Summary
Bu iletişim kuralı embriyonik Astyanax cavefish gen ifadesinde görselleştirme sağlar. Bu yaklaşım belirsiz arka plan boyama en aza indirerek gen ifade sinyal, en üst düzeye çıkarma amacı ile geliştirilmiştir.
Abstract
Son yıllarda, kör Meksika cavefish (Astyanax mexicanus) için bir taslak genom, binlerce gen için sıra kimlik açığa çıktı. Ortaya çıkan bu model sistem içine önceden araştırma çeşitli mağara ilişkili fenotipleri ile ilişkili çok sayıda nicel özellik loci (QTL) belirledik kapsamlı genom geniş araştırmalar üzerinde büyük harf. Ancak, faiz genler kalıtsal olarak fenotipik değiştirmek için bağlanma olanağı önemli bir meydan okuma kalır. Troglomorphic evrim gelişiminde rolü daha derin bir anlayış kolaylaştıran bir bütün-mount In situ hibridizasyon tekniktir. Bu teknik doğrudan gen ekspresyonu mağaralarda ve yüzey yaşayan biçimler arasında karşılaştırmak, kurulan QTL altında yatan genlerin aday, genlerin yeni nesil sıralama çalışmalar dan ilgi tanımlamak veya diğer geliştirmek için uygulanabilir keşif dayalı yaklaşımlar. Bu raporda, yaygın olarak sunulan çalışma sistemi çok ötesinde kullanmak için adapte edilebilir bir esnek denetim listesi tarafından desteklenen basit bir protokol tanıtacağız. Bu iletişim kuralı Astyanax toplum için ve ötesinde geniş bir kaynak olarak hizmet verebilir umulmaktadır.
Introduction
İn situ hibridizasyon gen ifade desenleri1görselleştirmek için sabit dokular boyama için yaygın bir yöntemdir. Bu teknik için diğer geleneksel2 ve geleneksel olmayan3 model sistemleri, yıllardır biyolojik çalışmalar çeşitli yapıldı. Ancak, birkaç adım ve Kimyasalları başarıyla bu yordamı gerçekleştirmek gereklidir. Hiç bu teknik yapmadıysanız müfettişler için işlemini Başlatan birçok adımları nedeniyle korkutabilir. Ayrıca, bu yordamı uzun doğası ile ilgili sorun giderme için zorlu teknik hatalar için oldukça rahat.
Bu makalede genel amacı bu hibridizasyon teknik geniş bir kitleye için erişilebilir hale getirecek bir basit ve kolay yöntem sunmaktır. Giriş hataları azaltmak için yüksek kaliteli gen ifade boyama verimleri ve non-spesifik arka sinyal en aza indirir basit bir yaklaşım sunuyoruz. Bu yordamı diğer yaklaşımlar Danio rerio4gibi geleneksel modeli sistemlerde gelişmiş benzer. Burada, dikkatli dikkatli uygulama Protokolü'nün tanıtmak için indirilebilir bir kontrol listesi (ek dosya 1) kullanarak her adım uygulanması kolaylaştırmak hedefliyoruz. Bunu yapmak için gerekçe bu yordamda birçok adımlar ile organizasyon kolaylaştırmaktır. Bu makalede araştırmacılar embriyo geliştirilmesinde bütün-mount In situ hibridizasyon gerçekleştirmede baktılar için uygundur, ancak henüz işlem yapmamış. Astyanax araştırmacılar için seçilen yaklaşımı bu test edilmiş ve kanıtlanmış cavefish ve yüzey balık morphs, böylece karşılaştırmalı ifade analizleri kolaylaştırmak avantajdır. Astyanax ve diğer sistemlerde çalışmalarda araştırmacılar tarafından sunulan yöntem kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Cincinnati Üniversitesi (iletişim kuralı #10-01-21-01) tarafından onaylanmış olması.
1. fiksasyon
- İstediğiniz bir üreme tanktan Astyanax mexicanus embriyo sayısını belirleyip ~ 50 embriyo teker teker çözmek. Embriyo büyük ve eski ise, 25 hatta fiksasyon sağlamak için teker teker düzeltmek gerekli olabilir.
- Embriyo yaş bağlı olarak, anestezi IACUC onaylı yöntemi kullanmaktadır. İşleyen bir sinir sistemi ile büyük embriyolar için embriyo anestezik aşırı doz ile kurban. Buna göre ağrı ve rahatsızlık organizma için en aza indirmek için ~ %1 tricaine (pH 7.4 arabelleğe alınmış) bir çözümde embriyo yerleştirin.
- Embriyo dokunmak yanıt vermeyen bir kez, sistem su tricaine içeren değiştirin ve ~ 1 mL 1 x fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS, pH 7,4) ekleyin.
- PBS çözümü kaldırmak ve 1 mL % 4 paraformaldehyde (PFA) ekleyin. Embriyo gecede 4 ° C'de düzeltmek
Dikkat: PFA (yani, yanıcı ve bir deri ve akciğer tahriş edici) tehlikeli, dikkatli.
2. su kaybı
- Embriyo kurutmak için sabitleştirici çözüm kaldırın ve PBS 1 mL ile durulayın. Embriyo içeren şişeleri (30 ° ve 45 °) arasında bir açı üzerinde platform Çalkalayıcı durulama sırasında yerleştirin. Embriyo iki kez, 5 min başına yıkama yıkamak devam edin.
- Embriyo bir koryon hala varsa, tüm 50 embriyo bir 100 x 25 mm Petri kabına yerleştirin ve dikkatle onları--dan mikroskop altında saatçi'nın forseps (örneğin, #5 forseps) iki kümesi kullanarak chorions izole.
Not: aşağıda ve protokol kalanında açıklanan adımları sırasında dikkatli bir şekilde temiz kullanarak önceki adımda tüm sıvı çıkarın, cam Pasteur Pipetler sonraki çözüm eklemeden önce - Aşağıda açıklanan metanol (MeOH) giderek yoğun yıkar bir dizi embriyo kurutmak. Dilutions çözümün her 4 mL cam şişe gidiş 500 µL olan bir 1 mL toplam birim temel alır. Bütün dehidratasyon adımları, oda sıcaklığında (RT) platform Çalkalayıcı üzerinde gerçekleştirin.
- PBS çözüm dikkatli bir şekilde çıkarın. (MeOH 250 µL) + PBS 750 µL % 25 MeOH çözüm ekleyin. Yavaşça 5 min için bir platform shaker sallamayın.
- % 25 MeOH çözüm dikkatli bir şekilde çıkarın. (MeOH 500 µL) + PBS 500 µL % 50 MeOH çözüm ekleyin. Yavaşça 5 min için bir platform shaker sallamayın.
- % 50 MeOH çözüm dikkatli bir şekilde çıkarın. (MeOH 750 µL) + PBS 250 µL % 75 MeOH çözüm ekleyin. Yavaşça bir platform üzerinde 5 dakika sallayıcı.
- % 75 MeOH çözüm dikkatli bir şekilde çıkarın. % 100 MeOH çözüm (MeOH 1 mL) ekleyin. 5 dk. bu adım 3 kez tekrar için bir platform Çalkalayıcı üzerinde yavaşça salla.
- Bu noktada, susuz embriyolar, gerektiğinde, kendi cam şişeleri-20 ° c (uzun vadeli) depolar. Alternatif olarak, doğrudan iletişim kuralı için 1 gün devam edin.
3. gün 1: sıvı
- -20 ° C dondurucudan susuz embriyo elde etmek (ya da doğrudan adım 2.5 devam edin).
- Pasteur pipet kullanarak embriyo sıralayın. Bir temel alınarak morphotype (yani, mağara ve/veya yüzey) sıralayabilirsiniz ve gen sayısı her deneyde değerlendirildi. Genellikle en fazla 12 embriyo bir kez sıralı şişe başına vardır. Kuruluş korumak için renkli laboratuvar bant şişeleri ve her gen Pipetler belirtmek için kullanırsınız. Embriyo aynı şişeyi tüm iletişim kuralı boyunca kalır.
Not: Yer % 100 Pasteur pipet ucu arasına sterilize etmek için alkol kullanır. - Titreyen bir su banyosu 70 ° c daha sonraki bir adımda kullanılmak üzere ayarla. Dikkatle, şişeleri sıralanmış embriyo MeOH dışarı çizin ve yeni %100 500 µL ile yerine MeOH. Yıkama kısaca (~ 1 dk) platform Çalkalayıcı üzerinde.
- 1 x PBS ara 20 (PBT, aşağıya bakınız) ile artan bir konsantrasyon platform Çalkalayıcı üzerinde embriyo rehydrate. Dilutions 500 µL her şişe gidiş ile 1 mL son seyreltme birim üzerinde temel alır.
- Bir % 25 PBT çözüm (PBT, MeOH 750 µL 250 µL) ekleyin. Yavaşça 5 min için bir platform shaker sallamayın.
- % 25 PBT çözüm dikkatli bir şekilde çıkarın. % 50 PBT çözüm (PBT, MeOH 500 µL 500 µL) ekleyin. Yavaşça 5 min için bir platform shaker sallamayın.
- % 50 PBT çözüm dikkatli bir şekilde çıkarın. % 75 PBT çözüm (PBT, MeOH 250 µL 750 µL) ekleyin. Yavaşça 5 min için bir platform shaker sallamayın.
- % 75 PBT çözüm dikkatli bir şekilde çıkarın. % 100 PBT çözüm (PBT 1 mL) ekleyin. 5 dk. bu adım 3 kez tekrar için bir platform Çalkalayıcı üzerinde yavaşça salla.
4. gün 1: Sindirim ve fiksasyon
- Bir İndinavir K (PK) çözüm PBT 2 mL için PK (20 mg/mL) 1 µL ekleyerek hazırlayın.
- Sonraki adımları beklentisiyle hibridizasyon arabellekleri (Hyb - ve Hyb, ek dosya 2 ve ek dosya 3bkz: +;) ve İngiltere'de yılın donmuş aliquots-20 ° C depolama ortamından elde etmek.
- PFA RT. çözülme izin
- Aliquots Hyb ve Hyb + dönen bir 70 ° C su banyosunda yerleştirin. Tüm reaktifler ve şişeleri küçük bir "conta" ile bir kafes alt içinde yüzen su banyosu aparatı içine yerleştirin. Bu basit toplama ve tüpler ve şişeleri dönen 70 ° C su banyosu dan kaldırılmasını sağlar.
- Yavaşça PK eriyik-e doğru tüm dokularda sağlanması embriyo vial(s) tamamen çözümü ile kaplı ekleyin. PK çalışma çözüm platform Çalkalayıcı üzerinde ~ 12 min için embriyo sindirmek.
Not: Sindirim uzunluğu en uygun sonuçlar sağlamak için araştırmacı tarafından değiştirilebilir. - Yavaşça PK çözüm çizmek ve kısa bir süre kalan herhangi bir PK. sulandırmak için PBT ile şişe sel
- PBT çözüm çizmek ve yeni PBT 500 µL ile değiştirin. Platform Çalkalayıcı 5 min için durulama çözüm sağlar.
- PBT çizmek ve çözdürülen %4 500 µL ile yerine İngiltere'de yılın. Platform Çalkalayıcı RT., üzerinde 20 dk için kuluçkaya embriyo izin
- %4 off çizmek PFA ve kısa bir süre kalan herhangi bir PFA sulandırmak için PBT ile şişe su basması. PBT çizmek ve taze PBT 500 µL ile değiştirin. Embriyo platform Çalkalayıcı üzerinde 5 min için durulama izin. Bu 4 kez daha tekrarlayın.
5. gün 1: Prehybridization
- Şişeyi içine Önceden ısıtılmış Hyb çözüm yer 500 µL. Dikkatle şişe, sallayarak için 5 dk 70 ° C su banyosu (içinde contalar) olmadan yerleştirin.
- Hyb çözüm çizmek ve flakon 500 µL Önceden ısıtılmış Hyb + çözüm ile su basması. Şişe (40 d/d) sallayarak ile 70 ° C su banyosu geri yerleştirin. Ya 4 h için kuluçkaya, veya bir gece.
Not: 4 h kuluçka için toplam 4 gün sürecek bir yerinde iletişim verecektir. Burada, bu adımı Toplam 5 gün süren bir protokol ortaya çıkarır bir gecede kuluçka olarak sunulur.
6. gün 2: hibridizasyon
- Bir aliquot Hyb + 5 min için titreyen sıcak su banyosu-20 ° C dondurucudan yerleştirin.
- Hyb + şişe çizmek ve Önceden ısıtılmış Hyb + 500 µL ile değiştirin. Bu, dikkatle RNA inceleyebilirsek 2 µL her şişe ekleyin. Yavaşça sonda eşit dağılımı sağlamak için şişe girdap.
- 70 ° C sıcak su banyosu Hyb + (ile eklenen sonda) çözümde gecede 40 rpm'de sallayarak süre kuluçkaya.
Not: Bir Hyb + (soruşturma ile) çözüm yeniden kullanabilirsiniz. Bunun için Hyb + sonda ile ilk 5 dk. Değiştir Hyb + 1 günden bir sıcak su banyosu içinde Hyb + ile sonda ile protokol ve gecede sıcak su banyosunda kuluçka izin-20 ° C-dondurucu ve yer çalışma almak.
7. gün 3: Çözüm hazırlık
- HYB + "gen ilgi" RNA sonda ile etiketli microcentrifuge tüpleri hazırlayın. 3 gün boyunca kullanılacak olan dilutions serisi hazırlayın.
- 6 ayrı borular kullanarak, dilutions Hyb ve serum sodyum sitrat (SSC, 0-%100) aşağıdaki bir dizi hazırlamak bir 1 mL hacmi ve yer onları sallayarak 70 ° c su banyosu: tüp 1 = %100 Hyb-(Hyb-1 mL): tüp 2 = %25 2 x SSC (2 250 µL x SSC, Hyb-750 µL); 3 = %50 2 x SSC tüp (2 x SSC, Hyb-500 µL 500 µL); 4 = %75 2 x SSC tüp (2 x SSC, Hyb-250 µL 750 µL); 5 = %100 2 x SSC (2 x SSC 1 mL); tüp 6 = %100 0.2 x SSC (0.2 x SSC 2 mL) tüp.
Not: 0,2 için 2 x değiştikçe SSC, konsantrasyon uyanık olmak x. - 4 kullanarak ayrı tüpler 1 mL hacminde PBT ve SSC dilutions aşağıdaki bir dizi hazırlamak ve yerleştirin RT: tüp 1 = %25 PBT (PBT, 0.2 750 µL 250 µL x SSC); 2 = %50 PBT tüp (PBT, 0.2 x SSC 500 µL 500 µL); 3 = %75 PBT tüp (PBT, 0.2 x SSC 250 µL 750 µL); 4 = %100 PBT (PBT 1 mL) tüp.
- Maleik asit tampon ara 20 (MABT) çalışma solüsyon içeren 2 mL ile bir tüp hazırlayın.
- Çözüm engelleme iki 15 mL konik tüp hazırlayın. Her tüpün engelleme reaktif 0.2 g MABT 10 mL için eklemek (bkz. ek dosya 4). Çözüm (en çok 3 saat) içinde tamamen çözülmüş kadar her iki tüpler nutating Mikser (veya platform çalkalayıcı) yerleştirin.
- 6 ayrı borular kullanarak, dilutions Hyb ve serum sodyum sitrat (SSC, 0-%100) aşağıdaki bir dizi hazırlamak bir 1 mL hacmi ve yer onları sallayarak 70 ° c su banyosu: tüp 1 = %100 Hyb-(Hyb-1 mL): tüp 2 = %25 2 x SSC (2 250 µL x SSC, Hyb-750 µL); 3 = %50 2 x SSC tüp (2 x SSC, Hyb-500 µL 500 µL); 4 = %75 2 x SSC tüp (2 x SSC, Hyb-250 µL 750 µL); 5 = %100 2 x SSC (2 x SSC 1 mL); tüp 6 = %100 0.2 x SSC (0.2 x SSC 2 mL) tüp.
8. gün 3: Sonda kaldırma
- Bir cam Pasteur pipet ile çözüm Hyb + (soruşturma ile) kapalı çizmek ve microcentrifuge tüp etiketli bir steril yerleştirin. (Sonda etiketleme başarılı olursa) bu tüp-20 ° C-dondurucu ileride kullanmak üzere saklayın.
- Dikkatle sıcak SSC/Hyb-(aşağıda belirtilen) dilutions 500 µL ekleyin. Her 10 min her 70 ° C sallayarak su banyosu için aşağıdaki çözümleri kuluçkaya.
- %100 ile sırayla kuluçkaya Hyb-(Hyb-1 mL), %25 2 x SSC (2 250 µL x SSC, Hyb-750 µL), %50 2 x SSC (2 500 µL x SSC, Hyb-500 µL), %75 2 x SSC (750 µL 2 x SSC, Hyb-250 µL), %100 2 x SSC (2 1 mL x SSC) , %100 0.2 x SSC (0.2 2 mL x SSC).
- Son adım, her 10 min için aşağıdaki çözümleri kuluçkaya. Tüm aşağıdaki incubations platform Çalkalayıcı RT yerini al: % 25 PBT (PBT, 0.2 750 µL 250 µL x SSC), %50 PBT (PBT, 0.2 500 µL 500 µL x SSC), %75 PBT (PBT, 0.2 250 µL 750 µL x SSC) , % 100 PBT (PBT 1 mL).
- %100 10 dk kuluçka sonra kaldırmak PBT ve MABT 500 µL her şişe içine ekleyin. İki kez 5 min için bu adımı yineleyin.
9. gün 3: engelleme
- MABT her flakon ve sel premix engelleme çözüm birinden (7.1.4 adımda hazırlanan) tüpler ile kaldırın. RT ~ 4 h için nutating Mikser şişe yerleştirin
- 2 ekleyin DIG-AP Fab µL parçaları 10 mL (7.1.4 adımda hazırlanan) çözüm ve kısaca girdap engelleme ikinci şişe.
- Her şişe neredeyse tamamen çözüm (~ 5 mL) engelleme ile doldurun ve nutating Mikser gecede 4 ° C'de buzdolabında yerleştirin
10. gün 4: MABT durular
- MABT % 10 normal keçi serum (NGS) hisse senedi bir şişe hazırlamak (100 µL NGS MABT 900 µL için ekleyin).
- Her şişe engelleme çözümde kapalı çizip 500 µL NGS/MABT karışımı her şişe ekleyebilirsiniz. RT platform Çalkalayıcı tarih itibariyle 25 min için kuluçkaya embriyo izin.
- NGS/MABT karışımı ile %100 500 µL yerine MABT. RT platform Çalkalayıcı tarih itibariyle 30 dk için kuluçkaya. Bu durulama 11 kez daha gün her 30 dk boyunca gerçekleştirin.
- %100 MABT ve bir nutating Mikser geceleme bir buzdolabı veya Walk Odası 4 ° C'de yer ile şişe doldurun
11. 5. gün: Sonda görselleştirme
- Alkalen fosfataz (AP) arabelleği 50 mL aliquot hazırlamak (bkz ek dosya 5). Aşağıda ışık pozlama sınırlamak için alüminyum folyo sarılı bir 50 mL konik tüp, birleştirmek: 1 M Tris (pH 9,5), 50 mm MgCl2, % 1 5 mL 5 mL 5 mL ara 20, 1 M NaCl, ddH2O 30 mL 5 mL.
- MABT kaldırın ve 1 mL AP arabelleği (folyo sarılı tüp) ile değiştirin. Bırak için 5 dakika yıkayın. İki kez MABT tümüyle kaldırılmasını sağlamak için bunu.
- AP arabellek kaldırmak ve AP önbellekle 3,5 μL 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate (BCIP) ve 4.5 ile 1 mL yerine μL nitro-mavi tetrazolium (NBT). Her saat kadar reaksiyon tamamlandıktan sonra taze hazırlanmış AP arabellek/NBT/BCIP ile değiştirin. Yakından, her elde boyama istenen seviyeye kadar gerçekleşmesi renklendirme tepki izin vermek için 15dk, kontrol izleriz. Çökelti forma başlıyorsa, çözüm er değiştirin.
- Sinyal (ile arka plan boyama en az miktarlarda) en uygun düzeyde elde kadar renklendirme tepki, 5 dk. devam durular PBT için taze % 100 AP arabelleği (olmadan NBT/BCIP) embriyo durulama tarafından durdurmak. PBT AP arabelleği dilutions aşağıdaki gibi artan numuneler durulama devam: % 25 PBT (PBT, AP arabelleği 750 μL 250 μL), durulama için 5 min; % 50 PBT (PBT, AP arabelleği 500 μL 500 μL), durulama için 5 min; % 75 PBT (PBT, AP arabelleği 250 μL 750 μL), durulama için 5 dak.
- Embriyo üzerinde en az arka plan boyama istenilen kadar nutating Mikser PBT ulaştı % 100 ~ 5 mL durulayın. Dışarı birkaç kez ile taze PBT geçiş. Bu birkaç gün sürebilir.
- Durulama bir platform Çalkalayıcı steril PBS 500 μL eksiksiz, yıkama embriyo olduğunda. Bu durulama iki kez 5 min için gerçekleştirin. PBS yıkar sonra numune %4 500 μL içinde sonrası tamir PFA RT bir platform Çalkalayıcı üzerinde 1 h için. Alternatif olarak, bir gecede 1 mL % 4 saptamak PFA 4 ° C'de buzdolabında
- Sabitleştirici taze ile yerine steril PBS. Bu durulama için en az iki kez 5 dk. yer embriyo ~ 4 mL % 100 steril PBS gerçekleştirmek ve uzun vadeli 4 ° C'de depolayın
12. görüntüleme
- Görüntüleme bir tabak içinde bir petri %3 özel ve TAE arabellek kullanarak oluşturur.
Not: Miktarları kaç tabak ihtiyaç vardır göre değişir. Tabak birkaç kez yeniden kullanılabilir. Bu jel bir depresyon için plaka üzerinde embriyo içeren oluşturmak için soğutma ise sığ bir dikdörtgen kalıp kabında yerleştirilir önerilir. - Embriyo PBS plaka üzerine yerleştirin.
Not: Hafifçe embriyo yerine onları pipetting onlar plastik Pipetler içeriye doğru sopa bulundu çünkü plaka üzerine dökmek en iyisidir. - Işık mikroskobu her embriyo görselleştirmek için kullanın. Künt bir sonda embriyoların istenen konuma manevra için kullanın.
- Embriyo istenen konuma geldiğinde fotoðraf. Not tamamlanmış boyama leke potansiyel bozulma önlemek için birkaç hafta içinde embriyo görüntülerini almak önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu raporda, biz yüksek kaliteli gen ifade analizi için embriyonik Astyanax örneklerin etiketleme gerçekleştirmek için basit ve kolay bir yaklaşım sağlar. Bu teknik dört ya da beş gün içinde yürütülen olabilir ve yordamı asıl her adımda bir renk kodlu akış (şekil 1) temsil edilir. Bir kez tam, lekeli embriyo ilgi belirli gen ifade dokularda koyu mor renk etiket liman. Biz başarıyla bu protokole Pachón cavefish (şekil 2A-B, E) ve yüzey balık (şekil 2C-D, F) embriyo hayata geçirdik.
Cavefish embriyo iki transkripsiyon faktörleri için bu etiket erken nöral crest doku, Sox9 ve Tfap2a5,6lekeli. Sox9 ifade için etiketli embriyolar etiketleme net gelişmekte olan bransiyal kemerler ve göğüs fin (sarı ok uçları, şekil 2A) göstermektedir. Boyama hemen hemen yok olduğunu unutmayın sarısı sac veya gelişmekte olan somites (şekil 2A) kanatta. Benzer şekilde, Tfap2a ifade erken geçiş nöral crest hücreler (şekil 2B, ok ucu) embriyonun dorsal kanat bölgesi boyunca yanı sıra gelişmekte olan baş kısımları açıktır. Cavefish embriyo için sunulan üçüncü temsilcisi gene Phf20a, bir işaretleyici osteoblast farklılaşma7var. Somitic mesoderm ve kemik doku (şekil 2E, ok uçları) ortaya çıkmasına mukadder olan posterior başın bölümlerinde olumlu boyama unutmayın.
Yüzey balık embriyo, CXCR, Adcyap1ave Sox10için gen probed. CXCR CXC kemokinler8bağlar bir G-protein membran bağlı reseptör kodlar. Pozitif etiketleme baş ve kanat (şekil 2F, ok uçları) yanı sıra sarısı sac örten bir kaç tek tek hücreleri izole bölgelerinde bulunur. Gen polipeptid adenilat cyclase harekete geçirmek, Adcyap1a, merkezi sinir sistemi, hipofiz hücreleri de dahil olmak üzere, bölgelerinde ifade edilir. Not embriyo hücreleri eşleştirilmiş, ikili kümelerinde dorsal yönü üzerinde ifade çok özel; orta hat ifade (şekil 2C, ok uçları) daha büyük bölgesinin yanı sıra. Son olarak, biz hangi etiketleri erken nöral arması ve oligodendrocyte hücreleri10 Sox10, transkripsiyon faktörü ifade mevcut. Çok özel pozitif boyama, erken bir işaretleyici nöral Crest sol ve sağ tarafında dorsal embriyo (şekil 2B, ok uçları) belirgindir.
Biz diğer müfettişler karşılaşabileceğiniz karıştırıcı sorunlar iki tür mevcut. Bir düzenli olarak karşılaştığı ilk konudur non-spesifik etiketleme punctate lekeleri. Bu lekeleri çökelti son MABT durular veya AP arabellek renklendirme reaksiyonlar sırasında ortaya çıkabilir. Bu etiketleme non-spesifik bir örnek sarısı sac Pnp4aifade için lekeli bir yüzey balık embriyo üzerinde belirgindir. Bu gen bir enzim (pürin nükleozit phosphorylase) üretim yanardöner pigmentasyon11kolaylaştıran kodlar. Bu gen ilk gelişmekte olan göz ve yüzme kesesi açıkça anlaşılmaktadır. Punctate lekeleri yüzey birkaç numune (şekil 3A), gözlenen sık yıkama ve AP tampon + NBT/BCIP yerine (şekil 3B) protokolünün son aşamasında tarafından elendi. Bir düzenli olarak karşılaştığı ikinci bir konu aksi halde ayrı ifade deseninin üretecektir genler diffüz, büyük ölçüde özel ifadesidir. Kromojen numune (şekil 3 c) mevcut seviyesinin düşük ile büyük ölçüde yaygın bir desen olarak görünen BMP4, gene bir örnektir. Bu gibi durumlarda, biz genellikle genin farklı bir bölgeyi belirlemek, bir vektör yükseltmek ve yeni bir sonda sentez gerçekleştirme (bkz. ek dosya 6). Bir denetim (hiçbir soruşturma) örnek (şekil 3D) örneği başarısız bizim BMP4 sonda yaygın ve belirsiz doğası göstermek için sağlanmıştır.
Şekil 1: Bütün-mount In situ hibridizasyon için basit bir akış çizelgesi. Bu akış çizelgesi In situ hibridizasyon asıl adımları göstermek için renk kodlaması kullanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Mağara ve Astyanaxyüzey morphs kullanarak altı genler için temsilcisi boyama. (A)görüntü gösterir belirli (sarı ok) Sox9 72 h sonrası döllenme (hpf) hemen yan tarafında, boyama Pachón cavefish (45 x). Tfap2a bir 36 hemen yan tarafında belirgin olduğu için (B) özel boyama hpf Pachón cavefish (45 x). (C) Bilateral ve orta hat (sarı ok uçları) Adcyap1a boyama 72 hpf yüzey balık (100 x) dorsal bölgede etiketlenir. Sox10 nöral crest dokularda 24 hpf yüzey balık (100 x), (D) Staining. (E) Phf20a dorsal bölge ifadede bir 24 zayıf ama açık, desenini gösterir hpf Pachón cavefish (100 x). (F) sitokin reseptör, CXCR, 24 hpf yüzey balık (100 x) hemen yan tarafında farklı bölgelerde ifade edilir. Ölçek çubukları içinde A, B, E, F = 0.5 mm; ölçek çubukları C, D = 2,5 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Bütün-mount In situ hibridizasyon için alt-optimal sonuçlar temsilcisi örnekleri. (A)özel boyama belirgindir yanında non-spesifik çökelti ve/veya enkaz (kırmızı ok ucu) 72 saatlik sağ yanal yönü üzerinde hpf Pachón cavefish (100 x). (B) A görselleştirildiği aynı prob, aynı boyama tasvir eden desenler çökelti veya arka planda bir 72 olmadan hpf Pachón cavefish (100 x). (C) bir 72 sağ yanal kanadını hpf Pachón cavefish gösterir diffüz, non-spesifik BMP4 için 45 x büyütme oranında boyama. (D) A 72 hpf Pachón cavefish tabi bu Protokolü ' sonda (45 x) ek olmadan. Ölçek çubukları 0.5 mm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bozulması için RNA açığı nedeniyle iletişim kuralındaki en önemli adımlardan biri RNA prob steril sentezi ile ilgili. Bir sonda dikkatli bir şekilde oluşturulur ve iyi sonuçlar sağlar, ancak, bu sonraki boyama reaksiyonlar yeniden kullanılabilir. İkinci önemli bir adım boyunca protokolünün kullanılan tüm reaktifler dikkatli yapımıdır. Bu iletişim kuralı birkaç gün ve birçok küçük adımlar gerektirdiğinden, bu önemlidir tüm reaktifler doğru vardır üretilen ve steril bir şekilde depolanır. Ayrıca, araştırmacı iletişim kuralında her adımı dikkatli izini tutar temelde önemlidir. Biz adım sağlanan denetim listesini bu iletişim kuralı her yönüyle doğru ve hassas tamamlanması sağlamada son derece yararlı olabilir bulduk.
Biz sık sık biz burada sunulan iletişim kuralı değiştirin. Ancak, müfettişler soruşturma incubations önerilen olanlardan daha farklı sıcaklıklarda gerçekleştirmek (yani, 70 ° C). Hibridizasyon sıcaklıklarda hafif değişiklikler RNA probları bağlayıcı etkisi olacaktır ve bu nedenle, en iyi hibridizasyon sıcaklık arayan olumlu boyama kalitesini etkileyebilir. Sorun giderme ile ilgili olarak, kesinlikle bu madde (ek dosya 1) ile sağlanan denetim listesini kullanmak için diğer araştırmacılar öneririz. Yüksek kalitede boyama sağlanmasında gerekli bir ilk adım kayıttır dikkatli devam ediyoruz. İkinci bir küçük değişiklik önerilen son rengi tepki sallanan olmadan gerçekleştirmek için (örneğin, koymadan bir platform Çalkalayıcı veya nutator). Bunun nedeni düzenli olarak biz muhtemelen AP arabellek eriyik--dan doğar çökelti, üretim dikkat olduğunu. Bu çökelti genellikle koyu bir renge overstains ve punctate (non-spesifik) arka plan üzerinde lekeli doku oluşturur. Bu çökelti üretimini en aza indirmek için hemen her reaksiyon önce sterilize AP arabellek hazır olun. NBT ve BCIP için arabelleği eklendikten sonra daha fazla, bu taze tampon ve NBT/BCIP ile renklendirme Tepki tamamlanıncaya kadar her saat değiştiririz.
Sunulan yöntem için bir sınırlama bir renk leke gen ifade görselleştirme için kullanılmış olmasıdır. Düşük maliyetli ve sadece görselleştirmek için ışık mikroskobu gerektirir beri bu yaklaşım tercih ederim. Eğer bir kantitatif farklılıklar değerlendirilmesinde istekli, onlar bir floresan renklendirme tepki kullanmanızı öneririz. Bu yarı Nefelometri, örneğin, göreli floresan birimleri ifade deneyler arasında karşılaştırılması yoluyla sağlar.
In situ hibridizasyon protokollerde yaygın olarak web12,13, yanı sıra bilimsel yayınlarda mevcuttur. Biz mevcut Protokolü özellikle bizim model sistemi için Astyanax mexicanusgeliştirilmiştir. Birkaç düzine gen ifadesinin leke ve sürekli olarak yüksek kaliteli sonuçlar sağlar hissediyorum bu protokolü kullanmış. Bu protokol önemli bir avantaj öğelerin her adımın bu protokolün doğru tamamlanması sağlarken birden çok görevi gerçekleştirmek için Dedektif etkinleştirmek için adım adım listesi verilmektedir. Umarız bu iletişim kuralı alanında ve ötesinde diğer müfettişler için yararlı bir kaynak olarak hizmet ve bu ortak laboratuvar teknik gelecek keşifler genotip fenotip kör Meksika cavefish içinde bağlantı destek olacak tahmin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar bu makale yararlı yorumlar için brüt laboratuvar üyeleri teşekkür etmek istiyorum. 2017 ve 2018 Christine Cao, Michael müdür, Aki Li ve David Nwankwo dahil olmak üzere, yaz staj sırasında bu iletişim kuralı kullanıldığında dört lise öğrencileri kabul etmek istiyorum. HL 2017 yaz aylarında UC Biyoloji Kök bursu tarafından desteklenmiştir. Bu eser Ulusal Bilim Vakfı (JBG için DEB-1457630) ve ulusal kurumları diş ve Fasiyal araştırma (NIH; gelen hibe tarafından desteklenmiştir JBG için DE025033).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
| Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
| Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
References
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization: Application to neurobiology. , Oxford University Press. Oxford. (1987).
- Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).
- Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression. Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Cheung, M., Briscoe, J. Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9. Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).
- Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development. Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).
- Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3. Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).
- Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways. Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).
- Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3). Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).
- Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).
- Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).
- Monsoro-Burq, A. H. A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).
- Schulz, C. In situ hybridization to Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).
