Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Vev forberedelse og Immunostaining av mus Kraniofacial vev og Undecalcified Bone

Published: May 10, 2019 doi: 10.3791/59113
Automatic Translation
*1,2, *2, 2
1The State Key Laboratory Breeding Base of Basic Science of Stomatology (Hubei-MOST) & Key Laboratory for Oral Biomedicine of Ministry of Education, School and Hospital of Stomatology, Wuhan University, 2Department of Biologic and Materials Sciences, School of Dentistry, University of Michigan
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en detaljert protokoll for å oppdage og kvantifisere proteinnivåer under kraniofacial morphogenesis/patogenesen av immunostaining ved hjelp av musen kraniofacial vev som eksempler. I tillegg beskriver vi en metode for utarbeidelse og kryosnitt av undecalcified harde vev fra unge mus for immunostaining.

Abstract

Tissue immunostaining gir svært spesifikk og pålitelig påvisning av proteiner av interesse innenfor et gitt vev. Her beskriver vi en komplett og enkel protokoll for å oppdage protein uttrykk under kraniofacial morphogenesis/patogenesen ved hjelp av mus kraniofacial vev som eksempler. Protokollen består av utarbeidelse og kryosnitt av vev, indirekte immunofluorescence, bildeoppkjøp, og kvantifisering. I tillegg er en metode for utarbeidelse og kryosnitt av undecalcified hardt vev for immunostaining beskrevet, ved hjelp av kraniofacial vev og lange bein som eksempler. Disse metodene er nøkkelen til å bestemme protein uttrykk og morfologiske/anatomiske endringer i ulike vev under kraniofacial morphogenesis/patogenesen. De gjelder også for andre vev med passende modifikasjoner. Kunnskap om histologi og høy kvalitet på seksjoner er avgjørende for å trekke vitenskapelige konklusjoner fra eksperimentelle utfall. Potensielle begrensninger av denne metodikken inkluderer men er ikke begrenset til spesifisitet av antistoffer og vanskeligheter med kvantifisering, som også diskuteres her.

Introduction

Ansiktet er en viktig del av menneskets identitet, og er sammensatt av flere forskjellige typer vev, som epitel, muskler, bein, brusk, tann. Disse vev er avledet fra alle tre bakterie lag: ektoderm, endoderm, og mesoderm1,2. For riktig mønster og utvikling av kraniofacial vev, celle spredning, død og differensiering må være svært koordinert og regulert av spesifikke signalering veier, for eksempel wnt, FGF, HH og BMP trasé3,4 ,5. Defekter i spredning, overlevelse eller differensiering av celler vil føre til kraniofacial misdannelser, som er blant de hyppigst forekommende medfødte misdannelser. Transgene mus er nyttige verktøy for å studere mekanismer for kraniofacial morphogenesis og patogenesen1,2,3,4,5. Forstå endringene i kraniofacial strukturer under utvikling og patogenesen vil bidra til å avklare viktige utviklingsmessige prinsipper samt mekanismer for kraniofacial misdannelser1,2,3 ,4,5.

Den farging av hele montere eller delt vev med spesifikke antistoffer er en uvurderlig teknikk for å bestemme romlig fordeling av proteiner av interesse 6. Formelt kan vevs immunostaining stole enten på immunhistokjemi (IHC) eller immunofluorescence (IF). Sammenlignet med den ugjennomsiktige reaksjons produkt generert med et kromogen substrat som 3, 3 '-Diaminobenzidine (DAB) med IHC, hvis innebærer bruk av fluorescerende konjugater synlig ved fluorescens mikroskopi. Derfor, hvis kan tydelig skille positive celler fra bakgrunnsstøy, og lar bildene skal kvantitativt analysert og forbedret på en enkel måte av programvare som ImageJ og Adobe Photoshop7,8. Hele Mount farging tilnærmingen fungerer på små blokker av vev (mindre enn 5 mm tykk), som kan gi tredimensjonal informasjon om plasseringen av proteiner/antigener uten behov for rekonstruksjon fra avsnitt9,10 . Men sammenlignet med vev seksjoner, hele Mount immunostaining er tidkrevende og krever store mengder antistoff løsninger. Ikke alle antistoffer er kompatible med den grunnleggende hele monterings tilnærmingen. I tillegg vil ufullstendig inntrengning av antistoffer føre til ujevne flekker eller falske negative flekker. Her vil vi fokusere på immunofluorescence deteksjon av proteiner/antigener på delt vev. For hardt vev (f. eks, hode, tann, lange ben), kalsium avsetning under utvikling/patogenesen gjør prøven vanskelig å delen og lett skylles av under immunostaining behandling11,12. De fleste av de tilgjengelige protokollene avkalke hard vev før innebygging for å gjøre snitting enklere, noe som er tidkrevende og kan ødelegge morfologi og antigener av prøver hvis håndteres feil11,12. For å overkomme problemene, optimaliserte vi en tilnærming for kryosnitt av hardt vev uten Avkalking, noe som fører til forbedret visualisering av deres morfologi og distribusjon av signalering proteiner.

Protokollen som beskrives her, brukes til å bestemme morphometric og histologiske endringer i det kraniofacial vevet i BMP transgene mus. Nærmere bestemt inkluderer protokollen (1) høsting og dissekere hodet vev, (2) seksjon og immunostaining av eksperimentelle markører (Ki67, pSmad1/5/9) sammen med TUNEL farging, (3) Imaging avsnittene ved hjelp av fluorescens mikroskop, og til slutt (4) analysere og kvantifisere resultatene. Protokollen til å forberede og cryosection hardt vev uten avkalking er også beskrevet13. Disse metodene er optimalisert for kraniofacial vev. De er også gjeldende for andre vev fra ulike aldre av prøver med passende modifikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle musen eksperimenter ble utført i samsvar med University of Michigan retningslinjer dekker Human omsorg og bruk av dyr i forskning. Alle dyr prosedyrer som brukes i denne studien ble godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) ved University of Michigan (protokoll #PRO00007715).

1. vevs forberedelser

  1. Utarbeidelse av embryonale vev
    1. Forbered 1 10 cm parabol og flere 3,5 cm retter som inneholder fosfat bufret saltvann (PBS), og 1 12-brønn kultur plate som inneholder 2 mL 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS i hver brønn for hver gravid mus. Plasser alle Petri retter og platen på isen.
      Merk: Håndter 4% PFA i en avtrekksvifte.
    2. Analysere embryo fra gravide mus i iskald PBS med pinsett og saks som tidligere beskrevet14.
      1. Kort, euthanize en gravid mus med CO2, grip huden under midten av magen med tang og skjær gjennom huden bare, deretter forsiktig trekke i huden for å skille den fra underliggende mage muskelen veggen.
      2. Deretter skåret i bukhulen etter samme linje av huden snitt. Fjern livmoren som inneholder en rekke embryo og fjerne embryo ved å forsiktig skjære bort livmor veggen. Den extraembryonic vev som eggeplomme SAC og amnion vil bli fjernet.
      3. Skjær og isolere hodet fra hvert embryo.
    3. Overfør hvert hode inn i hver brønn av en 12-brønn plate som inneholder 4% PFA med en plast overføring pipette eller tang. Fix prøver i 4% PFA ved 4 ° c for 4 h. skyll prøvene i PBS ved 4 ° c med lett risting i 12 timer.
      Merk: For embryo yngre enn embryonale dagen 16,5 (E 16.5), fikse embryo hoder med 4% PFA direkte etter isolasjon. For embryo på E 16.5 eller senere, fjerne å forkaste hud og fettvev fra hodene og skyll flere ganger i iskald PBS før fiksering.
    4. Cryoprotect hoder.
      1. Overfør hvert hode inn i en ny 12-brønn plate som inneholder 2 mL 30% sukrose i PBS ved hjelp av en plast overføring pipette eller tang. Agitere forsiktig ved 4 ° c til hodet synker til bunnen av fatet.
    5. Bygg inn hoder.
      1. Overfør cryoprotected hodet inn i en mold som inneholder optimal skjæring temperatur (OCT) sammensatte. Likevekt prøver i OCT i flere minutter. Juster plasseringen og retningen på prøvene med tang.
      2. Plasser mold på tørr is for å fryse. Oppbevar den resulterende cryomolds i en plastpose ved-80 ° c til den er klar for kryosnitt.
        Merk: Trimmet siden av prøvene må møte bunnen av embedding mold.
  2. Fremstilling av postnatal undecalcified hardt vev
    1. Euthanize for 3 uke eller 3 måneden gamle musen med CO2. Fjern hud og fettvev. Skjær og isolere hodet eller lange bein fra musen.
    2. Fix og cryoprotect hodet eller lange bein av mus som beskrevet i trinn 1.1.3-1.1.4.
    3. Embed i 8% gelatin på en lignende måte som trinn 1.1.5. Oppbevar cryomolds i en plastpose ved-80 ° c til kryosnitt.
      Merk: Avkalking er ikke nødvendig her. For å forberede 8% gelatin, bland 8 g gelatin med 100 mL av PBS og kok ved hjelp av en mikrobølgeovn. Vær oppmerksom på at blandingen koker over lett.

2. kryosnitt

  1. Sett kryostaten temperatur til-18 ° c for bløtvev innebygd i OCT eller-25 ° c og lavere for undecalcified hardt vev innebygd i gelatin. Hold prøvene i kryostaten kammeret i ca. 30 min for å likevekt til kryostaten temperatur.
  2. Fjern blokkeringen fra cryomold. Frys blokken på prøven Chuck (vev holderen) via montering med en okt drop. Hold trimmet siden av prøven lengst fra Chuck (mot operatøren).
  3. Last blokk montert Chuck på den kryostaten objektholderen. Juster bladholderen for å få vinkelen til bladet 3 ° – 5 ° i forhold til prøven.
  4. Samle 10 μm seksjoner på belagte objektglass. Tørre seksjoner helt på RT, og oppbevar dem ved-80 ° c.

3. histologiske farging og mikroskopisk Imaging

  1. Immunofluorescence farging
    1. Ta ut lysbilder fra-80 ° c. Hold lysbildene på RT for 1 t til airdry seksjoner. Skyll lysbildene i 0,1% PBST (0,1% polyetylen glykol tert-octylphenyl Eter i PBS; se tabell over materialer) tre ganger i 5 minutter hver for å vaske ut Oct og permeabilize seksjoner.
    2. Du kan også utføre antigen-henting (valgfritt).
      1. Forvarming citrate buffer (10 mM natrium citrate pH 6) i farge parabolen med dampskip eller vannbad til 95 – 100 ° c. Dypp lysbildene i citrate buffer, ruge i 10 min.
      2. Ta flekker rett ut fra dampbåten eller vannbad til RT. avkjøle det lysbilder for RT for 20 min eller lengere15.
        Merk: Som alternativer, bruk Tris-EDTA buffer (10 mM Tris base, 1 mm EDTA, 0,05% mellom 20, pH 9,0) eller EDTA buffer (1 mM EDTA, 0,05% mellom 20, pH 8,0) for varme-indusert antigen henting. Bruk en trykkoker, mikrobølgeovn eller vannbad for varme-indusert antigen henting, i tillegg til den varme dampbåten. Et enzym-indusert antigen henting ved hjelp av Trypsin eller pepsin er et annet alternativ. Optimaliser konsentrasjonen og behandlingstiden for enzymatisk gjenfinning for å unngå skadelige seksjoner. Optimaliser antigen henting metoden for hver antistoff/antigen kombinasjon.
    3. Ruge hvert lysbilde med 200 μL av blokkerings løsning (5% esel serum fortynnet i 0,1% PBST) ved RT i 30 minutter, og fjern deretter blokkerings løsningen uten skylling.
    4. Ruge hvert lysbilde med 100 μL av primær antistoff eller antistoffer fortynnet i blokkerings løsning for 1 time ved RT eller O/N ved 4 ° c. Skyll lysbildene med PBS tre ganger for 10 min hver på RT.
    5. Ruge hvert lysbilde med 100 μL av sekundært antistoff fortynnet i blokkerings løsning for 1 time ved RT. skyll lysbildene i PBS tre ganger i 10 minutter hver på RT. Beskytt lysbildene mot lys.
    6. Montere lysbilder.
      1. Legg til to dråper anti-fade medium med DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) på lysbildet. Deretter dekke med en dekkglass.
      2. Oppbevares ved 4 ° c i mørket til det er klart til bilde.
        Merk: Som et alternativ, merke kjernen med DAPI eller Hoechst 33324 fargestoff fortynnet 1:2000 i PBS på RT først, deretter montere med glyserol.
  2. Terminal deoksynukleotidyltransferase glutamyltransferase dUTP Nick end merking (TUNEL) farging.
    Merk: Dobbelt strandet DNA med 3 '-hydroksyl Termini (3 ' OH DNA Termini) vil danne under apoptose i cellen. Her gir vi en protokoll som etiketten den frie 3 ' OH DNA Termini in situ via merking DNA fragmenter med digoxigenin-nukleotid utnytte Terminal deoksynukleotidyltransferase glutamyltransferase (TdT) ved bestemte flekker ved hjelp av en kommersiell Kit (se tabell over materialer ).
    1. Alternativt, beis seksjoner med primær og Alexa fluor-488 merket sekundære antistoffer før TUNEL farging. Skyll lysbildene i PBS tre ganger for 10 min hver.
      Merk: Dette trinnet er valgfritt for en dobbel farging av et protein og TUNEL i samme lysbilde.
    2. Ruge hvert lysbilde med 100 μL proteinase K (10 μg/mL i 10 mM Tris pH 7,5 og 5 mM EDTA) i 5 minutter ved RT. skyll lysbildene med PBS tre ganger for 10 min hver på RT.
      Merk: Juster inkubasjonstid og temperatur på proteinase K for hver vevs type. For 10 μm deler av embryo hoder fast i 4% PFA, ruge i 5 min ved RT. I tillegg til metoden ved hjelp proteinase K, bruk alternative behandlinger etter behov, inkludert (1) nylaget 0,1% polyetylen glykol tert-octylphenyl Eter, 0,1% natrium citrate, 10 min ved 37 ° c; (2) 0,25% – 0,5% pepsin i HCl (pH 2) eller 0,25% Trypsin, 10 min ved 37 ° c; og (3) mikrobølger med 0,1 M citrate buffer (pH 6).
    3. Påfør 200 μL av blokkerings løsning (5% esel serum fortynnet i 0,1% PBST) til hvert lysbilde, ruge ved RT i 30 minutter, trykk av blokkerings løsningen uten skylling.
    4. Påfør 50 μL av likevekts buffer levert av settet til hvert lysbilde på RT i minst 10 s. Trykk av bufferen uten skylling.
    5. Forbered reaksjons blanding (arbeidsstyrke TdT enzym) ved å blande TdT enzym med reaksjonsbuffer levert av settet i forholdet 3:7. Påfør 50 μL av reaksjonsblandingen på hvert lysbilde, og ruge ved 37 ° c for 1 t. Trykk av bufferen uten skylling.
    6. Påfør 200 μL av stopp bufferen (1:30 fortynnet i ddH2O) leveres av settet til hvert lysbilde, deretter RUGE ved RT i 10 min. skyll LYSBILDENE med PBS tre ganger for 10 min hver.
    7. Etikett med Rhodamine-antistoff.
      1. Påfør 50 μL av pre-varmet (RT) anti-digoxigenin bøy (rhodamine) (1:1 fortynnet i blokkerings løsning) til hvert lysbilde. Ruge ved RT i 30 minutter i mørket.
      2. Skyll lysbildene med PBS tre ganger for 10 min hver. Monter lysbildene som trinn 3.1.6.

4. Imaging oppkjøp

  1. Bruk positive kontroller (vev positivt for mål antigen) for å kontrollere signal merking og negative kontroller (utelate primære antistoff, isotype kontroll eller vev negativt for mål antigen) for å evaluere bakgrunnen av bilder under fluorescerende Mikroskop.
  2. Still inn utstyr og kamera forhold (eksponeringer og andre generelle innstillinger) for bildebehandling basert på signal intensiteten til negative og positive kontroller.
    Merk: Disse forholdene varierer med (1) kameraer og mikroskop som brukes til bildebehandling, (2) antistoffer og (3) vev for hvert eksperiment. Vanlige tilstander som brukes for kraniofacial vev er ISO 200 med en eksponeringstid som spenner fra 1/100 s til 1 s avhenger av kvaliteten og spesifisitet av antistoffer. Passende forstørrelser varierer avhengig av størrelsen på prøvene og formålet med eksperimenter.
  3. Skaff bilder med konvensjonelt epifluorescence mikroskop eller konfokalmikroskopi mikroskop. Skaff deg bilder (inkludert de tilhørende kontrollene) i de samme betingelsene for hver fargekanal. Lagre bilder med samme format (TIFF er best å bevare informasjon).

5. fluorescens kvantifisering

Merk: Statistisk sammenligne farging mellom ulike grupper vil være mer informativ i mange tilfeller. Med de immunofluorescence bildene kan du Kvantifisere det relative nivået av proteinet ved å måle signal tetthet, telle positive celler eller beregne positive områder. For statistisk analyse er minimum antall biologisk uavhengige prøver 3. En typisk metode er å generere minst tre seksjoner fra hver prøve og ta bilder for minst tre representative områder i hver del.

  1. Kvantifisering av fluorescens intensitet ved hjelp ImageJ
    1. Åpne programvaren, og bruk analyser ≫ angi målinger for å kontrollere at bare området og integrert tetthet er valgt. Bruk arkiv > Åpne for å åpne bilder som skal analyseres.
    2. Bruk verktøylinjen til å velge enten Firkant-eller sirkelikonet helt til venstre. Velg området som skal analyseres på bildet ved hjelp av markeringsverktøyet. Bruk analyser > mål for å få avlesning av det valgte området og integrert tetthet i resultater-vinduet. Merk et område ved siden av en positiv celle som ikke har noen fluorescens, til å lese ut bakgrunnen.
    3. Gjenta trinn-5.1.2 for å analysere andre bilder. Justert området som skal analyseres for å samsvare med det for det første bildet.
    4. Kopier alle dataene i resultater-vinduet og lim inn i et regneark når du er ferdig med å analysere.
    5. Beregn den korrigerte fluorescens intensiteten (CTCF) som integrert tetthet — (areal på valgt celle x Mean fluorescens av bakgrunns avlesninger). Sammenlign forskjellen på den korrigerte total celle fluorescens mellom prøvene og lage en graf.
  2. Kvantifisering av positive celle antall fluorescerende bilder ved hjelp av ImageJ
    1. Manuell telling av celler.
      1. Bruk ImageJ > plugins > analyse for å installere Cell Counter plugin.
      2. Bruk arkiv > Åpne for å åpne bilder som skal analyseres. Bruk Plugins > analyse > celle telleren for å åpne teller vinduet og resultatvinduet.
        Merk: Celle telleren virker ikke på stakker. For telling stabler, plugin plot Z Axis profil, bruk deretter bilde ≫ stabler > plot Z Axis profil for å overvåke intensiteten av en bevegelig avkastning ved hjelp av et partikkel sporingsverktøy. Dette verktøyet kan enten være manuell eller automatisk.
      3. Klikk på en av knappene nederst i teller vinduet for å starte tellingen. Klikk direkte på en celle/objekt som skal telles til etterbehandling.
      4. Klikk på resultater -knappen i Count -vinduet. Det totale antallet celler som telles, vises i resultat vinduet. Lagre resultatloggen som regneark og analyser.
    2. Automatisert celle telling.
      1. Bruk arkiv > Åpne for å åpne bilder som skal analyseres. Konverter RGB-bildet til et gråtonebilde før du fortsetter.
      2. Bruk bilde > justere > terskelen for å velge alle områdene som må telles.
      3. Bruk analyser ≫ analysere partikler for å få antall celler/partikler. Angi en rekkevidde av den gyldige partikkelstørrelsen (for eksempel 100-Infinity) i stedet for standardverdien 0-uendelig for å telle celler/partikler innenfor et bestemt område. Lagre resultatloggen som regneark og analyser.
        Merk:         for å få annen informasjon fra bildet, i tillegg til området, gå til analyser > angi målinger og velg boksen ved siden av informasjonen som trengs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Embryonale kraniofacial vev seksjoner
Etter trinnene ovenfor, var hodene dissekert fra kontroll (p0-grobunn) eller mutant (Constitutively aktivert Bmpr1a i neural Crest celler, p0-grobunn; caBmpr1a) embryo på embryonale dagen (E) 16,5 eller 18,5. Etter innfesting i 4% PFA for 4 h, prøvene ble innebygd i OCT og cryosectioned koronalt. Resulterte seksjoner ble immunostained med antistoffer mot pSmad1/5/9 (nedstrøms BMP signalering faktorer) eller Ki67 (en celle spredning markør) uten antigen henting i henhold til protokollen. Som vist, pSmad1/5/9 (figur 1a) og Ki67 (figur 1C) var positive i frontal bein av kontroll embryo. I mutant embryo ble nivåene av pSmad1/5/9 øket (figur 1B), mens de av Ki67 ble redusert (figur 1d) i front benene. Celle død i disse prøvene ble også sjekket i henhold til protokollen. Som vist, ble mer apoptotisk celler observert i frontal bein av mutant embryo enn kontroll embryo (figur 1e, F).

Undecalcified kraniofacial vev eller lange bein seksjoner
Etter trinnene ovenfor for undecalcified hardt vev, hoder fra 3 uke gamle mus (p0-grobunn; mTmG (membran-tomat og membran GFP)) ble løst med 4% PFA og innebygd i 8% gelatin. Koronale cryosections ble vasket med PBST og montert med anti-fade medium med DAPI. Figur 2a , B demonstrere at gelatin ikke forstyrrer fluorescerende signaler fra delt vev.

Hoder og femora fra 3 uke gamle eller 3 måneder gamle mus var ansatt for å sjekke om gelatin innebygd undecalcified vev er bra for IF. Hele hodene og femora ble behandlet og delt i henhold til protokollen. Resulterte seksjonene ble brukt for SOX9 immunostaining (Figur 3) eller OSX og E11/Podoplanin dobbel Immunostaining (Figur 4). Som vist, god kvalitet seksjoner ble innhentet fra de fleste av de 3 ukers hardt vev, inkludert trabekulær og kortikale rom i femur (figur 3a, B, figur 4a-D), frontal bein (figur 4e, F), helikopteret (figur 3e, F, figur 4I, J), nasal vev (figur 3c, D), og skallen inkludert nasal-premaxilla Sutur og omkringliggende bein (figur 4G, H ) av hodet. Mens, med 3-måneders gamle prøvene, god kvalitet seksjoner ble bare innhentet i noen av de harde vev, inkludert trabekulær rom i femur (figur 3g, H, figur 4k, L), nasal vev (figur 3I , J), og skallen inkludert nasal-premaxilla Sutur og omkringliggende bein (figur 4m, N) av hodet. Som vist i Figur 3ble SOX9 positive celler påvist spesielt i chondrocytes av vekst platen (figur 3b) og leddet (figur 3h) fra femur og nese septum (figur 3D, J). I den 3 uke gamle helikopteret ble SOX9 påvist i mesenchymal celler (figur 3F). OSX og E11 dobbelt flekker resultatene viste at OSX ble oppdaget i osteoblaster, mens E11 ble oppdaget i osteocytter av bein fra femur og hodet (figur 4b, D, H, L, N). I 3 ukers helikopteret, OSX var positiv i dentindannelse, mens E11 var positiv i hårsekken mesenchymal celler (figur 4j). Disse resultatene tyder på at undecalcified hardt vev integrert med gelatin godt bevare antigen funksjoner.

Figure 1
Figur 1: eksempler på If-resultater av pSmad1/5/9, Ki67 eller TUNEL i kontroll embryo og mutant embryo med forbedret BMP-aktivitet. Constitutively aktivert Bmpr1a (caBmpr1a) mus ble krysset med p0-GROBUNN mus for å øke BMP signalering aktivitet i neural Crest celler (NCCs). Hoder av kontroll (p0-grobunn; caBmpr1a+/+) og mutant (p0-grobunn; caBmpr1aFX/+) embryo var dissekert på e 16.5 eller e 18.5, fast med 4% PFA for 4h, cryoprotected med 30% sukrose for 1 dag, innebygd i Oct, og cryosectioned ved-18 ° c. Deler av frontal benet (tilsvarende nivå med øyet) ble brukt for immunodetection mot pSmad1/5/9, Ki67, eller TUNEL farging. (A, B) pSmad1/5/9 (grønn) farging mønstre i frontal bein av kontroll (a) eller mutant (B) embryo på e 16.5. (C, D) Ki67 (grønn) farging mønstre i frontal bein av kontroll (C) eller mutant (D) embryo på e 18.5. (E, F) TUNEL (rød) farging mønstre i frontal bein av kontroll (E) eller mutant (F) embryo på E 18.5. Kjerner ble farget med DAPI (blå). FB = frontal bein, B = hjernen. Skala stolper = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: eksempler på mTmG reporter signal resultater av undecalcified vev i hodet. Heads fra 3 uke gamle p0-grobunn mus med membran-tomat og membran GFP (mTmG) reporter ble dissekert, festet med 4% PFA for 4h, cryoprotected med 30% sukrose i 2 dager, innebygd i 8% gelatin, og Cryosectioned ved-25 ° c. Head seksjoner tydelig viser GFP (grønn, grobunn rekombinasjon positive) og tomat (rød, grobunn rekombinasjon negativt) signal i nese benet og nese vevet (A, B). Kjerner ble farget med DAPI (blå). NB = nasal bein, N = nasal vev, NS = nasal septum. Skala stolper = 250 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: eksempler på SOX9 immunostaining resultater av undecalcified vev i hodet og femora. Hoder og femora ble dissekert fra 3 uke eller 3 måneder gamle mus, fast med 4% PFA for 4h, cryoprotected med 30% sukrose for 2 dager, innebygd i 8% gelatin, og cryosectioned ved-25 ° c. Lysbildene ble brukt til immunodetection mot SOX9 (rød). Kjerner ble farget med DAPI (blå) (B, D, F, H, J). Tilstøtende deler av disse vev ble brukt for Hematoksylin & Eosin (H & E) farging (A, C, E, G, I). Pil hoder i A og B indikerer vekst plate og i G og H, ledd brusk. Piler i A og G indikerer trabekulær bein og i C, D, I og J, nasal septum. DM = Dental mesenchyme, DE = Dental epitel, FM = hårsekken mesenchyme. Skala stolper = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: eksempler på OSX og E11 dobbelt immunostaining resultater av undecalcified vev i hodet og femora. Hoder og femora ble dissekert fra 3 uke gamle eller 3 måneder gamle mus, fast med 4% PFA for 4h, cryoprotected med 30% sukrose i 2 dager, innebygd i 8% gelatin, og cryosectioned ved-25 ° c. Seksjoner ble brukt for dobbel immunostaining med antistoffer mot OSX (rød) og E11/Podoplanin (grønn). Kjerner ble beiset med DAPI (blå) (B, D, F, H, J, L, N). Tilstøtende deler av disse vev ble brukt for H & E farging (A, C, E, G, I, K, M). Piler i A, B, K og L indikerer trabekulær rom i femur; C og D, kortikale hyller av femur; og i E og F, frontal Bones. Pilspisser i A og B angir vekst plate. BM = benmarg, N = nasal vev, DM = Dental mesenchyme, DE = Dental epitel, FM = hårsekken mesenchyme, NPS = nasal premaxilla Sutur. Front benene (E, F) og nese premaxilla Sutur og omkringliggende bein (G, H, M, N) vises også. Skala stolper = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her gir vi en detaljert protokoll for utarbeidelse av mus hodet og undecalcified bein vev, og kryosnitt for immunostaining av celle spredning, celle død, og BMP signalering markører. Vi har også detaljert informasjon om strategien for innhenting av kvantitative data fra immunofluorescent bilder. Disse metodene kan også gjelde for andre vev med passende modifikasjoner.

Betingelser for vevs forberedelser varierer etter størrelse og type vev. Fiksering og cryoprotection tid vanligvis trenger flere timer til over natten. Etter fiksering, kan vevet også bygges inn i parafin og delt med en mikrotomen16. Selv om både parafin og OCT fungerer godt for immunostaining, er det noen forskjeller mellom dem. Parafinblokkene kan oppbevares i flere år ved RT, mens OCT-blokkene er for 1 år ved-80 ° c. Parafin bevarer vev morfologi, mens iskrystall dannet under OCT innebygging kan negativt påvirke vev strukturer. Parafin noen ganger masker epitopes av antigener, mens OCT bevarer enzym aktiviteter og antigen epitopes. Derfor er det ikke behov for antigen henting for de fleste av Antistoffene hvis fast i 4% PFA for bare 4 t eller mindre og innebygd i OCT. Det er imidlertid fortsatt mulig å få bedre resultater ved antigen gjenfinning, hvis positive kontroller ikke viser gode flekker resultater i cryosections.

Både Hoechst fargestoff og DAPI kan brukes til kjernefysiske mot flekker. De har likheter, som begge (1) er UV-spent, mindre Groove-binding kjemikalier til å avgi signaler proporsjonal med totalt DNA-innhold, og (2) er utsatt for foto-bleking etter en lang eksponering. Men, Hoechst fargestoffer brukes vanligvis for farging av DNA-innhold i levende celler på grunn av deres høye permeabilitet. DAPI brukes vanligvis for farging av DNA i faste celler på grunn av dens lave membran permeabilitet. I tillegg genererer DAPI et sterkere og mer stabilt signal enn Hoechst.

Riktig kontroll er avgjørende for IF. Spesifisitet av hvert nytt antistoff bør bekreftes av Western Blot analyse, hvis det er aktuelt. Den optimale arbeids konsentrasjonen av et bestemt primært antistoff bør fastsettes ved bruk av serie fortynninger. En positiv kontroll (vev eller celle som er bevist å uttrykke protein/antigen) bør inkluderes for å sjekke IF-prosessen og spesifisitet av antistoff. En negativ kontroll bør også inkluderes, for eksempel fravær av det primære antistoff, eller substitusjon av normal IgG fra samme art for det primære antistoff, eller vev negativt for målet antigen. Når du tar bilder, bør prøven uten sekundære antistoffer (bakgrunns kontroll) undersøkes uavhengig av hver kanal for å sette grensene for signal forsterkning og offset for å tilpasses til den endelige bildebehandling. For påvisning av flere etiketter, bakgrunn kontroll og Single-merket kontroller må være forberedt på å unngå Spectral overlapping gjenstander. Alle kanaler som skal brukes til å få tak i et bilde av et utvalg med flere etiketter, må utsettes for uavhengig bakgrunns korreksjon, fordi autofluorescence i hver kanal varierer betydelig.

Vi gir også protokollen for utarbeidelse og kryosnitt av undecalcified hardt vev innebygd i gelatin. For OCT embedded decalcified hard vev, de fleste av de harde vev seksjoner vil bli løsrevet fra Skyv briller under immunostaining prosedyrer, på grunn av deres lav vedheft karakter på lysbildet. Den selvklebende tapen utformet for å lette kryosnitt bidrar til å generere god kvalitet seksjoner. Men, disse delene er lett skades når tapen er peeling av. For gelatin innebygd vev, er det ikke behov for en tape-Transfer system for å generere god kvalitet seksjoner. Som et embedding medium, kan gelatin infiltrere prøven godt, selv om den har en lavere viskositet sammenlignet med Oct. gelatin har blitt brukt i andre histologiske applikasjoner, slik som hjernevev17,18 og ultratynne deler av celler for immuncytokjemi19. Her ble gelatin brukt til å legge undecalcified bein, som genererer blokker lettere å cryosection enn OCT. Det er flere små tips for å få gode deler av gelatin innebygd undecalcified hardt vev. Det kritiske trinnet er å legge inn med gelatin i stedet for OCT. For å få bedre penetrasjon, holde prøvene i 30% sukrose en dag etter at prøvene synke til bunns. Det er like viktig å sette temperaturen lavere enn vanlig på ca-25 ° c. En ultra-skarp blad er ikke på krevd. Selv om en lavere fryse temperatur (-25 ° c) gjør noen forbedringer for kryosnitt av OCT embedded undecalcified hard vev, er det fortsatt vanskelig å få en god integritet av vev strukturer. Som vist i figur 2, Figur 3, og Figur 4, god kvalitet seksjoner gjelder for immunostaining ble innhentet fra gelatin innebygd hardt vev (f. eks, trabekulær bein, kortikale bein, skallen bein, nasal vev, og helikopteret). Disse resultatene beviste at gelatin embedding betydelig forbedrer prøven integriteten til harde vev seksjoner, men også forbedrer vedheft av delene til Skyv briller. I tillegg, gelatin bevarer antigen funksjoner, og utstillinger kompatibilitet med fluorescerende signaler og immunostaining. Imidlertid, denne teknikk bare arbeider frisk for til 3 måneden-gamle eksemplar. Muligheter forbedringer av denne metoden er (1) å analysere prøvene fremme å separat målet tissue fra annet deler å vil få struktur av vevet enkel (i tilfellet av tenner, kjeven eller maxilla burde være dissekert og bestemt istedet for det hele leder) og (2) å bruke 10% EDTA til avkalke vev for bare 2 – 3 dager før cryoprotection. Denne korte tiden med Avkalking vil ikke kompromittere immunostaining resultater. En annen bekymring er at, som en ikke-vandig embedding Media, kan gelatin ikke lett fjernes fra lysbildene, noe som kan føre til høyere bakgrunn avhengig av farge metoder (f. eks H & E farging).

Immunostaining resultatene er ikke lett å kvantifisere, så de er vanligvis brukes semi-kvantitativt. Vanskeligheter og begrensninger av kvantifisering av immunostaining av kraniofacial vev inkluderer men er ikke begrenset til følgende: (1) det er vanskelig å definere området som skal telles på grunn av kompleksiteten i strukturen av kraniofacial vev; (2) det er vanskelig å definere det merkede området eller merkede celler på grunn av den ikke-lineære natur immunostaining; (3) det er begrenset informasjon for det dynamiske spekteret av signalet; (4) det er vanskelig å sammenligne intensiteten av signaler mellom bilder eller grupper på grunn av falming av fluorescerende signal under bilde oppkjøpet; og (5) signal bakgrunnen kan endre betydelig blant antistoffer, lysbilder og prøver. For å øke påliteligheten av kvantifisering resultater, bør eksperimentet være nøye og strengt utført. Alle prøvene skal behandles under samme vilkår. Under immunostaining kreves det ulike kontroller for å evaluere signal bakgrunn og definere det positive området eller cellene for signalet. Ta overbevisende og representative bilder for å tydelig vise området som skal telles og merket celler med god kontrast. I tillegg, under bilde anskaffelse, må kamerainnstillingen og utstyrs innstillingen holdes konsekvent.

Til sammen presenterer vi en enkel standard protokoll for immunofluorescence på mus kraniofacial vev, spesielt for undecalcified hardt vev. Immunostaining analyse av kraniofacial vev vil ikke bare bidra til å forstå mekanismen av morphogenesis under utvikling, men også illustrere endringene under patogenesen. I tillegg kan immunostaining også brukes til å studere uttrykket mønster av andre signalering sti ligander, reseptorer, eller andre fenotypiske markører, foruten celle spredning, celle død, og BMP signalering veien. De kritiske trinnene i et immunostaining eksperiment må imidlertid endres på riktig måte for hvert antigen/antistoff eller vev for å få spesifikke flekker og minimerte ikke-spesifikke bakgrunns signaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (R01DE020843 til Y.M.), International FOP Association (Y.M.), og en stipend-i-bistand fra National Natural Science Foundation i Kina (31500788 til J.Y.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive tape Leica #39475214
Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody Invitrogen A-11034
Antifade Mountant with DAPI Invitrogen P36931
Bovine serum albumin Sigma A2153
Coverslips Fisher Brand 12-545-E
Cryostat Leica CM1850
EDTA Sigma E6758
Fluorescence microscope Olympus BX51
Gelatin Sigma G1890
In Situ Cell Death Detection Kit Millipore S7165
Microscope slides Fisher Brand 12-550-15
OCT Compound Fisher Healthcare 23-730-571
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148 
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P4417
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether Sigma T9284 Triton X-100
Proteinase K Invitrogen AM2542
Rabbit anti-Ki67 antibody Cell Signaling Technology 9129 Lot#:3; RRID:AB_2687446
Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody Cell Signaling Technology 13820 Lot#:3; RRID:AB_2493181
Sodium citrate Sigma 1613859
Sucrose Sigma S9378
Tris Sigma 10708976001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trinh, L. eA., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
  2. Marcucio, R., et al. Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face. Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).
  3. Graf, D., et al. Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development. Cytokine & Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).
  4. Snider, T. N., Mishina, Y. Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).
  5. Mishina, Y., Snider, T. N. Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology. Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).
  6. Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
  7. Xiao, C., Dan-Bi, C. Double staining immunohistochemistry. North American Journal of Medical Sciences. 2 (5), 241-245 (2010).
  8. Zongli, Q., et al. Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).
  9. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
  10. Dun, X. P., Parkinson, D. B. Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration. Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).
  11. Akkiraju, H., et al. An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).
  12. González-Chávez, S. A., et al. Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).
  13. Kapelsohn, K. Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology. Protocol Exchange. , (2015).
  14. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. (85), e50803 (2014).
  15. Shi, S. R., et al. Antigen retrieval techniques: current perspectives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).
  16. Adell, T., et al. Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections. Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).
  17. Griffioen, H. A., et al. Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry. Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).
  18. Sarkar, S., et al. In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals. Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).
  19. Oorschot, V., et al. A novel flat‐embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).

Tags

Utviklingsbiologi utviklingsbiologi transgene mus BMP signalering immunostaining kraniofacial morphogenesis undecalcified hardt vev kvantifisering
Vev forberedelse og Immunostaining av mus Kraniofacial vev og Undecalcified Bone
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, J., Pan, H., Mishina, Y.… More

Yang, J., Pan, H., Mishina, Y. Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone. J. Vis. Exp. (147), e59113, doi:10.3791/59113 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter