Summary
Detta protokoll möjliggör visualisering av genuttryck i embryonala Astyanax släktet. Detta synsätt har utvecklats med målet att maximera gen uttryck signal, samtidigt minimera ospecifika bakgrundsfärgning.
Abstract
Under de senaste åren har ett utkast till genomet för den blinda mexikanska släktet (Astyanax mexicanus) släppts, avslöjar sekvens identiteter för tusentals gener. Tidigare forskning i detta framväxande modellsystem aktiveras på omfattande genome-wide utredningar som har identifierat ett flertal kvantitativa loci (QTL) associerade med olika cave-associerade fenotyper. Möjlighet att ansluta gener av intresse till den ärftliga grunden för fenotypisk förändring är dock fortfarande en stor utmaning. En teknik som kan underlätta djupare förståelse av utvecklingen i troglomorphic evolution roll är hela-mount in situ hybridisering. Denna teknik kan genomföras för att direkt jämföra genuttryck mellan - och surface-grottboende former, nominera kandidat gener bakom etablerade QTL, identifiera gener av intresse från nästa generations sekvensering studier eller utvecklar andra Discovery-baserade metoder. I denna rapport presenterar vi ett enkelt protokoll, stöds av en flexibel checklista, som allmänt kan anpassas för användning utöver presenterade studien systemet. Förhoppningen är att detta protokoll kan tjäna som en bred resurs för Astyanax gemenskapen och bortom.
Introduction
In situ hybridisering är en vanlig metod för färgning fasta vävnader för att visualisera gen uttryck mönster1. Denna teknik har utförts i år i andra traditionella2 och icke-traditionella3 modellsystem, för en mängd olika biologiska studier. Dock är flera steg och reagenser nödvändiga för att kunna utföra denna procedur. För utredare som aldrig har utfört denna teknik, kan det vara skrämmande på grund av de många olika stegen att inleda processen. Dessutom lämpar långa arten av denna procedur sig för tekniska fel, som kan vara svårt för att felsöka.
Det övergripande målet för den här artikeln är att presentera en enkel och okomplicerad metod som kommer att göra denna hybridisering teknik tillgänglig för en bred publik. För att minska införandet av fel, presenterar vi en okomplicerad metod som ger hög kvalitet gen uttryck färgning och minimerar icke-specifik bakgrund signal. Proceduren liknar andra strategier som utvecklats i traditionell modellsystem, såsom Danio rerio4. Här, vi strävar efter att underlätta noggrann genomförandet av varje steg använder en nedladdningsbara checklista (kompletterande fil 1), att främja försiktig genomförande av protokollet. Motiven för att göra detta är att underlätta organisationen genom de många olika stegen i den här proceduren. Denna artikel är lämpligt för forskare som är intresserade av att utföra hela-mount in situ hybridisering i utvecklingen av embryon, men ännu inte har utfört proceduren. Fördelen med den valda metoden för Astyanax forskare är att det har testats och visat i både släktet och ytan fisk morphs, därigenom underlätta jämförande uttryck analyser. Denna metod kan användas av forskare i studier på Astyanax och andra system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) vid University of Cincinnati (protokoll nr 10-01-21-01).
1. fixering
- Isolera önskat antal Astyanax mexicanus embryon från en avel tank och åtgärda ~ 50 embryon i taget. Om embryon är stora och gamla, kan det vara nödvändigt att fixa 25 samtidigt för att säkerställa jämn fixering.
- Beroende på ålder av embryot, använder du metoden IACUC godkänd av anestesi. För äldre embryon med ett fungerande nervsystem, offra embryon via bedövningsmedel överdosering. Med detta, placera embryon i en lösning av ~ 1% tricaine (buffrat till pH 7,4) för att minimera smärta och obehag för organismen.
- När embryona är okänslig för beröring, ersätta systemet vatten innehållande tricaine och tillsätt ~ 1 mL 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4).
- Ta bort den PBS-lösningen och tillsätt 1 mL 4% paraformaldehyd (PFA). Fixa embryon över natten vid 4 ° C.
FÖRSIKTIGHET: PFA är farliga (dvs det är brandfarligt och är en hud och lungor irriterande), hantera med försiktighet.
2. Dehydrering
- Torkar embryona, ta bort fixativ lösningen och skölj med 1 mL PBS. Placera embryo-innehållande injektionsflaskor vinkel (mellan 30° och 45°), på en plattform shaker under skölj. Fortsätta att tvätta embryona två gånger, 5 min per tvätt.
- Om embryon har fortfarande en chorion, placera alla 50 embryon till en 100 mm x 25 mm petriskål och noggrant isolera dem från de chorions som använder två uppsättningar av urmakare pincett (t.ex. #5 tången) under ett Mikroskop.
Obs: Under stegen som beskrivs nedan, och för resten av protokollet, ta bort noggrant all vätska från föregående steg med hjälp av rena, glas Pasteur pipetter innan du lägger nästa lösning - Torka embryona i en serie av alltmer koncentrerad tvättar metanol (MeOH) beskrivs nedan. Spädningarna baseras på en 1 mL totalvolym med 500 µL lösning gå in varje 4 mL injektionsflaska av glas. Utför alla uttorkning steg vid rumstemperatur (RT) på plattformen shaker.
- Ta försiktigt bort den PBS-lösningen. Lägga till en 25% MeOH lösning (250 µL av MeOH) + 750 µL av PBS. Skaka försiktigt på en plattform shaker för 5 min.
- Ta försiktigt bort 25% MeOH lösningen. Lägg till en 50% MeOH lösning (500 µL av MeOH) + 500 µL av PBS. Skaka försiktigt på en plattform shaker för 5 min.
- Ta försiktigt bort 50% MeOH lösningen. Lägga till en 75% MeOH lösning (750 µL av MeOH) + 250 µL av PBS. Skaka försiktigt på en plattform shaker i 5 minuter.
- Ta försiktigt bort 75% MeOH lösningen. Lägga till en 100% MeOH lösning (1 mL MeOH). Skaka försiktigt på en plattform shaker för 5 min. Upprepa detta steg 3 gånger.
- Vid denna punkt, lagra uttorkad embryon, som behövs i deras glasampuller vid-20 ° C (lång sikt). Alternativt kan du fortsätta direkt till dag 1 i protokollet.
3. dag 1: rehydrering
- Uppnå dehydratiserad embryon från-20 ° C frys (eller fortsätta direkt från steg 2.5).
- Sortera de embryon som använder en Pasteur-pipett. Man kan sortera utifrån morphotype (dvs. grottan eller yta), och antalet gener bedömas i varje experiment. I området i närheten finns det oftast inte mer än 12 embryon per injektionsflaska sorterade på en gång. För att bibehålla organisation, använder du färgade lab tejp för att utse injektionsflaskor och Pipetter för varje gen. Embryon kommer att bo i samma injektionsflaskan i hela hela protokollet.
Obs: Plats spetsen av Pasteur pipetten i 100% EtOH att sterilisera den mellan använder. - Ange ett skakande vattenbad till 70 ° C ska användas i ett senare steg. Noga, dra ut MeOH i injektionsflaskor av sorterade embryon och ersätta med 500 µL av ny 100% MeOH. Tvätta kort (~ 1 min) på plattformen shaker.
- Rehydrera embryon i en ökande koncentrationen av 1 x PBS med Tween-20 (PBT, se nedan) på plattformen shaker. Spädningarna baseras på en 1 mL slutspädning volym med 500 µL gå in varje injektionsflaska.
- Lägga till en 25% PBT lösning (250 µL av PBT, 750 µL av MeOH). Skaka försiktigt på en plattform shaker för 5 min.
- Ta försiktigt bort 25% PBT lösningen. Lägg till en 50% PBT lösning (500 µL av PBT, 500 µL av MeOH). Skaka försiktigt på en plattform shaker för 5 min.
- Ta försiktigt bort 50% PBT lösningen. Lägga till en 75% PBT lösning (750 µL av PBT, 250 µL av MeOH). Skaka försiktigt på en plattform shaker för 5 min.
- Ta försiktigt bort 75% PBT lösningen. Lägga till en 100% PBT lösning (1 mL av PBT). Skaka försiktigt på en plattform shaker för 5 min. Upprepa detta steg 3 gånger.
4. dag 1: Matsmältning och fixering
- Förbereda en proteinas K (PK) lösning genom att lägga till 1 µL PK (20 mg/mL) 2 mL av PBT.
- I väntan på efterföljande steg, få frysta portioner av hybridisering buffertar (Hyb- och Hyb +; se kompletterande fil 2 och kompletterande fil 3) och PFA från-20 ° C lagring.
- Tillåta PFA Tina i RT.
- Placera alikvoter av Hyb- och Hyb + i roterande 70 ° C vattenbad. Placera alla reagenser och injektionsflaskor inuti en liten ”packning” med en mesh botten, släpper flytande vatten bad apparaten. Detta möjliggör enkel tillägg och borttagning av tuber och flaskor från det roterande 70 ° C vattenbadet.
- Försiktigt lägga PK lösning vaccinkoncentratet embryon att säkerställa alla vävnader är helt täckt med lösning. Smälta embryon för ~ 12 min i PK fungerande lösning på plattformen shaker.
NOTE: Längden på matsmältningen kan varieras av prövaren att säkerställa optimala resultat. - Försiktigt dra bort den PK-lösningen och kort översvämma injektionsflaskan med PBT att späda ut eventuella kvarvarande PK.
- Tappa av PBT lösningen och ersätta med 500 µL av nya PBT. Låt lösningen att skölja på plattformen shaker för 5 min.
- Tappa av PBT och ersätta med 500 µL av tinade 4% PFA. De embryon som Inkubera i 20 min på plattformen shaker på RT.
- Tappa av 4% PFA, och kort översvämma injektionsflaskan med PBT att späda ut eventuella kvarvarande PFA. Tappa av PBT och ersätta med 500 µL av färska PBT. Tillåta embryon att skölja för 5 min på plattformen shaker. Upprepa detta steg 4 gånger.
5. dag 1: Prehybridization
- Plats 500 µL före värmde Hyb-lösning i injektionsflaskan. Placera försiktigt injektionsflaskan i den 70 ° C vatten bad (inuti packningar) utan skakningar, för 5 min.
- Tappa av Hyb-lösningen och översvämma injektionsflaskan med 500 µL före värmde Hyb + lösning. Placera injektionsflaskan tillbaka i 70 ° C vattenbad med skakningar (40 rpm). Inkubera i antingen 4 h, eller över natten.
Obs: En 4 h inkubation kommer att ge ett komplett jordbaserad protokoll som kommer att pågå i 4 dagar totalt. Här presenteras detta steg som en övernattning ruvningen, som kommer att ge ett protokoll som varar i 5 dagar totalt.
6. dag 2: hybridisering
- Placera en alikvot av Hyb + från-20 ° C frysen i skakningar hett vattenbad för 5 min.
- Tappa av den Hyb + från injektionsflaskan och ersätta med 500 µL av pre värmde Hyb +. Till denna lösning, tillsätt försiktigt 2 µL av RNA sond till varje injektionsflaska. Snurra försiktigt injektionsflaskan för att säkerställa jämn fördelning av sonden.
- Inkubera över natten Hyb + (med extra sond) lösningen i 70 ° C varmt vattenbadet under omskakning vid 40 rpm.
Obs: Man kan åter använda Hyb + (med sond) lösning. För detta, ta Hyb + med sond från först springa från-20 ° C frys och ställe den i ett vattenbad för 5 min. Ersätt Hyb + från dag 1 protokoll med Hyb + med sond och tillåta ruvar över natten i vattenbad.
7. dag 3: Lösning förberedelse
- Förbereda mikrocentrifugrör märkt Hyb + med ”gen-of-intresse” RNA sond. Förbereda serien av utspädningar som kommer att användas under dag 3.
- Med 6 separata rören, förbereda följande serier av spädningar av Hyb- och saltlösning natriumcitrat (SSC, 0 till 100%) i en 1 mL volym, och placera dem i 70 ° C skakar vatten bad: Tube 1 = 100% Hyb-(1 mL av Hyb-): Tube 2 = 25% 2 x SSC (250 µL av 2 x SSC, 750 µL Hyb-); Tub 3 = 50% 2 x SSC (500 µL av 2 x SSC, 500 µL Hyb-); Tub 4 = 75% 2 x SSC (750 µL av 2 x SSC, 250 µL Hyb-); Tube 5 = 100% 2 x SSC (1 mL 2 x SSC); Tube 6 = 100% 0,2 x SSC (2 mL 0,2 x-SSC).
Obs: Var uppmärksam i koncentrationen av SSC, eftersom det ändras från 2 x till 0,2 x. - Med 4 separata rören, förbereda följande serier av spädningar av PBT och SSC i en 1 mL volym och placera på RT: Tube 1 = 25% PBT (250 µL av PBT, 750 µL av 0,2 x SSC); Tube 2 = 50% PBT (500 µL av PBT, 500 µL av 0,2 x SSC); Tub 3 = 75% PBT (750 µL av PBT, 250 µL av 0,2 x SSC); Tube 4 = 100% PBT (1mL av PBT).
- Laga en röret med 2 mL av maleinsyra buffert innehållande Tween 20 (MABT) fungerande lösning.
- Förbered två 15 mL koniska rör av blockerande lösning. I varje rör, tillsätt 0,2 g blockerande reagens till 10 mL MABT (se kompletterande fil 4). Placera båda rören på en nutating mixer (eller plattform shaker) tills helt upplöst i lösning (upp till 3 h).
- Med 6 separata rören, förbereda följande serier av spädningar av Hyb- och saltlösning natriumcitrat (SSC, 0 till 100%) i en 1 mL volym, och placera dem i 70 ° C skakar vatten bad: Tube 1 = 100% Hyb-(1 mL av Hyb-): Tube 2 = 25% 2 x SSC (250 µL av 2 x SSC, 750 µL Hyb-); Tub 3 = 50% 2 x SSC (500 µL av 2 x SSC, 500 µL Hyb-); Tub 4 = 75% 2 x SSC (750 µL av 2 x SSC, 250 µL Hyb-); Tube 5 = 100% 2 x SSC (1 mL 2 x SSC); Tube 6 = 100% 0,2 x SSC (2 mL 0,2 x-SSC).
8. dag 3: Sonden borttagning
- Tappa av Hyb + (med sond) lösning med ett glas Pasteur-pipett och placera det i en steril, märkt mikrocentrifug rör. Behålla denna tube i-20 ° C frysen för framtida bruk (om det är framgångsrikt att sonden-märkning).
- Tillsätt försiktigt 500 µL av de varma SSC/Hyb-utspädningar (anges nedan). Inkubera i varje av de följande lösningarna för 10 min varje i 70 ° C skakningar vattenbadet.
- Inkubera sekventiellt med 100% Hyb-(1 mL av Hyb-), 25% 2 x SSC (250 µL av 2 x SSC, 750 µL Hyb-), 50% 2 x SSC (500 µL av 2 x SSC, 500 µL Hyb-), 75% 2 x SSC (750 µL av 2 x SSC, 250 µL Hyb-), 100% 2 x SSC (1 mL 2 x SSC) , 100% 0,2 x SSC (2 mL 0,2 x SSC).
- Efter det sista steget, Inkubera i varje av de följande lösningarna för 10 min varje. Alla de följande inkubationer ske på RT på plattformen shaker: 25% PBT (250 µL av PBT, 750 µL av 0,2 x SSC), 50% PBT (500 µL av PBT, 500 µL av 0,2 x SSC), 75% PBT (750 µL av PBT, 250 µL av 0,2 x SSC) , 100% PBT (1 mL av PBT).
- Efter en 10 min inkubation, ta bort 100% PBT, och tillsätt 500 µL MABT injektionsflaska. Upprepa detta två gånger för 5 min.
9. dag 3: blockering
- Ta bort MABT från varje injektionsflaska och översvämning med färdigblandad blockerande lösning från ett av rören (bereddes i steg 7.1.4). Placera flaskan på en nutating mixer för ~ 4 h på RT.
- Lägg till 2 µL Anti-DIG-AP Fab fragment till den andra injektionsflaskan à 10 mL lösning (beredd enligt steg 7.1.4) och kort vortex blockeras.
- Fyll varje injektionsflaska nästan helt med blockering lösning (~ 5 mL) och placera på nutating mixer över natten i kylskåp vid 4 ° C.
10. dag 4: MABT sköljningar
- Förbereda en lager flaska med 10% normalt get serum (NGS) i MABT (tillsätt 100 µL av NGS till 900 µL av MABT).
- Tappa av den blockerande lösningen i en injektionsflaska och tillsätt 500 µL av NGS/MABT blandning i en injektionsflaska. Tillåta att embryon som Inkubera i 25 min på RT på plattformen shaker.
- Ersätta NGS/MABT blandningen med 500 µL av 100% MABT. Inkubera i 30 min på RT på plattformen shaker. Utföra detta skölj 11 gånger hela dagen varje 30 min.
- Fyll flaskan med 100% MABT och plats på en nutating mixer över natten i kylskåp eller duschkabin avdelning vid 4 ° C.
11. dag 5: Sonden visualisering
- Förbereda en 50 mL alikvot av alkaliskt fosfatas (AP) buffert (se kompletterande fil 5). Kombinera följande i en 50 mL konisk tub insvept i aluminiumfolie att begränsa ljus exponering: 5 mL 1 M Tris (pH 9,5), 5 mL 50 mM MgCl2, 5 mL 1% Tween-20, 5 mL 1 M NaCl, 30 mL ddH2O.
- Ta bort MABT och ersätta med 1 mL av AP buffert (rör insvept i folie). Låt det tvätta för 5 min. Gör detta två gånger för att säkerställa fullständig borttagning av MABT.
- Ta bort AP buffert och ersätta med 1 mL av AP buffert med 3,5 μL 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate (Beneluxkonventionen) och 4.5 μL av nitro-blue tetrazolium (NBT). Ersätt med nylagade AP buffert/NBT/Beneluxkonventionen när varje timme tills reaktionen är klar. Övervaka, kontrollera varje 15 min, för att möjliggöra färgning reaktionen ske tills önskad nivå av färgning har uppnåtts. Om fällningen börjar form, ersätta lösningen tidigare.
- Stoppa coloration reaktionen genom att skölja embryon i fräsch 100% AP buffert (utan NBT/Beneluxkonventionen) för 5 min. Fortsätt sköljningar i PBT tills optimala nivåer av signalen (med minimala mängder bakgrundsfärgning) uppnås. Fortsätt att skölja exemplar med ökande utspädningar av PBT i AP buffert enligt följande: 25% PBT (250 μL av PBT, 750 μL av AP buffert), skölj för 5 min; 50% PBT (500 μL av PBT, 500 μL av AP buffert), skölj för 5 min; 75% PBT (750 μL av PBT, 250 μL av AP buffert), skölj i 5 min.
- Skölj embryon i ~ 5 mL 100% PBT på nutating mixer tills önskad minsta bakgrundsfärgning nås. Byta ut med färska PBT flera gånger. Detta kan ta upp till flera dagar.
- När sköljning är komplett, tvätta embryon i 500 μL av steril fosfatbuffrad Koksaltlösning på en plattform shaker. Utföra detta skölj två gånger för 5 min. Efter PBS spolas, efter fixa exemplaren i 500 μL av 4% PFA för 1 h på RT på en plattform shaker. Alternativt, fixa över natten i 1 mL 4% PFA i kylskåpet vid 4 ° C.
- Ersätta fixeringsvätskan med färska, steril fosfatbuffrad Koksaltlösning. Utföra detta skölj minst två gånger för 5 min. plats embryon i ~ 4 mL 100% steril fosfatbuffrad Koksaltlösning och lagra lång sikt vid 4 ° C.
12. imaging
- Göra upp en imaging plate i en petriskål med 3% agaros och TAE buffert.
Observera: Kvantiteter beror på hur många plattor behövs. Plattorna kan återanvändas flera gånger. Det rekommenderas att ett grunt rektangulära mögel placeras i petriskål medan gelen är kylning för att skapa en depression för innehåller embryona på plattan. - Placera embryona på plattan i PBS.
Obs: Det är bäst att försiktigt hälla embryon på plattan istället för pipettering ut dem eftersom det har konstaterats att de fastnar på insidan av plast pipetter. - Använda ljusmikroskopi för att visualisera varje embryo. Använd en trubbig sond för att manövrera embryon till önskad position.
- Ta en bild när embryot är i önskad position. Observera att det är viktigt att ta bilder av embryon inom ett par veckor efter avslutad färgning för att undvika potentiell försämring av fläcken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna rapport ger vi en enkel och okomplicerad metod för att utföra märkning av embryonala Astyanax exemplar för högkvalitativa gen uttryck analys. Denna teknik kan utföras antingen fyra eller fem dagar, och varje huvudsakliga steg i förfarandet är representerad i ett färgkodade flödesschema (figur 1). När klar, bör färgade embryon hysa en mörk lila kromatisk etikett i vävnader som uttrycker den särskild gen av intresse. Vi har framgångsrikt genomfört detta protokoll i både Pachón släktet (figur 2A–B, E) och ytan fisk (figur 2 c–D, F) embryon.
Släktet embryona var färgas för två transkriptionsfaktorer som etikett tidiga neural crest vävnader, Sox9 och Tfap2a5,6. Embryon som märkt för Sox9 uttryck visar tydlig märkning i utvecklingsländer gäl valv och bröstmuskeln fin (gula pilspetsar, figur 2A). Observera att färgning är praktiskt taget frånvarande i gulesäcken eller de utveckla thoraxsegmenten på flanken (figur 2A). Likaså är Tfap2a uttryck tydligt i delarna av den framkallande huvud, liksom tidiga migration neural crest celler (figur 2B, pilspets) längs regionen dorsala flanken av embryot. Den tredje representativa gen presenteras för släktet embryon är Phf20a, en markör för osteoblast differentiering7. Observera den positiv färgning i delarna av somitic mesoderm och bakre huvudet som är avsedda för att ge upphov till beniga vävnad (figur 2E, pilspetsar).
I surface fisk embryon sonderade vi för generna CXCR, Adcyap1aoch Sox10. CXCR kodar en G-protein membran-bundna receptor som binder CXC chemokiner8. Positiv märkning är närvarande i isolerade regioner i huvudet och flanken (figur 2F, pilspetsar), samt några enskilda celler överliggande gulesäcken. Den genen hypofysadenylatecyclase cyclase-activating polypeptide, Adcyap1a, uttrycks i regioner i det centrala nervsystemet, inklusive hypofysen celler. Observera det mycket specifika uttrycket i Parade, bilaterala kluster av celler på den dorsala aspekten av embryot; samt en större region i mittlinjen uttryck (figur 2 c, pilspetsar). Slutligen presenterar vi ett uttryck för Sox10, en transkriptionsfaktor som etiketter tidiga neural crest och oligodendrocyte celler10. Mycket specifika positiv färgning märks som en tidig markör för neural crest till vänster och höger sida av dorsala embryot (figur 2D, pilspetsar).
Vi presenterar var och en av de två typerna av förbryllande problem andra utredare kan uppstå. Den första frågan som man regelbundet möter är punktuell fläckar av icke-specifik märkning. Dessa fläckar kan uppstå som fällningen från de slutliga MABT-sköljningar eller AP bufferten under färgning reaktionerna. Ett exempel på denna icke-specifik märkning är uppenbart på gulesäcken av en yta fisk embryo färgas för uttryck för Pnp4a. Denna gen kodar ett enzym (purin nukleosid phosphorylase) som underlättar produktionen av skimrande pigmentering11. Denna gen märks först i tredje ögat och Simblåsan. Punktuell prickar observerats i vissa surface exemplar (figur 3A), eliminerades av täta tvättar och byte av AP buffert + NBT/Beneluxkonventionen i slutskedet av protokollet (figur 3B). En andra fråga som man regelbundet möter är diffusa, till stor del icke-specifika uttrycket av gener som annars skulle producera ett distinkt uttryck mönster. Ett exempel är genen BMP4, som visas som ett i hög grad diffust mönster med låga nivåer av kromogen närvarande under hela preparatet (figur 3 c). I fall som dessa, vi generellt identifiera en annan region av genen, förstärka i en vektor och utföra en ny sond syntes (se kompletterande fil 6). Exemplet av kontroll (ingen sond) provexemplar (figur 3D) föreskrivs för att illustrera den diffusa och ospecifika naturen av vår misslyckade BMP4 sond.
Figur 1: ett enkelt flödesschema för hela-mount in situ hybridisering. Detta flödesschema använder tredjeparts färgkodning för att illustrera de huvudsakliga stegen av in situ hybridisering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa färgning för sex gener, med både grottan och ytan morphs av Astyanax. (A) bilden visar den specifika färgning (gula pilar) av Sox9 på just laterala sidan av en 72 h efter befruktning (hpf) Pachón släktet (45 x). (B) särskilda färgning för Tfap2a är uppenbart på just laterala sidan av en 36 hpf Pachón släktet (45 x). (C) bilaterala och mittlinjen färgning (gula pilspetsar) av Adcyap1a märks i regionen dorsala i en 72 hpf yta fisk (100 x). (D) färgningen av Sox10 i neural crest vävnader i en 24 hpf yta fisk (100 x). (E) Phf20a visar ett svagt men tydligt, mönster av uttryck i dorsala regionen för en 24 hpf Pachón släktet (100 x). (F), cytokin-receptorn, CXCR, uttrycks i olika regioner av just laterala sidan av en 24 hpf yta fisk (100 x). Skala barer i A, B, E, F = 0,5 mm; skala barer i C, D = 2,5 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa exempel på optimala resultat för hela-mount in situ hybridisering. (A) specifik färgning är uppenbart tillsammans med icke-specifik fällningen eller skräp (röda pilspets) på höger laterala delen av en 72 hpf Pachón släktet (100 x). (B) den samma prob visualiseras i A, som skildrar samma färgningen mönster utan fällning eller bakgrunden i en 72 hpf Pachón släktet (100 x). (C), den höger lateral flanken av en 72 hpf Pachón släktet uppvisar diffusa, icke-specifik färgning för BMP4 på 45 x förstoring. (D) A 72 hpf Pachón släktet utsätts för detta protokoll, utan tillsats av sonden (45 x). Skala barer = 0,5 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund av RNA sårbarhet för nedbrytning gäller en av de viktigaste stegen i protokollet sterila syntesen av RNA sonden. Dock om en sond genereras noga och ger bra resultat, kan den återanvändas i efterföljande färgning reaktioner. En andra avgörande steget är noga med produktionen av alla reagenser som används i hela protokollet. Eftersom detta protokoll innebär flera dagar och många små steg, är det viktigt att alla reagenser är korrekt produceras och lagras i ett sterilt sätt. Vidare är det principiellt viktigt att utredaren håller noggrann koll på varje steg i protokollet. Vi har funnit att den medföljande checklistan med olika moment kan vara mycket användbart för att säkerställa noggrann och exakt slutförandet av varje aspekt av detta protokoll.
Vi ändrar inte ofta protokollet vi presenteras här. Men utredarna kan utföra sonden inkubationer vid olika temperaturer än de som föreslås (dvs 70 ° C). Smärre förändringar i hybridisering temperaturer påverkar bindning av RNA sonder, och därför söker den optimala hybridiseringstemperatur kan positivt påverka kvaliteten på färgning. När det gäller felsökning att rekommenderar vi andra utredare att utnyttja den checklista som medföljer denna artikel (kompletterande fil 1). Att upprätthålla noggrann records är ett nödvändigt första steg för att säkerställa hög kvalitet färgning. En andra smärre ändring föreslås är att utföra den slutliga coloration reaktionen utan att gunga (t.ex., utan att lägga på en plattform shaker eller nutator). Anledningen till detta är att vi regelbundet noterar produktion av fällning, som förmodligen uppstår från AP buffertlösningen. Denna utfällning vanligtvis overstains till en mörk färg och skapar punktuell (icke-specifik) bakgrund på färgade vävnad. För att minimera produktion av denna utfällning, förbereder vi steriliserade AP buffert strax före varje reaktion. Ytterligare, när NBT och Beneluxkonventionen har lagts till bufferten, vi ersätta det med frisk buffert och NBT/Beneluxkonventionen varje timme tills coloration reaktionen är klar.
En begränsning till den presenterade metoden är att en kromatisk fläck användes för gen uttryck visualisering. Vi föredrar denna metod eftersom den är kostnadseffektiv och kräver endast ljusmikroskopi att visualisera. Om man var intresserad utvärdera kvantitativa skillnader, föreslår vi att de använder en fluorescerande färgning reaktion. Detta aktiverar semi kvantitering, exempelvis genom jämförelse av relativ fluorescerande enheter av uttryck mellan experiment.
Protokoll för in situ hybridisering finns allmänt på webben12,13, liksom i vetenskapliga publikationer. Det protokoll som vi presenterar har utvecklats speciellt för våra modellsystem, Astyanax mexicanus. Vi har använt detta protokoll att fläcken uttrycket av flera dussintals gener, och känner det konsekvent ger högkvalitativa resultat. En betydande fördel i detta protokoll är stegvisa checklistan kan aktivera utredaren att utföra flera uppgifter samtidigt som man garanterar korrekt slutförande av varje steg i detta protokoll. Vi hoppas att detta protokoll kommer att tjäna som en användbar resurs för andra utredare inom och utanför, och räknar med att denna gemensamma laboratoriet-teknik kommer att stödja framtida upptäckter länka genotyp till fenotyp i den blinda mexikanska släktet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka medlemmarna i brutto lab för hjälpsamma kommentarer på detta manuskript. Vi vill uppmärksamma fyra gymnasieelever som utnyttjade detta protokoll under sommaren praktik i 2017 och 2018, inklusive Christine Cao, Michael Warden, Aki Li och David Nwankwo. HL stöddes av en UC biologi STEM gemenskap under sommaren 2017. Detta arbete stöds av bidrag från National Science Foundation (DEB-1457630 till JBG), nationella institut av tandvård och kraniofaciala forskning (NIH; DE025033 till JBG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
| Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
| Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
References
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization: Application to neurobiology. , Oxford University Press. Oxford. (1987).
- Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).
- Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression. Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Cheung, M., Briscoe, J. Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9. Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).
- Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development. Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).
- Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3. Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).
- Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways. Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).
- Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3). Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).
- Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).
- Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).
- Monsoro-Burq, A. H. A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).
- Schulz, C. In situ hybridization to Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).
