाओं में arenavirus dsRNA और पीआरआर कल्पना करने के लिए एक फोकल माइक्रोस्कोपी विधि विकसित की है ।
Abstract
डबल असहाय (डी एस) आरएनए एक प्रतिकृति मध्यवर्ती आरएनए वायरस संक्रमण के दौरान के रूप में उत्पादित है । मेजबान पैटर्न मांयता रिसेप्टर्स (PRRs) जैसे retinoic एसिड (रिग-मैं) रिसेप्टर्स (RLRs) रिग-मैं और मेलेनोमा भेदभाव-जुड़े प्रोटीन 5 (एमडीए-5) की तरह द्वारा dsRNA की मांयता जंमजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की प्रेरण की ओर जाता है । सकारात्मक-अर्थ आरएनए वायरस संक्रमण में dsRNA के गठन और intracellular वितरण को सूक्ष्मता से अच्छी तरह से पहचाना गया है । कई नकारात्मक-भावना आरएनए वायरस, कुछ arenaviruses सहित, संक्रमण के दौरान सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को ट्रिगर. हालांकि, नकारात्मक भावना आरएनए वायरस dsRNA के निम्न स्तर का उत्पादन करने के लिए सोचा गया था, जो वायरल dsRNA की पीआरआर मान्यता के इमेजिंग अध्ययन में बाधा. साथ ही, अत्यधिक रोगजनक arenaviruses के साथ संक्रमण प्रयोगों उच्च नियंत्रण में किया जाना चाहिए-सुरक्षा स्तर की सुविधाओं (बीएसएल-4) । उच्च रोगजनक आरएनए वायरस के लिए वायरल आरएनए और PRRs के बीच बातचीत मुख्यतः अतिरिक्त तकनीकी चुनौतियों के कारण अज्ञात है जो शोधकर्ताओं को बीएसएल-4 सुविधाओं में सामना करने की आवश्यकता है । हाल ही में, एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (मॉब) (क्लोन 9D5) मूल रूप से पैन के लिए इस्तेमाल किया enterovirus पता लगाने के लिए विशेष रूप से पारंपरिक dsRNA या J2 विरोधी K1 एंटीबॉडी की तुलना में एक उच्च संवेदनशीलता के साथ dsRNA का पता लगाने के लिए पाया गया है । इस के साथ साथ, 9D5 एंटीबॉडी का उपयोग करके, हम एक फोकल माइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल है कि सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है dsRNA, वायरल प्रोटीन और एक साथ व्यक्तिगत कोशिकाओं में पीआरआर arenavirus से संक्रमित कल्पना का वर्णन । प्रोटोकॉल भी BSL4 सुविधाओं में रोगजनक arenavirus संक्रमित कोशिकाओं में dsRNA और पीआरआर वितरण के इमेजिंग अध्ययनों के लिए उपयुक्त है ।
Introduction
सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की प्रेरण के प्रारंभिक कदम के पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRRs) जैसे retinoic एसिड (रिग-मैं) रिसेप्टर्स (RLRs) रिग की तरह द्वारा डबल-कतरा (डी एस) आरएनए के मेजबान मान्यता है-मैं और मेलेनोमा भेदभाव से जुड़े प्रोटीन 5 (एमडीएस-5)1. सकारात्मक भावना आरएनए वायरस के लिए, dsRNA आमतौर पर J2 या K1 विरोधी dsRNA मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (मॉब)2का उपयोग कर आसानी से पता लगाया जा सकता है । इस तरह के picornavirus के रूप में सकारात्मक-किनारा आरएनए वायरस, में dsRNA और PRRs के बीच बातचीत, फोकल माइक्रोस्कोपी3का उपयोग कर विशेषता है । हालांकि, के लिए नकारात्मक अर्थ आरएनए वायरस, दृश्य और पीआरआर और dsRNA बातचीत के लक्षण वर्णन dsRNA के लिए संवेदनशील एंटीबॉडी की कमी से बाधा गया है. सीटू संकरण (मछली) में आरएनए फ्लोरोसेंट वायरल आरएनए और PRRs4के दृश्य के लिए लागू किया गया है । फिर भी, मछली पद्धति लक्ष्य आरएनए अनुक्रम के ज्ञान की आवश्यकता है और पीआरआर सह धुंधला के साथ संगत नहीं हो सकता है । हाल ही में, 9D5 मॉब, जो मूल रूप से पैन-enterovirus संक्रमण के निदान के लिए विकसित किया गया था, J2 मॉब से अधिक संवेदनशील पाया गया था और आसानी से नकारात्मक-भाव आरएनए वायरस संक्रमण5,6में dsRNA का पता लगा सकते हैं । इस प्रकार, मॉब 9D5 वायरल प्रतिकृति और नकारात्मक भावना आरएनए वायरस के लिए पीआरआर और वायरल आरएनए के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उपंयास और उपयोगी उपकरण है ।
Arenaviruses के एक परिवार के एकल-असहाय, नकारात्मक भावना आरएनए वायरस, जो कई मानव रोगजनकों शामिल हैं, जैसे लासॅ वायरस (LASV), Junín वायरस (JUNV) और Machupo वायरस (MACV), कि मानव में गंभीर रक्तस्रावी बुखार रोगों के कारण7. अर्जेण्टीनी रक्तस्रावी बुखार के गंभीर और घातक मामलों से नैदानिक डेटा नई दुनिया arenavirus JUNV सीरम IFN के असामांय रूप से उच्च स्तर के प्रदर्शन की वजह से-α8,9। हमें पता चला है कि रोगजनक arenaviruses (JUNV और MACV), लेकिन रोगजनक पुरानी दुनिया arenavirus, LASV, मानव इंटरफेरॉन में एक प्रकार मैं IFN (monocyte) प्रतिक्रिया प्रेरित-वृक्ष कोशिकाओं10व्युत्पंन । इसके अलावा, रिग-मैं JUNV-संक्रमित कोशिकाओं11में प्रकार मैं IFN प्रतिक्रिया मध्यस्थता सेंसरों में से एक है. हमने यह भी पाया कि प्रोटीन कळेनासे आर (PKR) रिसेप्टर, जो परंपरागत रूप से dsRNA मांयता के लिए जाना जाता है, रोगजनक arenavirus12संक्रमण में सक्रिय है । arenavirus संक्रमण के दौरान वायरस विशिष्ट IFN प्रतिक्रिया के तंत्र को समझने के लिए, हम वायरल dsRNA और cytoplasmic PRRs के बीच बातचीत की कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित करने के उद्देश्य से ।
रोगजनक JUNV, MACV और LASV के साथ संक्रमण प्रयोगों के लिए सुरक्षा स्तर 4 (बीएसएल-4) सुविधाओं में किया जाना है । इस प्रकार, arenavirus संक्रमण में गठित dsRNA के संभवतः निम्न स्तर के अलावा, इन अत्यधिक रोगजनक विषाणुओं के लिए इमेजिंग अध्ययनों के प्रदर्शन के दौरान, सुरक्षा आवश्यकताओं को पूरा करना एक और तकनीक चुनौती है । 9D5 एंटीबॉडी और JUNV के Candid1 # वैक्सीन तनाव का उपयोग करके, एक फोकल माइक्रोस्कोपी आधारित प्रोटोकॉल इस रिपोर्ट में वर्णित है, जो सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है dsRNA, वायरल प्रोटीन और पीआरआर में arenavirus से संक्रमित कोशिकाओं में एक साथ कल्पना करने के लिए BSL2 लैब्स । प्रोटोकॉल भी BSL4 सुविधाओं में रोगजनक arenavirus संक्रमण के दौरान dsRNA और पीआरआर के intracellular वितरण के दृश्य के लिए उपयुक्त है ।
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Protocol
1. A549 कोशिकाओं और JUNV संक्रमण की तैयारी
- बीज 2 x 105 मानव फेफड़े उपकला A549 कोशिकाओं पर पाली-डी-lysine (PDL) लेपित ग्लास coverslips 12 में अच्छी तरह से प्लेटें 24 घंटे में संक्रमण से पहले ।
- JUNV13 के १५० मिलीलीटर संक्रमण (MOI) की एक गुणा पर aliquots तैयार करें Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) मीडिया में पतला सेल प्रति इकाई बनाने के १.० पट्टिका के 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक और 1% पेनिसिलिन और streptomycin (पी/ ).
- मीडिया को सेल कल्चर से निकालें । प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त coverslip पर वायरस इनोक्युलम जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर १.५ ज के लिए मशीन । हर 15 मिनट प्लेट हिला ।
- वायरस इनोक्युलम निकालें, 5% FBS और 1% P/S के साथ पूरक DMEM के 1 मिलीलीटर जोड़ें वांछित समय बिंदु के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर थाली ।
2. निर्धारण और immunostaining
- मीडिया को महाप्राण । एक अच्छी तरह से कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ पूरक फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के 1 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं कुल्ला ।
- पंजाबियों को हटा दें । मेथनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें (MeOH) पर-20 डिग्री सेल्सियस पूर्व ठंडा और-20 ° c या 15 मिनट के लिए सूखी बर्फ पर मशीन ।
- निकाल MeOH.
- प्रत्येक अच्छी तरह से पंजाब के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और 5 मिनट के लिए कोमल कमाल के साथ 4 ° c पर नमूने धो लें 4 बार के कुल के लिए धो दोहराएं ।
- ०.२% टी के 1 मिलीलीटर में coverslips पर निश्चित कोशिकाओं धो-4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए octylphenoxypolyethoxyethanol, कोमल कमाल के साथ ।
- प्रत्येक अच्छी तरह से पंजाब के 1 मिलीलीटर जोड़ें । कोमल कमाल के साथ 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने धो लें । 4 बार के कुल के लिए धुलाई कदम दोहराएं ।
- dsRNA और MDA5 का पता लगाने के लिए, 3% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के २०० मिलीलीटर में मशीन नमूने । एक 1:2 कमजोर पड़ने पर विरोधी dsRNA 9D5 एंटीबॉडी पतला और 1:250 पर विरोधी एमडीए-5 एंटीबॉडी पतला । 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कोमल कमाल के साथ मशीन ।
- प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें और आरटी पर कोमल कमाल के साथ 5 मिनट के लिए पंजाबियों की 1 मिलीलीटर के साथ एक अच्छी तरह से धो लो । इस धो चार अधिक बार दोहराएं ।
- माध्यमिक एंटीबॉडी के २०० मिलीलीटर जोड़ें (1:2000 कमजोर पड़ने) 3% BSA में पतला और आरटी पर 1 एच के लिए मशीन ।
- माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें और आरटी पर कोमल कमाल के साथ 5 मिनट के लिए पंजाबियों की 1 मिलीलीटर के साथ एक अच्छी तरह से धो । इस धो चार अधिक बार दोहराएं ।
- JUNV nucleoprotein (NP) और रिग-I का पता लगाने के लिए, 3% BSA में पतला संयुग्मित एंटीबॉडी के २०० मिलीलीटर जोड़ें । संयुग्मित विरोधी JUNV NP (एजी-12) 1:1000 और कोमल कमाल के साथ आरटी पर 2 ज के लिए मशीन नमूने पतला । पतला संयुग्मित विरोधी रिग-मैं 1:500 पर एंटीबॉडी और 4 ° c पर गर्मी कोमल कमाल के साथ रात भर ।
- संयुग्मित एंटीबॉडी निकालें और आरटी पर कोमल कमाल के साथ 5 मिनट के लिए पंजाबियों की 1 मिलीलीटर के साथ एक अच्छी तरह से धो लें । इस धो चार अधिक बार दोहराएं ।
- Counterstain के साथ coverslips DAPI (1:1000) के लिए 3 मिनट के लिए आरटी पर कोमल कमाल के साथ ।
- coverslips 3 बार धो, ०.५% टी के 1 मिलीलीटर में 5 मिनट के लिए हर बार आरटी पर कोमल कमाल के साथ octylphenoxypolyethoxyethanol ।
- 5 मिनट के लिए हर बार आरटी में कोमल कमाल के साथ पंजाब के 1 मिलीलीटर में धो दो बार ।
- आरटी में 1 मिनट के लिए ddH2ओ के 1 मिलीलीटर में एक बार धो लो, धीरे कमाल ।
- माउंट coverslips बढ़ते मीडिया का उपयोग कर ग्लास स्लाइड पर । रात भर इलाज करते हैं ।
- नेल पॉलिश और एयर ड्राई के साथ 1 एच के लिए स्लाइड सील ।
- 60x/1.42 संख्यात्मक एपर्चर तेल विसर्जन एक नमूना के लिए एक ही लेजर उत्सर्जन का उपयोग लेंस के साथ फोकल माइक्रोस्कोप पर छवि ।
- डेटा का विश्लेषण करते समय, यदि आवश्यक हो, तो सभी नमूनों के लिए समान रेखीय समायोजन का उपयोग करके चमक और कंट्रास्ट के लिए समायोजन करें ।
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Representative Results
यह प्रोटोकॉल RLRs (रिग-I और एमडीएस-5) और dsRNA JUNV-संक्रमित कोशिकाओं के बीच वितरण और colocalization के अध्ययन के लिए लागू किया गया था । के रूप में चित्रा 1 और चित्रा 2में दिखाया गया है, वायरल संक्रमण की प्रगति के रूप में समय के साथ dsRNA वृद्धि का संचय । केंद्रित एमडीएस-5 (चित्रा 1) और रिग-I (चित्रा 2) सिग्नल एनपी और dsRNA के कबरा संरचनाओं के साथ colocalized पाया गया ।
चित्रा 1: dsRNA और JUNV एनपी गठन के समय पाठ्यक्रम और एमडीए के वितरण-5 । JUNV-संक्रमित और नकली संक्रमित A549 कोशिकाओं तय, दाग और 24, ३६, और ४८ घंटे के बाद संक्रमण (HPI) में प्रोटोकॉल के अनुसार छवि थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: dsRNA और JUNV एनपी गठन और रिग के वितरण के समय पाठ्यक्रम-I । JUNV-संक्रमित और नकली संक्रमित A549 कोशिकाओं तय, दाग और 24, ३६, और ४८ HPI में प्रोटोकॉल के अनुसार छवि थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
सकारात्मक भावना आरएनए वायरस और dsDNA वायरस के लिए, dsRNA व्यापक रूप से इस्तेमाल किया J2 विरोधी dsRNA एंटीबॉडी के साथ आसानी से पता चला है । हालांकि, नकारात्मक-भावना आरएनए वायरस एक ही एंटीबॉडी2का उपयोग कर पता लगाने के स्तर पर एक कम या नीचे dsRNA उत्पादन करने के लिए माना जाता है. इस प्रकार, वायरल आरएनए और पीआरआर बातचीत के कई पहलुओं को नकारात्मक अर्थ आरएनए वायरस के लिए काफी हद तक स्पष्ट नहीं हैं । हम J2 एंटीबॉडी का उपयोग कर arenavirus संक्रमण में dsRNA के लिए दाग का प्रयास किया, लेकिन प्रतिदीप्ति संकेत नकली संक्रमण की तुलना में differentiable नहीं थे । मॉब 9D5, मूल रूप से पैन-enterovirus का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया, dsRNA के लिए विशिष्ट और J2 एंटीबॉडी5से अधिक संवेदनशील पाया गया था । इस एंटीबॉडी का प्रयोग सफलतापूर्वक अनिष्ट-भावना आरएनए वायरस संक्रमण के दौरान वायरल dsRNA का पता लगाने के लिए किया गया है, जिसमें प्रोटोटाइप arenavirus लिम्फोसाईटिक choriomeningitis वायरस5,6,14शामिल हैं । तदनुसार, हम मॉब 9D5 की उपस्थिति के लिए सह दाग का इस्तेमाल किया dsRNA, वायरल NP, और PRRs आगे arenavirus संक्रमण के दौरान व्यक्तिगत कोशिकाओं में उनके वितरण और बातचीत को समझने के लिए ।
कई निर्धारण तरीके है कि सेल संरचना को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । paraformaldehyde और formalin crosslinks प्रोटीन, जबकि वर्षण प्रोटीन से MeOH कृत्यों के साथ निर्धारण । MeOH कोशिकाओं में न्यूक्लिक एसिड के संरक्षण पर aldehydes से अधिक प्रभावी है और कम पृष्ठभूमि immunostaining प्रदान करता है । मेथनॉल भी कोशिकाओं से लिपिड निकालता है और इस प्रकार permeabilizes कोशिका झिल्ली एक ही समय में15. इस प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं बर्फ ठंड MeOH का उपयोग कर तय कर रहे हैं । अंय निर्धारण विधियों का भी प्रयास किया गया, जिसमें 4% paraformaldehyde, formalin, paraformaldehyde द्वारा मेथनॉल के बाद, और मेथनॉल द्वारा फ़ॉलो किए गए नमूनों को फिक्सिंग शामिल है । हालांकि, उच्च बेसल स्तर गैर विशिष्ट धुंधला paraformaldehyde या formalin इस्तेमाल किया गया था जब नकली संक्रमित कोशिकाओं में मनाया गया था । इष्टतम निर्धारण विधि MeOH के साथ निर्धारण है-20 डिग्री सेल्सियस पर संवेदनशीलता और परिणामों की विशिष्टता के आधार पर. प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला होने से पहले, नमूना 3% BSA, 5% BSA, और 10% या 5% बकरी सीरम के साथ 30 मिनट के लिए 1 घंटे के लिए अवरुद्ध परीक्षण किया गया था, लेकिन सभी गैर विशिष्ट, पृष्ठभूमि धुंधला के परिणामस्वरूप । सबसे अच्छा परिणाम अवरुद्ध कदम के बिना हासिल किया और सीधे एंटीबॉडी कमजोर पड़ने में 3% BSA का उपयोग कर रहे थे । बैकग्राउंड संकेतों को न्यूनतम करने में अहम कदम उठाने वाले पंजाबियों और टी-Octylphenoxypolyethoxyethanol बहाकर निर्धारण के बाद हैं । जबकि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 9D5 एंटीबॉडी विक्रेता द्वारा पतला है और प्रत्यक्ष उपयोग के लिए तैयार है, 3% BSA के साथ एंटीबॉडी के एक 1:2 कमजोर पड़ने भी अच्छी तरह से काम किया । dsRNA संकेत कमजोर है कि मामले में, एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के बिना इस्तेमाल किया जा सकता है ।
इस प्रोटोकॉल arenavirus संक्रमण में dsRNA और PRRs के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । जबकि यह पद्धति एक बीएसएल-2 वातावरण में विकसित की गई थी, मेथनॉल निर्धारण यहां वर्णित arenavirus की पूरी निष्क्रियता की अनुमति देता है । इसलिए, एक ही प्रोटोकॉल एक बीएसएल-4 सुविधा में उच्च रोगजनक arenaviruses (यानी, LASV, JUNV और MACV) के लिए इमेजिंग अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है । यह भी अन्य आरएनए वायरस पर अध्ययन करने के लिए इस प्रोटोकॉल लागू करने के लिए संभव है. इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए, प्रोटोकॉल का एक संशोधन आवश्यक हो सकता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम UTMB इमेजिंग कोर सुविधाओं और माइक्रोस्कोप सहायता के लिए मैक्सिम Ivannikov शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
इस कार्य को जन स्वास्थ्य सेवा अनुदान RO1AI093445 द्वारा समर्थित किया गया और RO1AI129198 को एसपी, UTMB वचनबद्धता निधि P84373 को चौधरी, और T32 AI007526 को उन्हें सम्मानित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit | Invitrogen | A10475 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | 1:1,000 dilution |
| Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-11058 | 1:2,000 dilution; Lot #: 1454437 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Goat-anti mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | 1:2000 dilution; Lot #: 1874804 |
| Human lung epithelial A549 cells | ATCC | CCL-185 | |
| Methanol | Fisher | A412 | Stored at -20 °C |
| Mouse MAb anti-JUNV NP | BEI | NA05-AG12 | Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution |
| Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent | Millipore Sigma | 3361 | ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445 |
| PBS supplemented with Ca and Mg | Corning | 21-030-CV | |
| PDL Coated coverslips | Neuvitro | H-12-1.5-pdl | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P10144 | |
| Rabbit MAb MDA-5 | Abcam | ab126630 | 1:250 dilution; Lot #: GR97758-7 |
| recombiant Candid#1 strain of JUNV | Lab generated | Lab generated | As previously described in reference 13. |
| RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594 | Santa Cruz | sc-376845 | 1:1000 dilution; Lot #: AO218 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
References
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