Summary
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att upptäcka och kvantifiera proteinnivåer under kraniofacial morfogenes/patogenes genom immunofärgning med hjälp av mus kraniofacial vävnader som exempel. Dessutom beskriver vi en metod för beredning och kryosektionering av undecalcified hårda vävnader från unga möss för immunofärgning.
Abstract
Vävnads immunofärgning ger mycket specifik och tillförlitlig detektion av proteiner av intresse inom en given vävnad. Här beskriver vi ett komplett och enkelt protokoll för att detektera proteinuttryck under kraniofacial morfogenes/patogenes med hjälp av mus kraniofacial vävnader som exempel. Protokollet består av beredning och kryosektionering av vävnader, indirekt immunofluorescens, bild förvärv och kvantifiering. Dessutom beskrivs en metod för beredning och kryosektionering av undecalcified hård vävnad för immunofärgning, med hjälp av kraniofaciala vävnader och långa ben som exempel. Dessa metoder är avgörande för att bestämma proteinuttryck och morfologiska/anatomiska förändringar i olika vävnader under kraniofacial morfogenes/patogenes. De är också tillämpliga på andra vävnader med lämpliga modifieringar. Kunskap om histologi och hög kvalitet på sektioner är avgörande för att dra vetenskapliga slutsatser från experimentella resultat. Potentiella begränsningar av denna metod inkluderar men är inte begränsade till specificitet av antikroppar och kvantifieringsproblem, som också diskuteras här.
Introduction
Ansiktet är en viktig del av människans identitet, och består av flera olika typer av vävnader, såsom epitel, muskler, ben, brosk, tand. Dessa vävnader härstammar från alla tre bakterie lagren: ektoderm, endoderm och mesoderm1,2. För korrekt mönkning och utveckling av kraniofaciala vävnader, cellproliferation, död och differentiering måste vara mycket samordnade och regleras av specifika signalering vägar, såsom WNT, FGF, hh och BMP vägar3,4 ,5. Defekter i proliferation, överlevnad eller differentiering av celler kommer att leda till kraniofaciala missbildningar, som är bland de vanligast förekommande medfödda missbildningar. Transgena möss är användbara verktyg för att studera mekanismerna för kraniofacial morfogenes och patogenes1,2,3,4,5. Att förstå förändringarna i kraniofaciala strukturer under utveckling och patogenes kommer att bidra till att klargöra viktiga utvecklingsprinciper samt mekanismerna för kraniofaciala missbildningar1,2,3 ,4,5.
Färgning av hela Mount eller sektionerade vävnader med specifika antikroppar är en ovärderlig teknik för bestämning av rumslig distribution av proteiner av intresse 6. Formellt kan vävnads immunofärgning förlita sig antingen på immunohistokemi (IHC) eller immunofluorescens (IF). Jämfört med den ogenomskinliga reaktionsprodukt som genereras med ett kromogent substrat såsom 3, 3 '-Diaminobenzidin (DAB) av IHC, om det innebär användning av fluorescerande konjugat synligt genom fluorescens mikroskopi. Därför, om kan tydligt skilja positiva celler från bakgrundsbrus, och gör att bilder kan kvantitativt analyseras och förbättras på ett enkelt sätt av program som imagej och Adobe Photoshop7,8. Hela monteringen färgning tillvägagångssätt fungerar på små block av vävnad (mindre än 5 mm tjock), som kan ge tredimensionell information om placeringen av proteiner/antigener utan behov av rekonstruktion från avsnitt9,10 . Jämfört med vävnads sektioner är dock hela Mount immunofärgning tidskrävande och kräver stora mängder antikropps lösningar. Alla antikroppar är inte kompatibla med det grundläggande hela monterings sättet. Dessutom kommer den ofullständiga penetrationen av antikroppar resultera i ojämn färgning eller falsk negativ färgning. Här kommer vi att fokusera på immunofluorescensen detektion av proteiner/antigener på sektionerade vävnader. För hårda vävnader (t. ex, huvud, tand, långa ben), kalcium deposition under utveckling/patogenes gör provet svårt att avsnitt och lätt sköljas av under immunofärgning behandling11,12. De flesta av de för närvarande tillgängliga protokollen avkalka hårda vävnader innan inbäddning för att göra snittning lättare, vilket är tidskrävande och kan förstöra morfologi och antigener av prover om de hanteras felaktigt11,12. För att övervinna problemen, vi optimerat ett tillvägagångssätt för kryosektionering av hårda vävnader utan avalskning, vilket leder till förbättrad visualisering av deras morfologi och distribution av signalering proteiner.
Det protokoll som beskrivs här används för att bestämma morphometriska och histologiska förändringar i kraniofaciala vävnader av BMP transgena möss. Specifikt innehåller protokollet (1) skörd och dissekera huvud vävnader, (2) avsnitt och immunofärgning av experimentella markörer (Ki67, pSmad1/5/9) tillsammans med TUNEL färgning, (3) Imaging sektionerna med fluorescensmikroskop, och slutligen (4) analysera och kvantifiera resultaten. Protokollet för beredning och kryosektion av hårda vävnader utan avalskning beskrivs också13. Dessa metoder är optimerade för kraniofacial vävnader. De är också tillämpliga på andra vävnader från olika åldrar av prover med lämpliga modifieringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla mus experiment utfördes i enlighet med University of Michigan riktlinjer som omfattar Human Care och användning av djur i forskning. Alla djurförsök som används i denna studie godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) vid University of Michigan (protokoll #PRO00007715).
1. vävnads beredning
-
Beredning av embryonala vävnader
- Förbered 1 10 cm skålen och flera 3,5 cm rätter som innehåller fosfatbuffrad saltlösning (PBS), och 1 12-well kultur tallrik som innehåller 2 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS i varje brunn för varje gravid mus. Placera alla petriskålar och plattan på isen.
Anmärkning: Handtag 4% PFA i ett draghuv. - Dissekera embryon från dräktiga möss i iskall PBS med pinps och sax som tidigare beskrivits14.
- Kortfattat, euthanize en gravid mus med CO2, ta tag i huden under mitten av magen med tång och skär genom huden bara, sedan försiktigt dra i huden för att separera den från den underliggande bukmuskeln väggen.
- Nästa, skuren i bukhålan efter samma linje av huden snitt. Ta bort livmodern som innehåller en sträng av embryon och ta bort embryon genom att försiktigt skära bort livmoderväggen. Den extraembryonala vävnader såsom äggula SAC och Amnion kommer att avlägsnas.
- Skär och isolera huvudet från varje embryo.
- Överför varje huvud till varje brunn på en 12-brunn-platta som innehåller 4% PFA med en plastöverföringspipett eller pinps. Fix prover i 4% PFA vid 4 ° c för 4 h. Skölj proverna i PBS vid 4 ° c med skonsam skakning i 12 h.
Anmärkning: För embryon yngre än embryonala dag 16,5 (E 16.5), fixera embryo huvuden med 4% PFA direkt efter isolering. För embryon vid E 16.5 eller senare, ta bort för att kassera hud och fettvävnad från huvudena och skölj flera gånger i iskall PBS före fixering. - Cryoprotect huvuden.
- Överför varje huvud till en ny 12-brunn-platta som innehåller 2 mL 30% sackaros i PBS med en plastöverföringspipett eller pinpett. Agitera försiktigt vid 4 ° c tills huvudet sjunker till botten av skålen.
- Bädda in huvuden.
- Överför det kryoskyddade huvudet till en form som innehåller optimal skärtemperatur (OCT) förening. Equilibrate prover i oktober i flera minuter. Justera placeringen och riktningen för proverna med pinpeppar.
- Placera mögel på torris att frysa. Förvara resulterande kryomåringar i en plastpåse vid-80 ° c till klar för kryosektionering.
Anmärkning: Den trimmade sidan av proverna måste möta botten av inbäddning mögel.
- Förbered 1 10 cm skålen och flera 3,5 cm rätter som innehåller fosfatbuffrad saltlösning (PBS), och 1 12-well kultur tallrik som innehåller 2 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS i varje brunn för varje gravid mus. Placera alla petriskålar och plattan på isen.
-
Beredning av postnatal undecalcified hård vävnad
- Euthanize på 3 vecka eller 3 månader gammal mus med CO2. Ta bort huden och fettvävnader. Skär och isolera huvudet eller långa ben från musen.
- Fix och cryoprotect huvudet eller långa benet av möss som beskrivs i steg 1.1.3 – 1.1.4.
- Bädda in 8% gelatin på ett liknande sätt som steg 1.1.5. Förvara kryomåringar i en plastpåse vid-80 ° c till kryosektionering.
Anmärkning: Dealcification är inte nödvändigt här. För att förbereda 8% gelatin, blanda 8 g gelatin med 100 mL PBS och koka med hjälp av en mikrovågsugn. Tänk på att blandningen kokar över lätt.
2. kryosnittning
- Ställ in kryostattemperatur till-18 ° c för mjuk vävnad inbäddade i OCT eller-25 ° c och lägre för undecalcified hårda vävnader inbäddade i gelatin. Förvara proverna i kryostatkammaren i ca 30 minuter för att jämna till kryostattemperaturen.
- Utvisa blocket från cryomold. Frys blocket på preparat Chuck (vävnads hållare) via montering med en ULT droppe. Håll den trimmade sidan av provet längst bort från chucken (vänd mot operatören).
- Fyll på den blockmonterade chucken på objekt hållaren kryostat. Justera bladhållaren så att vinkeln på bladet blir 3 ° – 5 ° i förhållande till provet.
- Samla 10 μm-sektioner på belagda Mikroskop glas. Torra sektioner helt vid RT och förvara dem sedan vid-80 ° c.
3. histologisk färgning och mikroskopisk avbildning
- Färgning av immunofluorescensteknik
- Ta ut diabilder från-80 ° c. Håll diabilder på RT för 1 h till lufttorka sektioner. Skölj diabilder i 0,1% PBST (0,1% polyetylenglykoltert-oktylfenyleter i PBS; se tabell över material) tre gånger för 5 min vardera för att tvätta ut Oct och permeabilize sektioner.
- Du kan också utföra antigen hämtning (valfritt).
- Prevärmecitratbuffert (10 mM natriumcitrat pH 6) i infärgning skålen med ångbåt eller vattenbad till 95 – 100 ° c. Sänk ned diabilderna i citratbufferten, inkubera i 10 minuter.
- Ta Färgnings skålen ut från ångbåten eller vattenbadet till RT. kyl bilderna på RT i 20 minuter eller längre15.
Anmärkning: Som alternativ, Använd Tris-EDTA buffert (10 mM Tris bas, 1mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 9,0) eller EDTA buffert (1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 8,0) för värmeinducerade antigen hämtning. Använd en tryckkokare, mikrovågsugn, eller vattenbad för värmeinducerade antigen hämtning, förutom den heta ångbåten. Ett enzym-inducerad antigen hämtning med trypsin eller pepsin är ett annat alternativ. Optimera koncentrationen och behandlingstiden för enzymatisk återhämtning för att undvika skadliga sektioner. Optimera antigen Hämtningsmetoden för varje antikropp/antigen-kombination.
- Inkubera varje bild med 200 μL blockerande lösning (5% Donkey serum utspädd i 0,1% PBST) vid RT i 30 min, ta sedan bort den blockerande lösningen utan sköljning.
- Inkubera varje bild med 100 μL primär antikropp eller antikroppar utspädd i blockerande lösning för 1 h vid RT eller O/N vid 4 ° c. Skölj diabilder med PBS tre gånger för 10 min vardera vid RT.
- Inkubera varje bild med 100 μL sekundär antikropp utspädd i blockerande lösning för 1 h vid RT. Skölj diabilder i PBS tre gånger för 10 min vardera vid RT. skydda diabilder mot ljus.
- Montera diabilder.
- Tillsätt två droppar anti-Fade medium med DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) på bilden. Täck sedan med en täckslip.
- Förvaras vid 4 ° c i mörker tills bilden är klar.
Anmärkning: Som ett alternativ, märk atomkärnor med DAPI eller Hoechst 33324 Dye utspädd 1:2000 i PBS vid RT först, sedan montera med glycerol.
- Terminal deoxinukleotidyl transferas dutp Nick end märkning (Tunel) färgning.
Anmärkning: Dubbelsträngad DNA med 3 '-hydroxyl Termini (3 ' OH DNA Termini) kommer att bildas under apoptos i cellen. Här ger vi ett protokoll som etiketterar den fria 3 ' OH-DNA Termini in situ via märkning DNA fragment med digoxigenin-nukleotid använder Terminal deoxynucleotidyltransferas (TdT) genom specifik färgning med hjälp av en kommersiell Kit (se tabell över material ).- Alternativt, fläcken sektioner med primär och Alexa fluor-488 märkta sekundära antikroppar före TUNEL färgning. Skölj glasen i PBS tre gånger för 10 min vardera.
Anmärkning: Detta steg är frivilligt för en dubbel färgning av ett protein och TUNEL i samma bild. - Inkubera varje bild med 100 μL Proteinase K (10 μg/mL i 10 mM Tris pH 7,5 och 5 mM EDTA) i 5 min vid RT. Skölj diabilder med PBS tre gånger för 10 min vardera vid RT.
Anmärkning: Justera inkubationstiden och temperaturen för proteinas K för varje vävnadstyp. För 10 μm sektioner av embryohuvuden som fixeras i 4% PFA, inkubera i 5 minuter vid RT. Utöver den metod som använder proteinas K, Använd alternativa behandlingar vid behov, inklusive (1) nyberedd 0,1% polyetylenglykol tert-oktylfenyleter, 0,1% natriumcitrat, 10 min vid 37 ° c; (2) 0,25% – 0,5% pepsin i HCl (pH 2) eller 0,25% trypsin, 10 min vid 37 ° c; och (3) mikrovågsbestrålning med 0,1 M citratbuffert (pH 6). - Applicera 200 μL blockerande lösning (5% Donkey serum utspädd i 0,1% PBST) till varje bild, inkubera vid RT i 30 min, Knacka bort den blockerande lösningen utan sköljning.
- Applicera 50 μL av den jämnings buffert som tillhandahålls av satsen på varje bild på RT i minst 10 s. Knacka av bufferten utan att skölja.
- Förbered reaktionsblandningen (arbetsstyrka TdT-enzym) genom att blanda TdT-enzymet med reaktionsbufferten som tillhandahålls av satsen vid förhållandet 3:7. Applicera 50 μL av reaktionsblandningen på varje bild och inkubera vid 37 ° c i 1 h. Knacka bort bufferten utan att skölja.
- Applicera 200 μL av stoppbufferten (1:30 utspädd i ddH2O) som levereras av satsen till varje bild och inkubera vid RT i 10 min. Skölj diabilder med PBS tre gånger för 10 min vardera.
- Etikett med Rhodamine-antikropp.
- Applicera 50 μL av pre-warmed (RT) anti-digoxigenin konjugat (rhodamine) (1:1 utspädd i blockerande lösning) på varje bild. Inkubera vid RT för 30 min i mörker.
- Skölj diabilder med PBS tre gånger för 10 min vardera. Montera diabilder som steg 3.1.6.
- Alternativt, fläcken sektioner med primär och Alexa fluor-488 märkta sekundära antikroppar före TUNEL färgning. Skölj glasen i PBS tre gånger för 10 min vardera.
4. förvärvet av Imaging
- Använd positiva kontroller (vävnader positiva för målantigenet) för att kontrollera signalmärkningarna och de negativa kontrollerna (utelämna den primära antikroppen, isotypkontrollen eller vävnaderna som är negativa för målantigenen) för att utvärdera bakgrunden till bilderna under fluorescerande Mikroskop.
- Ställ in utrustning och kamera förhållanden (exponeringar och andra allmänna inställningar) för avbildning baserat på signalintensiteten hos negativa och positiva kontroller.
Anmärkning: Dessa villkor varierar med (1) kameror och Mikroskop som används för avbildning, (2) antikroppar, och (3) vävnader för varje experiment. Vanliga villkor som används för kraniofacial vävnader är ISO 200 med en exponeringstid som sträcker sig från 1/100 s till 1 s beror på kvalitet och specificitet av antikroppar. Lämpliga förstoringar varierar beroende på storleken på proverna och syftet med experiment. - Hämta bilder med konventionellt epifluorescensmikroskop eller konfokala Mikroskop. Hämta bilder (inklusive motsvarande kontroller) under samma förutsättningar för varje färgkanal. Spara bilder med samma format (TIFF är bäst att bevara information).
5. kvantifiering av fluorescens
Anmärkning: Statistiskt jämföra färgning mellan olika grupper kommer att vara mer informativ i många fall. Med immunofluorescensmätningarna, kvantifiera den relativa nivån av proteinet genom att mäta signal tätheten, räkna positiva celler, eller beräkna positiva områden. För statistisk analys är det minsta antalet biologiskt oberoende prover 3. En typisk metod är att generera minst tre avsnitt från varje prov och ta bilder för minst tre representativa områden i varje avsnitt.
-
Kvantifiering av fluorescensintensitet med ImageJ
- Öppna programvaran och Använd analysera ≫ ställa in mätningar för att kontrollera att endast område och integrerad densitet väljs. Använd fil > Öppna för att öppna bilder som ska analyseras.
- Använd verktygsfält för att välja antingen kvadraten eller cirkel ikonen längst till vänster. Välj det område som ska analyseras på bilden med markeringsverktyget. Använd analysera > mått för att få avläsning av det valda området och integrerad densitet i resultatfönstret. Välj en region bredvid en positiv cell som inte har någon fluorescens för att läsa upp bakgrunden.
- Upprepa steg 5.1.2 för att analysera andra bilder. Justerat det område som ska analyseras för att matcha den första bildens.
- Kopiera alla data i resultatfönstret och klistra in i ett kalkylblad när du är klar med analysen.
- Beräkna den korrigerade fluorescensintensiteten (CTCF) som integrerad densitet — (område i vald cell x Medelfluorescensen av bakgrunds avläsningar). Jämför skillnaden mellan de korrigerade totala cellfluorescensen mellan exemplen och gör ett diagram.
-
Kvantifiering av det positiva cell antalet fluorescerande bilder med ImageJ
- Manuell cell inventering.
- Använd imagej > plugins > analys för att installera cell Counter plugin.
- Använd fil > Öppna för att öppna bilder som ska analyseras. Använd insticksmoduler > analys > cell räknare för att öppna fönstret räknare och resultatfönstret.
Anmärkning: Cell räknaren fungerar inte på travar. För att räkna stackar, plugin Plot z Axis profil, sedan använda bild ≫ stackar > Plot z axel profil för att övervaka intensiteten i en rörlig ROI med hjälp av en partikel spårningsverktyg. Detta verktyg kan vara antingen manuell eller automatisk. - Klicka på en av knapparna längst ned i räknar fönstret för att initiera inventering. Klicka direkt på en cell/ett objekt som ska räknas tills du avslutar.
- Klicka på knappen resultat i fönstret antal . Det totala antalet celler som räknas kommer att visas i resultat fönstret. Spara resultat loggen som kalkylblad och analysera.
- Automatiserad cellräkning.
- Använd fil > Öppna för att öppna bilder som ska analyseras. Konvertera RGB-bilden till en gråskalebild innan du fortsätter.
- Använd bild > Justera > tröskel för att välja alla områden som behöver inventeras.
- Använd analysera ≫ analysera partiklar för att få antalet celler/partiklar. Ställ in ett intervall av den giltiga partikelstorleken (t. ex. 100-Infinity) i stället för standardvärdet 0-oändlighet för att räkna celler/partiklar inom ett visst område. Spara resultat loggen som kalkylblad och analysera.
Obs: för att få annan information från bilden, förutom område, gå till analysera ≫ ställa in mätningar och markera rutan bredvid den information som behövs.
- Manuell cell inventering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Embryonala kraniofaciala vävnad sektioner
Efter ovanstående steg var huvuden dissekeras från kontroll (P0-CRE) eller mutant (konstitutivt aktiveras Bmpr1a i neurala Crest celler, P0-CRE; caBmpr1a) embryon på embryots dag (E) 16,5 eller 18,5. Efter fixering i 4% PFA för 4 h, prover var inbäddade i oktober och kryosektionerade Coralt. Resulterade avsnitt var immunostained med antikroppar mot pSmad1/5/9 (nedströms BMP signalering faktorer) eller Ki67 (en cell spridning markör) utan antigen hämtning enligt protokollet. Som visad, pSmad1/5/9 (figur 1a) och Ki67 (figur 1c) var positiva i frontal benen av kontroll embryon. I muterade embryon höjdes nivåerna av pSmad1/5/9 (figur 1b), medan Ki67 minskade (figur 1d) i frontalbenen. Celldöd i dessa prover kontrollerades också enligt protokollet. Som visad, observerades fler apoptotiska celler i frontalbenen hos muterade embryon än de som användes för att kontrollera embryon (figur 1e, F).
Undecalcified kraniofaciala vävnader eller långa ben sektioner
Efter ovanstående steg för undecalcified hårda vävnader, huvuden från 3 veckor gamla möss (P0-CRE; mTmG (membran-tomat och membran GFP) fastställdes med 4% PFA och inbäddade i 8% gelatin. Koronala kryosektioner tvättades med PBST och monteras med anti-Fade medium med DAPI. Figur 2A , B Visa att gelatin inte stör fluorescerande signaler från sektionerade vävnader.
Huvuden och lårben från 3 veckor gamla eller 3 månader gamla möss var anställda för att kontrollera om gelatin inbäddade undecalcified vävnader är bra för om. Hela huvuden och lårben behandlades och sektionerades enligt protokollet. De resulterade avsnitten användes för SOX9 immunofärgning (figur 3) eller OSX och E11/Podoplanin dubbel immunofärgning (figur 4). Som visad, bra kvalitet avsnitt erhölls från de flesta av de 3 vecka hårda vävnader, inklusive trabekulära och kortikala fack i lårbenet (figur 3a, B, figur 4a-D), de främre benen (figur 4e, F), framtand (figur 3e, f, figur 4i, J), näs vävnader (figur 3c, D) och skallen inklusive näs-Premaxilla suturen och omgivande ben (figur 4G, H ) på huvudet. Även om 3-månaders gamla prover, var bra kvalitet avsnitt endast erhållits i vissa av de hårda vävnader, inklusive trabekulärt fack i lårbenet (figur 3G, H, figur 4K, L), näs vävnader (figur 3i , J), och skallen inklusive nasal-Premaxilla suturen och omgivande ben (figur 4m, N) i huvudet. Som framgår i figur 3, SOX9 positiva celler upptäcktes specifikt i chondrocyter av tillväxtplattan (figur 3b) och den gemensamma (figur 3H) från lårbenet, och nässkiljeväggen (figur 3D, J). I den 3 veckor gamla incisor upptäcktes SOX9 i mesenkymala celler (figur 3F). Resultat från OSX och E11 dubbel färgning visade att OSX upptäcktes i osteoblaster, medan E11 upptäcktes i osteocyter av ben från lårbenet och huvudet (figur 4b, D, H, L, N). I 3 veckors incisor, OSX var positivt i odontoblaster, medan E11 var positivt i follikelstimulerande mesenkymala celler (figur 4J). Dessa resultat indikerar att undecalcified hårda vävnader inbäddade med gelatin väl bevara antigen funktioner.
Figur 1: exempel på om resultaten av pSmad1/5/9, Ki67 eller TUNEL för att kontrollera embryon och muterade embryon med förbättrad BMP-aktivitet. Konstitutivt aktiverad Bmpr1a (caBmpr1a) möss korsades med P0-CRE möss för att öka BMP signalering aktivitet i neurala Crest celler (NCCs). Cheferna för kontroll (P0-CRE; caBmpr1a+/+) och Mutant (P0-CRE; caBmpr1aFX/+) embryon dissekeras vid e 16.5 eller e 18.5, fast med 4% PFA för 4h, cryoprotected med 30% sackaros för 1 dag, inbäddad i ULT, och kryosektioneras vid-18 ° c. Sektioner av pannbenet (liknande nivå med ögat) användes för immunodetection mot pSmad1/5/9, Ki67, eller TUNEL färgning. (A, B) pSmad1/5/9 (grön) infärgnings mönster i de främre benen av kontroll (a) eller muterade (b) embryon vid e 16.5. (C, D) Ki67 (grön) infärgnings mönster i frontala ben av kontroll (C) eller mutant (D) embryon på e 18.5. (E, F) TUNEL (röd) färgning mönster i främre ben av kontroll (e) eller mutant (F) embryon på E 18.5. Kärnor färgas med DAPI (blå). FB = pannben, B = hjärna. Skalstreck = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: exempel på mTmG reporter signal resultat av undecalcified vävnader i huvudet. Huvuden från 3 veckor gamla P0-CRE möss med membran-tomat och membran GFP (mtmg) reporter dissekeras, fast med 4% PFA för 4h, cryoprotected med 30% sackaros för 2 dagar, inbäddade i 8% gelatin, och kryosektionerad vid-25 ° c. Huvudavsnitten visar tydligt GFP (grön, CRE rekombination positiv) och tomat (röd, CRE rekombination negativ) signal i näsans ben och näs vävnader (A, B). Kärnor färgas med DAPI (blå). NB = näsans ben, N = näs vävnader, NS = nässkiljeväggen. Skalstreck = 250 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: exempel på SOX9 immunofärgning resultat av undecalcified vävnader i huvudet och femora. Huvuden och lårben var dissekeras från 3 vecka eller 3 månader gamla möss, fast med 4% PFA för 4h, kryoskyddad med 30% sackaros i 2 dagar, inbäddade i 8% gelatin, och kryosektionerad vid-25 ° c. Diabilder användes för immunodetection mot SOX9 (röd). Kärnor färgas med DAPI (blå) (B, D, F, H, J). Angränsande delar av dessa vävnader användes för hematoxylin & eosin (H & E) färgning (A, C, E, G, I). Pilhuvuden i A och B indikerar tillväxtplattan och i G och H, ledbrosk. Pilar i A och G indikerar trabekulära ben och i C, D, i och J, nässkiljeväggen. DM = Dental Mesenchyme, DE = Dental epitel, FM = follikelstimulerande Mesenchyme. Skalstreck = 50 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: exempel på OSX och E11 dubbel immunofärgning resultat av undecalcified vävnader i huvudet och femora. Huvuden och lårben dissekeras från 3 veckor gamla eller 3 månader gamla möss, fast med 4% PFA för 4h, kryoskyddad med 30% sackaros i 2 dagar, inbäddade i 8% gelatin, och kryosektionerad vid-25 ° c. Avsnitten användes för dubbel immunofärgning med antikroppar mot OSX (röd) och E11/Podoplanin (grön). Kärnor färgas med DAPI (blå) (B, D, F, H, J, L, N). Angränsande delar av dessa vävnader användes för H & E färgning (A, C, E, G, I, K, M). Pilar i A, B, K och L indikerar trabekulära fack i lårbenet; C och D, kortikala fack i lårbenet; och i E och F, de främre benen. Pilspetsar i A och B indikerar tillväxtplattan. BM = benmärg, N = näs vävnader, DM = Dental Mesenchyme, DE = Dental epitel, FM = follikelmesenchyme, NPS = nasal Premaxilla sutur. De främre benen (E, F) och nasal-Premaxilla suturen och omgivande ben (G, H, M, N) visas också. Skalstreck = 50 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här ger vi ett detaljerat protokoll för beredning av mus huvudet och undecalcified ben vävnader, och kryosektionering för immunofärgning av cellproliferation, celldöd, och BMP signal markörer. Vi specificerar också strategin för att erhålla kvantitativa data från Immunofluorescerande bilder. Dessa metoder kan också tillämpas på andra vävnader med lämpliga modifieringar.
Villkoren för vävnads beredning varierar beroende på vävnadernas storlek och typ. Fixeringen och kryoskyddstid behöver vanligtvis flera timmar att övernatta. Efter fixering kan vävnaden också bäddas in i paraffin och sektioneras med en mikrotom16. Även om både paraffin och OCT fungerar bra för immunofärgning, det finns vissa skillnader mellan dem. Paraffin block kan hållas för flera år på RT, medan OCT block är för 1 år vid-80 ° c. Paraffin bevarar vävnadmorfologi, medan isen kristall bildas under OCT inbäddning kan negativt påverka vävnad strukturer. Paraffin masker ibland epitoper av antigener, medan ULT bevarar Enzymaktiviteter och antigen epitoper. Därför finns det inget behov av antigen hämtning för de flesta av antikropparna om de fastställs i 4% PFA för endast 4 h eller mindre och inbäddade i ULT. Det är dock fortfarande möjligt att få bättre resultat genom antigen hämtning, om positiva kontroller inte visade bra färgning resultat i kryosektioner.
Både Hoechst Dye och DAPI kan användas för nukleär motfärgning. De har likheter, eftersom både (1) är UV-upphetsad, mindre Groove-bindande kemikalier för att avge signaler proportionellt till totalt DNA-innehåll, och (2) utsätts för foto-blekning efter en lång exponering. Emellertid, Hoechst färgämnen används vanligtvis för färgning DNA-innehåll i levande celler på grund av deras höga permeabilitet. DAPI används vanligtvis för färgning av DNA i fasta celler på grund av dess låga membran permeabilitet. Dessutom genererar DAPI en starkare och stabilare signal än Hoechst.
Ordentliga kontroller är nödvändiga för IF. Specificiteten hos varje ny antikropp bör bekräftas av Western blot-analys, om tillämpligt. Den optimala arbets koncentrationen för en viss primär antikropp bör bestämmas med hjälp av seriella utspädningar. En positiv kontroll (vävnad eller cell som visat sig uttrycka proteinet/antigen) bör inkluderas för att kontrollera om-processen och specificiteten hos antikroppen. En negativ kontroll bör också inkluderas, t. ex. frånvaro av primär antikropp, eller substitution av normala IgG från samma art för den primära antikroppen, eller vävnader negativa för målantigenet. När man tar bilder, bör provet utan sekundära antikroppar (bakgrundskontroll) undersökas självständigt med varje kanal för att ställa in gränserna för signal förstärkning och offset för att anpassas för den slutliga bilden. För detektering av flera etiketter, bakgrundskontroll och enkelmärkta kontroller måste förberedas för att undvika spektrala överlappning artefakter. Alla kanaler som ska användas för att få en bild av ett fleretikettprov måste genomgå en oberoende bakgrundskorrigering, eftersom autofluorescens nivå i varje kanal varierar avsevärt.
Vi tillhandahåller också protokollet för beredning och kryosektionering av undecalcified hårda vävnader inbäddade i gelatin. För Oct inbäddade urkalkade permanenta hårda vävnader, kommer de flesta av de hårdvävnads sektioner lossas från glid glasögon under immunofärgning förfaranden, på grund av deras låg vidhäftning karaktär på bilden. Den tejp som utformats för att underlätta kryosektionering bidrar till att generera bra kvalitet sektioner. Men, dessa sektioner är lätt skadas när tejpen är skalar av. För gelatin inbäddade vävnader, det finns inget behov av ett band-överföringssystem för att generera bra kvalitet sektioner. Som en inbäddning medium, gelatin kan infiltrera provet väl, även om det har en lägre viskositet jämfört med Oct. gelatin har använts i andra histologiska tillämpningar, såsom hjärnvävnad17,18 och ultratunna sektioner av celler för immunocytokemi19. Här, gelatin användes för att bädda undecalcified ben, som genererar block lättare att kryosektion än OCT. Det finns flera små tips för att få bra avsnitt av gelatin inbäddade undecalcified hårda vävnader. Det kritiska steget är att bädda med gelatin istället för OCT. För att få bättre penetration, hålla prover i 30% sackaros en dag efter prover sjunker till botten. Det är lika viktigt att ställa in temperaturen lägre än vanligt vid ca-25 ° c. En ultra-skarp blad är inte nödvändigt. Även om en lägre Cryo temperatur (-25 ° c) gör vissa förbättringar för kryosektionering av OCT inbäddade undecalcified hårda vävnader, är det fortfarande svårt att få en god integritet vävnad strukturer. Som framgår av figur 2, figur 3, och figur 4, god kvalitet avsnitt som gäller för immunofärgning erhölls från gelatin inbäddade hårda vävnader (t. ex., trabekulära ben, kortikala ben, skallben, näs vävnader, och incisor). Dessa resultat visade att gelatin inbäddning avsevärt förbättrar preparat integriteten av hård vävnad sektioner, men också förbättrar vidhäftning av sektionerna för att glida glasögon. Dessutom, gelatin bevarar antigen funktioner, och uppvisar kompatibilitet med fluorescerande signaler och immunofärgning. Men denna teknik fungerar bara bra för upp till 3 månader gamla prover. Potentiella förbättringar av denna metod är (1) att dissekera proverna ytterligare för att separera målvävnaden från andra delar för att göra strukturen av vävnaden enkel (i fråga om tänder, underkäken eller maxilla bör dissekeras och fast i stället för hela huvudet) och (2) att använda 10% EDTA att avkalka vävnader för endast 2 – 3 dagar före kryoprotection. Denna korta tid av urkalkning kommer inte att äventyra immun färgning resultat. Ett annat bekymmer är att gelatin, som icke-vattenhaltiga inbäddnings medier, inte lätt kan avlägsnas från diabilder, vilket kan leda till högre bakgrund beroende på infärgnings metoder (t. ex. H & E färgning).
Immunofärgning resultat är inte lätt att kvantifiera, så de används vanligtvis semi-kvantitativt. Svårigheter och begränsningar av kvantifiering av immunofärgning av kraniofaciala vävnader inkluderar men är inte begränsade till följande: (1) det är svårt att definiera den areal som skall räknas på grund av komplexiteten i strukturen hos kraniofaciala vävnader; (2) det är svårt att definiera det märkta området eller märkta celler på grund av den icke-linjära karaktären av immunofärgning; (3) det finns begränsad information om signalens dynamiska omfång. (4) det är svårt att jämföra intensiteten av signaler mellan bilder eller grupper på grund av blekning av fluorescerande signal under bild förvärv; och (5) signal bakgrunden kan förändras markant bland antikroppar, diabilder och prover. För att öka tillförlitligheten i kvantifieringsresultaten bör experimentet noggrant och strikt utföras. Alla prover bör bearbetas på samma villkor. Under immunofärgning krävs olika kontroller för att utvärdera signal bakgrunden och definiera det positiva området eller cellerna för signalen. Ta övertygande och representativa bilder för att tydligt visa det område som ska räknas och märkas celler med bra kontrast. Dessutom måste inställningen kamera inställning och utrustning hållas konsekvent under bild anskaffningen.
Sammantaget presenterar vi ett enkelt standardprotokoll för immunofluorescens på mus kraniofacial vävnader, särskilt för undecalcified hård vävnad. Immunofärgning analys av kraniofacial vävnader kommer inte bara att hjälpa till att förstå mekanismen för morfogenes under utveckling, men också illustrera förändringarna under patogenes. Dessutom kan immunofärgning också användas för att studera uttrycket mönstret av andra signalering väg ligander, receptorer, eller andra fenotypiska markörer, förutom cellproliferation, celldöd, och BMP signalering väg. De kritiska stegen i ett immunofärgnings experiment måste dock ändras på lämpligt sätt för varje antigen/antikropp eller vävnad för att få specifik färgning och minimerade icke-specifika bakgrunds signaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (R01DE020843 till Y.M.), International FOP Association (Y.M.), och en bidrag-in-Aid från National Natural Science Foundation i Kina (31500788 till J.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive tape | Leica | #39475214 | |
| Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11034 | |
| Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| Coverslips | Fisher Brand | 12-545-E | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit | Millipore | S7165 | |
| Microscope slides | Fisher Brand | 12-550-15 | |
| OCT Compound | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Sigma | T9284 | Triton X-100 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2542 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Cell Signaling Technology | 9129 | Lot#:3; RRID:AB_2687446 |
| Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody | Cell Signaling Technology | 13820 | Lot#:3; RRID:AB_2493181 |
| Sodium citrate | Sigma | 1613859 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tris | Sigma | 10708976001 |
References
- Trinh, L. eA., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
- Marcucio, R., et al. Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face. Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).
- Graf, D., et al. Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development. Cytokine & Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).
- Snider, T. N., Mishina, Y. Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).
- Mishina, Y., Snider, T. N. Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology. Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
- Xiao, C., Dan-Bi, C.
- Zongli, Q., et al. Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
- Dun, X. P., Parkinson, D. B. Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration. Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).
- Akkiraju, H., et al. An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).
- González-Chávez, S. A., et al. Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).
- Kapelsohn, K. Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology. Protocol Exchange. , (2015).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. (85), e50803 (2014).
- Shi, S. R., et al. Antigen retrieval techniques: current perspectives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).
- Adell, T., et al. Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections. Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).
- Griffioen, H. A., et al. Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry. Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).
- Sarkar, S., et al. In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals. Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).
- Oorschot, V., et al. A novel flat‐embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).
