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Developmental Biology

阿斯蒂亚纳克斯胚胎的全原位杂交

doi: 10.3791/59114 Published: March 2, 2019

Summary

该方案使胚胎阿斯蒂亚纳克斯的基因表达可视化。这种方法的发展目标是最大限度地提高基因表达信号, 同时最大限度地减少非特异性背景染色。

Abstract

近年来, 墨西哥盲人的基因组草案已经发布, 揭示了数千个基因的序列特征。此前对这一新兴模型系统的研究利用了全基因组的全面研究, 这些研究已经确定了许多与各种洞穴相关表型相关的定量性状位点 (qtl)。然而, 将感兴趣的基因与表型变化的遗传基础联系起来的能力仍然是一个重大的挑战。一种能够促进更深入地了解发育在多态进化中的作用的技术是全安装原位杂交。这项技术可以用来直接比较洞穴和地表居住形式之间的基因表达, 提名已建立的 qtl 基础的候选基因, 从下一代测序研究中识别感兴趣的基因, 或开发其他基因基于发现的方法。在本报告中, 我们提出了一个简单的协议, 并得到了灵活的清单的支持, 可以广泛适应, 远远超出所提出的研究系统。希望该议定书能够成为Astyanax社区内外的广泛资源。

Introduction

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原位杂交是染色固定组织的常用方法, 可直观地显示基因表达模式1。这项技术已在其他传统的2和非传统3型模型系统中进行多年, 用于各种生物研究。但是, 要成功执行此过程, 需要执行几个步骤和试剂。对于从未使用过这种技术的调查人员来说, 由于涉及许多步骤, 启动这一过程可能会令人望而生畏。此外, 此过程的冗长性质可能会导致技术错误, 而对故障排除可能会很有挑战性。

本文的总体目标是介绍一种简单而直接的方法, 使这种杂交技术可供广大受众访问。为了减少错误的引入, 我们提出了一个简单的方法, 产生高质量的基因表达染色, 并最大限度地减少非特异性背景信号。此过程类似于在传统模型系统中开发的其他方法, 如daio rerio 4。在这里, 我们的目标是使用可下载的清单 (补充文件 1) 促进每个步骤的谨慎实施, 以促进协议的谨慎实施。这样做的理由是通过这一程序所涉及的许多步骤为组织提供便利。本文适用于有兴趣在胚胎发育过程中进行全安装原位杂交的研究人员, 但尚未进行该程序。对于Astyanax研究人员来说, 所选择的方法的优点是, 它已在紫鱼和表面鱼类形态中进行了测试和验证, 从而有助于比较表达分析。该方法可供研究人员在阿斯蒂亚纳克斯等系统的研究中使用。

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Protocol

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这里描述的所有方法都得到了辛辛那提大学动物护理和使用机构委员会 (《议定书》 #10-01-21-01) 的批准。

1. 固定

  1. 从繁育池中分离所需数量的马尾道胚胎, 一次固定 ~ 50个胚胎。如果胚胎又大又旧, 可能需要一次固定 2 5个, 以确保甚至固定。
  2. 根据胚胎的年龄, 使用 iacu 批准的麻醉方法。对于具有正常神经系统功能的老年胚胎, 通过麻醉过量牺牲胚胎。因此, 将胚胎置于约1% 的滴虫 (缓冲为 ph 7.4) 的溶液中, 以最大限度地减少机体的疼痛和不适。
  3. 一旦胚胎对触摸没有反应, 更换含有旋塞因的系统水, 并添加 ~ 1 毫升的1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs, ph 7.4)。
  4. 除去 pbs 溶液, 加入1毫升的4% 甲醛 (pfa)。在4°c 下隔夜修复胚胎。
    注意: pfa 是危险的 (即, 它是易燃的, 是皮肤和肺刺激物), 小心处理。

2. 脱水

  1. 要使胚胎脱水, 请去除固定溶液, 然后用1毫升的 pbs 冲洗。在冲洗过程中, 将含有胚胎的小瓶放在平台振动台上, 角度 (在30°至45°之间)。继续清洗胚胎两次, 每次清洗5分钟。
  2. 如果胚胎仍有绒毛膜, 将所有50个胚胎放入100毫米 x25 毫米 petri 培养皿中, 并在显微镜下使用两套守望者的钳子 (例如, #5 钳子) 将它们从绒毛膜中仔细分离。
    注: 在下面描述的步骤中, 在协议的其余部分, 使用干净的玻璃巴斯德移液器小心去除上一步中的所有液体, 然后再添加下一个解决方案
  3. 在下面描述的一系列日益浓缩的甲醇 (meoh) 中使胚胎脱水。稀释的基础是1毫升的总体积, 每4毫升玻璃小瓶中的溶液为500μl。在平台振动台上的室温 (rt) 下执行所有脱水步骤。
    1. 小心删除 pbs 解决方案。加入25% 的 meoh 溶液 (25μl 的 meoh + 750μl 的 pbs)。轻轻摇晃在平台振动台上5分钟。
    2. 小心去除25% 的 meoh 溶液。加入50% 的 meoh 溶液 (500μl 的 meoh + 500μl 的 pbs)。轻轻摇晃在平台振动台上5分钟。
    3. 小心去除50% 的 meoh 溶液。加入75% 的 meoh 溶液 (750μl 的 meoh + 250μl 的 pbs)。在平台振动台上轻轻晃动5分钟。
    4. 小心去除75% 的 meoh 溶液。加入 100% meoh 溶液 (1 毫升 meoh)。在平台振动台上轻轻晃动 5分钟. 重复此步骤3次。
  4. 此时, 根据需要, 将脱水胚胎存放在-20°c (长期) 的玻璃瓶中。或者, 直接进入协议的第1天。

3. 第1天: 补液

  1. 从-20°c 的冷冻室中获得脱水的胚胎 (或直接从步骤2.5 开始)。
  2. 使用巴斯德移液器对胚胎进行分类。可以根据形态 (即洞穴和表面) 以及每个实验中评估的基因数量进行排序。每瓶分拣后, 通常不超过12个胚胎。若要维护组织, 请使用彩色实验室磁带为每个基因指定小瓶和移液器。在整个协议过程中, 胚胎将停留在同一个小瓶中。
    注: 将巴斯德移液器的尖端放入 100% etoh 中, 在使用之间对其进行消毒。
  3. 将晃动的水浴设置为 70°c, 以便在后面的步骤中使用。小心地在已分类胚胎的小瓶中提取 meoh, 并替换为500μl 的新 100% meoh。在平台振动台上进行短暂清洗 (~ 1分钟)。
  4. 在平台振动台上, 用补间 20 (pbt, 见下文) 在不断增加的浓度为 1x pbs 的胚胎进行再包。稀释是基于1毫升最终稀释体积与500μl 进入每个小瓶。
    1. 加入25% 的 pbt 溶液 (250μl pbt, 750μl meoh)。轻轻摇晃在平台振动台上5分钟。
    2. 小心去除25% 的 pbt 解决方案。加入50% 的 pbt 溶液 (500μl pbt, 500μl meoh)。轻轻摇晃在平台振动台上5分钟。
    3. 小心地去除50% 的 pbt 解决方案。加入75% 的 pbt 溶液 (750μl pbt, 250μl meoh)。轻轻摇晃在平台振动台上5分钟。
    4. 小心地去除75% 的 pbt 解决方案。添加 100% pbt 溶液 (1 毫升 pbt)。在平台振动台上轻轻晃动 5分钟. 重复此步骤3次。

4. 第1天: 消化和固定

  1. 在 pbt 的2毫升中加入1μl 的 pk (20 mg/ml), 制备蛋白酶 k (pk) 溶液。
  2. 在后续步骤的预期中, 从-20°c 存储中获得混合缓冲液 (hyb 和 hyb +; 见补充文件 2补充文件 3) 和 pfa 的冷冻等价物。
    1. 允许 pfa 在 rt 解冻。
    2. 将 hyb-和 hyb + 的等价物放置在70°c 的旋转水浴中。将所有试剂和小瓶放入一个带有网状底部的小 "垫圈" 内, 放在浮动的水浴装置内。这样可以简单地从70°c 的水浴中添加和拆卸管道和小瓶。
  3. 轻轻地将 pk 溶液添加到胚胎的小瓶中, 确保所有组织都完全覆盖着溶液。在平台振动台上的 pk 工作溶液中消化胚胎 ~ 12分钟。
    注: 消化长度可由调查人员改变, 以确保最佳的结果。
  4. 轻轻地脱下 pk 溶液, 并短暂地将小瓶注入 pbt, 以稀释任何剩余的 pk。
  5. 脱下 pbt 解决方案, 更换500μl 的新 pbt。允许溶液在平台振动台上冲洗5分钟。
  6. 拔下 pbt, 更换500μl 解冻的 4% pfa。允许胚胎在 rt 的平台振动台上孵育20分钟。
  7. 抽走4% 的 pfa, 并短暂地将小瓶注入 pbt, 以稀释任何剩余的 pfa。脱下 pbt, 更换500μl 的新鲜 pbt。允许胚胎在平台振动台上冲洗5分钟。再重复此步骤4次。

5. 第1天: 预杂交

  1. 将500μl 预热的水溶液放入小瓶中。小心地将小瓶放在70°c 的水浴 (垫圈内) 中 , 不摇晃, 5分钟。
  2. 脱下 hyb 溶液, 用500μl 预热的 hyb + 溶液淹没小瓶。将小瓶放回70°c 的水浴中, 摇一摇 (40 转/分)。孵化 4小时, 或过夜。
    注: 4小时的孵育将产生一个完整的现场协议, 总共将持续4天。在这里, 这一步被描述为隔夜孵化, 这将产生一个总共持续5天的协议。

6. 第2天: 杂交

  1. 将-20°c 冰柜中的 hyb + 的一个 aliquot 放入晃动的热水浴池中5分钟。
  2. 从小瓶中提取 hyb +, 替换为500μl 的预热 hyb +。在该解决方案中, 小心地将 2μl rna 探针添加到每个小瓶中。轻轻旋涡小瓶, 以确保探头的均匀分布。
  3. 在70°c 热水浴池中, 在40转/分的情况下晃动, 在70°c 热水浴池中隔夜培育 hyb + (带附加探头) 溶液。
    注: 可以重复使用 hyb + (带探头) 解决方案。为此, 从-20°c 冰柜开始, 用探头用 hyb + 将其放入热水浴池 5分钟, 用探头将第1天协议中的 hyb + 替换为 hyb +, 并允许在热水浴池中孵育一夜。

7. 第3天: 解决方案准备

  1. 用 "兴趣基因" rna 探针制备贴有 hyb + 标签的微离心管。准备将在第3天使用的一系列稀释剂。
    1. 使用6个独立的管, 制备以下系列柠檬酸氢钠和盐水钠的稀释剂 (ssc, 0至100%)在1毫升体积, 并将它们放置在70°c 的晃动水浴: 管 1 = 100% hyb-(1 毫升 hyb-): 管 2 = 25% 2x ssc (250μl 的 2x ssc, 750 微米 hyb-);管 3 = 50% 2x ssc (500μl 的 2x ssc, 500μl 的 hyb-);管 4 = 75% 2x ssc (750μl 的 2x ssc, 250μl 的 hyb-);管 5 = 100% 2x ssc (2x ssc 的1毫升);管 6 = 100% 0.2 x ssc (0.2 x ssc 的2毫升)。
      注: 请警惕 ssc 的浓度, 因为它从2倍变为 0.2 x。
    2. 使用4个独立的管, 准备以下系列的 pbt 和 ssc 在1毫升体积中的稀释, 并放置在 rt: 管 1 = 25% pbt (250μl pbt, 50μl 的 0.2x ssc);管 2 = 50% pbt (500μl pbt, 500μl 0.2 x ssc);管 3 = 75% pbt (750μl pbt, 250μl 0.2 ssc);管 4 = 100% pbt (1ml pbt)。
    3. 制备含有含有 tween 20 (mabt) 工作溶液的2毫升马来酸缓冲液的管。
    4. 制备两个15毫升锥形管的阻塞溶液。在每个管中, 在 mabt 的10毫升中添加 0.2 g 的阻滞剂 (参见补充文件 4)。将两个管放在一个螺母搅拌机 (或平台振动台) 上, 直到完全溶解在溶液中 (最高 3小时)。

8. 第3天: 清除探测器

  1. 用玻璃巴斯德移液器提取 hyb + (带探针) 溶液, 并将其放入无菌、标记为微型离心管。将此管保留在-20°c 的冰柜中, 以备将来使用 (如果探针标签成功)。
  2. 小心加入500μl 的温热 ssc-hyb 稀释剂 (如下所示)。在70°c 晃动的水浴中, 在以下每个溶液中培养10分钟。
    1. 连续用 100% hyb-(1 ml hyb-)、25% 2x ssc (25μl 的 2x ssc, 750μl hyb-), 50% 2x ssc (500μl 的 2x ssc, 500μl 的 hyb-), 75% 2x ssc (2x ssc 的 750μl, 250μl 的 hyb-), 100% 2x ssc (2x ssc 的1毫升), 100% 0.2 x ssc (0.2 x ssc 的2毫升)。
  3. 在最后一步之后, 在以下每个解决方案中孵育10分钟。以下所有孵化都在平台振动台上的 rt 进行: 25% pbt (250μl pbt, 750μl 的 0.2 x ssc), 50% pbt (500μl pbt, 500μl 的 0.2 x ssc), 75% 的 pbt (750 微米 pbt, 250μl 的 0.2 x ssc), 100% pbt (1 毫升 pbt)。
  4. 孵育10分钟后, 取出 100% pbt, 并在每个小瓶中加入500μl 的 mabt。重复此步骤两次5分钟。

9. 第3天: 阻塞

  1. 从每个小瓶中取出 mabt, 并从其中一个管中取出预混堵塞溶液 (7.1.4 步骤准备)。在 rt 将小瓶放在一个坚果搅拌机上, 时间约为4小时。
  2. 在第二小瓶10毫升阻断溶液中加入2μl 的抗 dig-ap fab 片段 (步骤7.1.4 制备), 并短暂产生涡旋。
  3. 几乎完全用阻滞溶液 (~ 5 毫升) 填充每个小瓶, 并在4°c 的冰箱中过夜。

10. 第4天: mabt 冲洗

  1. 在 mabt 中制备10% 正常山羊血清 (ngs) 的库存小瓶 (将100μl 的 ngs 添加到900μl 的 mabt 中)。
  2. 在每个小瓶中提取封堵液, 并在每个小瓶中加入500μl 的 ngsmabt 混合物。允许胚胎在平台振动台上的 rt 孵育25分钟。
  3. 将 ngs/mabt 混合物更换为500μl 的 100% mabt。在平台振动台上的 rt 上孵化30分钟。每30分钟进行11次冲洗。
  4. 在小瓶中加入100% 的 mabt, 并在4°c 的冰箱或步入式室过夜放置在一个坚果搅拌机上过夜。

11. 第5天: 探测可视化

  1. 准备一个50毫升的碱性磷酸酶 (ap) 缓冲液 (见补充文件 5)。将以下内容合并在用铝箔包裹的50毫升锥形管中, 以限制光照射: 5 ml 1 mtis (ph 9.5), 50 mL mgcl 2, 5 ml 1%tween 20, 5 ml 1 m nacl, 30 ml ddh2o。
  2. 取出 mabt, 更换1毫升 ap 缓冲液 (用铝箔包裹的管子)。让它洗5分钟。执行此操作两次, 以确保完全删除 mabt。
  3. 取出 ap 缓冲液, 用 3. 5μl 5-溴-4-氯-3-二氧化磷 (bcip) 和4.5 μl 的硝基蓝色四唑 (nbt) 替换 ap 缓冲液1毫升。每小时更换一次新鲜准备的 ap buffer/NBT/BCIP, 直到反应完成。密切监测, 每15分钟检查一次, 以便进行着色反应, 直到达到所需的染色水平。如果沉淀开始形成, 则更早地替换溶液。
  4. 在新鲜的 100% ap 缓冲液 (不含 nbt/bcip) 中冲洗胚胎 5分钟, 停止着色反应, 继续在 pbt 中冲洗, 直到达到最佳的信号水平 (以最少的背景染色量)。继续在 ap 缓冲器中对增加 pbt 稀释的样品进行冲洗, 具体如下: 25% pbt (250μl pbt, 750μl ap 缓冲液), 冲洗 5分钟;50% pbt (500μl pbt, 500μl ap 缓冲器), 冲洗 5分钟;75% pbt (750μl pbt, 250μl ap 缓冲液), 冲洗5分钟。
  5. 在坚果搅拌机上冲洗 ~ 5 毫升的 100% pbt 胚胎, 直到达到所需的最小背景染色。多次使用新鲜 pbt 切换。这可能需要长达几天的时间。
  6. 冲洗完成后, 在平台振动台上清洗500μl 无菌 pbs 中的胚胎。进行两次冲洗5分钟。pbs 清洗后, 在平台振动台上的 rt 上, 将500μl 的样品固定在 4小时 pfa 1小时。或者, 在4°c 的冰箱中, 将隔夜固定在1毫升的 4% pfa 中。
  7. 将固定剂更换为新鲜、无菌的 pbs。进行此冲洗至少 5分钟, 将胚胎放入100% 无菌 pbs 的 ~ 4 毫升, 并长期存放在4°c。

12. 成像

  1. 用3% 琼脂糖和 tae 缓冲液在培养皿中制作成像盘。
    注: 数量取决于需要多少个板。板材可重复使用几次。建议在培养皿中放置一个浅的矩形模具, 而凝胶是冷却, 以创建一个抑制含有在板上的胚胎。
  2. 将胚胎放在 pbs 的盘子上。
    注: 最好将胚胎轻轻倒在盘子上, 而不是将其移注出来, 因为已经发现它们会粘在塑料移液器的内部。
  3. 使用光学显微镜, 以可视化每个胚胎。使用钝器探头将胚胎操纵到所需的位置。
  4. 当胚胎处于所需位置时, 拍摄图像。请注意, 重要的是要在完成染色后的几个星期内拍摄胚胎图像, 以避免潜在的污渍降解。

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Representative Results

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在本报告中, 我们提供了一种简单而直接的方法来对胚胎Astyanax标本进行标记, 以进行高质量的基因表达分析。此技术可以在四天或五天内执行, 过程中的每个主要步骤都在颜色编码的流程图中表示 (图 1)。一旦完成, 染色的胚胎应该在表达特定感兴趣基因的组织中贴上深紫色的彩色标签。我们在 pachón 河豚 (图 2a-b, e) 和水面鱼类 (图 2A-d, f) 胚胎中成功地实现了这一协议。

对卵鱼胚胎进行染色, 发现两个转录因子标记早期神经冠状组织, sox9tfap2a5,6。标记为sox9表达式的胚胎在发育中的分枝弓和胸鳍 (黄色箭头,图 2 a) 中表现出清晰的标记。请注意, 卵黄囊或侧面发育中的体细胞几乎不存在染色 (图 2a)。同样, tfap2a 表达在发育中的头部部分以及沿胚胎背侧侧区域的早期迁移神经冠细胞 (图 2b, 箭头) 中都很明显。为空鱼胚胎提供的第三个代表性基因是phf20a,这是成骨细胞分化的标志7。注意在体细胞中胚层和后头的部分, 注定会产生骨组织的积极染色 (图 2e, 箭头)。

在鱼类表面胚胎中, 我们研究了cxcradxap1asox10基因。cxcr编码了一种 g 蛋白膜结合受体, 它能将 cxc 趋化因子8结合在一起。正面标记存在于头部和侧面的孤立区域 (图 2f, 箭头), 以及在卵黄囊上方的几个单独的细胞。腺苷酸环酶活化多肽 adcyap1a中枢神经系统的各个区域表达, 包括垂体细胞。注意胚胎背侧的配对双侧细胞簇的高度特异性表达;以及更大的中线表达式区域 (图 2c, 箭头)。最后, 我们提出了sox10的表达式, 这是一种转录因子, 它标记早期神经冠和少突胶质细胞10。高度特异性阳性染色是明显的神经冠的早期标记的左侧和右侧的背侧 (图 2d, 箭头)。

我们提出了其他调查人员可能遇到的两类混淆问题中的每一种。一个人定期遇到的第一个问题是点点非特异性标签的斑点。这些斑点可能会出现在最后的 mabt 冲洗中的沉淀, 或在着色反应过程中的 ap 缓冲液。这种非特异性标记的一个例子在表面鱼类胚胎的蛋黄囊上很明显, 被染色为pnp4a 的表达。该基因编码一种酶 (嘌呤核苷磷酸化酶), 促进产生虹彩色素 11.这种基因首先在发育中的眼睛和游泳膀胱中显现出来。在协议的最后阶段, 通过频繁清洗和更换 ap 缓冲区 + nbt/bcip (图 3A), 消除了在一些表面样品中观察到的点状斑点 (图 3a)。一个人定期遇到的第二个问题是分散的, 主要是非特定的表达基因, 否则会产生一个独特的表达模式。一个例子是bmp4基因, 它显示为一个主要是漫反射的模式, 在整个标本中存在低含量的铬原 (图 3c)。在这样的情况下, 我们通常会识别基因的不同区域, 放大到一个载体, 并执行一个新的探针合成 (见补充文件 6)。提供了一个控制 (无探头) 样品的示例 (图 3d), 以说明我们失败的bmp4探头的漫反射和非特定性质。

Figure 1
图 1: 用于全安装原位杂交的简单流程图.该流程图利用颜色编码来说明原位杂交的主要步骤。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 六个基因的代表性染色, 同时使用阿斯蒂亚纳克斯的洞穴和表面形态.(a) 图像显示了sox9在受精后 72小时 (hpf) 右侧的特定染色 (黄色箭头)。(b) tfap2a的具体染色在 36 hpf pachón cavefish (45x) 的右侧是明显的。(c) adcyap1a 的双侧和中线染色 (黄色箭头) 标记在 72 hpf 表面鱼类 (100x) 的背侧区域。(d) 将sox10 保存在24 hpf 表面鱼类 (100x) 的神经冠组织中。(e) phf20a在 24 hpf pachón 塌陷 (100x) 的背侧区域表现出微弱但清晰的表达模式。(f) 细胞因子受体cxcr在 24 hpf 表面鱼类 (100x) 右侧侧的不同区域表达。a、b、e、f 中的刻度条 = 0.5 mm;以 c、d = 2.5 毫米为标度条. 请点击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 全安装原位杂交的次优结果的代表性示例.(a) 在 72 hpf pachón 塌陷 (100x) 的右侧侧向, 特定染色与非特异性沉淀物和/或碎片 (红色箭头) 一起明显。(b) a 中显示的同一探针, 在 72 hpf pachón 塌陷 (100x) 中描绘了相同的染色模式, 没有沉淀或背景。(c) 72 hpf pachón 空鳍的右侧侧面显示bmp4 在45x 放大倍率下的漫反射、非特异性染色。(d) 在没有增加探测器的情况下, 接受本议定书的 72 hpf pachón 屈服。刻度条 = 0.5 毫米,请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

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由于 rna 容易降解, 该协议中最关键的步骤之一是 rna 探针的无菌合成。然而, 如果探头是精心生成的, 并提供了良好的结果, 它可以在随后的染色反应中重复使用。第二个关键步骤是仔细生产整个协议中使用的所有试剂。由于该协议涉及几天和许多小步骤, 因此必须准确地生产所有试剂, 并以无菌的方式储存。此外, 调查人员对协议中的每一步都进行仔细跟踪, 这一点至关重要。我们发现, 所提供的步骤清单对于确保准确和准确地完成本协议的各个方面非常有用。

我们并不经常修改我们在这里介绍的协议。然而, 研究人员可以在与建议温度不同的温度下进行探针孵育 (即 70°c)。杂交温度的轻微变化会影响 rna 探针的结合, 因此, 寻求最佳的杂交温度会对染色质量产生积极影响。关于故障排除, 我们强烈建议其他调查人员使用本文提供的检查表 (补充文件 1)。保持仔细的记录是确保高质量染色的必要的第一步。建议的第二个小修改是在不摇晃的情况下执行最终着色反应 (例如, 不放在平台振动台或螺母上)。这样做的原因是, 我们定期注意到沉淀的产生, 这大概产生于 ap 缓冲液。这种沉淀通常会被覆盖到深色, 并在染色组织上产生点状 (非特异性) 背景。为了最大限度地减少这种沉淀物的产生, 我们在每次反应之前准备了灭菌的 ap 缓冲液。此外, 一旦 nbt 和 bcip 添加到缓冲液中, 我们将每小时用新鲜的缓冲液和 nbt/bcip 替换它, 直到着色反应完成。

对所提出的方法的一个局限性是, 采用彩色染色的基因表达可视化。我们更喜欢这种方法, 因为它具有成本效益, 只需要光学显微镜即可可视化。如果你有兴趣评估定量差异, 我们建议他们使用荧光着色反应。这将使半定量, 例如, 通过比较实验之间的相对荧光表达单位。

现场杂交协议可在1213 网络以及科学出版物上广泛查阅。我们提出的协议是专门为我们的模型系统--马西肛门开发的。我们使用这个协议来染色几十个基因的表达, 并觉得它一贯提供高质量的结果。此协议的一个显著优势是项目的分步检查, 以使调查员能够执行多个任务, 同时确保准确完成此协议的每个步骤。我们希望该协议将作为一个有用的资源, 其他调查人员在该领域和其他领域, 并预计这一共同的实验室技术将支持未来的发现, 将基因型与表型联系在盲目的墨西哥空鱼。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者希望感谢格罗斯实验室的成员对这份手稿的有益评论。我们要感谢在2017年和2018年暑期实习期间使用这一礼仪的四名高中生, 其中包括克里斯汀·曹、迈克尔·沃登、阿基·李和大卫·恩万克沃。hl 在2017年夏季得到了 uc 生物 stem 研究金的支持。这项工作得到了国家科学基金会 (deb-1457630 至 jbg) 和国家牙科和颅面研究所 (nih;de025033 至 jbg)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Serological Pipette VWR 89130-888
1000 mL Filtration Unit VWR 89220-698
15 mL Conical VWR-Greiner 82050-278
25 mL Serological Pipette VWR 89130-890
250 mL Filtration Unit VWR 89220-694
5 mL Serological Pipette VWR 89130-886
50 mL Conical VWR-Falcon 21008-940
500 mL Filtration Unit VWR 89220-696
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma-Roche 11093274910
BCIP Sigma-Aldrich B8503-1G 1 g
Blocking Solution Sigma-Roche 11 096 176 001 50 g
Citric Acid Fisher Scientific A104-500 500 g
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) Sigma-Roche 11175025910
Eppendorf Tubes VWR 20170-577
Ethanol Fisher-Decon 04-355-223 1 Gal
Formamide Thermo Fisher Scientific 17899 100 mL
Glass dram vials VWR 66011-041 1 Dr
Glass Pipettes Fisher Scientific 13-678-8A
HCl Thermal-ScientificPharmco-AAPER 284000ACS 500 mL
Heparin Sigma H3393-25KU
Magnesium Chloride-crystalline Fisher Scientific M33-500 500 g
Maleic Acid Sigma M0375-100g 100g
Methanol Fisher Scientific A452-4 4L
Molecular-grade Water (RNase-free) VWR 7732-18-5 500 mL
NaCl Fisher Scientific S271-3 3 kg
NaOH pellets Fisher Scientific S318-500 500 g
NBT Substrate powder ThermoFisher Scientific 34035 1 g
Normal Goat Serum Fisher-Invitrogen 31873
Nutating Mixer VWR 82007-202
Paraformaldehyde Sigma 158127-500g 500 g
PBS 10x Fisher Scientific BP399-20 20L
Proteinase K (200mg/10ml) Qiagen 19133 10 mL
Plastic Pipettes VWR-Samco 14670-147
RNAse Sigma R2020-250mL 250 mL
Shaking Water Bath 12 L VWR 10128-126 12 L
Standard Analog Shaker VWR 89032-092
Tris Sigma Millipore-OmniPur 9210-500GM 500 g
tRNA Yeast Fisher-Invitrogen 15401011 25 mg
Tween 20 Sigma P9416-50mL 50 mL
Vortex-Genie 2 Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc 50-728-002
Lithium Chloride (LiCl) Sigma-Aldrich 203637-10G 10 g

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References

  1. Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization: Application to neurobiology. Oxford University Press. Oxford. (1987).
  2. Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization. The Journal of Cell Biology. 107, (4), 1325-1335 (1988).
  3. Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression. Evolution & Development. 12, (4), 373-382 (2010).
  4. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, (1), 59-69 (2008).
  5. Cheung, M., Briscoe, J. Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9. Development. 130, (23), 5681-5693 (2003).
  6. Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development. Development. 130, (23), 5755-5768 (2003).
  7. Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3. Scientific Reports. 7, (1), 8060 (2017).
  8. Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways. Journal of Biological Chemistry. 273, (36), 23169-23175 (1998).
  9. Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3). Cytogenetic and Genome Research. 71, (2), 193-196 (1995).
  10. Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes & Development. 16, (2), 165-170 (2002).
  11. Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7, (4), 1357-1363 (2017).
  12. Monsoro-Burq, A. H. A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).
  13. Schulz, C. In situ hybridization to Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).
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Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos. J. Vis. Exp. (145), e59114, doi:10.3791/59114 (2019).More

Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos. J. Vis. Exp. (145), e59114, doi:10.3791/59114 (2019).

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