Summary
Этот протокол позволяет визуализации экспрессии генов в эмбриональных Астианакт cavefish. Этот подход был разработан с целью максимального сигнала выражения гена, минимизируя фон неспецифичный пятнать.
Abstract
В последние годы были освобождены проект генома для слепых мексиканской cavefish (Астианакт гракл), выявление последовательности идентификаторов для тысяч генов. Предыдущие исследования в этой формирующейся системе модель капитализируются на комплексные исследования генома общесистемной, которые выявили многочисленные локусов количественных признаков (QTL) связанные с различных связанных пещера фенотипов. Однако возможность подключения гены интереса к наследственным основы для фенотипические изменения остается серьезной проблемой. Один из методов, которые могут способствовать более глубокое понимание роли развития в эволюции troglomorphic — целое гора в гибридизации situ. Этот метод может быть реализован для непосредственно сравнить экспрессии генов между формами и поверхности местонахождения троглофильных, кандидата генов, лежащие в основе созданной QTL, идентифицировать гены интереса от следующего поколения последовательности исследований или разрабатывать другие подходы, основанные на открытие. В настоящем докладе мы представляем простой протокол, поддерживаемый гибкие контрольный список, который может быть широко адаптирована для использования далеко за рамки представленного исследования системы. Остается надеяться, что этот протокол может служить широкий ресурс для Астианакт сообщества и за его пределами.
Introduction
Гибридизации in situ является распространенным методом для окрашивания фиксированных тканей для визуализации ген выражение модели1. Эта техника была выполнена для лет в других традиционных2 и нетрадиционных3 модели систем, для различных биологических исследований. Однако несколько шагов и реактивы необходимы для успешного выполнения этой процедуры. Для следователей, которые никогда не выполнили эту технику инициирование процесса может быть пугающим из-за многих этапов. Кроме того длительный характер этой процедуры поддается технические ошибки, которые могут быть сложным для устранения неполадок.
Общая цель этой статьи заключается в простой и прямой метод, который будет отображать этот гибридизации метод доступным для широкой аудитории. Чтобы уменьшить введение ошибок, мы представляем простой подход, который дает высокое качество ген выражение окрашивание и минимизирует неспецифической фонового сигнала. Эта процедура похожа на другие подходы, разработанные в традиционной модели систем, таких как данио рерио4. Здесь мы стремимся содействовать тщательного выполнения каждого шага, используя загружаемый контрольный (дополнительный файл 1), для содействия тщательного осуществления протокола. Обоснование этого заключается в содействии Организации через многие этапы этой процедуры. Эта статья подходит для исследователей, заинтересованных в выполнении всего гора гибридизации in situ в развивающихся эмбрионов, но пока еще не выполнили процедуру. Преимущество выбранного подхода для Астианакт исследователей является, что он было проверено и доказано в cavefish и поверхности рыбы морф, способствуя тем самым сравнительного выражения анализа. Представленный метод может использоваться исследователями в исследованиях по Астианакт и других систем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из Университета Цинциннати (протокол #10-01-21-01).
1. Фиксация
- Изолировать желаемое количество эмбрионов Астианакт гракл от разведения танк и исправить ~ 50 эмбрионов за один раз. Если эмбрионов больших и старых, это может быть необходимо исправить 25 одновременно для обеспечения даже фиксации.
- В зависимости от возраста эмбриона используют метод утверждения IACUC анестезии. Для старых эмбрионов с функционирующей нервной системы Пожертвуйте эмбрионов через передозировки анестетика. Соответственно место эмбрионов в растворе tricaine ~ 1% (буфер с рН 7,4), чтобы свести к минимуму боль и дискомфорт для организма.
- После того как эмбрионы не реагирует на ощупь, заменить системы воды, содержащие tricaine и добавьте ~ 1 мл 1 x фосфат амортизированное saline (PBS, рН 7,4).
- Удаление решения PBS и добавьте 1 mL параформальдегида 4% (PFA). Исправить эмбрионов на ночь при 4 ° C.
Предупреждение: PFA опасными (т.е. он легко воспламеняется и кожи и легких раздражитель), обращаться с осторожностью.
2. обезвоживание
- Чтобы обезвоживая эмбрионы, удалите фиксирующие решение и промыть с 1 мл раствора PBS. Место эмбриона содержащих флаконы под углом (между 30° и 45°), на платформе шейкера во время полоскания. Продолжать мыть эмбрионы дважды, 5 мин на мыть.
- Если эмбрионов до сих пор хориона, поместите все 50 эмбрионов в 100 мм x 25 мм Петри и тщательно изолировать их от chorions, с помощью двух наборов часового щипцов (например, #5 щипцы) под микроскопом.
Примечание: Во время действия, описанные ниже и на оставшуюся часть протокола, тщательно удалить все жидкости из предыдущего шага, используя чистый, стекло Пастер пипетки перед добавлением следующее решение - Обезвоживает эмбрионов в серии все более концентрированный моет метанола (метанола) описано ниже. Разведений основаны на суммарный объем 1 мл с 500 мкл раствора, вдаваясь в каждый стакан 4 мл во флаконе. Выполните все обезвоживания при комнатной температуре (RT) на платформе шейкер.
- Осторожно удалите решение PBS. Добавьте 25% раствора метанола (250 мкл метанола) + 750 мкл PBS. Осторожно встряхните в шейкере платформа для 5 мин.
- Осторожно удалите 25% раствора метанола. Добавьте 50% раствора метанола (500 мкл метанола) + 500 мкл PBS. Осторожно встряхните в шейкере платформа для 5 мин.
- Осторожно удалите 50% раствора метанола. Решение добавьте в 75% метанола (750 мкл рабочего раствора метанола) + 250 мкл PBS. Осторожно встряхните в шейкере платформа для 5 минут.
- Осторожно удалите 75% раствора метанола. Добавьте 100% раствора метанола (1 мл метанола). Осторожно встряхните в шейкере платформа для 5 минут повторите этот шаг 3 раза.
- На данный момент магазин обезвоженной эмбрионов, при необходимости, в их стеклянных флаконов при-20 ° C (долгосрочные). Кроме того перейти непосредственно к день 1 протокола.
3. день 1: регидратации
- Получить обезвоженной эмбрионов от-20 ° C морозильной камеры (или перейти непосредственно с шагом 2.5).
- Сортировка эмбрионов, с помощью пипетки Пастера. Один можно сортировать на основе морфотипа (то есть, пещера или поверхности), и количество генов оценку в каждом эксперименте. Есть обычно не более чем 12 эмбрионов на флакон после сортировки. Для поддержания Организации, используйте цветные лаборатории ленту для обозначения флаконов и пипетки для каждого гена. Эмбрионы будут оставаться же флакон на протяжении всего протокола.
Примечание: Место кончиком пипетки Пастера в 100% EtOH стерилизовать его между использует. - Установите пожимая водяной бане до 70 ° C для использования в дальнейшем. Осторожно, вытянуть метанола в флаконах отсортированных эмбрионов и заменить 500 мкл новые 100% метанола. Мыть кратко (~ 1 мин), на платформе шейкер.
- Увлажняет эмбрионов в растущей концентрации ПБС с Tween-20 (PBT, см. ниже) на платформе шейкер. Разведений основаны на томе окончательного растворения 1 мл с 500 мкл, вдаваясь в каждом флаконе.
- Добавьте 25% раствор PBT (250 мкл PBT, 750 мкл метанола). Осторожно встряхните в шейкере платформа для 5 мин.
- Осторожно удалите PBT 25% раствор. Добавьте 50% раствора PBT (500 мкл PBT, 500 мкл метанола). Осторожно встряхните в шейкере платформа для 5 мин.
- Осторожно удалите решение PBT 50%. Добавьте решение PBT 75% (750 мкл PBT, 250 мкл метанола). Осторожно встряхните в шейкере платформа для 5 мин.
- Осторожно удалите решение PBT 75%. Добавьте 100% решение PBT (1 мл PBT). Осторожно встряхните в шейкере платформа для 5 минут повторите этот шаг 3 раза.
4. день 1: Пищеварение и фиксация
- Подготовьте протеиназы K (PK) решение, добавив 1 мкл PK (20 мг/мл) 2 мл PBT.
- В ожидании последующих шагов получите от-20 ° C для хранения замороженных аликвоты гибридизации буферов (Гибнер - и Гибнер +; дополнительный файл 2 и 3 дополнительных файлов) и PFA.
- Разрешить PFA таять на RT.
- Место аликвоты Гибнер - и Гибнер + в ванне с вращающейся водой 70 ° С. Поместите все реагенты и флаконов внутри небольшой «прокладка» с сеткой внизу, внутри плавающей аппарат ванна воды. Это позволяет простое добавление и удаление трубки и флаконы из вращающейся ванну водой 70 ° C.
- Аккуратно добавьте решение PK vial(s) эмбрионы, обеспечивая все ткани полностью покрыты раствором. Дайджест эмбрионов для ~ 12 мин в PK рабочего раствора на платформе шейкера.
Примечание: Длина пищеварение может изменяться следователя для обеспечения оптимальных результатов. - Аккуратно снимать PK решение и кратко наводнение флакона с PBT ослабить любые оставшиеся PK.
- Снимать решения ПБТ и замените 500 мкл новой PBT. Дайте раствору для полоскания на платформе шейкер для 5 мин.
- Снимать ПБТ и заменить 500 мкл талой 4% PFA. Позволить эмбрионов для Проинкубируйте втечение 20 мин на платформе шейкера на RT.
- Рисовать от 4% PFA и кратко наводнений флакона с PBT ослабить любые оставшиеся PFA. Снимать PBT и заменить 500 мкл свежих PBT. Позвольте эмбрионов ополосните в течение 5 мин на платформе шейкера. Повторите этот шаг 4 раза.
5. день 1: Prehybridization
- Место 500 мкл подогретым Гибнер-решения в пробирку. Осторожно поместите ампулу в 70 ° C воды баня (внутри прокладки) без встряхивания, 5 мин.
- Снимать Гибнер решение и наводнений во флаконе с 500 мкл подогретым Гибнер + решение. Поместите ампулу обратно в ванну воды 70 ° C при встряхивании (40 мин). Проинкубируйте либо 4 ч, или на ночь.
Примечание: 4 h инкубации даст полный протокол на месте, который будет длиться в общей сложности 4 суток. Здесь этот шаг представлен как ночь инкубации, который даст протокол продолжительностью 5 дней в общей сложности.
6. день 2: гибридизация
- Место Алиготе Гибнер + от-20 ° C Морозильник в тряску ванну горячей водой на 5 мин.
- Снимать Гибнер + из флакона и замените 500 мкл подогретым Гибнер +. В этот раствор тщательно мкл 2 РНК зонд для каждого флакона. Слегка взболтать флакон для обеспечения равномерного распределения зонда.
- Инкубируйте Гибнер + (с дополнительной зонд) раствор в ванну горячей воды 70 ° C на ночь при встряхивании в 40 об/мин.
Примечание: Один можно повторно использовать Гибнер + (с зондом) решение. Для этого возьмите Гибнер + с зонда от первого запуска от-20 ° C морозильника и место его в ванну горячей воды на 5 мин заменить Гибнер + от дня 1 протокола с Гибнер + с зонда и позволяют инкубации на ночь в ванну с горячей водой.
7. день 3: Подготовка решения
- Подготовьте microcentrifuge трубки помечены Гибнер + с РНК зонд «ген интереса». Подготовьте серию разведений, которые будут использоваться в день 3.
- Использование 6 отдельных труб, подготовьте следующие серии разведений Гибнер - и физиологическим цитрат натрия (SSC, 0-100%) в 1 мл тома и место их в 70 ° C пожимая воды Ванна: трубка 1 = 100% Гибнер-(1 мл Гибнер-): трубки 2 = 25% 2 x SSC (250 мкл 2 x SSC, 750 мкл Гибнер-); Труба 3 = 50% 2 x SSC (2 x SSC, 500 мкл Гибнер - 500 мкл); Трубка SSC 2 x 4 = 75% (2 x SSC, 250 мкл Гибнер - 750 мкл); Трубка 5 = 100% 2 x SSC (1 мл 2 x SSC); Трубка 6 = 100% 0.2 x SSC (2 мл 0,2 x SSC).
Примечание: Будьте бдительны концентрации SSC, как она изменяется от 2 x 0,2 x. - С помощью 4 отдельные трубы, подготовить следующие серии разведений ПБТ и SSC в томе 1 мл и место на RT: трубка 1 = 25% PBT (250 мкл PBT, 750 мкл 0,2 x SSC); Труба 2 = 50% PBT (500 мкл PBT, 500 мкл 0.2 x SSC); Труба 3 = 75% PBT (750 мкл PBT, 250 мкл 0.2 x SSC); Трубка 4 = 100% PBT (1 мл PBT).
- Подготовка трубки с 2 мл буфера малеиновой кислоты, содержащий рабочий раствор 20 анимации (MABT).
- Подготовьте два 15 мл конические трубы блокирования решения. В каждой тюбике, добавить 0,2 г блокировки реагента до 10 мл MABT (см. дополнительные 4 файла). Место обеих трубок на смеситель nutating (или платформы шейкер) до полностью растворяют в растворе (до 3 ч).
- Использование 6 отдельных труб, подготовьте следующие серии разведений Гибнер - и физиологическим цитрат натрия (SSC, 0-100%) в 1 мл тома и место их в 70 ° C пожимая воды Ванна: трубка 1 = 100% Гибнер-(1 мл Гибнер-): трубки 2 = 25% 2 x SSC (250 мкл 2 x SSC, 750 мкл Гибнер-); Труба 3 = 50% 2 x SSC (2 x SSC, 500 мкл Гибнер - 500 мкл); Трубка SSC 2 x 4 = 75% (2 x SSC, 250 мкл Гибнер - 750 мкл); Трубка 5 = 100% 2 x SSC (1 мл 2 x SSC); Трубка 6 = 100% 0.2 x SSC (2 мл 0,2 x SSC).
8. день 3: Удаление зонд
- Снимать Гибнер + (с зондом) решение с стеклянной пипетки Пастера и поместите его в стерильной, помечены пробки microcentrifuge. Сохранить эту трубку в морозильной камере-20 ° C для будущего использования (если зонд маркировки является успешным).
- Тщательно 500 мкл теплый SSC/Гибнер-разведений (указанные ниже). Инкубируйте в каждом из следующих решений для 10 мин на водяной бане пожимая 70 ° C.
- Проинкубируйте последовательно с 100% Гибнер-(1 мл Гибнер-), 25% 2 x SSC (250 мкл 2 x SSC, 750 мкл Гибнер-), 50% 2 x SSC (500 мкл 2 x SSC, 500 мкл Гибнер-), 75% 2 x SSC (750 мкл 2 x SSC, 250 мкл Гибнер-), 100% 2 x SSC (1 мл, 2 x SSC) , 100% 0,2 x SSC (2 мл 0,2 x SSC).
- После последнего шага инкубировать в каждом из следующих решений за 10 мин. Все следующие инкубаций происходят в РТ на платформе шейкера: 25% PBT (250 мкл PBT, 750 мкл 0,2 x SSC), 50% PBT (500 мкл PBT, 500 мкл 0,2 x SSC), 75% PBT (750 мкл PBT, 250 мкл 0,2 x SSC) , 100% PBT (1 мл PBT).
- После 10 минут инкубации, удалите 100% PBT и 500 мкл MABT в каждом флаконе. Повторите этот шаг два раза за 5 мин.
9. день 3: блокирование
- Удалите MABT из каждого флакона и наводнений с готовые блокировки решение одного из трубы (подготовленных на шаге 7.1.4). Флакон место на nutating микшер для ~ 4 h на RT.
- Добавить 2 мкл DIG-AP Fab фрагментов для второй флакон 10 мл, блокирование раствор (готовят на шаге 7.1.4) и кратко вихря.
- Почти полностью заполнить каждый флакон с блокировкой раствор (~ 5 мл) и место на nutating смеситель на ночь в холодильник на 4 ° C.
10. день 4: MABT полоскания
- Подготовка запасов флакон 10% нормальной козьего сыворотки (НГС) в MABT (добавить 100 мкл NGS 900 мкл MABT).
- Снимать блокировки решение в каждом флаконе и 500 мкл NGS/MABT смеси в каждом флаконе. Позвольте эмбрионов для инкубации для 25 мин на RT на платформе шейкера.
- Замените смесь NGS/MABT 500 мкл, 100% MABT. Инкубируйте 30 мин на RT на платформе шейкера. Выполните этот полоскания 11 раз в течение дня каждые 30 мин.
- Заполнить ампулу с 100% MABT и место на nutating смеситель на ночь в холодильник или гардеробная камере при 4 ° C.
11. день 5: Зонд визуализация
- Подготовка 50 мл Алиготе щелочной фосфатазы (AP) буфера (см. дополнительный файл 5). Объединить в 50 мл Конические трубки, завернутые в фольгу для ограничения воздействия света следующее: 5 мл 1 М трис (pH 9.5), 5 мл 50 мм MgCl2, 5 мл 1% Tween-20, 5 мл 1 M NaCl, 30 мл ddH2O.
- Удаление MABT и замените 1 мл буфера AP (труба, завернутый в фольгу). Пусть это мыть за 5 мин. Сделать это дважды, чтобы обеспечить полное удаление MABT.
- Удаление буфера AP и заменить 1 мл AP буфер с 3.5 мкл 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate (ПКВП) и 4,5 мкл нитро голубой tetrazolium (НБТ). Замените свежеприготовленные AP буфера/НБТ/ПКВП, после завершения каждый час до реакции. Следить, проверяя каждые 15 минут, чтобы окраска реакции занять место, пока не был достигнут желаемый уровень пятнать. Если осадок начинает форме, замените решение раньше.
- Остановите окраска реакции, промыв эмбрионы в свежих 100% AP буфера (без НБТ/ПКВП) для полосканий продолжить 5 мин в PBT пока достигнуты оптимальные уровни сигнала (с минимальной суммы окрашивания фона). Продолжать промойте образцов с увеличением разведения ПБТ в буфере AP следующим образом: 25% PBT (250 мкл PBT, 750 мкл буфера AP), ополосните в течение 5 мин; 50% PBT (500 мкл PBT, 500 мкл буфера AP), ополосните в течение 5 мин; 75% PBT (750 мкл PBT, 250 мкл буфера AP), ополосните в течение 5 мин.
- Промойте эмбрионов в ~ 5 мл 100% достигается PBT на nutating миксер, пока желаемый минимальный фон окраски. Переключатель с свежим PBT несколько раз. Это может занять до нескольких дней.
- Полоскание при полной, стирать эмбрионов в 500 мкл стерильных PBS на платформе шейкера. Выполните этот полоскать дважды за 5 мин. После смывки PBS, после исправления образцы в 500 мкл 4% PFA для 1 h на RT на платформе шейкера. Кроме того, исправить на ночь в 1 мл 4% ПФА в холодильнике при температуре 4 ° C.
- Замените фиксатор свежие, стерильные PBS. Выполнить это полоскания по крайней мере дважды в течение 5 минут место эмбрионы в ~ 4 мл стерильного PBS 100% и хранить долгосрочной перспективе при 4 ° C.
12. изображений
- Составляют изображений пластины в чашку Петри, используя 3% агарозном и буфер TAE.
Примечание: Количества зависит сколько пластин необходимы. Плиты могут использоваться несколько раз. Рекомендуется, что мелкой прямоугольной формы помещается в Петри, в то время как охлаждение гель для создания депрессии для содержащего эмбрионы на плите. - Место эмбрионы на плите в PBS.
Примечание: Это лучше осторожно налить эмбрионов на пластину вместо закупорить их, потому что, как было установлено, что они будут придерживаться внутри Пластиковые пипетки. - Используйте световой микроскопии для того, чтобы визуализировать каждый эмбрион. Используйте тупой зонд для маневра эмбрионов в нужное положение.
- Возьмите изображения, когда зародыш в желаемое положение. Обратите внимание, что важно принять изображения эмбрионов в течение пару недель завершенных окрашивания, чтобы избежать потенциальной деградации пятно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В настоящем докладе мы предоставляем простой и прямой подход для выполнения маркировки эмбриональных Астианакт образцов для анализа выражения гена высокого качества. Эта техника может осуществляться в четыре или пять дней, и каждый основной шаг в процедуре представлена в цветную схему (рис. 1). После завершения, окрашенных эмбрионы должны гавани темный фиолетовый хроматической метку в тканях, выражая особую гена интереса. Мы успешно реализовали этот протокол в Pachón cavefish (рис. 2A–B, E) и поверхности рыбы (рис. 2 c–D, F) эмбрионов.
Cavefish эмбрионы были витражи для двух факторов транскрипции что лейбл ранних нейронные крест ткани, Sox9 и Tfap2a5,6. Эмбрионов, помечены для выражения Sox9 свидетельствуют о четкой маркировки в развивающихся жаберных арки и грудной плавник (Желтые стрелки, рис. 2A). Обратите внимание, что окрашивание практически отсутствует в желточного мешка или развивающиеся сегменты на фланге (рис. 2A). Аналогично выражение Tfap2a проявляется в части развивающихся головы, а также раннего нейронные крест миграции клеток (Рисунок 2Б, стрелки) вдоль спинной фланг региона эмбриона. Третий представитель ген представлен для cavefish эмбрионов является Phf20a, маркер из остеобластов дифференциация7. Обратите внимание на положительный пятнать в части somitic мезодермы и задняя головы, что суждено привести к костной ткани (рис. 2е, стрелок).
В поверхности рыбы эмбрионов мы исследовали генов, CXCR, Adcyap1aи Sox10. CXCR кодирует рецептор мембраны прыгните G-белок, который связывает КЭС chemokines8. Позитивные маркировки присутствует в изолированных регионах головы и фланка (Рисунок 2F, стрелки), а также несколько отдельных ячеек, обволакивающие желточного мешка. Ген активации аденилатциклазы полипептид, Adcyap1a, выражается в регионах центральной нервной системы, включая клетки гипофиза. К сведению весьма конкретное выражение в паре, двусторонние кластеры клеток на спинной эмбриона; а также большего региона срединной выражения (рис. 2 c, стрелок). Наконец мы представляем выражением Sox10, транскрипционный фактор которых этикетки ранних нейронные крест и Олигодендроциты клетки10. Весьма специфические положительный пятнать очевидна как маркер начала нейронные крест на левой и правой стороны спинной эмбриона (Рисунок 2D, стрелок).
Мы представляем каждого из двух типов смешанных вопросов, которые могут столкнуться с другими исследователями. Первый вопрос, который периодически встречаются — неспецифичный Этикетировочный пунктата пятнышками. Эти пятна могут возникать как осадок из окончательного полоскания MABT, или AP буфера во время окраски реакций. Пример этой неспецифичный Этикетировочный очевидным желточного мешка поверхности рыбы эмбриона, витражи для выражения Pnp4a. Этот ген кодирует фермент (пуриновых нуклеозидов фосфорилаза), которая облегчает производство радужные пигментации11. Этот ген впервые проявляется в развивающихся глаз и пузырь. Пунктата пятна наблюдаются в некоторых поверхности образцов (Рисунок 3А), были устранены частых стирок и замена буфера AP + НБТ/ПКВП на заключительном этапе протокола (рис. 3B). Второй вопрос, который периодически встречается это диффузного, основном неспецифические экспрессии генов, которые бы в противном случае производят различные выражения. Одним из примеров является ген BMP4, которая появляется в основном диффузным шаблон с низким уровнем хромогена на всей территории образца (рис. 3 c). В таких случаях, мы вообще определить различные области гена, усилить в вектор и выполнить новый синтез зонд (см. дополнительный файл 6). Пример управления (без зонда) образца (рис. 3D) предоставляется для иллюстрации диффузных и неспецифический характер наших неудачных BMP4 зонда.
Рисунок 1: простая блок-схема для всего гора в гибридизации situ. Эта схема использует цветовое кодирование для иллюстрации основных шагов гибридизации in situ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Представитель пятная для шести генов, используя пещеры и поверхности морф Астианакт. (A) изображение показывает специфического окрашивания (Желтые стрелки) из Sox9 на правой боковой стороне 72 ч после оплодотворения (hpf) Pachón cavefish (45 x). (B) специфического окрашивания для Tfap2a является очевидным, на правой боковой стороне 36 hpf Pachón cavefish (45 x). (C) двусторонние и срединной окрашивание (Желтые стрелки) Adcyap1a помечены в регионе спинной 72 hpf поверхности рыбы (100 x). (D) окрашивания Sox10 в тканях нейронные крест 24 hpf поверхности рыбы (100 x). (E) Phf20a демонстрируется шаблон слабый, но ясно, выражения в регионе спинной 24 hpf Pachón cavefish (100 x). (F) цитокина рецепторов, CXCR, выражается в отдельных регионах, правой боковой стороне 24 hpf поверхности рыбы (100 x). Масштаб-баров в, B, E, F = 0,5 мм; масштаб баров в C, D = 2,5 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: показательные примеры югу оптимальных результатов для всего гора в гибридизации situ. (A) специфического окрашивания проявляется рядом неспецифических преципитата и/или мусора (красная стрелка) на правой боковой стороне 72 hpf Pachón cavefish (100 x). (B) же зонд, визуализируется в A, изображающие же окрашивания моделей без осадка или фон в 72 hpf Pachón cavefish (100 x). (C) правой боковой фланг 72 hpf Pachón cavefish демонстрирует диффузного, неспецифичный пятнать для BMP4 на 45 крат. (D) 72 hpf Pachón cavefish подвергали этот протокол, без добавления зонд (45 x). Масштаб баров = 0.5 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ввиду уязвимости РНК к деградации одним из наиболее важных шагов в протокол касается стерильных синтез РНК зонда. Однако если зонд тщательно создается и дает хорошие результаты, то могут использоваться в последующих реакций окрашивания. Вторым важным шагом является тщательное производство всех реактивы, используемые в протоколе. Поскольку этот протокол включает в себя несколько дней и многие небольшие шаги, важно, что все реагенты, точно производятся и хранятся в виде стерильного. Кроме того принципиально важно, что следователь продолжает внимательно отслеживать каждый шаг в протоколе. Мы нашли, что предлагаемый контрольный список шагов может быть чрезвычайно полезным в обеспечении точной и достоверной завершения каждого аспекта настоящего Протокола.
Часто мы не изменить протокол, который мы представили здесь. Однако, следователи могут выполнять зонд инкубаций при различных температурах, чем те, которые предложил (т.е., 70 ° C). Незначительные изменения в гибридизации температуры повлияет на связывание РНК зондов, и таким образом, ищет оптимальный гибридизации температура может положительно повлиять на качество окрашивания. Что касается устранения неполадок, мы настоятельно призываем другие следователи использовать контрольный список, описываемых в этой статье (дополнительный файл 1). Ведение тщательного records является необходимым первым шагом в обеспечении высокого качества окрашивания. Второй незначительные изменения предлагается для выполнения окончательной окраски реакции без качания (например, без размещения на платформе шейкер или nutator). Причина этого заключается, что периодически мы отмечаем производства осадок, который предположительно возникает от AP буферного раствора. Обычно этот преципитат overstains в темный цвет и создает пунктата (неспецифические) фон на окрашенных тканей. Для сведения к минимуму производства этот преципитат, мы готовим стерилизованные AP буфера перед каждой реакции. Кроме того после НБТ и ПКВП были добавлены в буфер, мы заменить его свежим буфер и NBT/ПКВП каждый час до завершения реакции окраской.
Ограничение к представленным методом является, что пятно хроматической используется для визуализации выражения гена. Мы предпочитаем этот подход, поскольку он является экономически эффективным и требует только световой микроскопии для визуализации. Если один были заинтересованы в оценке количественных различий, мы предлагаем, что они используют реакции флуоресцентной окраски. Это даст возможность полу количественный, например, путем сравнения относительной флуоресцентные единиц выражения между экспериментов.
Протоколы для гибридизации in situ доступны широко на веб12,13, а также в научных публикациях. Протокол, который мы представляем был разработан специально для нашей модели системы, Астианакт гракл. Мы использовали этот протокол пятно выражение несколько десятков генов, и чувствую, что она постоянно обеспечивает высокое качество результатов. Значительное преимущество этого протокола является поэтапный контрольный перечень элементов для включения следователь выполнять несколько задач при одновременном обеспечении точной завершения каждого из шагов этого протокола. Мы надеемся, что этот протокол послужит полезным ресурсом для других исследователей в области и за ее пределами и ожидаем, что этот общий метод лаборатория будет оказывать поддержку будущих открытий, связывание генотипа к фенотипу в слепой мексиканской cavefish.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить членов брутто лаборатории за полезные замечания по этой рукописи. Мы хотим отметить четыре учащихся средней школы, которые использовали этот протокол во время летней стажировки в 2017 и 2018, включая Christine Цао, Майкл Уорден, Аки Li и Дэвид Нванкво. HL поддержал UC биологии стволовых стипендий в течение лета 2017. Эта работа была поддержана субсидии от национального научного фонда (DEB-1457630 до JBG) и национальные институты стоматологических и челюстно-лицевой исследований (низ; DE025033 для JBG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
| Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
| Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
References
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization: Application to neurobiology. , Oxford University Press. Oxford. (1987).
- Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).
- Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression. Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Cheung, M., Briscoe, J. Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9. Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).
- Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development. Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).
- Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3. Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).
- Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways. Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).
- Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3). Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).
- Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).
- Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).
- Monsoro-Burq, A. H. A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).
- Schulz, C. In situ hybridization to Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).
