Summary
Denne protokol giver mulighed for visualisering af genekspression i embryonale Astyanax cavefish. Denne fremgangsmåde er blevet udviklet med formålet at maksimere gen expression signal, samtidig minimere uspecifikke baggrund farvning.
Abstract
I de seneste år, er et udkast til genom for den blinde mexicanske cavefish (Astyanax mexicanus) blevet frigivet, afslørende sekvens identiteter for tusindvis af gener. Tidligere forskning i denne nye modelsystem kapitaliseres på omfattende genome-wide undersøgelser, der har identificeret talrige kvantitative træk loci (QTL) forbundet med forskellige cave-associerede fænotyper. Evnen til at forbinde gener af interesse til den arvelige basis for fænotypisk ændring er dog en betydelig udfordring. En teknik, der kan lette dybere forståelse af rollen, som udviklingen i troglomorphic evolution er hele-mount in situ hybridisering. Denne teknik kan gennemføres for at direkte sammenligne genekspression mellem hule og flade bolig former, nominere kandidat gener underliggende etablerede QTL, identificere gener af interesse fra næste generation sequencing undersøgelser eller udvikle andre Discovery-baserede tilgange. I denne betænkning præsenterer vi en enkel protokol, understøttes af en fleksibel tjekliste, som kan tilpasses bredt til brug langt ud over præsenteres undersøgelse system. Det er håbet, at denne protokol kan tjene som en omfattende ressource for Fællesskabets Astyanax og videre.
Introduction
In situ hybridisering er en fælles metode for farvning faste væv for at visualisere gen expression mønstre1. Denne teknik er blevet udført i år i andre traditionelle2 og ikke-traditionelle3 modelsystemer, for en bred vifte af biologiske undersøgelser. Dog er flere trin og reagenser, der nødvendige for at fuldføre denne procedure. For efterforskerne, der aldrig har udført denne teknik, kan indlede processen være skræmmende på grund af de mange trin involveret. Yderligere, den langvarige karakter af denne procedure egner sig til tekniske fejl, som kan være en udfordring for at fejlfinde.
Det overordnede mål med denne artikel er at præsentere en enkel og ligetil metode, der vil gøre denne hybridisering teknik har adgang til et bredt publikum. For at reducere indførelsen af fejl, præsenterer vi en enkel tilgang, der giver høj kvalitet gen expression farvning og minimerer uspecifikke baggrund signal. Denne procedure er magen til andre metoder udviklet i traditionelle modelsystemer, såsom Danio rerio4. Her, vi sigter mod at lette omhyggelig gennemførelse af hvert trin ved hjælp af en downloades tjekliste (supplerende fil 1), at fremme omhyggelig gennemførelse af protokollen. Begrundelsen herfor er at lette organisation gennem de mange trin i denne procedure. Denne artikel er relevant for forskere interesseret i at udføre hele-mount in situ hybridisering i udviklingen af embryoner, men endnu har udført ikke proceduren. Fordelen ved den valgte metode for Astyanax forskere er at det er blevet testet og bevist i både cavefish og overflade fisk morphs, hvilket letter sammenlignende udtryk analyser. Metoden præsenteres kan bruges af forskere i undersøgelser af Astyanax og andre systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of Cincinnati (protokol #10-01-21-01).
1. fiksation
- Isolere ønskede antal Astyanax mexicanus embryoner fra en formering tank og fastsætte ~ 50 embryoner på en gang. Hvis embryoner er store og gamle, kan det være nødvendigt at fastsætte 25 på et tidspunkt at sikre selv fiksering.
- Afhængigt af alder af embryonet, udnytte metoden IACUC-godkendt af anæstesi. For ældre embryoner med et velfungerende nervesystem, ofre embryoner via bedøvende overdosis. Derfor placere embryoner i en opløsning af ~ 1% tricaine (buffer til pH 7,4) for at minimere smerter og ubehag for organismen.
- Når embryoner er ikke reagerer på røre, erstatte system vand indeholdende tricaine og tilføje ~ 1 mL af 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS, pH 7,4).
- Fjerne PBS løsning, og der tilsættes 1 mL af 4% PARAFORMALDEHYD (PFA). Fix embryoner natten over ved 4 ° C.
Forsigtig: PFA er farlige (dvs. det er brandfarligt og er en hud og lunge lokalirriterende), håndterer med omhu.
2. dehydrering
- At dehydrere embryonerne, fjerne den Fikseringsvæske løsning og skyl med 1 mL PBS. Placer embryo-holdige hætteglas på en vinkel (mellem 30° og 45°), på en platform shaker under skylning. Fortsætte med at vaske embryoner to gange, 5 min pr. vask.
- Hvis embryoner stadig har en chorion, placere alle 50 embryoner i en 100 mm x 25 mm petriskål, og omhyggeligt isolere dem fra chorions ved hjælp af to sæt af Urmagers pincet (f.eks. #5 pincet) under et mikroskop.
Bemærk: Under de trin, der beskrives nedenfor, og i resten af protokollen, fjerne forsigtigt alle væske fra det forrige trin ved hjælp af ren, glas Pasteur pipetter før du tilføjer den næste løsning - Dehydrere embryoner i en række mere og mere koncentreret vasker methanol (MeOH) beskrevet nedenfor. Fortyndingerne er baseret på et 1 mL volumen med 500 µL af løsning går ind i hver 4 mL hætteglas. Udfør alle dehydrering trin ved stuetemperatur (RT) på platform shaker.
- Fjern forsigtigt PBS løsning. Tilføje en 25% MeOH løsning (250 µL af MeOH) + 750 µL af PBS. Ryst forsigtigt på en platform shaker i 5 min.
- Fjern forsigtigt 25% MeOH løsning. Tilføje en 50% MeOH løsning (500 µL af MeOH) + 500 µL af PBS. Ryst forsigtigt på en platform shaker i 5 min.
- Fjern forsigtigt 50% MeOH løsning. Tilføje en 75% MeOH løsning (750 µL af MeOH) + 250 µL af PBS. Ryst forsigtigt på en platform shaker i 5 minutter.
- Fjern forsigtigt 75% MeOH løsning. Tilføje en 100% MeOH løsning (1 mL af MeOH). Ryst forsigtigt på en platform shaker i 5 min. Gentag dette trin 3 gange.
- På dette tidspunkt butik dehydreret embryoner, efter behov, i deres hætteglas ved-20 ° C (lang sigt). Alternativt kan du fortsætte direkte til dag 1 i protokollen.
3. dag 1: rehydrering
- Få dehydreret embryoner fra-20 ° C fryser (eller gå direkte fra trin 2.5).
- Sortere embryoner ved hjælp af Pasteurs pipette. Man kan sortere baseret på morphotype (dvs., hule og overflade), og antallet af gener vurderes i hvert forsøg. Der er normalt ikke mere end 12 embryoner pr. hætteglas engang sorteret. For at opretholde organisation, skal du bruge farvet lab tape til at udpege hætteglas og pipetter for hvert Gen. Embryoner vil forblive i den samme hætteglas i hele den hele protokol.
Bemærk: Sted spidsen af Pasteur pipette i 100% EtOH at sterilisere det mellem bruger. - Angiv en rystende vandbad til 70 ° C skal anvendes i et senere trin. Omhyggeligt, trække ud MeOH i hætteglas af sorterede embryoner og erstatte med 500 µL af ny 100% MeOH. Vask kort (~ 1 min) på platform shaker.
- Rehydrere embryoner i en stigende koncentration af 1 x PBS med Tween 20 (PBT, se nedenfor) på platform shaker. Fortyndingerne er baseret på en 1 mL endelige fortyndingsvolumen med 500 µL går ind i hvert hætteglas.
- Tilføje en 25% PBT løsning (250 µL af PBT, 750 µL af MeOH). Ryst forsigtigt på en platform shaker i 5 min.
- Fjern forsigtigt 25% PBT løsning. Tilføje en 50% PBT løsning (500 µL af PBT, 500 µL af MeOH). Ryst forsigtigt på en platform shaker i 5 min.
- Fjern forsigtigt 50% PBT løsning. Tilføje en 75% PBT løsning (750 µL af PBT, 250 µL af MeOH). Ryst forsigtigt på en platform shaker i 5 min.
- Fjern forsigtigt 75% PBT løsning. Tilføje en 100% PBT løsning (1 mL af PBT). Ryst forsigtigt på en platform shaker i 5 min. Gentag dette trin 3 gange.
4. dag 1: Fordøjelse og fiksering
- Forbered en proteinase K (PK) løsning ved at tilføje 1 µL af PK (20 mg/mL) til 2 mL af PBT.
- I forventning om efterfølgende trin, få frosne delprøver af hybridisering buffere (Hyb- og Hyb +; Se supplerende fil 2 og supplerende fil 3) og PFA fra-20 ° C opbevaring.
- Tillad PFA at tø på RT.
- Placer delprøver af Hyb- og Hyb + i en roterende 70 ° C vandbad. Placere alle reagenser og hætteglas inde i en lille "pakning" med en mesh bund, inden apparatet flydende vand bad. Dette giver mulighed for simpel tilføjelse og fjernelse af rør og hætteglas fra de roterende 70 ° C vandbad.
- Forsigtigt tilføje PK løsning til vial(s) af embryoner at sikre alle væv er helt dækket med løsning. Fordøje embryoner for ~ 12 min i PK brugsopløsning på platform shaker.
Bemærk: Længden af fordøjelsen kan varieres ved investigator at sikre optimale resultater. - Forsigtigt trække off PK løsning, og kort oversvømme hætteglas med PBT at udvande enhver resterende PK.
- Trække off PBT løsning og erstatte med 500 µL af nye PBT. Tillade løsning at skylle på platform shaker i 5 min.
- Trække off PBT og erstatte med 500 µL af optøede 4% PFA. Tillade embryoner til Ruger i 20 min. på platform shakeren på RT.
- Trække off 4% PFA, og kortvarigt oversvømme hætteglas med PBT at udvande enhver resterende PFA. Trække off PBT, og erstatte med 500 µL af frisk PBT. Tillade embryoner til skylles i 5 min på platform shaker. Gentag dette trin 4 gange mere.
5. dag 1: Prehybridization
- Sted 500 µL af pre varmede Hyb-løsning i hætteglasset. Anbring forsigtigt hætteglasset i de 70 ° C vand bad (inde i pakninger) uden omrøring i 5 min.
- Trække off Hyb-løsning og oversvømme hætteglas med 500 µL af pre varmede Hyb + løsning. Placere hætteglasset tilbage i 70 ° C vandbad under omrystning (40 rpm). Inkuber i enten 4 h, eller natten over.
Bemærk: En 4 h inkubation vil give en komplet in situ protokol, som vil vare 4 dage i alt. Her, er dette trin præsenteret som en natten inkubation, som vil give en protokol, der varede 5 dage i alt.
6. dag 2: hybridisering
- Anbringes en alikvot af Hyb + fra-20 ° C fryser i den rystende vandbad i 5 min.
- Drage ud Hyb + hætteglasset og erstatte med 500 µL af pre varmede Hyb +. Denne løsning, omhyggeligt tilføje 2 µL af RNA sonde til hvert hætteglas. Forsigtigt swirl hætteglas for at sikre ligelig fordeling af sonden.
- Inkuber Hyb + (med tilføjet sonde) løsning på 70 ° C vandbad natten mens ryste på 40 rpm.
Bemærk: Kan man igen bruge Hyb + (med sonde) løsning. For dette, tage Hyb + med sonden fra først køre fra-20 ° C fryser og sted det i et vandbad i 5 min. Udskift Hyb + fra dag 1 protokol med Hyb + med sonde og tillade inkubering natten over i vandbad.
7. dag 3: Løsning forberedelse
- Forberede microcentrifuge rør mærket Hyb + med "gen-af-interesse" RNA sonde. Forberede serien af fortyndinger, der vil blive anvendt under dag 3.
- Bruger 6 separate rør, forberede den følgende række fortyndinger af Hyb- og saline natriumcitrat (VSK, 0-100%) i en 1 mL volumen, og sted dem i 70 ° C ryster vand bad: rør 1 = 100% Hyb-(1 mL af Hyb-): rør 2 = 25% 2 x SSC (250 µL af 2 x SSC, 750 µL af Hyb-); Rør 3 = 50% 2 x SSC (500 µL af 2 x SSC, 500 µL af Hyb-); Tube 4 = 75% 2 x SSC (750 µL af 2 x SSC, 250 µL af Hyb-); Rør 5 = 100% 2 x SSC (1 mL af 2 x SSC); Tube 6 = 100% 0,2 x SSC (2 mL 0,2 x SSC).
Bemærk: Være på vagt af koncentrationen af VSK, som den ændres fra 2 x til 0,2 x. - Ved hjælp af 4 separate rør, forberede den følgende række fortyndinger af PBT og SSC i en 1 mL volumen, og sted på RT: rør 1 = 25% PBT (250 µL af PBT, 750 µL af 0,2 x SSC); Rør 2 = 50% PBT (500 µL af PBT, 500 µL af 0,2 x SSC); Rør 3 = 75% PBT (750 µL af PBT, 250 µL af 0,2 x SSC); Tube 4 = 100% PBT (1mL af PBT).
- Forberede en tube med 2 mL af maleinsyre buffer indeholdende Tween 20 (MABT) brugsopløsning.
- Forbered to 15 mL konisk rør af blokering løsning. I hver tube, tilsættes 0,2 g blokerende reagens 10 mL af MABT (Se supplerende fil 4). Placere begge rør på en nutating mixer (eller platform shaker) indtil fuldstændig opløst i løsning (op til 3 h).
- Bruger 6 separate rør, forberede den følgende række fortyndinger af Hyb- og saline natriumcitrat (VSK, 0-100%) i en 1 mL volumen, og sted dem i 70 ° C ryster vand bad: rør 1 = 100% Hyb-(1 mL af Hyb-): rør 2 = 25% 2 x SSC (250 µL af 2 x SSC, 750 µL af Hyb-); Rør 3 = 50% 2 x SSC (500 µL af 2 x SSC, 500 µL af Hyb-); Tube 4 = 75% 2 x SSC (750 µL af 2 x SSC, 250 µL af Hyb-); Rør 5 = 100% 2 x SSC (1 mL af 2 x SSC); Tube 6 = 100% 0,2 x SSC (2 mL 0,2 x SSC).
8. dag 3: Sonden fjernelse
- Trække off Hyb + (med sonde) løsning med et glas Pasteur pipette og læg det i en steril, mærket microcentrifuge tube. Beholde denne rør i-20 ° C fryser til fremtidig brug (hvis sonden-mærkning er vellykket).
- Forsigtigt tilføje 500 µL af de varme SSC/Hyb-fortyndinger (angivet nedenfor). Inkuber i hver af de følgende løsninger i 10 min i 70 ° C ryster vandbad.
- Inkuber sekventielt med 100% Hyb-(1 mL af Hyb-), 25% 2 x SSC (250 µL af 2 x SSC, 750 µL af Hyb-), 50% 2 x SSC (500 µL af 2 x SSC, 500 µL af Hyb-), 75% 2 x SSC (750 µL af 2 x SSC, 250 µL af Hyb-), 100% 2 x SSC (1 mL af 2 x SSC) , 100% 0,2 x SSC (2 mL 0,2 x SSC).
- Efter det sidste trin, inkuberes i hver af de følgende løsninger i 10 min. Alle af de følgende inkubationer finder sted på RT på platform shaker: 25% PBT (250 µL af PBT, 750 µL af 0,2 x SSC), 50% PBT (500 µL af PBT, 500 µL af 0,2 x SSC), 75% PBT (750 µL af PBT, 250 µL af 0,2 x SSC) , 100% PBT (1 mL af PBT).
- Efter en 10 min inkubation, fjerne 100% PBT, og tilsættes 500 µL af MABT i hvert hætteglas. Gentag dette trin to gange for 5 min.
9. dag 3: blokering
- Fjerne MABT fra hvert hætteglas og oversvømmelse med forblandet blokerende løsning fra en af de rør (udarbejdet i trin 7.1.4). Sted hætteglas på en nutating mixer til ~ 4 h på RT.
- Tilføj 2 µL af DIG-AP Fab fragmenter til den anden hætteglas med 10 mL blokerende løsning (udarbejdet i trin 7.1.4) og kortvarigt vortex.
- Fyld hvert hætteglas næsten helt med blokering løsning (~ 5 mL) og placere på nutating mixer natten over i køleskab ved 4 ° C.
10. dag 4: MABT skylninger
- Forberede en stock hætteglas med 10% normalt ged serum (NGS) i MABT (tilføje 100 µL af NGS til 900 µL af MABT).
- Tegner ud den blokerende løsning i hvert hætteglas og tilsæt 500 µL af NGS/MABT blanding i hvert hætteglas. Tillade embryoner til inkuberes i 25 min. ved RT på platform shaker.
- Erstatte NGS/MABT blanding med 500 µL af 100% MABT. Inkuber i 30 min. ved RT på platform shaker. Udføre dette skyl 11 flere gange i løbet af dagen hvert 30 min.
- Fyld hætteglasset med 100% MABT og sted på en nutating mixer natten over i et køleskab eller walk-in kammer ved 4 ° C.
11. dag 5: Sonden visualisering
- Forberede en 50 mL prøve af alkalisk fosfatase (AP) buffer (Se supplerende fil 5). Kombinere følgende i en 50 mL konisk tube indpakket i aluminiumsfolie at begrænse lys eksponering: 5 mL 1 M Tris (pH 9.5), 5 mL 50 mm MgCl2, 5 mL 1% Tween 20, 5 mL 1 M NaCl, 30 mL af ddH2O.
- Fjerne MABT og erstatte med 1 mL af AP buffer (tube indpakket i folie). Lad det vaske i 5 min. Gøre dette to gange for at sikre fuldstændig fjernelse af MABT.
- Fjerne AP buffer og erstatte med 1 mL af AP buffer med 3,5 μL 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate (BCIP) og 4.5 μL af nitro-blå tetrazolium (NBT). Erstat med frisklavede AP buffer/NBT/BCIP når hver time indtil reaktion er fuldført. Overvåge, kontrollere hver 15 min, til at tillade farvning reaktion finder sted, indtil det ønskede niveau af farvning er opnået. Hvis bundfaldet begynder at danne, erstatte løsningen før.
- Stop farvning reaktion ved skylning af embryoner i frisk 100% AP buffer (uden NBT/BCIP) for 5 min. Fortsæt skylninger i PBT, indtil der opnås optimale niveauer af signal (med minimale mængder af baggrunden farvning). Fortsætte med at skylle prøver med stigende fortyndinger af PBT i AP Buffer som følger: 25% PBT (250 μL af PBT, 750 μL af AP Buffer), skylles i 5 min; 50% PBT (500 μL af PBT, 500 μL af AP Buffer), skylles i 5 min; 75% PBT (750 μL af PBT, 250 μL af AP buffer), skylles i 5 min.
- Skyl embryoner i ~ 5 mL af 100% PBT på nutating mixer indtil ønsket minimum baggrund farvning er nået. Skifte ud med frisk PBT flere gange. Dette kan tage op til flere dage.
- Når skylning er komplet, vask embryoner i 500 μl sterilt PBS på en platform shaker. Udføre denne skylles to gange i 5 min. Efter PBS vasker, post fix enhederne i 500 μL af 4% PFA for 1 h i RT på en platform shaker. Alternativt kan du lave natten over i 1 mL af 4% PFA i køleskab ved 4 ° C.
- Erstatte fiksativ med friske, steril PBS. Udføre denne skylning mindst to gange i 5 min. sted embryoner i ~ 4 mL 100% steril PBS, og gemme langsigtede ved 4 ° C.
12. billedbehandling
- Udgør en billeddannelse plade i en petriskål ved hjælp af 3% Agarosen og TAE buffer.
Bemærk: Mængder afhænger hvor mange plader er nødvendige. Plader kan genbruges flere gange. Det anbefales, at en lavvandet rektangulære skimmel er placeret i petriskålen, mens gelen er køling for at skabe en depression for indeholdende embryoner på pladen. - Placer embryoner på pladen i PBS.
Bemærk: Det er bedst at forsigtigt hældes embryoner på pladen i stedet for pipettering dem ud, fordi det er blevet konstateret, at de vil holde sig til indersiden af plast pipetter. - Bruge lysmikroskopi for at visualisere hvert embryon. Brug en stump sonde til at manøvrere embryoner til ønsket position.
- Tage et billede, når fosteret er i ønskede position. Bemærk at det er vigtigt at tage billeder af embryoner inden for et par uger efter afsluttet farvning for at undgå potentielle nedbrydning af pletten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne betænkning leverer vi en enkel og ligetil tilgang til at udføre mærkning af embryonale Astyanax enheder til høj kvalitet gen expression analyse. Denne teknik kan udføres i enten fire eller fem dage, og hvert vigtigste trin i proceduren er repræsenteret i et farvekodet diagram (fig. 1). Når du er færdig, skal farves embryoner havnen en mørk lilla kromatisk etiket i væv udtrykker den bestemt gen af interesse. Vi har med succes gennemført denne protokol i både Pachón cavefish (figur 2A-B, E) og overflade fisk (figur 2 c-D, F) embryoner.
Cavefish embryoner blev farves for to transkriptionsfaktorer at etiketten tidlige neurale crest væv, Sox9 og Tfap2a5,6. Embryoner mærket for Sox9 udtryk viser tydelig mærkning i udviklingslandene branchial buer og brystfinnen (gul pilespidser, figur 2A). Bemærk at farvning er stort set fraværende i blommesækken eller at udvikle somites på flanke (figur 2A). Tfap2a udtryk er ligeledes tydelig i dele af udviklingslandene hoved, samt tidlig migration neurale crest celler (figur 2B, pilespids) langs regionen dorsale flanke af embryoet. Den tredje repræsentative gen præsenteret for cavefish embryoner er Phf20a, en markør for osteoblastdannelse differentiering7. Bemærk den positive farvning i dele af somitic mesoderm og posterior hoved, der er bestemt til at give anledning til knoklet væv (figur 2E, pilespidser).
I overflade fisk embryoner aftestede vi for generne CXCR, Adcyap1aog Sox10. CXCR koder en G-protein membran-bundet receptor, som binder CXC kemokiner8. Positive mærkning er til stede i isolerede regioner i hovedet og flanke (figur 2F, pilespidser), samt et par enkelte celler overliggende blommesækken. Det gen adenylate cyclase-aktivering polypeptid, Adcyap1a, udtrykkes i regioner i det centrale nervesystem, herunder hypofyse celler. Bemærk den meget specifikke udtryk i parrede, bilaterale klynger af celler på den dorsale aspekt af embryoner; ud over et større område af midterlinjen udtryk (figur 2 c, pilespidser). Endelig præsenterer vi udtryk for Sox10, en transkriptionsfaktor hvilke etiketter tidlige neurale crest og oligodendrocyte celler10. Meget specifikke positive farvning fremgår som en tidlig markør af neural crest på venstre og højre side af den dorsale embryo (figur 2D, pilespidser).
Vi præsenterer hver af de to typer af confounding spørgsmål kan støde på andre efterforskere. Det første spørgsmål, man støder på med jævne mellemrum er punktformet pletter af ikke-specifik mærkning. Disse pletter kan opstå som bundfald fra de endelige MABT skylninger eller AP buffer under farvning reaktioner. Et eksempel på denne ikke-specifik mærkning er tydeligt på blommesækken af en overflade fisk embryo farvet for udtryk for Pnp4a. Dette gen koder et enzym (purin nucleoside phosphorylase), der fremmer produktion af iriserende pigmentering11. Dette gen er først tydelig i den tredje øjet og svømme blæren. Punktformet pletter observeret i nogle overflade prøver (figur 3A), blev elimineret af hyppig vask og udskiftning af AP Buffer + NBT/BCIP i de sidste faser af protokollen (figur 3B). Et andet spørgsmål, som man støder på med jævne mellemrum er den diffuse, stort set ikke-specifikke udtryk af gener, der ellers ville producere en særskilt udtryk mønster. Et eksempel er gen BMP4, der vises som et stort set mønster med lave niveauer af kromogen hele modellen (figur 3 c). I tilfælde som disse, vi generelt identificere en anden region af genet, forstærke i en vektor og udføre en ny sonde syntese (Se supplerende fil 6). Eksempel på en kontrol (ingen sonde) modellen (figur 3D) er fastsat til at illustrere den diffuse og uspecifikke karakter af vores mislykkede BMP4 sonde.
Figur 1: et enkelt rutediagram for hele-mount in situ hybridisering. Dette rutediagram benytter farvekoder for at illustrere de vigtigste trin i in situ hybridisering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative farvning for seks gener, ved hjælp af både cave og overflade morphs af Astyanax. (A) billede viser den specifikke farvning (gule pile) af Sox9 på den højre laterale side af en 72 h efter befrugtning (hpf) Pachón cavefish (45 x). (B) særlige farvning for Tfap2a er tydeligt på den højre laterale side af en 36 hpf Pachón cavefish (45 x). (C) bilaterale og midterlinjen farvning (gul pilespidser) af Adcyap1a er mærket i den dorsale regionen en 72 hpf overflade fisk (100 x). (D) farvning af Sox10 i neurale crest væv af en 24 hpf overflade fisk (100 x). (E) Phf20a viser en svag, men klart mønster af udtryk i den dorsale region af en 24 hpf Pachón cavefish (100 x). (F) i cytokin receptor, CXCR, udtrykkes i forskellige regioner af den højre laterale side af en 24 hpf overflade fisk (100 x). Skala barer i A, B, E, F = 0,5 mm; skalere barer i C, D = 2,5 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentative eksempler på sub-optimale resultater for hele-mount in situ hybridisering. (A) specifik farvning er tydeligt sammen med uspecifikke bundfald og/eller vragrester (rød pilespids) på den højre laterale aspekt af en 72 hpf Pachón cavefish (100 x). (B) den samme sonde visualiseret i A, skildrer den samme farvning mønstre uden bundfald eller baggrund i en 72 hpf Pachón cavefish (100 x). (C) den højre laterale flanke af en 72 hpf Pachón cavefish viser diffuse, uspecifik farvning for BMP4 på 45 x forstørrelse. (D) en 72 hpf Pachón cavefish udsat for denne protokol, uden tilsætning af sonde (45 x). Skalere barer = 0.5 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund af sårbarheden af RNA til nedbrydning vedrører et af de mest kritiske trin i protokollen sterile syntesen af RNA sonden. Men hvis en sonde genereres omhyggeligt, og giver gode resultater, det kan genbruges i efterfølgende farvning reaktioner. Et andet afgørende skridt er forsigtige produktionen af alle reagenser, der anvendes i hele protokollen. Da denne protokol omfatter flere dage og mange små skridt, det er vigtigt at alle reagenser er præcist produceret og gemt i en steril måde. Endvidere er det vigtigt at investigator holder nøje styr på hvert trin i protokollen. Vi har fundet, at kontrollisten angivne trin kan være meget nyttige i at sikre nøjagtige og præcise afslutningen af hvert aspekt af denne protokol.
Vi må ikke ofte ændre protokollen vi præsenteret her. Men efterforskerne kan udføre sonde inkubationer ved forskellige temperaturer end dem, der foreslog (dvs., 70 ° C). Små ændringer i hybridisering temperaturer vil påvirke binding af RNA-sonder, og derfor søger den optimale hybridisering temperatur positivt kan påvirke kvaliteten af farvning. Med hensyn til fejlfinding, opfordre vi kraftigt andre efterforskere at udnytte kontrollisten forsynet med denne artikel (supplerende fil 1). Opretholde omhyggelig records er et nødvendigt første skridt i at sikre høj kvalitet farvning. En anden mindre ændring foreslås det at udføre den endelige farve reaktion uden vuggende (fx, uden at placere på en platform shaker eller nutator). Det skyldes at periodisk vi noterer produktion af bundfaldet, der formentlig skyldes AP stødpudeopløsning. Dette bundfald normalt overstains til en mørk farve og skaber punktformet (non-specifik) baggrunden på den farvede væv. For at minimere produktionen af dette bundfald, forbereder vi steriliseret AP buffer lige før hver reaktion. Yderligere, når NBT og BCIP er blevet tilføjet til bufferen, vi erstatte det med friske buffer og NBT/BCIP hver time indtil farvning reaktion er afsluttet.
En begrænsning til metoden præsenteres er, at en kromatisk plet blev brugt til gen expression visualisering. Vi foretrækker denne tilgang, da det er omkostningseffektiv, og kræver kun lysmikroskopi at visualisere. Hvis man var interesseret i evaluere kvantitative forskelle, foreslår vi, at de bruger en fluorescerende farve reaktion. Dette vil aktivere semi-kvantitering, eksempelvis gennem sammenligning af relative fluorescerende enheder af udtryk mellem eksperimenter.
Protokoller for in situ hybridisering er tilgængelig bredt på web12,13, samt i videnskabelige publikationer. Den protokol, som vi præsenterer blev udviklet specielt til vores modelsystem, Astyanax mexicanus. Vi har brugt denne protokol til at plette udtryk af flere snesevis af gener, og føler det konsekvent giver høj kvalitet resultater. En væsentlig fordel ved denne protokol er den trinvise kontrolliste til at aktivere investigator at udføre flere opgaver samtidig sikre nøjagtige afslutning af hvert af trinene i denne protokol. Vi håber, at denne protokol vil tjene som en nyttig ressource til andre efterforskere i feltet og videre, og forventer, at denne fælles laboratorium teknik vil støtte fremtidige opdagelser forbinder genotype med fænotype i den blinde mexicanske cavefish.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af de grove lab for nyttige kommentarer på dette håndskrift. Vi vil gerne anerkende fire gymnasieelever, der udnyttede denne protokol i løbet af sommeren praktikpladser i 2017 og 2018, herunder Christine Cao, Michael Warden, Aki Li og David Nwankwo. HL blev støttet af en UC biologi STILK Fellowship i løbet af sommeren i 2017. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Science Foundation (DEB-1457630 til JBG), og de nationale institutter for Dental og Craniofacial forskning (NIH; DE025033 til JBG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
| Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
| Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
References
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization: Application to neurobiology. , Oxford University Press. Oxford. (1987).
- Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).
- Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression. Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Cheung, M., Briscoe, J. Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9. Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).
- Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development. Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).
- Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3. Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).
- Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways. Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).
- Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3). Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).
- Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).
- Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).
- Monsoro-Burq, A. H. A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).
- Schulz, C. In situ hybridization to Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).
