Summary
Здесь мы представляем подробный протокол для обнаружения и количественной оценки уровня белка во время черепно-мозгового морфогенеза / патогенеза путем иммуносохранения с помощью мыши черепно-лицевой ткани в качестве примеров. Кроме того, мы описываем метод приготовления и криоотделения недекальцифицированных твердых тканей у молодых мышей для иммунодефицита.
Abstract
Ткань иммуностоинга обеспечивает высокоспецифическое и надежное обнаружение белков, представляющих интерес в данной ткани. Здесь мы описываем полный и простой протокол для обнаружения экспрессии белка во время черепно-мозгового морфогенеза/ патогенеза с использованием мышичерепных тканей в качестве примеров. Протокол состоит из подготовки и криоотделения тканей, косвенной иммунофлуоресценции, приобретения изображения и количественной оценки. Кроме того, описан метод подготовки и криоотделения недекальцифицированных твердых тканей для иммуностоинга, в качестве примеров используется черепно-мозговая ткани и длинные кости. Эти методы являются ключевыми для определения экспрессии белка и морфологических / анатомических изменений в различных тканях во время черепно-мозгового морфогенеза / патогенеза. Они также применимы к другим тканям с соответствующими изменениями. Знание гистологии и высокое качество разделов имеют решающее значение для того, чтобы сделать научные выводы из экспериментальных результатов. Потенциальные ограничения этой методологии включают, но не ограничиваются спецификой антител и трудностями количественной оценки, которые также обсуждаются здесь.
Introduction
Лицо является ключевой частью человеческой идентичности, и состоит из нескольких различных типов тканей, таких как эпителий, мышцы, кости, хрящи, зуб. Эти ткани являются производными от всех трех слоев зародыша: эктодерм, эндодерм, и мезодерм1,2. Для правильного узорства и развития черепно-мозговых тканей, пролиферации клеток, смерти и дифференциации должны быть высоко скоординированы и регулируются конкретными сигнальными путями, такими как Wnt, Fgf, Hh и Bmp пути3,4 ,5. Дефекты пролиферации, выживания или дифференциации клеток приведут к черепно-мозговым порокам развития, которые являются одними из наиболее часто встречающихся врожденных дефектов. Трансгенные мыши являются полезными инструментами дляизучения механизмов краниофациального морфогенеза и патогенеза1,2,3,4. Понимание изменений в черепно-мозговых структурах во время развития и патогенеза поможет прояснить ключевые принципы развития, а также механизмы черепно-мозговых пороковразвития1,2,3 ,4,5.
Окрашивание целых креплений или секционированных тканей с конкретными антителами является бесценным методом для определения пространственного распределения белков, представляющих интерес 6. Формально иммуностоидирование тканей может опираться либо на иммуногистохимию (IHC), либо на иммунофлуоресценцию (ИФ). По сравнению с непрозрачным продуктом реакции, генерируемым с хромогенным субстратом, таким как 3,3'-Диаминобензидин (DAB) IHC, IF включает в себя использование флуоресцентных конъюгатов, видимых флуоресценцией микроскопии. Таким образом, ЕСЛИ может четко дифференцировать положительные клетки от фонового шума, и позволяет изображения, которые будут количественно проанализированы и расширены в простой моды с помощью программного обеспечения, таких как ImageJ и Adobe Photoshop7,8. Весь подход крепления окрашивания работает на небольших блоках ткани (толщиной менее 5 мм), которые могут предоставить трехмерную информацию о расположении белков/антигенов без необходимости реконструкции из разделов9,10 . Однако, по сравнению с секциями тканей, цельное иммуносирование монтирует много времени и требует больших объемов антител. Не все антитела совместимы с основным подходом всего крепления. Кроме того, неполное проникновение антител приведет к неравномерному окрашиванию или ложному отрицательному окрашиванию. Здесь мы сосредоточимся на иммунофлуоресценции обнаружения белков / антигенов на разделенных тканей. Для твердых тканей (например, головы, зуба, длинной кости), осаждение кальция во время развития / патогенез делает образец трудно сечения и легко промыть во время иммуно-денсивного лечения11,12. Большинство имеющихся в настоящее время протоколов декальцифифицировать твердые ткани перед встраиванием, чтобы сделать секционирование легче, что отнимает много времени и может уничтожить морфологию и антигены образцов, если обращаться неправильно11,12. Чтобы преодолеть проблемы, мы оптимизировали подход к криоотделению твердых тканей без декальцинации, что привело к улучшению визуализации их морфологии и распространению сигнальных белков.
Описанный здесь протокол используется для определения морфометрических и гистологических изменений в черепно-мозговых тканях трансгенных мышей БМП. В частности, протокол включает в себя (1) уборку и вскрытие тканей головы, (2) раздел и иммуностонинг экспериментальных маркеров (Ki67, pSmad1/5/9) наряду с окрашиванием TUNEL, (3) визуализацией секций с использованием флуоресцентного микроскопа и, наконец, (4) анализ и количественная оценка результатов. Протокол для подготовки и криосецификации твердых тканей без декальцинации также описано13. Эти методы оптимизированы для черепно-мозговых тканей. Они также применимы к другим тканям разного возраста образцов с соответствующими модификациями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты с мышью проводились в соответствии с руководящими принципами Мичиганского университета, охватывающими гуманный уход и использование животных в исследованиях. Все процедуры для животных, используемые в этом исследовании, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) при Мичиганском университете (Протокол #PRO00007715).
1. Подготовка тканей
-
Подготовка эмбриональных тканей
- Приготовьте одну тарелку 10 см и несколько 3,5 см блюд, содержащих фосфат буферный солен (PBS), и одну 12-колодую культурную тарелку, содержащую 2 мл 4% параформальдегида (PFA) в PBS в каждой скважине для каждой беременной мыши. Поместите все блюда Петри и тарелку на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка 4% PFA в дым капота. - Вскрыть эмбрионы беременных мышей в ледяной PBS с щипками и ножницами, как ранее описано14.
- Кратко, усыпить беременнуюмышь с CO 2, захватить кожу ниже центра живота с щипками и прорезать только кожу, затем осторожно тянуть на кожу, чтобы отделить его от основной стенки мышц живота.
- Далее, нарезать брюшной полости после той же линии разреза кожи. Удалить матку, содержащую строку эмбрионов и удалить эмбрионы, мягко отрезав стенки матки. Экстраэмбриональные ткани, такие как желтковый мешок и амнион будут удалены.
- Вырезать и изолировать голову от каждого эмбриона.
- Перенесите каждую голову в каждую скважину 12-ну хорошей пластины, содержащей 4% PFA с пластиковой передачей пипетки или щипц. Исправьте образцы в 4% ПФА при 4 градусах по Цельсию при 4 ч. Промыть образцы в PBS при 4 градусах Цельсия с нежной тряской в течение 12 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для эмбрионов моложе эмбрионального дня 16,5 (E16.5), исправить эмбриона головы с 4% ПФА непосредственно после изоляции. Для эмбрионов на E16.5 или позже, удалить, чтобы отбросить кожу и жировой ткани из головы и промыть несколько раз в ледяной PBS перед фиксацией. - Криозащита головы.
- Перенесите каждую голову в новую 12-ну хорошую пластину, содержащую 2 мл 30% сахарозы в PBS с помощью пластиковой передачи пипетки или щипцы. Агитировать осторожно при 4 градусах Цельсия, пока голова не опустится на дно блюда.
- Вставлять головы.
- Передача криозащищенной головы в форму, содержащую Оптимальную температуру резки (OCT) соединения. Равновесие образцов в ОКТ в течение нескольких минут. Отрегулируйте расположение и направление образцов с помощью щипков.
- Поместите форму на сухой лед, чтобы заморозить. Храните в результате криомольды в полиэтиленовый пакет при -80 градусов по Цельсию до готовности к криоотделению.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обрезанная сторона образцов должна смотреть на дно встраивающей формы.
- Приготовьте одну тарелку 10 см и несколько 3,5 см блюд, содержащих фосфат буферный солен (PBS), и одну 12-колодую культурную тарелку, содержащую 2 мл 4% параформальдегида (PFA) в PBS в каждой скважине для каждой беременной мыши. Поместите все блюда Петри и тарелку на льду.
-
Подготовка послеродовых недекалированных твердых тканей
- Euthanize на 3 недели или 3 месяца мыши с CO2. Удалите кожу и жировые ткани. Вырезать и изолировать голову или длинные кости от мыши.
- Исправить и криозащитить голову или длинную кость мышей, как описано в шагах 1.1.3-1.4.
- Встраиваем в 8% желатин таким же образом, как шаг 1.1.5. Храните криомольды в полиэтиленовом пакете при -80 градусов по Цельсию до криосекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Декалькация здесь не нужна. Для приготовления 8% желатина смешайте 8 г желатина со 100 мл PBS и варите с помощью микроволновой печи. Имейте в виду, что смесь кипит легко.
2. Криосекция
- Установите температуру криостата до -18 градусов по Цельсию для мягких тканей, встроенных в OCT или -25 градусов по Цельсию и ниже для недекалкированных твердых тканей, встроенных в желатин. Держите образцы в криосаткамере около 30 минут, чтобы уравновесить температуру криостата.
- Изгнать блок из криомолд. Заморозить блок на образец патрон (держатель ткани) через монтаж с падением OCT. Держите обрезанную сторону образца дальше от патрона (лицом к оператору).
- Загрузите блок-установленный патрон на держатель объекта криостата. Отрегулируйте держатель лезвия, чтобы угол клинка был 3-5 градусов по отношению к образцу.
- Соберите 10 мкм разделов на покрытые слайды микроскопа. Сухие секции полностью на RT, а затем хранить их при -80 градусов по Цельсию.
3. Гистологическое окрашивание и микроскопическая визуализация
- Иммунофлуоресценция окрашивания
- Выньте слайды от -80 градусов по Цельсию. Держите слайды на RT в течение 1 ч до воздушных секций. Промыть слайды в 0,1% PBST (0,1% Полиэтилен гликоль терт-октилфенил эфир в PBS; см. Таблица материалов) три раза в течение 5 мин каждый, чтобы вымыть OCT и permeabilize разделов.
- Дополнительно, выполнять антиген поиска (необязательно).
- Разогреть цитрат ный буфер (10 мм натрия цитрат рН 6) в окрашивание блюдо с пароходом или водяной бане до 95-100 градусов по Цельсию. Погрузите слайды в цитратный буфер, инкубируют в течение 10 минут.
- Возьмите окрашивание блюдо из парохода или водяной ванны для RT. Охладите слайды на RT в течение 20 минут или дольше15.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы используйте буфер Tris-EDTA (база 10 мм Tris, 1mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 9.0) или буфер EDTA (1 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 8.0) для поиска антигена, индуцированного в теплом. Используйте скороварку, микроволновую печь или водяную баню для поиска антигена, вызванного теплом, в дополнение к горячему пароходу. Фермент-индуцированной антигена поиска с использованием трипсина или пепсина является еще одной альтернативой. Оптимизируйте концентрацию и время обработки ферментативного поиска, чтобы избежать повреждения секций. Оптимизируйте метод извлечения антигена для каждой комбинации антител/антигенов.
- Инкубировать каждый слайд с 200 злителком блокирующего раствора (5% ослиной сыворотки, разбавленной в 0,1% PBST) на RT в течение 30 мин, затем удалите блокирующий раствор без промывки.
- Инкубировать каждый слайд с 100 злител первичных антител или антител, разбавленных в блокирующем растворе в течение 1 ч при РТ или O/N при 4 градусах По Цельсию. Промыть слайды с PBS три раза в течение 10 минут каждый на RT.
- Инкубировать каждый слайд с 100 л вторичных антител, разбавленных в блокирующем растворе в течение 1 ч на RT. Промыть слайды в PBS три раза в течение 10 минут каждый на RT. Защитите слайды от света.
- Горные горки.
- Добавьте две капли анти-увядения среды с DAPI (4', 6-диамидино-2-фенилиндол) на слайде. Затем накройте крышкой.
- Хранить при 4 градусах по Цельсию в темноте до готовности к изображению.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, этикетка ядра с DAPI или Hoechst 33324 красителя разбавленной 1:2,000 в PBS на RT, а затем смонтировать с глицеролом.
- Терминал deoxynucleotidyl transferase dUTP ник конец маркировки (TUNEL) окрашивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Двухцепочечная ДНК с 3'-гидроксил термини (3'OH ДНК termini) будет образовываться во время апоптоза в клетке. Здесь мы предоставляем протокол, который маркирует свободный 3'OH ДНК termini in situ через маркировку фрагментов ДНК с digoxigenin-нуклеотид, используя терминал дезоксинуклеотидидной передачи (TdT) по конкретным окрашивания с помощью коммерческого комплекта (см. Таблица материалов ).- Дополнительно, пятно разделы с первичной и Alexa Fluor-488 помечены вторичные антитела до tuneL окрашивания. Промыть слайды в PBS три раза в течение 10 минут каждый.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным для двойного окрашивания белка и TUNEL в том же слайде. - Инкубировать каждый слайд с 100 мл Протеиназа K (10 мкг/мл в 10 мм Tris рН 7,5 и 5 мМ EDTA) в течение 5 минут на RT. Промыть слайды с PBS три раза в течение 10 минут каждый на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте время инкубации и температуру Протеиназа K для каждого типа ткани. Для 10 мкм секций эмбриона головы фиксированной в 4% PFA, инкубировать в течение 5 мин на RT. В дополнение к методу использования Proteinase K, использовать альтернативные методы лечения по мере необходимости, в том числе (1) свежеприготовленные 0,1% Полиэтилен гликоль терт-октилфенил эфир, 0,1% цитрат натрия, 10 мин при 37 градусов по Цельсию; (2) 0,25%-0,5% Пепсина в HCl (pH 2) или 0,25% трипсин, 10 мин при 37 градусах Цельсия; и (3) микроволновое облучение буфером цитрата 0,1 М (pH 6). - Нанесите 200 зл блокирующего раствора (5% сыворотки осла, разбавленной в 0,1% PBST) на каждый слайд, инкубировать на RT в течение 30 минут, сняйте блокирующий раствор без промывки.
- Нанесите 50 зл ибуфер аквесибрации, поставляемый комплектом, на каждый слайд на RT не менее 10 с. Нажмите с буфера без промывки.
- Подготовьте реакционную смесь (рабочая прочность фермента TdT) путем смешивания фермента TdT с буфером реакции, поставляемым комплектом в соотношении 3:7. Нанесите 50 qL реакции смеси на каждый слайд, и инкубировать при 37 кв кв. м в течение 1 ч. Нажмите с буфера без промывки.
- Нанесите 200 л стоп-буфера (1:30, разбавленного в ddH2O), поставляемого комплектом на каждый слайд, затем инкубировать на RT в течение 10 минут. Промыть слайды с PBS три раза в течение 10 минут каждый.
- Этикетка с родамин антитела.
- Нанесите 50 конъюгина анти-дигоксигенина (родамина) (1:1, разбавленного в блокирующем растворе) на каждый слайд. Инкубировать на RT в течение 30 минут в темноте.
- Промыть слайды с PBS три раза в течение 10 минут каждый. Монтировать слайды как шаг 3.1.6.
- Дополнительно, пятно разделы с первичной и Alexa Fluor-488 помечены вторичные антитела до tuneL окрашивания. Промыть слайды в PBS три раза в течение 10 минут каждый.
4. Приобретение изображений
- Используйте положительные элементы управления (ткани положительные для целевого антигена), чтобы проверить маркировку сигналов и отрицательный контроль (опустить первичное антитело, контроль изоттипа, или ткани, отрицательные для целевого антигена) для оценки фона изображений под флуоресцентным Микроскоп.
- Установите условия оборудования и камеры (экспозиции и другие общие настройки) для визуализации на основе интенсивности сигнала отрицательного и положительного элементов управления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти условия варьируются в зависимости от (1) камер и микроскопов, используемых для визуализации, (2) антител и (3) тканей для каждого эксперимента. Общие условия, используемые для черепно-лицевой ткани ISO 200 с воздействием времени от 1/100 до 1 с зависит от качества и специфичности антител. Соответствующие увеличения варьируются в зависимости от размера образцов и цели экспериментов. - Приобретайте изображения с помощью обычного эпифлюоресцентного микроскопа или конфокального микроскопа. Приобретайте изображения (в том числе соответствующие элементы управления) в одинаковых условиях для каждого цветного канала. Сохранить изображения в том же формате (tiff лучше всего сохранить информацию).
5. Количественная оценка флуоресценции
ПРИМЕЧАНИЕ: Статистические сравнения окрашивания между различными группами будет более информативным во многих случаях. С изображениями иммунофлуоресценции, количественно относительный уровень белка путем измерения плотности сигнала, подсчета положительных клеток, или расчета положительных областей. Для статистического анализа минимальное число биологически независимых образцов составляет 3. Типичный метод заключается в том, чтобы генерировать по крайней мере три раздела из каждого образца и принимать изображения, по крайней мере, для трех репрезентативных областей в каждом разделе.
-
Количественная оценка интенсивности флуоресценции с использованием ImageJ
- Откройте программное обеспечение, и используйте Анализ (RuGT; Set Measurements), чтобы проверить, что выбираются только область и интегрированная плотность. Используйте файл и открыть для открытия изображения для анализа.
- Используйте панель инструментов, чтобы выбрать значок квадрата или круга в крайнем левом конце. Выберите область, которая будет проанализирована на изображении с помощью инструмента выбора. Используйте анализить и измерения, чтобы получить считыватель выбранной области и плотности интегрированной в окно результатов. Выберите область рядом с положительной клеткой, которая не имеет флуоресценции, чтобы зачитать фон.
- Повторите шаг 5.1.2 для анализа других изображений. Скорректирована область, которая будет проанализирована, чтобы соответствовать первому изображению.
- Копируйте все данные в окне результатов и вставьте в электронную таблицу при завершении анализа.
- Рассчитайте скорректированную интенсивность флуоресценции (CTCF) как интегрированная плотность – (Область выбранной ячейки x Средняя флуоресценция фоновых показаний). Сравните разницу исправленной общей флуоресценции клеток между образцами и сделайте график.
-
Количества положительного количества клеток флуоресцентных изображений с помощью ImageJ
- Ручной подсчет ячеек.
- Используйте ImageJ , плагины , чтобы установить плагин Cell Counter.
- Используйте файл и открыть для открытия изображения для анализа. Используйте плагины (ru) и анализ( а стоильный счетчик, чтобы открыть окно счетчика и окно результатов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Счетчик ячейки не работает на стеках. Для подсчета стеков, плагин Участок и axis профиль, а затем использовать изображение йgt; Стеки »gt; Участок и axis профиль для мониторинга интенсивности движущихся рентабельность инвестиций с помощью инструмента отслеживания частиц. Этот инструмент может быть как ручным, так и автоматическим. - Нажав одну из кнопок в нижней части окна Счетчика, чтобы начать подсчет. Нажмите прямо на ячейку / объект, чтобы рассчитывать до окончания.
- Нажмите кнопку «Результаты» в окне Count. Общее количество подсчитанных ячеек будет отображаться в окне результатов. Сохранить журнал результатов в виде электронной таблицы и проанализировать.
- Автоматизированный подсчет клеток.
- Используйте файл и открыть для открытия изображения для анализа. Перед началом работы преобразуйте изображение RGB в изображение серого масштаба.
- Используйте изображение , чтобы скорректировать порог, чтобы выбрать все области, которые должны быть подсчитаны.
- Используйте анализить и анализировать частицы, чтобы получить количество клеток / частиц. Установите диапазон допустимого размера частиц (например, 100-Бесконечность) вместо значения 0-Бесконечности для подсчета клеток/частиц в определенном диапазоне. Сохранить журнал результатов в виде электронной таблицы и проанализировать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить другую информацию из изображения, кроме области, перейдите на анализ и установить измерения и выбрать поле рядом с необходимой информацией.
- Ручной подсчет ячеек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эмбриональные участки черепно-мозговой ткани
После вышеуказанных шагов, головы были расчленены от управления(P0-Cre) или мутант (в обязательно активированный Bmpr1a в нервных клетках гребня, P0-Cre; caBmpr1a) зародышить на зародышевом дне (E) 16.5 или 18.5. После фиксации в 4% PFA для 4 ч, образцы были встроены в OCT и криосекционные коронально. Полученные разделы были immunostained с антителами против pSmad1/5/9 (вниз по течению факторы сигнала BMP) или Ki67 (маркер пролиферации клетки) без поиска антигена согласно протоколу. Как показано, pSmad1/5/9(Рисунок 1A)и Ki67 (Рисунок1C) были положительными в лобных костях контрольных эмбрионов. В эмбрионах мутантов, уровни pSmad1/5/9 был увеличен(Рисунок 1B), в то время как у Ki67 был снижен (Рисунок1D) в лобных костях. Смертность клеток в этих образцах также проверялась в соответствии с протоколом. Как показано, больше апоптотические клетки наблюдались в лобных костях эмбрионов-мутантов, чем у контрольных эмбрионов(рисунок 1E, F).
Недекалкированные черепно-мозговые ткани или длинные костные секции
После вышеуказанных шагов для недекальцифицированных твердых тканей, головы от 3 недель ных мышей(P0-Cre; mTmG (мембрана-помидора и мембраны GFP)) были зафиксированы с 4% PFA и встроенные в 8% желатина. Корональные криосекции были промыты С PBST и установлены с анти-fade среды с DAPI. Рисунок 2A , B продемонстрировать, что желатин не мешает флуоресцентные сигналы из разделенных тканей.
Головы и фемора от 3 недельных или 3-месячных мышей были использованы, чтобы проверить, является ли желатин встроенных недеккалированных тканей хороши для ЕСЛИ. В соответствии с протоколом были обработаны и разделены все головы и фемора. Полученные разделы были использованы для SOX9 иммуно-стоининга(Рисунок 3) или OSX и E11/Podoplanin двойной иммуно-денсирования (рисунок4). Как показано, хорошее качество разделы были получены из большинства из 3 недели твердых тканей, в том числе трабекулярных и корковых отсеков бедренной кости(рисунок 3A, B, Рисунок 4A-D), лобные кости (Рисунок 4E, F), резец (Рисунок 3E, F, Рисунок 4I, J), носовые ткани (Рисунок 3C, D, и череп, включая носовой premaxilla шов и окружающие кости (Рисунок 4G, H ) головы. В то время как, с 3-месячными образцами, хорошее качество разделов были получены только в некоторых из твердых тканей, в том числе трабекулярных отсеков бедренной кости(Рисунок 3G, H, Рисунок 4K, L), носовые ткани (Рисунок 3I , J), и череп, включая носовой premaxilla шов и окружающие кости (Рисунок 4M, N) головы. Как показано на рисунке 3, SOX9 положительные клетки были обнаружены специально в хондроцитов роста пластины (рисунок3B) и сустава (Рисунок3H) из бедренной кости, и носовой перегородки (Рисунок 3D, J). В 3-недельный резец, SOX9 был обнаружен в мезенхимальных клеток(рисунок 3F). OSX и E11 двойные результаты окрашивания показали, что OSX был обнаружен в остеобластах, в то время как E11 был обнаружен в остеоцитах костей из бедренной кости и головы(Рисунок 4B,D, H, L, N). В 3 недели резец, OSX был положительным в одонтоблассов, в то время как E11 был положительным в фолликул мезенхимальных клеток(рисунок 4J). Эти результаты показывают, что недекалькированные твердые ткани, встроенные в желатин хорошо сохранить антигенные функции.
Рисунок 1: Примеры if результатов pSmad1/5/9, Ki67 или TUNEL в контрольных эмбрионах и эмбрионах мутантов с повышенной активностью БМП. В целях активированные bmpr1a (caBmpr1a)мыши были скрещены с мышами P0-Cre для увеличения активности Сигнализации БМП в клетках нервного гребня (NCC). Руководители управления(P0-Cre; caBmpr1a q/)и мутант (P0-Cre; caBmpr1afx/)эмбрионы были расчленены на E16.5 или E18.5, зафиксированы с 4% PFA для 4h, криозащищенные с 30% сахарозой в течение 1 дня, встроенные в OCT, и криосекционные при -18 градусах Цельсия. Разделы лобной кости (аналогичный уровень с глазом) были использованы для иммунообнаружения против pSmad1/5/9, Ki67, или tuneL окрашивания. (A, B) pSmad1/5/9 (зеленый) окрашивая картины в лобных костях управления (A) или мутант (B) эмбрионы на E16.5. (C, D) Ki67 (зеленый) окрашивая картины влобных костях управления (C ) или мутант (D ) эмбрионы на E18.5. (E, F) TUNEL (красный) окрашивая картины влобных костях управления (E ) или мутант (F ) эмбрионов на E18.5. Ядра были окрашены DAPI (синий). FB - лобная кость, B и мозг. Шкала баров 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Примеры сигнала репортера mTmG результатов недекальцифицированных тканей в голове. Головы от 3 недель P0-Cre мышей с мембраной помидор и мембраны GFP(mTmG) репортер были вскрыты, фиксированной с 4% ПФА для 4h, криозащищенные с 30% сахарозы в течение 2 дней, встроенные в 8% желатина, и криосекции при -25 градусов по Цельсию. Головные секции четко показывают GFP (зеленый, Cre рекомбинации положительный) и томат (красный, Cre рекомбинации отрицательный) сигнал в носовой кости и носовых тканей (A, B). Ядра были окрашены DAPI (синий). НБ - носовая кость, N и носовые ткани, НС и носовая перегородка. Шкала баров 250 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Примеры иммунодефицита SOX9 результаты недекальцифицированных тканей в голове и феморы. Головы и фемора были вскрыты от 3 недель или 3 месяцев мышей, фиксированной с 4% ПФА для 4h, криозащищенные с 30% сахарозы в течение 2 дней, встроенные в 8% желатина, и криосекции при -25 Градусов по Цельсию. Слайды были использованы для иммунообнаружения против SOX9 (красный). Ядра были окрашены DAPI (синий)(B, D, F, H, J). Соседние участки этих тканей были использованы для гематаклина и эозина (H и E) окрашивания(A, C, E, G, I). Стрелка головы в A и B указывают рост пластины и в G и H, суставной хрящ. Стрелки в A и G указывают трабекулярных костей и в C, D, I, и J, носовой перегородки. ДМ - зубной мезенхим, DE - зубной эпителий, FM- и фолликул мезенхим. Шкала баров 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Примеры двойного иммунодефицита OSX и E11 результаты недекальцифицированных тканей в голове и бедренной конверфии. Головы и фемора были вскрыты от 3 недельных или 3-месячных мышей, фиксированных с 4% PFA для 4h, криозащищенные с 30% сахарозы в течение 2 дней, встроенные в 8% желатина, и криосекции при -25 градусов по Цельсию. Разделы были использованы для двойного иммуносохранения с антителами против OSX (красный) и E11/Podoplanin (зеленый). Ядра были окрашены DAPI (синий)(B, D, F, H, J, L, N). Соседние участки этих тканей были использованы для н и e окрашивания (A, C, E, G, I, K, M). Стрелки в A, B, K и L указывают на трабекулярные отсеки бедренной кости; C и D, корковые отсеки бедренной кости; и в E и F, лобные кости. Стрелки в A и B указывают на пластину роста. БМ - костный мозг, N и носовые ткани, DM и зубной мезенхим, DE зубной эпителий, FM - фолликул мезенхим, NPS - носовой шов премаксиллы. Также показаны лобные кости(E,F) и шов носовой премаксиллы и окружающие кости (G,H, M, N). Шкала баров 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы предоставляем подробный протокол для подготовки головы мыши и недекальцифицированных костных тканей, а также криосекции для иммуносточки зрения клеточной пролиферации, клеточной смерти и сигнальных маркеров БМП. Мы также подробно описываем стратегию получения количественных данных с иммунофлуоресцентных изображений. Эти методы могут также применяться к другим тканям с соответствующими изменениями.
Условия подготовки тканей варьируются в зависимости от размера и типа тканей. Фиксация и криозащита время обычно требуется несколько часов, чтобы на ночь. После фиксации, ткань также может быть встроена в парафин и разделены с микротомом16. Хотя и парафин и OCT хорошо работают для иммуно-стоидляи, есть некоторые различия между ними. Парафиновые блоки могут храниться в течение нескольких лет на RT, в то время как блоки OCT в течение 1 года при -80 градусах По Цельсию. Парафин сохраняет морфологию тканей, в то время как кристалл льда, образовавшийся во время встраивания OCT, может негативно влиять на структуры тканей. Парафин иногда маскирует эпитопы антигенов, в то время как OCT сохраняет ферментную активность и антигенные эпитопы. Таким образом, нет необходимости в извлечении антигена для большинства антител, если фиксированные в 4% PFA только 4 ч или менее и встроенные в OCT. Это, однако, все еще можно получить лучшие результаты по извлечению антигена, если положительный контроль не показал хорошие результаты окрашивания криосекций.
Оба красителя Hoechst и DAPI могут быть использованы для ядерного контр-пятна. Они имеют сходство, так как оба (1) являются УФ-возбужденных, незначительные паз-связывающих химических веществ для испускания сигналов, пропорциональных общему содержанию ДНК, и (2) подвергаются фото-отбеливания после длительного воздействия. Тем не менее, Hoechst красители, как правило, используются для окрашивания содержания ДНК в живых клетках из-за их высокой проницаемости. DAPI обычно используется для окрашивания ДНК в фиксированных клетках из-за его низкой проницаемости мембраны. Кроме того, DAPI генерирует более сильный и стабильный сигнал, чем Hoechst.
Правильный контроль имеет важное значение для IF. Специфика каждого нового антитела должна быть подтверждена западным анализом поблучности, если это применимо. Оптимальная рабочая концентрация конкретного первичного антитела должна определяться с помощью серийных разбавлений. Положительный контроль (ткань или клетка, которая, как доказано, выражает белок/антиген) должна быть включена для проверки процесса IF и специфичности антител. Отрицательный контроль также должен быть включен, например, отсутствие первичных антител, или замена нормального IgG от того же вида для первичных антител, или тканей, отрицательных для целевого антигена. При съемке образец без вторичных антител (фоновый контроль) следует изучить независимо с каждым каналом, чтобы установить пределы увеличения сигнала и смещения, чтобы быть адаптированы для окончательного изображения. Для обнаружения нескольких меток необходимо подготовить элементы управления фоном и одномаркированные элементы управления, чтобы избежать артефактов спектрального перекрытия. Все каналы, которые будут использоваться для получения изображения образца с несколькими метками, должны подвергаться независимой фоновой коррекции, поскольку уровень автофлюоресценции в каждом канале существенно варьируется.
Мы также предоставляем протокол для подготовки и криоотделения недекализированных твердых тканей, встроенных в желатин. Для OCT встроенных декальцилированных твердых тканей, большинство жестких секций ткани будут отделены от слайд-очки во время иммуно-тисходительных процедур, из-за их низкого характера стычки на слайде. Клеевая лента, предназначенная для облегчения криосекции, помогает создавать секции хорошего качества. Но, эти разделы легко повреждены, когда лента отслаивается. Для встроенных тканей желатина нет необходимости в системе переноса лентдля для создания секций хорошего качества. Как встраивающая среда, желатин может проникать в образец хорошо, хотя он имеет более низкую вязкость по сравнению с OCT. Желатин был использован в других гистологических приложений, таких как ткани мозга17,18 и ультратонких разделов клеток для иммуноцитохимии19. Здесь желатин был использован для встраиваемого недекальцифицированной кости, которая генерирует блоки легче криосекции, чем OCT. Есть несколько небольших советов, чтобы получить хорошие разделы желатина встроенных недекализированных твердых тканей. Критический шаг заключается в том, чтобы вставлять с желатином вместо OCT. Чтобы лучше проникнуть, держите образцы в 30% сахарозы еще один день после того, как образцы опускаются на дно. Не менее важно установить температуру ниже, чем обычно, при температуре около -25 градусов по Цельсию. Ультра-острый лезвие не требуется. Хотя более низкая температура крио (-25 градусов по Цельсию) вносит некоторые улучшения для криоотделения OCT встроенных недеккалированных твердых тканей, по-прежнему трудно получить хорошую целостность структур ткани. Как показано на рисунке 2, Рисунок 3, и Рисунок 4, хорошее качество разделы, применимые для иммуно-стоина были получены из желатина встроенных твердых тканей (например, трабекулярные кости, корковые кости, кости черепа, носовые ткани и резец). Эти результаты доказали, что встраивание желатина значительно улучшает целостность образца секций твердой ткани, но также усиливает сливки секций для скольжения очков. Кроме того, желатин сохраняет функции антигена и обладает совместимостью с флуоресцентными сигналами и иммуностоингом. Тем не менее, эта техника хорошо работает только для образцов до 3 месяцев. Потенциальные улучшения этого метода (1) для вскрытия образцов дальше, чтобы отделить целевую ткань от других частей, чтобы сделать структуру ткани простой (в случае зубов, челюсть или челюсть должна быть расчленена и фиксированной вместо всей головы) и (2) использовать 10% ЭДТА для декальцифиза тканей всего за 2-3 дня до криозащиты. Это короткое время декальцинации не поставит под угрозу результаты иммунодефицита. Еще одна проблема заключается в том, что, как неводное встраивающее средства массовой информации, желатин не может быть легко удален из слайдов, что может привести к более высокому фону в зависимости от методов окрашивания (например, окрашивание Н И Е).
Иммуностоцингрезультаты результаты не легко количественно, поэтому они обычно используются полуколичественно. Трудности и ограничения количественной оценки иммуностоиции черепно-лицевых тканей включают, но не ограничиваются следующим: (1) трудно определить область, подсчитывается из-за сложности структуры черепно-мозговых тканей; (2) трудно определить маркированную область или помеченные клетки из-за нелинейного характера иммуносохранения; (3) существует ограниченная информация для динамического диапазона сигнала; (4) трудно сравнить интенсивность сигналов между изображениями или группами из-за увядания флуоресцентного сигнала во время приобретения изображения; и (5) фон сигнала может значительно измениться среди антител, слайдов и образцов. Чтобы повысить надежность результатов количественной оценки, эксперимент должен быть тщательно и строго выполнен. Все образцы должны быть обработаны в одинаковых условиях. Во время иммунодефицита, различные элементы управления необходимы для оценки сигнального фона и определить положительную область или клетки для сигнала. Возьмите убедительные и репрезентативные изображения, чтобы четко показать область, которая будет подсчитана и помечены клетки с хорошим контрастом. Кроме того, при приобретении изображения настройка камеры и оборудование должны быть согласованы.
В совокупности мы представляем простой стандартный протокол иммунофлуоресценции на черепно-мозговых тканях мыши, особенно для недекалькированных твердых тканей. Иммунодефицитный анализ черепно-мозговых тканей не только поможет понять механизм морфогенеза во время развития, но и иллюстрирует изменения при патогенезе. Кроме того, иммуностоирование может также использоваться для изучения экспрессии других сигнальных лигандов, рецепторов или других фенотипических маркеров, помимо пролиферации клеток, гибели клеток и сигнального пути БМП. Тем не менее, критические шаги иммуно-эксперимента должны быть изменены надлежащим образом для каждого антигена / антитела или ткани, чтобы получить конкретные окрашивания и сведены к минимуму неспецифических фоновых сигналов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (R01DE020843 до Y.M.), Международной ассоциацией ФОП (Y.M.), а также грантом от Национального фонда естественных наук Китая (31500788 до J.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive tape | Leica | #39475214 | |
| Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11034 | |
| Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| Coverslips | Fisher Brand | 12-545-E | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit | Millipore | S7165 | |
| Microscope slides | Fisher Brand | 12-550-15 | |
| OCT Compound | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Sigma | T9284 | Triton X-100 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2542 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Cell Signaling Technology | 9129 | Lot#:3; RRID:AB_2687446 |
| Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody | Cell Signaling Technology | 13820 | Lot#:3; RRID:AB_2493181 |
| Sodium citrate | Sigma | 1613859 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tris | Sigma | 10708976001 |
References
- Trinh, L. eA., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
- Marcucio, R., et al. Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face. Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).
- Graf, D., et al. Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development. Cytokine & Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).
- Snider, T. N., Mishina, Y. Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).
- Mishina, Y., Snider, T. N. Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology. Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
- Xiao, C., Dan-Bi, C. Double staining immunohistochemistry. North American Journal of Medical Sciences. 2 (5), 241-245 (2010).
- Zongli, Q., et al. Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
- Dun, X. P., Parkinson, D. B. Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration. Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).
- Akkiraju, H., et al. An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).
- González-Chávez, S. A., et al. Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).
- Kapelsohn, K. Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology. Protocol Exchange. , (2015).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. (85), e50803 (2014).
- Shi, S. R., et al. Antigen retrieval techniques: current perspectives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).
- Adell, T., et al. Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections. Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).
- Griffioen, H. A., et al. Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry. Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).
- Sarkar, S., et al. In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals. Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).
- Oorschot, V., et al. A novel flat‐embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).
