Summary
Denne protokollen kan visualisering av byggkorn under embryonale Astyanax cavefish. Denne tilnærmingen har blitt utviklet med mål om å maksimere gene expression signal, samtidig som ikke-spesifikke bakgrunnen flekker.
Abstract
De siste årene, er et utkast genom for det blind meksikanske cavefish (Astyanax mexicanus) blitt befridd, avslørende sekvens identiteter for tusenvis av gener. Tidligere forskning i denne nye modellsystem kapitalisert på omfattende genomet hele undersøkelser som har identifisert flere kvantitative egenskap loci (QTL) forbundet med ulike hule-assosiert fenotyper. Muligheten til å koble gener rundt til arvelig grunnlaget for fenotypiske endringen imidlertid en betydelig utfordring. En teknikk som kan gjøre dypere forståelse av rollen i utviklingen i troglomorphic evolution er hele-mount i situ hybridisering. Denne teknikken kan implementeres direkte sammenligne genuttrykk mellom hule - og overflaten-bolig former, nominere kandidat gener underliggende etablerte QTL, identifisere tilblivelse interesse fra neste generasjons sekvensering studier eller utvikle andre Discovery-baserte tilnærminger. I denne rapporten presenterer vi en enkel protokoll, støttet av en fleksibel Sjekkliste, som kan være mye tilpasset for bruk godt utover presentert studie systemet. Håpet er at denne protokollen kan tjene som en bred ressurs for Astyanax samfunnet og utover.
Introduction
In situ hybridisering er en vanlig måte flekker fast vev for å visualisere gene expression mønstre1. Denne teknikken er utført i år i andre tradisjonelle2 og utradisjonelle3 modellsystemer, for en rekke biologiske studier. Flere trinn og reagenser er imidlertid nødvendig for å utføre denne prosedyren. For etterforskere som aldri har utført denne teknikken, kan starte prosessen være skremmende på grunn av mange trinnene involvert. Videre gir lange natur denne prosedyren seg til tekniske feil, som kan være utfordrende for å feilsøke.
Det overordnede målet med denne artikkelen er å presentere en enkel og grei metode som gjør denne hybridisering teknikken tilgjengelig for et bredt publikum. For å redusere innføring av feil, presenterer vi en enkel tilnærming som gir høy kvalitet gene expression flekker og minimerer uspesifisert bakgrunn signal. Denne fremgangsmåten ligner andre tilnærminger utviklet i tradisjonelle modellsystemer, for eksempel Danio rerio4. Her, forsøker vi å rette forsiktig gjennomføring av hvert trinn bruker en nedlastbar Sjekkliste (ekstra fil 1), å fremme forsiktig gjennomføring av protokollen. Begrunnelsen for dette er å lette organisasjon gjennom mange trinnene involvert i denne prosedyren. Denne artikkelen er hensiktsmessig for forskere interessert i å utføre hele-mount i situ hybridisering utvikle embryo, men ennå ikke har utført fremgangsmåten. Fordelen av valgte tilnærming for Astyanax forskere er at det har blitt testet og utprøvd i både cavefish og overflate fisk morphs, dermed tilrettelegge sammenlignende uttrykk analyser. Presentert metoden kan brukes av forskere i studier på Astyanax og andre systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av University of Cincinnati (Protocol #10-01-21-01).
1. fiksering
- Finne ønsket antall Astyanax mexicanus embryoer fra en formering tank og løse ~ 50 embryo samtidig. Hvis embryoer er store og gamle, kan det være nødvendig å fikse 25 for å sikre selv fiksering.
- Avhengig av alderen på fosteret, bruker du metoden IACUC godkjent av anestesi. For eldre embryoer med en fungerende nervesystemet, ofre embryo via bedøvende overdose. Følgelig sett embryo i en løsning av ~ 1% tricaine (bufret til pH 7.4) for å redusere smerte og ubehag for organismen.
- Når embryoene er reagerer å berøre, erstatte system vann som inneholder tricaine, og Legg ~ 1 mL 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS, pH 7.4).
- Fjern PBS løsningen, og tilsett 1 mL av 4% paraformaldehyde (PFA). Fikse embryo overnatter i 4 ° C.
FORSIKTIG: PFA er farlig (dvs. det er brannfarlig og er en hud og lunge irriterende), håndteres med forsiktighet.
2. dehydrering
- Tørke av embryo, fjerne etappe, den stabiliserende løsningen og skyll med 1 mL av PBS. Plass embryoet inneholder ampuller på en vinkel (mellom 30° og 45°), på en plattform shaker under skylling. Fortsette å vaske embryo to ganger, 5 minutter per vask.
- Hvis embryoer har en plasmocitara, plassere alle 50 embryo i en 100 mm x 25 mm Petriskål og forsiktig isolere dem fra chorions med to sett med Urmakers tang (f.eks #5 tang) under et mikroskop.
Merk: I trinnene som er beskrevet nedenfor, og resten av protokollen, fjerne nøye all væsken fra det tidligere trinnet bruker ren, glass Pasteur Pipetter før du legger til neste løsning - Tørke embryo i en serie stadig mer konsentrert vasker av metanol (MeOH) beskrevet nedenfor. Fortynninger er basert på en 1 mL totale volumet med 500 µL løsning går inn hver 4 mL hetteglass. Utføre alle dehydrering trinnene ved romtemperatur (RT) på plattformen shaker.
- Fjern forsiktig PBS løsningen. Legge til en 25% MeOH løsning (250 µL av MeOH) + 750 µL av PBS. Forsiktig risting på en plattform shaker i 5 min.
- Fjern forsiktig 25% MeOH løsningen. Legge til en 50% MeOH løsning (500 µL av MeOH) + 500 µL av PBS. Forsiktig risting på en plattform shaker i 5 min.
- Fjern forsiktig 50% MeOH løsningen. Legge til en 75% MeOH løsning (750 µL av MeOH) + 250 µL av PBS. Forsiktig risting på en plattform shaker i 5 minutter.
- Fjern forsiktig 75% MeOH løsningen. Legge til en 100% MeOH løsning (1 mL av MeOH). Forsiktig risting på en plattform shaker i 5 min. Gjenta dette trinnet 3 ganger.
- På dette punktet, lagre dehydrert embryoer, etter behov, i deres hetteglass på 20 ° C (lang sikt). Alternativt, gå direkte til dag 1 av protokollen.
3. dag 1: rehydrering
- Få dehydrert embryoer fra 20 ° C fryser (eller fortsette direkte fra trinn 2.5).
- Sortere embryoene bruker en Pasteur pipette. En kan sortere basert på morphotype (dvs. hulen og/eller overflate), og antall gener vurdert i hvert eksperiment. Det er vanligvis ikke mer enn 12 embryo per medisinglass når sortert. For å opprettholde organisasjon, bruke farget lab tape for å angi ampuller og Pipetter for hver genet. Embryo vil bo i samme ampullen gjennom hele protokollen.
Merk: Sted spissen av Pasteur Pipetter 100% EtOH å sterilisere mellom bruker. - Angi en risting vannbad til 70 ° C i et senere trinn. Nøye, trekke ut MeOH i ampuller av sorterte embryoer og erstatte med 500 µL av nye 100% MeOH. Vask kort (~ 1 min) på plattformen shaker.
- Rehydrate embryo i en økende konsentrasjonen av 1 x PBS med mellom 20 (PBT, se nedenfor) på plattformen shaker. Fortynninger er basert på et 1 mL siste fortynning volum med 500 µL går inn i hvert hetteglass.
- Legge til en 25% PBT løsning (250 µL av PBT, 750 µL av MeOH). Forsiktig risting på en plattform shaker i 5 min.
- Fjern forsiktig 25% PBT løsningen. Legge til en 50% PBT løsning (500 µL av PBT, 500 µL av MeOH). Forsiktig risting på en plattform shaker i 5 min.
- Fjern forsiktig 50% PBT løsningen. Legge til en 75% PBT løsning (750 µL av PBT, 250 µL av MeOH). Forsiktig risting på en plattform shaker i 5 min.
- Fjern forsiktig 75% PBT løsningen. Legge til en 100% PBT løsning (1 mL av PBT). Forsiktig risting på en plattform shaker i 5 min. Gjenta dette trinnet 3 ganger.
4. dag 1: Fordøyelse og fiksering
- Klargjør en proteinasen K (PK) løsning ved å legge til 1 µL av PK (20 mg/mL) 2 mL PBT.
- I påvente av fremgangsmåten, få frosne dele hybridisering buffere (Hyb- og Hyb +; se ekstra fil 2 og ekstra filen 3) og PFA fra 20 ° C lagring.
- Tillate PFA å tine på RT.
- Sett dele Hyb- og Hyb + i en roterende 70 ° C-vannbad. Plass alle reagenser og ampuller inne en liten "pakning" med mesh bunn, inne flytende vann bad apparatet. Dette kan enkelt tillegg og fjerning av rør og flasker fra roterende 70 ° C vannbad.
- Forsiktig legge PK løsning vial(s) av embryo sikre alle vev er helt dekket med løsningen. Fordøye embryo for ~ 12 min i PK fungerende løsning på plattformen shaker.
Merk: Lengden på fordøyelsen kan endres av utprøver å sikre optimale resultater. - Forsiktig trekke av PK løsningen og kort flom ampullen med PBT å fortynne eventuelle gjenværende PK.
- Trekke av PBT løsningen og erstatte med 500 µL av nye PBT. Tillate løsningen å skylle på plattformen shaker i 5 min.
- Trekke av PBT og erstatte med 500 µL av tinte 4% PFA. Tillat embryoene å ruge etter 20 min på plattformen shaker på RT.
- Trekke av 4% PFA, og kort flom ampullen med PBT å fortynne eventuelle gjenværende PFA. Trekke av PBT, og Erstatt med 500 µL av fersk PBT. Tillate embryo skylle i 5 min på plattformen shaker. Gjenta dette trinnet 4 ganger.
5. dag 1: Prehybridization
- Sted 500 µL av forvarmes Hyb-løsning i ampullen. Forsiktig plassere ampullen til 70 ° C vann bad (innenfor pakninger) uten riste, i 5 min.
- Trekke av Hyb-løsningen og flom ampullen med 500 µL forvarmes Hyb + løsning. Plass ampullen tilbake til 70 ° C vannbad med skjelvende (40 rpm). Inkuber enten 4 h eller over natten.
Merk: En 4 h inkubasjon vil gi en komplett i situ protokoll som vil vare i 4 dager totalt. Dette trinnet vises her som en overnatting inkubering, som vil gi en protokoll varer 5 dager totalt.
6. dag 2: hybridisering
- Plass en aliquot av Hyb + fra 20 ° C fryseren i risting varmt vannbad i 5 min.
- Trekke av Hyb + fra ampullen og erstatte med 500 µL av forvarmes Hyb +. Denne løsningen, nøye legge 2 µL av RNA probe til hvert hetteglass. Forsiktig swirl ampullen for å sikre jevn fordeling av sonden.
- Inkuber Hyb + (med ekstra sonde) løsningen i 70 ° C varmt vannbad natten mens riste på 40 rpm.
Merk: En kanne re-bruk Hyb + (med sonde) løsning. For dette, ta Hyb + med sonde fra første løpe fra 20 ° C fryser og sted i et varmt vannbad for 5 min. Erstatt Hyb + fra dag 1 protokoll med Hyb + med sonde og tillate rugende overnatting i varmt vannbad.
7. dag 3: Løsning forberedelse
- Forberede microcentrifuge rør merket Hyb + med "genet av interesse" RNA sonden. Forberede en rekke fortynninger som skal brukes under dag 3.
- Bruker 6 separate rør, forberede det fulgte serien av fortynninger av Hyb- og saltvann natriumsitrat (SSC, 0-100%) i en 1 mL volum og sted i 70 ° C risting vann bad: Tube 1 = 100% Hyb-(1 mL av Hyb-): rør 2 = 25% 2 x SSC (250 µL av 2 x SSC, 750 µL av Hyb-); Rør 3 = 50% 2 x SSC (500 µL av 2 x SSC, 500 µL av Hyb-); Rør 4 = 75% 2 x SSC (750 µL av 2 x SSC, 250 µL av Hyb-); Rør 5 = 100% 2 x SSC (1 mL av 2 x SSC); Rør 6 = 100% 0,2 x SSC (2 mL 0,2 x SSC).
Merk: Være årvåken for konsentrasjonen av SSC, som endres fra 2 x til 0,2 x. - Bruker 4 separate rør, forberede det fulgte serien av fortynninger av PBT og SSC i et 1 mL volum og plassere på RT: Tube 1 = 25% PBT (250 µL av PBT, 750 µL av 0,2 x SSC); Rør 2 = 50% PBT (500 µL av PBT, 500 µL av 0,2 x SSC); Rør 3 = 75% PBT (750 µL av PBT, 250 µL av 0,2 x SSC); Rør 4 = 100% PBT (1mL av PBT).
- Forberede en tube med 2 mL maleic syre buffer inneholder mellom 20 (MABT) fungerende løsning.
- Forberede to 15 mL konisk rør for å blokkere løsning. I hver retning, legge 0.2 g blokkerer reagens til 10 mL av MABT (se ekstra fil 4). Plass begge rør på en nutating blandebatteri (eller plattform shaker) til fullstendig oppløst i løsning (opptil 3 h).
- Bruker 6 separate rør, forberede det fulgte serien av fortynninger av Hyb- og saltvann natriumsitrat (SSC, 0-100%) i en 1 mL volum og sted i 70 ° C risting vann bad: Tube 1 = 100% Hyb-(1 mL av Hyb-): rør 2 = 25% 2 x SSC (250 µL av 2 x SSC, 750 µL av Hyb-); Rør 3 = 50% 2 x SSC (500 µL av 2 x SSC, 500 µL av Hyb-); Rør 4 = 75% 2 x SSC (750 µL av 2 x SSC, 250 µL av Hyb-); Rør 5 = 100% 2 x SSC (1 mL av 2 x SSC); Rør 6 = 100% 0,2 x SSC (2 mL 0,2 x SSC).
8. dag 3: Sonde fjerning
- Trekke av Hyb + (med sonde) løsning med et glass Pasteur pipette, og plasser den i et sterilt, merket microcentrifuge tube. Behold dette røret i 20 ° C fryseren for fremtidig bruk (hvis probe-merking er vellykket).
- Forsiktig legge 500 µL av de varme SSC/Hyb-fortynninger (angitt nedenfor). Inkuber i hver av følgende løsninger for 10 min hver med 70 ° C risting vannbad.
- Inkuber sekvensielt med 100% Hyb-(1 mL av Hyb-), 25% 2 x SSC (250 µL av 2 x SSC, 750 µL av Hyb-), 50% 2 x SSC (500 µL av 2 x SSC, 500 µL av Hyb-), 75% 2 x SSC (750 µL av 2 x SSC, 250 µL av Hyb-), 100% 2 x SSC (1 mL av 2 x SSC) , 100% 0,2 x SSC (2 mL 0,2 x SSC).
- Etter det siste trinnet ruge i hver av følgende løsninger for 10 min. Alle de følgende incubations finne sted på RT plattform shaker: 25% PBT (250 µL av PBT, 750 µL av 0,2 x SSC), 50% PBT (500 µL av PBT, 500 µL av 0,2 x SSC), 75% PBT (750 µL av PBT, 250 µL av 0,2 x SSC) , 100% PBT (1 mL av PBT).
- Etter en 10 min incubation, fjerne 100% PBT, og legge til 500 µL av MABT i hvert hetteglass. Gjenta dette trinnet to ganger i 5 minutter.
9. dag 3: blokkere
- Fjern MABT fra hvert hetteglass og flom med ferdigblandet blokkerer løsning fra en av rør (forberedt i trinn 7.1.4). Plasser ampuller på en nutating mikser for ~ 4 h på RT.
- Legge til 2 µL av DIG-AP Fab fragmenter til andre ampullen 10 ml blokkering løsning (forberedt i trinn 7.1.4) og kort vortex.
- Fylle hvert hetteglass nesten helt med blokkering løsning (~ 5 mL) og plassere på nutating blandebatteri overnatter i kjøleskap på 4 ° C.
10. dag 4: MABT skyller
- Klargjør lager ampuller med 10% normal geit serum (NGS) i MABT (legge 100 µL av NGS til 900 µL av MABT).
- Trekke av blokkering løsningen i hvert hetteglass og Legg 500 µL av NGS/MABT blandingen i hvert hetteglass. Kan embryoene å ruge for 25 min på RT på plattformen shaker.
- Erstatte NGS/MABT blandingen med 500 µL av 100% MABT. Inkuber i 30 min på RT på plattformen shaker. Utføre dette skylling 11 ganger hele dagen hver 30 min.
- Fylle ampullen med 100% MABT og sted på en nutating mikser overnatter i et kjøleskap eller walk-in kammer på 4 ° C.
11. dag 5: Sonde visualisering
- Forberede en 50 mL aliquot alkalisk fosfatase (AP)-bufferen (se ekstra fil 5). Kombinere følgende i en 50 mL konisk tube innpakket i aluminiumsfolie begrense lyseksponering: 5 mL 1 M Tris (pH 9,5), 5 mL av 50 mM MgCl2, 5 mL 1% mellom 20, 5 mL 1 M NaCl, 30 mL av ddH2O.
- Fjern MABT og erstatte med 1 mL av AP buffer (tube innpakket i folie). La det vasker for 5 min. Gjøre to ganger for å sikre fullstendig fjerning av MABT.
- Fjerne AP buffer og erstatte med 1 mL av AP buffer med 3,5 μL 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate (BCIP) og 4.5 μL nitro-blå tetrazolium (NBT). Erstatt med nylagede AP buffer/NBT/BCIP når hver time til reaksjon er fullført. Overvåk nøye sjekke hvert 15 min, å tillate coloration reaksjonen skjer til ønsket nivå med flekker er oppnådd. Hvis bunnfall begynner skjema, erstatte løsningen før.
- Stopp coloration reaksjonen av skylling embryoene frisk 100% AP buffer (uten NBT/BCIP) for 5 min. Fortsett skyller i PBT til optimale nivåer av signal (med minimale mengder bakgrunn flekker) er oppnådd. Fortsette å skylle prøver med økende fortynninger av PBT AP buffer som følger: 25% PBT (250 μL PBT, 750 μL AP Buffer), skyll i 5 min; 50% PBT (500 μL PBT, 500 μL AP Buffer), skyll i 5 min; 75% PBT (750 μL PBT, 250 μL AP buffer), skyll i 5 min.
- Skyll embryo i ~ 5 mL av 100% PBT på nutating mikser inntil ønsket minimum bakgrunn flekker er nådd. Bytte ut med fersk PBT flere ganger. Dette kan ta til flere dager.
- Når skylling er komplett, vask embryo i 500 μL sterilt PBS på en plattform shaker. Utføre dette skylling to ganger i 5 minutter. Etter PBS vasker, etter fikse de i 500 μL 4% PFA 1t på RT på en plattform shaker. Eventuelt løse over natten i 1 mL av 4% PFA i kjøleskapet i 4 ° C.
- Erstatte bindemiddel med frisk og sterile PBS. Utføre dette skylling minst to ganger i 5 min. sted embryoene i ~ 4 mL 100% sterilt PBS og lagre langsiktig på 4 ° C.
12. imaging
- Utgjør en tenkelig plate i en Petriskål 3% agarose og TAE buffer.
Merk: Antall avhenger av hvor mange plater er nødvendig. Platene kan brukes på nytt flere ganger. Det anbefales at en grunne rektangulære mold er plassert i Petriskål mens gel er kjøling for å skape en depresjon for inneholder embryoene på tallerkenen. - Plass embryoene på platen i PBS.
Merk: Det er best å forsiktig helle embryoer på stedet for pipettering dem ut fordi det har blitt funnet at de vil holde seg til innsiden av plast pipetter. - Bruke * lys for å visualisere hver fosteret. Bruk en stump sonde for å manøvrere embryo til ønsket posisjon.
- Ta et bilde når embryoet er i ønsket posisjon. Merk at det er viktig å ta bilder av embryo innen et par uker etter fullført flekker for å unngå potensielle nedbrytning av flekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne rapporten gir vi en enkel og grei tilnærming for å utføre merking av embryonale Astyanax for høy kvalitet gene expression analyse. Denne teknikken kan utføres enten fire eller fem dager, og hvert viktigste trinn i prosedyren er representert i et fargekodet flytskjema (figur 1). En gang fullført, bør farget embryo havn en mørk lilla kromatisk etikett i vev uttrykke det bestemte genet av interesse. Vi har implementert denne protokollen både Pachón cavefish (figur 2A-B, E) og overflate fisk (figur 2C-D, F) embryoer.
Cavefish embryo var farget for to transkripsjonsfaktorer som etiketten tidlig neural crest vev, Sox9 og Tfap2a5,6. Embryo merket Sox9 uttrykk viser tydelig merking i utviklingsland branchial buer og pectoral fin (gul pilspisser, figur 2A). Merk at flekker er nesten fraværende i plommesekken eller de utvikle somites på flanke (figur 2A). Tilsvarende er Tfap2a uttrykk tydelig i delene av utvikle hodet, i tillegg til tidlig migrasjon neural crest celler (figur 2B, pilspiss) langs dorsal flanke regionen fosteret. Tredje representant genet presentert for cavefish embryoer er Phf20a, en markør av osteoblast differensiering7. Merk den positive flekker i deler av somitic mesoderm og bakre leder som er bestemt til å gi opphav til bein vev (figur 2E, pilspisser).
I overflate fisk embryoer analysert vi for genene CXCR, Adcyap1aog Sox10. CXCR koder en G-protein membran-bundet reseptor som binder CXC chemokines8. Positiv merking finnes i isolerte områder i hodet og flanke (figur 2F, pilspisser), samt noen enkeltceller overliggende plommesekken. Den gene adenylate cyclase-aktivere polypeptid, Adcyap1a, uttrykkes i områder av det sentrale nervesystemet, inkludert hypofysen celler. Merk svært spesifikke uttrykk i sammenkoblede, bilaterale klynger av celler på dorsal aspekt av embryoet; i tillegg til et større område av midtlinjen uttrykk (figur 2C, pilspisser). Til slutt presenterer vi uttrykk for Sox10, en transkripsjon faktor som etiketter tidlig neural crest og oligodendrocyte celler10. Svært spesifikke positiv flekker er tydelig som en tidlig markør for neural toppen til venstre og høyre side av dorsal embryoet (figur 2D, pilspisser).
Vi presenterer hvert av de to typene forvirrende problemer støte på andre etterforskere. Det første problemet en jevnlig møter er vises punctate prikker av ikke-spesifikk merking. Disse flekker kan oppstå som utløse de endelige MABT rinses eller AP bufferen under farge reaksjonene. Et eksempel på dette ikke-spesifikk merking er tydelig på plommesekken på en overflate fisk fosteret farget for uttrykk for Pnp4a. Dette genet koder for et enzym (purine nukleosid phosphorylase) som forenkler produksjonen av iriserende pigmentering11. Dette genet er først tydelig i utviklingsland øyet og svømmeblæren. De vises punctate prikker observert i noen overflate eksemplarer (figur 3A), ble eliminert av hyppig vask og utskifting av AP Buffer + NBT/BCIP i sluttfasen av protokollen (figur 3B). En andre problemet som en periodisk møter er diffus, i stor grad ikke-spesifikke uttrykket av gener som ellers ville produsere et tydelig uttrykksmønster. Et eksempel er genet BMP4, som vises som et stort sett diffus mønster med lave nivåer av chromogen stede hele prøven (Figur 3 c). I slike tilfeller vi vanligvis identifisere et annet område av genet, forsterke i en vektor og utføre en ny sonde syntese (se ekstra fil 6). Eksemplet av en kontroll (ingen sonde) (figur 3D) tilbys for å illustrere diffuse og uspesifikk natur våre mislykkede BMP4 sonde.
Figur 1: et enkelt flytskjema for hele-mount i situ hybridisering. Dette flytdiagrammet benytter fargekoding for å illustrere de viktigste trinnene i i situ hybridisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representant flekker for seks gener, bruker både hulen og overflate morphs av Astyanax. (A) bildet viser den bestemte flekker (gule piler) av Sox9 på den høyre laterale siden av en 72 h etter befruktning (hpf) Pachón cavefish (45 x). (B) spesifikk farging for Tfap2a er tydelig på den høyre laterale siden av en 36 hpf Pachón cavefish (45 x). (C) Bilateral og midtlinjen flekker (gul pilspisser) av Adcyap1a merket i regionen dorsal til 72 hpf overflate fisk (100 x). (D) Beising av Sox10 i neural crest vev til 24 hpf overflate fisk (100 x). (E) Phf20a viser en svak, men klart mønster av uttrykk i regionen dorsal for en 24 hpf Pachón cavefish (100 x). (F) cytokin reseptoren, CXCR, uttrykkes i forskjellige regioner i den høyre laterale siden av en 24 hpf overflate fisk (100 x). Skala barer i A, B, E, F = 0,5 mm; skalere barer i C, D = 2,5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representative eksempler på sub-optimale resultater for hele-mount i situ hybridisering. (A) spesifikk farging er tydelig sammen med uspesifisert utløse og/eller rusk (rød pilspiss) på høyre lateral aspekt av en 72 hpf Pachón cavefish (100 x). (B) samme sonden visualisert i A, som viser den samme flekker mønstre uten utløse eller bakgrunn i en 72 hpf Pachón cavefish (100 x). (C) en lateral flanken av en 72 hpf Pachón cavefish viser diffus, ikke-spesifikk farging for BMP4 på 45 x forstørrelse. (D) en 72 hpf Pachón cavefish utsatt for denne protokollen, uten tilsetning av sonden (45 x). Skalere barer = 0,5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grunn av sikkerhetsproblemet av til fornedrelse gjelder en av de viktigste trinnene i protokollen sterilt syntesen av RNA sonden. Men hvis en sonde genereres nøye, og gir gode resultater, kan det bli gjenbrukt i påfølgende flekker reaksjoner. Andre avgjørende trinnet er forsiktig produksjon av reagenser brukes i protokollen. Siden denne protokollen innebærer flere dager og mange små skritt, er det viktig at alle reagenser er nøyaktig produsert og lagret i et sterilt måte. Videre, det er fundamentalt viktig at etterforskeren holder nøye oversikt over hvert trinn i protokollen. Vi har funnet at den angitte sjekklisten med trinn kan være svært nyttig å sikre nøyaktig og presis ferdigstillelse av hvert aspekt av denne protokollen.
Vi må ikke ofte endre protokollen vi presentert her. Men etterforskerne kan utføre sonde incubations ved forskjellige temperaturer enn de foreslo (dvs. 70 ° C). Små endringer i hybridisering temperaturer vil påvirke binding av RNA sonder, og derfor søker optimal hybridisering temperaturen kan positivt påvirke kvaliteten på flekker. Med hensyn til feilsøking, oppfordrer vi andre etterforskere å utnytte kontrollisten følger med denne artikkelen (ekstra fil 1). Opprettholde forsiktig records er et nødvendig første skritt i å sikre høy kvalitet flekker. En andre mindre endringer er foreslått å utføre den endelige coloration reaksjonen uten rock (f.eks uten å plassere på en plattform shaker eller nutator). Grunnen til dette er at regelmessig vi merke produksjon av bunnfall, som antagelig oppstår fra AP buffer løsning. Dette utløse vanligvis overstains til en mørk farge og skaper vises punctate (ikke-spesifikk) bakgrunn på farget vev. For å redusere produksjonen av denne bunnfall, forbereder Vi sterilisert AP buffer like før hver reaksjon. Videre, når NBT og BCIP er lagt til bufferen, vi erstatte den med ferske buffer og NBT/BCIP hver time til farge reaksjonen er fullført.
En begrensning til presentert metoden er at en kromatisk flekk ble brukt for gene expression visualisering. Vi foretrekker denne siden det er kostnadseffektivt, og krever bare * lys å visualisere. Hvis en var interessert i å evaluere kvantitative forskjeller, bør de bruke en fluorescerende farge reaksjon. Dette vil aktivere semi kvantifisering, for eksempel gjennom sammenligning av relative fluorescerende enheter uttrykk mellom eksperimenter.
Protokoller for i situ hybridisering finnes mye på web12,13og vitenskapelige publikasjoner. Protokollen som presenterer vi ble utviklet spesielt for systemet vårt modell, Astyanax mexicanus. Vi har brukt denne protokollen å flekken uttrykk for dusinvis av gener, og føler det gir konsekvent resultater av høy kvalitet. En betydelig fordel av denne protokollen er trinnvis sjekkliste for elementer å aktivere etterforskeren å utføre flere oppgaver samtidig sikre nøyaktige fullføringen av hvert trinn i denne protokollen. Vi håper at denne protokollen vil tjene som en nyttig ressurs til andre etterforskere i feltet og utover, og forventer at denne felles laboratorium teknikken vil støtte fremtidige søk koble genotype til fenotypen i den blinde meksikanske cavefish.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke medlemmer av brutto lab for nyttige kommentarer på dette manuskriptet. Vi ønsker å erkjenne fire high school-elever som utnyttet denne protokollen under Sommer praksisplasser i 2017 og 2018, inkludert Christine Cao, Michael Warden, Aki Li og David Nwankwo. HL ble støttet av en UC biologi STEM Fellowship sommeren 2017. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Science Foundation (DEB-1457630 til JBG), og den nasjonale institutter for Dental og Craniofacial forskning (NIH; DE025033 til JBG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
| Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
| Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
References
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization: Application to neurobiology. , Oxford University Press. Oxford. (1987).
- Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).
- Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression. Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Cheung, M., Briscoe, J. Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9. Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).
- Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development. Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).
- Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3. Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).
- Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways. Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).
- Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3). Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).
- Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).
- Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).
- Monsoro-Burq, A. H. A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).
- Schulz, C. In situ hybridization to Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).
