Summary
Ce protocole permet la visualisation de l’expression génique dans embryonnaires agassizii Astyanax . Cette approche a été développée avec l’objectif de maximiser le signal d’expression de gène, tout en minimisant la coloration de fond non spécifique.
Abstract
Ces dernières années, un génome de projet pour les aveugles agassizii mexicain (Astyanax mexicanus) a été libéré, révéler l’identité de séquence pour des milliers de gènes. Des recherches antérieures dans ce nouveau système de modèle capitalisé sur les enquêtes de génome complets qui ont identifié plusieurs QTL (QTL) associé à divers phénotypes associés à la grotte. Toutefois, la possibilité de connecter des gènes d’intérêt à la base héréditaire de changement phénotypique demeure un défi important. Une technique qui peut faciliter une compréhension plus profonde du rôle du développement dans l’évolution de la troglomorphic est entier-montez l’hybridation in situ. Cette technique peut être implémentée pour directement comparer l’expression des gènes entre les formes vivant dans les grottes et surface, désigner candidat gènes qui sous-tendent les QTL établie, identifier des gènes d’intérêt provenant d’études de la nouvelle génération de séquençage ou développer autre approches axées sur la découverte. Dans ce rapport, nous présentons un protocole simple, accompagné d’une liste de contrôle flexible, qui peut être largement adapté pour une utilisation bien au-delà du système de l’étude présentée. Il est à espérer que ce protocole peut servir comme une grande ressource pour la communauté Astyanax et au-delà.
Introduction
Hybridation in situ est une méthode commune pour la coloration des tissus fixés pour visualiser gene expression patterns1. Cette technique a été réalisée pour années dans d’autres traditionnels2 et systèmes de modèles non traditionnels3 , pour une variété d’études biologiques. Cependant, plusieurs étapes et les réactifs sont nécessaires pour réaliser avec succès cette procédure. Pour les enquêteurs qui n’ont jamais fait cette technique, il peut être intimidant en raison des nombreuses étapes d’amorcer le processus. En outre, la nature longue de cette procédure se prête à des fautes techniques, qui peuvent être difficile à résoudre.
L’objectif général du présent article est de présenter une méthode simple et directe qui rendra cette technique d’hybridation accessible à un large public. Afin de réduire l’introduction d’erreurs, nous présentons une approche simple qui donne expression de gène de haute qualité coloration et minimise le signal de fond non spécifique. Cette procédure est similaire aux autres approches développées dans les systèmes de modèle traditionnel, comme le Danio rerio4. Ici, nous visons à faciliter l’application minutieuse de chaque étape à l’aide d’une liste téléchargeable (fichier supplémentaire 1), à promouvoir l’application minutieuse du protocole. La raison d’être pour ce faire est de faciliter l’organisation à travers les nombreuses étapes dans cette procédure. Cet article est approprié pour les chercheurs intéressés dans l’accomplissement entier-montez l’hybridation in situ dans le développement des embryons, mais n’ont pas encore effectué la procédure. L’avantage de l’approche choisie pour Astyanax chercheurs est qu’il a été testé et prouvé en agassizii et morphes de poissons de surface, ce qui facilite les analyses comparatives d’expression. La méthode présentée peut être utilisée par des chercheurs en études sur les autres systèmes et Astyanax .
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Cincinnati (protocole n° 10-01-21-01).
1. la fixation
- Isoler le nombre désiré d’Astyanax mexicanus embryons provenant d’un réservoir d’élevage et difficulté ~ 50 embryons à la fois. Si les embryons sont grandes et anciennes, il peut être nécessaire de fixer les 25 à la fois pour assurer la fixation même.
- Selon l’âge de l’embryon, utiliser la méthode IACUC approuvée de l’anesthésie. Pour les plus vieux embryons avec le fonctionnement du système nerveux, sacrifier les embryons par surdosage anesthésique. Par conséquent, placez les embryons dans une solution d’environ 1 % de tricaïne (tamponnée à pH 7,4) pour minimiser la douleur et l’inconfort pour l’organisme.
- Une fois que les embryons ne répondent pas au toucher, remplacer l’eau du système contenant tricaïne et ajouter environ 1 mL de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4).
- Enlever la solution de PBS et ajouter 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA). Difficulté des embryons pendant la nuit à 4 ° C.
Attention : PFA est dangereux (c.-à-d. il est inflammable et est une peau et un irritant pulmonaire), manipuler avec précaution.
2. la déshydratation
- Pour déshydrater les embryons, supprimer la solution de fixation et rincer avec 1 mL de PBS. Placer les flacons contenant des embryons à un angle (entre 30° et 45°), sur un agitateur-secoueur pendant le rinçage. Continuer à laver les embryons à deux reprises, 5 min / cycle de lavage.
- Si des embryons ont toujours une chorion, placer tous les 50 embryons dans un 100 mm x 25 mm boîte de Pétri et isoler soigneusement des chorions à l’aide de deux paires de pinces d’horloger (p. ex., pinces à #5) sous un microscope.
NOTE : Pendant les étapes décrites ci-dessous et pour le reste du protocole, retirer soigneusement tout le liquide de l’étape précédente à l’aide de nettoyer, de pipettes de verre Pasteur avant d’ajouter la solution suivante - Déshydrater les embryons dans une série de plus en plus concentrés lavages de méthanol (MeOH) décrites ci-dessous. Les dilutions sont basées sur un volume total de 1 mL avec 500 µL de solution dans chaque flacon de verre de 4 mL. Exécutez toutes les étapes de déshydratation à la température ambiante (RT) sur agitateur-secoueur.
- Retirez soigneusement la solution de PBS. Ajouter une solution de MeOH de 25 % (250 µL de MeOH) + 750 µL de PBS. Secouer doucement sur un agitateur-secoueur pendant 5 min.
- Retirez soigneusement la solution de MeOH de 25 %. Ajouter une solution de MeOH de 50 % (500 µL de MeOH) + 500 µL de PBS. Secouer doucement sur un agitateur-secoueur pendant 5 min.
- Retirez soigneusement la solution de MeOH de 50 %. Ajouter une solution de MeOH de 75 % (750 µL de MeOH) + 250 µL de PBS. Secouer doucement sur un agitateur-secoueur pendant 5 minutes.
- Retirez soigneusement la solution de MeOH de 75 %. Ajouter une solution de MeOH de 100 % (1 mL de MeOH). Secouer doucement sur un agitateur-secoueur pendant 5 min. répéter cette étape 3 fois.
- À ce stade, conservation des embryons déshydratés, selon les besoins, dans leurs flacons en verre à-20 ° C (long terme). Vous pouvez également passer directement au jour 1 du protocole.
3. jour 1 : réhydratation
- Obtenir des embryons déshydratés du congélateur-20 ° C (ou passez directement à l’étape 2.5).
- Trier les embryons à l’aide d’une pipette Pasteur. On peut trier sur la base de morphotype (c.-à-d., la cave et/ou la surface), et le nombre de gènes évalués dans chaque expérience. Il n’y a généralement pas plus de 12 embryons par fiole une fois triés. Afin de maintenir l’organisation, utilisez ruban couleur lab pour désigner des flacons et des pipettes pour chaque gène. Embryons resteront dans le même flacon tout au long de l’ensemble du protocole.
NOTE : Place l’embout de la pipette Pasteur dans 100 % EtOH à stériliser entre utilise. - Définissez un secousse bain-marie à 70 ° C à utiliser dans une étape ultérieure. Avec précaution, faire ressortir le MeOH dans des flacons d’embryons triées et remplacer avec 500 µL de nouveau 100 % MeOH. Lavage brièvement (~ 1 min) sur l’agitateur-secoueur.
- Réhydrater les embryons dans une concentration croissante de 1 x PBS avec Tween 20 (PBT, voir ci-dessous) sur l’agitateur-secoueur. Les dilutions sont basées sur un volume de dilution finale de 1 mL avec 500 µL entrer dans chaque flacon.
- Ajouter une solution PBT 25 % (250 µL de PBT, 750 µL de MeOH). Secouer doucement sur un agitateur-secoueur pendant 5 min.
- Retirez soigneusement la solution PBT 25 %. Ajouter une solution à 50 % PBT (500 µL de PBT, 500 µL de MeOH). Secouer doucement sur un agitateur-secoueur pendant 5 min.
- Retirez soigneusement la solution à 50 % PBT. Ajouter une solution PBT 75 % (750 µL de PBT, 250 µL de MeOH). Secouer doucement sur un agitateur-secoueur pendant 5 min.
- Retirez soigneusement la solution PBT de 75 %. Ajouter une solution PBT 100 % (1 mL de PBT). Secouer doucement sur un agitateur-secoueur pendant 5 min. répéter cette étape 3 fois.
4. jour 1 : Digestion et fixation
- Préparer une protéinase solution K (PK) en ajoutant 1 µL de PK (20 mg/mL) à 2 mL de PBT.
- En prévision des étapes subséquentes, obtenir des aliquotes congelés de tampons d’hybridation (Hyb - et Hyb + ; voir 2 fichier supplémentaire et complémentaire fichier 3) et PFA de stockage-20 ° C.
- Permettre la PFA décongeler à température ambiante.
- Placez des parties aliquotes de Hyb - et Hyb + dans un bain d’eau rotatif de 70 ° C. Placez tous les réactifs et les flacons à l’intérieur d’un petit « joint » avec un fond en filet, à l’intérieur de l’appareil flottant de bain l’eau. Cette mesure simple ajout et suppression des tubes et flacons du bain-marie tournante 70 ° C.
- Ajouter doucement solution PK à la vial(s) des embryons assurant tous les tissus sont complètement recouvertes de solution. Digérer les embryons pendant environ 12 min dans la solution de travail PK sur l’agitateur-secoueur.
Remarque : La durée de la digestion peut varier par l’enquêteur pour assurer des résultats optimaux. - Retirer doucement la solution PK et brièvement inonder la cuvette de PBT pour diluer tout restant PK.
- Retirer la solution PBT et remplacer avec 500 µL de nouveau PBT. Laisser la solution se rincer sur l’agitateur-secoueur pendant 5 min.
- Retirer les PBT et les remplacer par 500 µL de décongelés 4 % PFA. Permettre les embryons à incuber pendant 20 min sur l’agitateur-secoueur à température ambiante.
- Retirer les 4 % PFA et brièvement inonder la cuvette de PBT pour diluer tout PFA restant. Retirer le PBT et remplacez par 500 µL de PBT fraîche. Permettre aux embryons de rincer pendant 5 min sur l’agitateur-secoueur. Répétez cette opération 4 fois plus.
5. jour 1 : Prehybridization
- Place 500 µL de préchauffé Hyb-solution dans le flacon. Placez soigneusement le flacon dans les 70 ° C eau bain (à l’intérieur des joints) sans agitation, pendant 5 min.
- Retirer la solution Hyb et inonder le flacon avec 500 µL de solution Hyb + préchauffée. Remettre le flacon dans le bain d’eau de 70 ° C sous agitation (40 t/mn). Incuber pendant ou 4 h, ou toute la nuit.
Remarque : Un 4 h d’incubation permet d’obtenir un protocole complet sur place qui va durer pendant 4 jours au total. Ici, cette étape est présentée comme une incubation durant la nuit, ce qui produira un protocole durant 5 jours au total.
6. jour 2 : hybridation
- Placer une aliquote de Hyb + du congélateur-20 ° C en le secouant bain d’eau chaude pendant 5 min.
- Retirer les Hyb + à partir du flacon et remplacer avec 500 µL de Hyb pré chauffé +. Pour cette solution, ajouter avec précaution 2 µL de sonde d’ARN dans chaque flacon. Doucement agiter le flacon pour assurer une répartition égale de la sonde.
- Incubez la solution Hyb + (avec sonde supplémentaire) dans le bain d’eau chaude 70 ° C durant la nuit et en agitant à 40 tr/min.
Remarque : On peut re-utiliser solution Hyb + (avec sonde). Pour ce faire, prendre Hyb + avec sonde de la première exécution depuis le congélateur-20 ° C et les place dans un bain d’eau chaude pendant 5 min. remplacer Hyb + dès le jour 1 du protocole avec Hyb + avec sonde et laisser incuber pendant la nuit dans le bain d’eau chaude.
7. jour 3 : Préparation de la Solution
- Préparer les tubes de microcentrifuge étiquetés Hyb + avec la sonde d’ARN « gène d’intérêt ». Préparer la série de dilutions qui seront utilisées au cours de la journée 3.
- À partir de 6 tubes distincts, préparer la série de dilutions de Hyb - et citrate de sodium salin (SSC, 0 à 100 %) dans un volume de 1 mL et le lieu dans les 70 ° C secouant bainmarie : Tube 1 = 100 % Hyb-(1 mL de Hyb-) : Tube 2 = 25 % 2 x SSC (250 µL de 2 x SSC, 750 µL de Hyb-) ; Tube de SSC 2 x 3 = 50 % (500 µL de SSC 2 x, 500 µL de Hyb-) ; Tube de SSC 2 x 4 = 75 % (750 µL de SSC 2 x, 250 µL de Hyb-) ; Tube de SSC de 2 x 5 = 100 % (1 mL de SSC 2 x) ; Tube de 6 = 100 % x 0,2 SSC (2 mL de 0,2 x SSC).
NOTE : Être vigilant de la concentration de la CSE, car il change de 2 x 0,2 x. - À l’aide de 4 tubes de séparer, préparer la série de dilutions de PBT et SSC dans un volume de 1 mL et placez au RT : Tube 1 = 25 % PBT (250 µL de PBT, 750 µL de 0,2 x SSC) ; Tube 2 = 50 % PBT (500 µL de PBT, 500 µL de SSC x 0,2) ; Tube 3 = 75 % PBT (750 µL de PBT, 250 µL de SSC x 0,2) ; Tube 4 = 100 % PBT (1mL de PBT).
- Préparer un tube avec 2 mL de tampon de l’acide maléique contenant la solution de travail de Tween 20 (MABT).
- Préparer deux tubes coniques 15 mL de solution de blocage. Dans chaque tube, ajouter 0,2 g de réactif de blocage à 10 mL de MABT (voir 4 de fichier supplémentaire). Placer les deux tubes sur un mélangeur oscillant (ou agitateur-secoueur) jusqu'à complètement dissous dans la solution (jusqu'à 3 h).
- À partir de 6 tubes distincts, préparer la série de dilutions de Hyb - et citrate de sodium salin (SSC, 0 à 100 %) dans un volume de 1 mL et le lieu dans les 70 ° C secouant bainmarie : Tube 1 = 100 % Hyb-(1 mL de Hyb-) : Tube 2 = 25 % 2 x SSC (250 µL de 2 x SSC, 750 µL de Hyb-) ; Tube de SSC 2 x 3 = 50 % (500 µL de SSC 2 x, 500 µL de Hyb-) ; Tube de SSC 2 x 4 = 75 % (750 µL de SSC 2 x, 250 µL de Hyb-) ; Tube de SSC de 2 x 5 = 100 % (1 mL de SSC 2 x) ; Tube de 6 = 100 % x 0,2 SSC (2 mL de 0,2 x SSC).
8. jour 3 : Sonde removal
- Retirer la solution Hyb + (avec sonde) avec une pipette Pasteur en verre et placez-le dans une solution stérile, étiqueté tube microcentrifuge. Conserver ce tube dans le congélateur-20 ° C pour une utilisation ultérieure (si sonde-étiquetage est réussie).
- Ajouter 500 µL des SSC/Hyb-dilutions chauds (indiqué ci-dessous) avec précaution. Incuber dans chacune des solutions suivantes pendant 10 min chaque dans le bain d’eau secouer de 70 ° C.
- Incuber dans l’ordre avec 100 % Hyb-(1 mL de Hyb-), 25 % 2 x SSC (250 µL de 2 x SSC, 750 µL de Hyb-), 50 % 2 x SSC (500 µL de 2 x SSC, 500 µL de Hyb-), 75 % 2 x SSC (750 µL de 2 x SSC, 250 µL de Hyb-), 100 % 2 x SSC (1 mL de 2 x SSC) , 100 % 0,2 x SSC (2 mL de 0,2 x SSC).
- Suite à la dernière étape, incuber dans chacune des solutions suivantes pour chaque 10 min. Tous les incubations suivantes ont lieu à ta sur l’agitateur-secoueur : 25 % PBT (250 µL de PBT, 750 µL de 0,2 x SSC), 50 % PBT (500 µL de PBT, 500 µL de 0,2 x SSC), 75 % PBT (750 µL de PBT, 250 µL de 0,2 x SSC) , 100 % PBT (1 mL de PBT).
- Après une incubation de 10 min, enlever le 100 % PBT et ajouter 500 µL de MABT dans chaque flacon. Répétez cette étape deux fois pendant 5 min.
9. jour 3 : blocage
- MABT retirer de chaque flacon et inondations avec solution prémélangée de saturation d’un des tubes (préparés à l’étape 7.1.4). Placer le flacon dans un mélangeur oscillant pendant environ 4 heures à température ambiante.
- Ajouter 2 µL d’Anti-DIG-AP Fab des fragments de la deuxième fiole de 10 mL de solution (préparée à l’étape 7.1.4) et brièvement vortex de blocage.
- Remplir chaque flacon presque complètement avec bloquant la solution (~ 5 mL) et placer le mélangeur oscillant du jour au lendemain au réfrigérateur à 4 ° C.
10. jour 4 : MABT rinçages
- Préparer un flacon de stock de 10 % de sérum de chèvre normal (NGS) dans MABT (ajouter 100 µL de NGS à 900 µL de MABT).
- Retirer la solution de saturation dans chaque flacon et ajouter 500 µL du mélange NGS/MABT dans chaque flacon. Laissez les embryons à incuber pendant 25 min à ta sur l’agitateur-secoueur.
- Remplacer le mélange NGS/MABT avec 500 µL de 100 % MABT. Incuber 30 min à ta sur l’agitateur-secoueur. Effectuez ce rinçage 11 fois plus tout au long de la journée toutes les 30 minutes.
- Remplir le flacon avec 100 % MABT et la place sur une table de mixage oscillant toute la nuit dans une chambre de réfrigérateur ou en personne à 4 ° C.
11. jour 5 : Sonde de visualisation
- Préparer une portion de 50 mL de tampon de la phosphatase alcaline (PA) (voir 5 de fichier supplémentaire). Combinez ce qui suit dans un tube conique de 50 mL, enveloppé dans du papier d’aluminium pour limiter l’exposition à la lumière : 5 mL de 1 M Tris (pH 9,5), 5 mL de 50 mM MgCl2, 5 mL de 1 % Tween 20, 5 mL de 1 NaCl M, 30 mL de ddH2O.
- Supprimez MABT et remplacez-les par 1 mL de tampon de AP (tube enveloppé dans du papier). Laissez-le se laver pendant 5 min. Faire cela deux fois pour assurer le retrait complet de MABT.
- Retirer le tampon de l’AP et les remplacer par 1 mL de tampon d’AP avec 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate 3,5 μL (CBPI) et 4.5 μL de nitro bleu de tétrazolium (NBT). Remplacez par AP tampon/NBT/BCIP fraîchement préparé une fois toutes les heures jusqu'à ce que la réaction est terminée. Suivre de près, vérifiant toutes les 15 min, afin de permettre la réaction de coloration se dérouler jusqu'à ce que le niveau de coloration désiré a été atteint. Si le précipité commence à se former, remplacer la solution plus tôt.
- Arrêter la réaction de coloration en rinçant les embryons dans la mémoire tampon AP 100 % fraîche (sans NBT/BCIP) pour 5 min. continuer rinçages en PBT jusqu'à ce qu’un niveau optimal de signal (avec des quantités minimes de la coloration de fond) est atteints. Continuer à rincer des spécimens avec l’augmentation des dilutions de PBT dans un tampon AP comme suit : 25 % PBT (250 μL de PBT, 750 μL de tampon de l’AP), rincer pendant 5 min ; 50 % PBT (500 μL de PBT, 500 μL de tampon de l’AP), rincer pendant 5 min ; 75 % PBT (750 μL de PBT, 250 μL de tampon de l’AP), rincer pendant 5 min.
- Rincer les embryons dans environ 5 mL de 100 % PBT sur oscillant mélangeur jusqu'à désiré la coloration de fond minimal est atteint. Commuter dehors avec PBT fraîche plusieurs fois. Cela pourrait prendre jusqu'à plusieurs jours.
- Lorsque le rinçage est complets, laver les embryons dans 500 μl de PBS stérile sur un agitateur-secoueur. Effectuez ce rincer deux fois pendant 5 min. Après lavages de PBS, fixer les spécimens dans 500 μL de 4 % PFA pendant 1 h à RT sur un secoueur. Alternativement, difficulté à passer la nuit dans 1 mL de 4 % PFA au réfrigérateur à 4 ° C.
- Remplacer le fixateur avec frais, PBS stérile. Effectuer ce rinçage au moins deux fois pendant 5 min Place les embryons dans ~ 4 mL de PBS stérile de 100 % et à long terme à 4 ° C.
12. imagerie
- Composent une plaque d’imagerie dans une boîte de pétri à l’aide de 3 % d’agarose et tampon TAE.
Remarque : Les quantités dépendent combien de plaques sont nécessaires. Plaques peuvent être réutilisées plusieurs fois. Il est recommandé de place un moule rectangulaire peu profond dans la boîte de pétri tandis que le gel est de refroidissement afin de créer une dépression pour contenant les embryons sur la plaque. - Placez les embryons sur la plaque dans du PBS.
Remarque : Il est préférable de verser doucement sur la plaque au lieu de pipetage les sortir car il a été constaté qu’ils seront en tiendra à l’intérieur des pipettes en plastique, les embryons. - Utiliser la microscopie photonique afin de visualiser chaque embryon. Utiliser une sonde émoussée à manœuvrer les embryons à la position désirée.
- Prendre une image lorsque l’embryon est dans la position souhaitée. Notez qu’il est important de prendre des images d’embryons dans quelques semaines de coloration terminée pour éviter une dégradation potentielle de tache.
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Representative Results
Dans ce rapport, nous proposons une approche simple et directe pour effectuer le marquage des spécimens d’Astyanax embryonnaires pour l’analyse de l’expression génique de haute qualité. Cette technique peut être effectuée dans les quatre ou cinq jours, et chaque étape principale de la procédure est représenté dans un diagramme de flux codés par couleur (Figure 1). Une fois terminé, embryons colorés devraient abriter une étiquette chromatique violette foncée en tissus exprimant le gène d’intérêt. Nous avons implémenté avec succès de ce protocole en Pachón agassizii (Figure 2 a–B, E) et les embryons de poissons de surface (Figure 2–D, F).
Les embryons agassizii ont été colorés pour deux facteurs de transcription de cette étiquette début crête neurale tissus, Sox9 et milieux Tfap2a5,6. Embryons étiquetés pour expression Sox9 démontrent un étiquetage clair dans les pays en développement arcs branchiaux et nageoire pectorale (pointes de flèches jaunes, Figure 2 a). Notez que la coloration est pratiquement absente dans le sac vitellin ou les somites en développement sur le flanc (Figure 2 a). De même, l’expression Tfap2a est évidente dans les parties de la tête en voie de développement, mais aussi des premières cellules neurales de crête migration (Figure 2 b, flèche) le long de la région de flanc dorsal de l’embryon. Le troisième gène représentant présenté pour les embryons agassizii est Phf20a, un marqueur de différenciation ostéoblastique7. Noter la coloration positive dans les portions du mésoderme somitique et tête postérieure qui est destinés à donner lieu à des tissus osseux (Figure 2E, pointes de flèches).
Chez les embryons de poissons de surface, nous avons sondé pour les gènes CXCR, Adcyap1aet Sox10. CXCR encode un récepteur membranaire G-protéine qui lie CXC chimiokines8. Un marquage positif est présent dans les régions isolées de la tête et flanc (Figure 2F, pointes de flèches), ainsi que quelques cellules individuelles recouvrant le sac vitellin. Le gène polypeptide activation de l’adénylate cyclase, Adcyap1a, s’exprime dans les régions du système nerveux central, y compris les cellules hypophysaires. Remarque l’expression très spécifique en grappes appariés, bilatérales des cellules sur l’aspect dorsal de l’embryon ; ainsi qu’une plus grande région d’expression de la ligne médiane (Figure 2, pointes de flèches). Enfin, nous présentons l’expression de Sox10, un facteur de transcription dont étiquettes début crête neurale et oligodendrocyte cellules10. Une coloration positive très spécifique est évidente comme un marqueur précoce de la crête neurale à gauche et à droite de l’embryon dorsale (Figure 2D, pointes de flèches).
Nous présentons de chacun des deux types de problèmes confusionnels qu'autres enquêteurs peuvent rencontrer. La première question que l'on rencontre périodiquement est taches ponctuées de marquage non spécifique. Ces taches peuvent découler comme précipité des rinçages MABT finales, ou le tampon de l’AP au cours des réactions de coloration. Un exemple de cet étiquetage non spécifique est évident sur le sac vitellin d’un embryon de poissons de surface coloré pour l’expression de Pnp4a. Ce gène code pour une enzyme (purine nucléoside phosphorylase) qui facilite la production de pigmentation irisé11. Ce gène est d’abord évident dans le œil en voie de développement et de la vessie natatoire. Les taches ponctuées observées dans certains échantillons de surface (Figure 3 a), ont été éliminés par les lavages fréquents et le remplacement du tampon AP + NBT/BCIP dans les dernières étapes du protocole (Figure 3 b). Un deuxième problème que l'on rencontre régulièrement est l’expression diffuse, en grande partie non spécifique des gènes qui produirait autrement un modèle d’expression distincte. Un exemple est le gène BMP4, qui apparaît comme un modèle largement diffus ayant un faible niveau de chromogène présent tout au long de l’échantillon (Figure 3). Dans de tels cas, nous avons généralement identifier une région différente du gène, amplifier dans un vecteur et effectuer une nouvelle synthèse de la sonde (voir 6 de fichier supplémentaire). L’exemple d’une éprouvette de contrôle (sans sonde) (Figure 3D) est fourni pour illustrer le caractère diffus et imprécis de notre sonde BMP4 ayant échoué.
Figure 1 : un diagramme de flux simple pour l’hybridation in situ entier-montent. Cet organigramme utilise le codage par couleur pour illustrer les principales étapes de l’hybridation in situ. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Coloration représentant six gènes, utilisant la grotte et surfaces morphes de Astyanax. (A) Image montre la coloration spécifique (flèches jaunes) de Sox9 sur le côté droit latéral d’une fertilisation après 72 h (hpf) Pachón agassizii (x 45). (B) coloration spécifique pour Tfap2a est évident sur la face latérale droite d’un 36 hpf Pachón agassizii (x 45). (C) bilatérale et ligne médiane coloration (pointes de flèche jaunes) de Adcyap1a sont marqués dans la région dorsale d’un poisson 72 de surface de hpf (100 x). (D) coloration de Sox10 dans les tissus de la crête neurale du 24 poisson surface hpf (100 x). (E) Phf20a illustre un modèle léger, mais clair, d’expression dans la région dorsale d’un 24 hpf Pachón agassizii (x 100). (F) la cytokine récepteur, CXCR, s’exprime dans des régions distinctes du côté latéral droit du 24 poisson surface hpf (100 x). Barres d’échelle en A, B, E, F = 0,5 mm ; échelle des barres aux C, D = 2,5 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : exemples représentatifs des résultats moins qu’optimales pour l’hybridation in situ entier-montent. Coloration spécifique (A) est évidente aux côtés de précipité non spécifiques et/ou des débris (pointe de flèche rouge) sur la face latérale droite d’un 72 hpf Pachón agassizii (x 100). (B) la même sonde visualisée dans A, illustrant la même coloration patterns sans précipité ou d’arrière-plan dans un 72 hpf Pachón agassizii (x 100). (C) le flanc latéral droit d’un 72 hpf Pachón agassizii montre diffus, non spécifiques coloration pour BMP4 au grossissement x 45. (D) A 72 hpf Pachón agassizii soumis au présent protocole, sans ajout de sonde (x 45). Barreaux de l’échelle = 0,5 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
En raison de la vulnérabilité de l’ARN à la dégradation, une des étapes plus critiques dans le protocole porte sur la synthèse stérile de la sonde d’ARN. Toutefois, si une sonde est générée avec soin et donne de bons résultats, il peut être réutilisé dans des réactions subséquentes de coloration. Une seconde étape cruciale est la production minutieuse de tous les réactifs utilisés tout au long du protocole. Ce protocole implique plusieurs jours et nombreuses petites étapes, il est essentiel que tous les réactifs sont avec précision produites et stockées de façon stérile. En outre, il est fondamentalement important que le chercheur assure le suivi attentif de chaque étape dans le protocole. Nous avons constaté que la liste de contrôle fournie des étapes peut être extrêmement utile pour assurer l’achèvement et précis de chaque aspect du présent protocole.
Souvent, nous ne modifient pas le protocole que nous avons présenté ici. Toutefois, les enquêteurs peuvent effectuer des incubations de sonde à des températures différentes que celles suggérées (c.-à-d., 70 ° C). Légers changements dans les températures d’hybridation aura une incidence liaison des sondes d’ARN, et par conséquent, cherchant la température optimale de l’hybridation peut influer positivement la qualité de la coloration. En ce qui concerne le dépannage, nous encourageons vivement les autres chercheurs à utiliser la liste de contrôle fourni avec cet article (supplémentaire 1 fichier). Maintenant attention records est une première étape nécessaire pour assurer la haute qualité de coloration. Une deuxième modification mineure est suggérée consiste à effectuer la réaction de coloration finale sans bascule (par exemple, sans les placer sur un agitateur-secoueur ou nutator). La raison en est que, périodiquement, nous notons la production du précipité, ce qui en découle probablement de la solution tampon de AP. Habituellement, ce précipité overstains pour une couleur foncée et crée ponctuée (non spécifique) fond sur le tissu taché. Pour minimiser la production de ce précipité, nous préparons stérilisé tampon AP juste avant chaque réaction. En outre, une fois NBT et CBPI ont été ajoutés au tampon, nous remplacer par tampon fraîche et NBT/BCIP toutes les heures jusqu'à ce que la réaction de coloration est terminée.
Une limitation à la méthode présentée est qu’une tache chromatique a été utilisée pour la visualisation d’expression de gène. Nous préférons cette approche car elle est rentable et ne nécessite que la microscopie photonique à visualiser. Si on s’intéressaient à l’évaluation des différences quantitatives, nous suggérons qu’ils utilisent une réaction de coloration fluorescente. Cela permettra la détermination semi-quantitative, par exemple, par le biais de la comparaison des unités fluorescentes relatives d’expression entre les expériences.
Protocoles pour l’hybridation in situ sont disponibles largement sur le web12,13, ainsi que dans des publications scientifiques. Le protocole que nous vous présentons a été développé spécifiquement pour notre système de modèle, Astyanax mexicanus. Nous avons utilisé ce protocole pour souiller l’expression de plusieurs dizaines de gènes et se sentent qu'il fournit constamment des résultats de haute qualité. Un avantage important du présent protocole est la liste de vérifications détaillée d’éléments pour permettre à l’enquêteur d’effectuer plusieurs tâches tout en assurant la réalisation précise de chacune des étapes du présent protocole. Nous espérons que ce protocole va constituer une ressource utile aux autres chercheurs dans le domaine et au-delà et prévoir que cette technique de laboratoire commun soutiendra les futures découvertes reliant génotype au phénotype à l’aveugle agassizii mexicain.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire brut des commentaires utiles sur ce manuscrit. Nous tenons à souligner quatre lycéens qui utilise ce protocole au cours de stages d’été en 2017 et 2018, dont Christine Cao, Michael Warden, Aki Li et David Nwankwo. HL était soutenue par une bourse de recherche de souches de biologie UC pendant l’été de 2017. Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Science Foundation (DEB-1457630 de JBG) et le National Institutes of Dental and Craniofacial Research (NIH ; DE025033 à JBG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
| Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
| Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
References
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