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Developmental Biology

astyanax भ्रूण के लिए स्वस्थानी संकरण में wholemount

doi: 10.3791/59114 Published: March 2, 2019

Summary

इस प्रोटोकॉल भ्रूण astyanax cavefish में जीन अभिव्यक्ति के दृश्य को सक्षम बनाता है । इस दृष्टिकोण को अधिकतम जीन अभिव्यक्ति संकेत के लक्ष्य के साथ विकसित किया गया है, जबकि गैर विशेष पृष्ठभूमि धुंधला को कम करने ।

Abstract

हाल के वर्षों में, अंधा मैक्सिकन cavefish के लिए एक मसौदा जीनोम (astyanax mexicanus) जारी किया गया है, जीन के हजारों के लिए अनुक्रम पहचान खुलासा । इस उभरते मॉडल प्रणाली में पहले अनुसंधान व्यापक जीनोम व्यापक जांच है कि कई मात्रात्मक लक्षण loci (qtl) विभिंन गुफा से जुड़े phenotypes से संबंधित की पहचान की है पर कैपिटल में । हालांकि, लक्षणप्ररूपी परिवर्तन के लिए ह्य आधार के लिए ब्याज के जीन कनेक्ट करने की क्षमता एक महत्वपूर्ण चुनौती बनी हुई है. एक तकनीक है कि troglomorphic विकास में विकास की भूमिका की गहरी समझ की सुविधा कर सकते है पूरे स्वस्थानी संकरण में माउंट है । इस तकनीक को सीधे गुफा के बीच जीन अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए लागू किया जा सकता है और सतह पर रहने वाले रूपों, उंमीदवार नामित स्थापित qtl जीन, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण अध्ययन से ब्याज के जीन की पहचान, या अंय विकसित डिस्कवरी-आधारित दृष्टिकोण । इस रिपोर्ट में, हम एक सरल प्रोटोकॉल वर्तमान, एक लचीला चेकलिस्ट द्वारा समर्थित है, कि व्यापक रूप से अच्छी तरह से प्रस्तुत अध्ययन प्रणाली से परे उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । यह आशा व्यक्त की है कि इस प्रोटोकॉल astyanax समुदाय और परे के लिए एक व्यापक संसाधन के रूप में सेवा कर सकते हैं ।

Introduction

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स्वस्थानी संकरण में निर्धारित ऊतकों को धुंधला करने के लिए एक सामान्य विधि है जो जीन अभिव्यक्ति पैटर्न1को देखने के लिए होती है । इस तकनीक को अंय पारंपरिक2 और गैर पारंपरिक3 मॉडल प्रणालियों में वर्षों के लिए प्रदर्शन किया गया है, जैविक अध्ययन की एक किस्म के लिए । हालांकि, इस कार्यविधि को सफलतापूर्वक करने के लिए कई चरण और अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है । जांचकर्ताओं जो इस तकनीक का प्रदर्शन नहीं किया है के लिए, प्रक्रिया की शुरुआत कई शामिल कदम के कारण डरा दिया जा सकता है । इसके अलावा, इस प्रक्रिया की लंबी प्रकृति ही तकनीकी त्रुटियों के लिए उधार देता है, जो समस्या निवारण करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है.

इस लेख के समग्र लक्ष्य के लिए एक सरल और सीधा तरीका है कि इस संकरण एक व्यापक दर्शकों के लिए सुलभ तकनीक प्रदान करेगा पेश है । त्रुटियों की शुरूआत को कम करने के लिए, हम एक सीधा दृष्टिकोण है कि पैदावार उच्च गुणवत्ता जीन अभिव्यक्ति धुंधला और गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि संकेत कम कर देते हैं । यह प्रक्रिया पारंपरिक मॉडल प्रणालियों में विकसित अन्य दृष्टिकोणों के समान है, जैसे कि डेनियो रेरियो4. यहाँ, हम एक डाउनलोड चेकलिस्ट (पूरक फ़ाइल 1) का उपयोग कर प्रत्येक कदम के सावधान कार्यान्वयन की सुविधा के लिए, प्रोटोकॉल के सावधान कार्यान्वयन को बढ़ावा देने के उद्देश्य. ऐसा करने के लिए तर्क इस प्रक्रिया में शामिल कई चरणों के माध्यम से संगठन की सुविधा के लिए है । यह लेख पूरे प्रदर्शन में रुचि शोधकर्ताओं के लिए उपयुक्त है-भ्रूण विकासशील में स्वस्थानी संकरण में माउंट, लेकिन अभी तक प्रक्रिया नहीं किया है । astyanax शोधकर्ताओं के लिए चुना दृष्टिकोण का लाभ यह है कि यह परीक्षण किया गया है और दोनों cavefish और सतह मछली morphs में सिद्ध है, जिससे तुलनात्मक अभिव्यक्ति विश्लेषण की सुविधा । प्रस्तुत विधि astyanax और अंय प्रणालियों पर अध्ययन में शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Protocol

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यहां वर्णित सभी विधियों इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड फीमेल कमेटी (iacuc) द्वारा यूनिवर्सिटी ऑफ सिनसिनाटी (Protocol #10-01-21-01) को मंजूरी दी गई है ।

1. नियतन

  1. एक प्रजनन टैंक से astyanax mexicanus भ्रूण की वांछित संख्या को अलग और फिक्स ~ ५० एक समय में भ्रूण । यदि भ्रूण बड़े और पुराने हैं, तो भी निर्धारण को सुनिश्चित करने के लिए 25 बार तय करना आवश्यक हो सकता है ।
  2. भ्रूण की उम्र के आधार पर, एनेस्थेसिया के iacuc-अनुमोदित विधि का उपयोग करें । एक कामकाजी तंत्रिका तंत्र के साथ पुराने भ्रूण के लिए, संवेदनाहारी ओवरडोज के माध्यम से भ्रूण बलिदान । तदनुसार, ~ 1% tricaine के समाधान में जगह भ्रूण (पीएच ७.४ के लिए buffered) को कम करने के लिए दर्द और जीव के लिए असुविधा ।
  3. एक बार भ्रूण को छूने के लिए निष्क्रिय कर रहे हैं, tricaine युक्त प्रणाली पानी की जगह है, और जोड़ें ~ 1 1x फास्फेट-buffered खारा (pbs, पीएच ७.४) की मिलीलीटर ।
  4. pbs समाधान निकालें, और 4% paraformaldehyde (pbs) की 1 मिलीलीटर जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर भ्रूण ठीक ।
    सावधानी: पीएफए खतरनाक है (यानी, यह ज्वलनशील है और एक त्वचा और फेफड़ों में अड़चन है), देखभाल के साथ संभाल ।

2. निर्जलीकरण

  1. भ्रूण को डिहाइड्रेट करने के लिए, फिक्टिव समाधान निकालें और 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ कुल्ला करें । एक कोण पर (30 डिग्री और ४५ डिग्री के बीच) भ्रूण-युक्त की जगह, कुल्ला के दौरान एक मंच पर शेखर । भ्रूण को दो बार धोना जारी रखें, 5 मिनट प्रति वॉश ।
  2. यदि भ्रूण अभी भी एक चोरियों है, एक १०० मिमी x 25 मिमी पेट्री डिश में सभी ५० भ्रूण जगह है, और ध्यान से उंहें एक खुर्दबीन के नीचे watchmaker के संदंश (जैसे, #5 संदंश) के दो सेट का उपयोग कर चोरियों से अलग ।
    नोट: नीचे दिए गए चरणों के दौरान, और प्रोटोकॉल के शेष के लिए, ध्यान से अगले समाधान जोड़ने से पहले साफ, कांच pasteur पिपेट्स का उपयोग कर पिछले कदम से सभी तरल निकालें
  3. नीचे वर्णित मेथनॉल (मेथनॉल) के तेजी से केंद्रित बहाकर की एक श्रृंखला में भ्रूण dehydrate । dilutions प्रत्येक 4 मिलीलीटर गिलास शीशी में जा समाधान के ५०० μl के साथ एक मिलीलीटर कुल मात्रा पर आधारित हैं । कमरे के तापमान पर सभी निर्जलीकरण चरणों का प्रदर्शन (आरटी) मंच पर शेखर ।
    1. pbs समाधान को सावधानीपूर्वक निकालें । एक 25% meoh समाधान जोड़ें (२५० μl के meoh + ७५० μl pbs) । धीरे 5 मिनट के लिए एक मंच शेखर पर हिला ।
    2. ध्यान से 25% meoh समाधान निकालें । जोड़ें ५०% meoh समाधान (५०० μl के meoh + ५०० μl pbs) । धीरे 5 मिनट के लिए एक मंच शेखर पर हिला ।
    3. ध्यान से ५०% meoh समाधान निकालें । जोड़ें ७५% meoh समाधान (७५० μl के meoh + २५० μl pbs) । धीरे से 5 मिनट के लिए एक मंच शेखर पर हिला ।
    4. ध्यान से ७५% meoh समाधान निकालें । एक १००% meoh समाधान (meoh के 1 मिलीलीटर) जोड़ें । धीरे से 5 मिनट के लिए एक मंच शेखर पर हिला । इस चरण को 3 बार दोहराएं ।
  4. इस बिंदु पर, निर्जला भ्रूण की दुकान, के रूप में की जरूरत है, उनके गिलास में-20 डिग्री सेल्सियस (लंबी अवधि) में शीशियों । वैकल्पिक रूप से, प्रोटोकॉल के 1 दिन के लिए सीधे आगे बढ़ें ।

3. दिन 1: पुनर्जलयोजन

  1. -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से निर्जला भ्रूण प्राप्त करें (या चरण २.५ से सीधे आगे बढ़ें) ।
  2. एक pasteur पिपेट का उपयोग कर भ्रूण सॉर्ट करें । एक प्रकार के आधार पर क्रमबद्ध कर सकते हैं (यानी, गुफा और/या सतह), और प्रत्येक प्रयोग में मूल्यांकन जीन की संख्या. आमतौर पर एक बार हल किए जाने वाले प्रति शीशी 12 से अधिक भ्रूण नहीं होते हैं । संगठन बनाए रखने के लिए, प्रत्येक जीन के लिए वाइल्स और पिसेटों को नामित करने के लिए रंगीन लैब टेप का उपयोग करें । भ्रूण पूरे प्रोटोकाल के दौरान एक ही शीशी में रह जाएगा.
    नोट: यह उपयोग के बीच जीवाणुरहित करने के लिए १००% etoh में pasteur पिपेट की नोक प्लेस ।
  3. ७० डिग्री सेल्सियस के लिए एक मिलाते हुए पानी स्नान सेट एक बाद में कदम में इस्तेमाल किया जा करने के लिए । ध्यान से, छांटे गए भ्रूण की वाइल्स में meoh बाहर आकर्षित और नए १००% meoh के ५०० μl के साथ की जगह । (~ 1 मिनट) मंच शेखर पर संक्षेप में धो लें ।
  4. 20 tween के साथ 1x pbs की बढ़ती एकाग्रता में भ्रूण rehydrate (pbs, नीचे देखें) मंच पर शेखर । dilutions ५०० μl प्रत्येक शीशी में जाने के साथ एक 1 मिलीलीटर अंतिम कमजोर पड़ने की मात्रा पर आधारित हैं ।
    1. एक 25% pbt समाधान जोड़ें (२५० μl of pbt, ७५० μl of meoh). धीरे 5 मिनट के लिए एक मंच शेखर पर हिला ।
    2. 25% पीबीटी समाधान को सावधानीपूर्वक निकालें । जोड़ें एक ५०% pbt समाधान (५०० μl of pbt, ५०० μl of meoh) । धीरे 5 मिनट के लिए एक मंच शेखर पर हिला ।
    3. ध्यान से ५०% pbt समाधान निकालें । जोड़ें एक ७५% pbt समाधान (७५० μl of pbt, २५० μl of meoh) । धीरे 5 मिनट के लिए एक मंच शेखर पर हिला ।
    4. ध्यान से ७५% pbt समाधान निकालें । एक १००% pbt समाधान जोड़ें (1 मिलीलीटर पीबीटी) । धीरे से 5 मिनट के लिए एक मंच शेखर पर हिला । इस चरण को 3 बार दोहराएं ।

4. दिन 1: पाचन और निर्धारण

  1. पीके के 1 μl (20 मिलीग्राम/एमएल) को 2 मिलीलीटर पीबीटी से जोड़कर एक प्रोटिनेज़ K (pk) समाधान तैयार करें ।
  2. बाद के चरणों की प्रत्याशा में, संकरण बफ़र्स के जमे हुए aliquots प्राप्त (hyb-और hyb +; पूरक फ़ाइल 2 और पूरक फ़ाइल देखें 3) और पीएफए से-20 ° c भंडारण.
    1. pfa को RT पर गल जाने दें.
    2. एक घूर्णन ७० ° c पानी स्नान में hyb-और hyb की जगह aliquots + । सभी अभिकर्मकों और एक जाल नीचे के साथ एक छोटा सा पाल बांधने की रस्सी के अंदर, शीशियों प्लेस, फ्लोटिंग पानी स्नान उपकरण के अंदर । इस घूर्णन ७० ° c पानी स्नान से ट्यूबों और शीशियों के सरल इसके अलावा और हटाने में सक्षम बनाता है ।
  3. धीरे सभी ऊतकों को पूरी तरह से समाधान के साथ कवर कर रहे हैं सुनिश्चित करने के भ्रूण की शीशी (ओं) के लिए पीके समाधान जोड़ें । पीके में ~ 12 मिनट के लिए भ्रूण डाइजेस्ट मंच पर काम कर समाधान शेखर ।
    ध्यान दें: इष्टतम परिणाम सुनिश्चित करने के लिए जांचकर्ता द्वारा पाचन की लंबाई को अलग किया जा सकता है ।
  4. धीरे से pk समाधान ड्रा, और संक्षेप में किसी भी शेष पीके को पतला करने के लिए पीबीटी के साथ शीशी बाढ़ ।
  5. पीबीटी समाधान को ड्रा करें और नए पीबीटी के ५०० μl के साथ बदलें । 5 मिनट के लिए मंच शेखर पर कुल्ला करने के लिए समाधान की अनुमति दें ।
  6. बंद पीबीटी ड्रा और गल 4% pbt के ५०० μl के साथ बदलें । भ्रूण को 20 मिनट के लिए RT पर मंच पर शेखर के लिए सेते करने की अनुमति दें ।
  7. 4% पीएफए को ड्रा करें, और किसी भी शेष पीएफए को पतला करने के लिए पीबीटी के साथ शीशी को संक्षेप में फ्लड करें । बंद पीबीटी ड्रा, और ताजा पीबीटी के ५०० μl के साथ प्रतिस्थापित करें । भ्रूण के लिए मंच पर 5 मिनट के लिए कुल्ला करने की अनुमति दें शेखर । इस चरण को 4 बार दोहराएं ।

5. दिन 1: पूर्व संकरण

  1. शीशी में पूर्व-गर्म hyb-समाधान के ५०० μl प्लेस । 5 मिनट के लिए ध्यान से मिलाते हुए बिना ७० ° c पानी स्नान (गास्केट के अंदर) में शीशी जगह है ।
  2. hyb-समाधान को ड्रा करें और शीशी को प्री-गर्म हाइब + समाधान के ५०० μl के साथ फ्लड करें । शीशी वापस मिलाते हुए (४० rpm) के साथ ७० ° c पानी स्नान में रखें । या तो 4 ज, या रात भर के लिए सेते ।
    नोट: एक 4 एच ऊष्मायन सीटू प्रोटोकॉल है कि कुल में 4 दिनों के लिए पिछले जाएगा में एक पूर्ण उपज होगी । यहां, यह कदम एक रातोंरात ऊष्मायन, जो कुल में 5 दिनों तक चलने प्रोटोकॉल निकलेगा के रूप में प्रस्तुत किया है ।

6. दिन 2: संकरण

  1. 5 मिनट के लिए मिलाते हुए गर्म पानी स्नान में-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से hyb के एक aliquot प्लेस + ।
  2. शीशी से hyb + दूर ड्रा और पूर्व गर्म hyb के ५०० μl के साथ बदलें । इस समाधान के लिए, ध्यान से प्रत्येक शीशी के लिए आरएनए जांच के 2 μl जोड़ें । धीरे से शीशी को भी जांच का वितरण सुनिश्चित करने के भंवर ।
  3. ७० ° c गर्म पानी स्नान रात भर जबकि ४० rpm पर मिलाते हुए hyb (अतिरिक्त जांच के साथ) समाधान सेते ।
    नोट: एक फिर से उपयोग कर सकते है hyb + (जांच के साथ) समाधान । इस के लिए,-20 ° c फ्रीजर से पहले चलाने से जांच के साथ hyb + ले और यह एक गर्म पानी स्नान में 5 मिनट के लिए जगह है । hyb + के साथ दिन 1 प्रोटोकॉल से हाइब + की जगह जांच के साथ + और गर्म पानी के स्नान में रातोंरात incubating की अनुमति देते हैं ।

7. दिन 3: समाधान तैयारी

  1. "जीन-ऑफ-इंटरेस्ट" आरएनए जांच के साथ, हाइब लेबल वाले माइक्रोसेंट्रेज ट्यूब तैयार करें । dilutions की श्रृंखला है कि 3 दिन के दौरान इस्तेमाल किया जाएगा तैयार करें ।
    1. 6 अलग ट्यूबों का उपयोग करना, hyb की dilutions की निंनलिखित श्रृंखला तैयार-और खारा सोडियम साइट्रेट (एसएससी, 0 से १००%) 1 मिलीलीटर मात्रा में, और उन्हें ७० डिग्री सेल्सियस में जगह पानी स्नान मिलाते हुए: ट्यूब 1 = १००% hyb-(hyb की 1 मिलीलीटर-): ट्यूब 2 = 25% 2x एसएससी (२५० μl of 2x एसएससी, ७५० μl of hyb-); Tube 3 = ५०% 2x एसएससी (५०० μl of 2x ssc, ५०० μl of hyb-); Tube 4 = ७५% 2x एसएससी (७५० μl of 2x ssc, २५० μl of hyb-); ट्यूब 5 = १००% 2x एसएससी (2x एसएससी की 1 मिलीलीटर); ट्यूब 6 = १००% 0.2 एक्स एसएससी (0.2 एक्स एसएससी की 2 मिलीलीटर) ।
      नोट: एसएससी की एकाग्रता के बारे में सतर्क रहें, क्योंकि यह 2x से 0.2 x तक बदलता है ।
    2. 4 अलग ट्यूबों का उपयोग करना, एक 1 मिलीलीटर मात्रा में पीबीटी और एसएससी की dilutions की निम्नलिखित श्रृंखला तैयार, और आरटी पर जगह: ट्यूब 1 = 25% पीबीटी (२५० μl of pbt, ७५० μl of 0.2 x SSC); ट्यूब 2 = ५०% पीबीटी (५०० μl of pbt, ५०० μl of 0.2 x SSC); ट्यूब 3 = ७५% पीबीटी (७५० μl of pbt, २५० μl of 0.2 x SSC); ट्यूब 4 = १००% पीबीटी (पीबीटी के 1ml) ।
    3. 2 मिलीलीटर के साथ एक ट्यूब तैयार मलेइक एसिड बफर युक्त 20 (mabt) काम कर समाधान ।
    4. अवरुद्ध समाधान के २ १५ मिलीलीटर शंकु ट्यूबों तैयार करें । प्रत्येक ट्यूब में, ०.२ जी को अवरुद्ध अभिकर्मक के 10 एमएल mabt के लिए जोड़ें ( पूरक फ़ाइल देखें 4). एक nutating मिक्सर पर दोनों ट्यूबों प्लेस (या मंच शेखर) जब तक पूरी तरह से समाधान में भंग (अप करने के लिए 3 ज).

8. दिन 3: जांच हटाने

  1. एक गिलास pasteur पिपेट के साथ hyb + (जांच के साथ) समाधान ड्रा और यह एक बाँझ, लेबल microcentrifuge ट्यूब में जगह है । भविष्य में उपयोग के लिए-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में इस ट्यूब को बरकरार रखें (यदि जांच-लेबलिंग सफल है) ।
  2. ध्यान से गर्म SSC/hyb-dilutions के ५०० μl जोड़ने (नीचे संकेत) । ७० डिग्री सेल्सियस पानी स्नान मिलाते हुए 10 मिनट प्रत्येक के लिए निम्नलिखित समाधानों में सेते हैं ।
    1. १००% hyb-(hyb की 1 मिलीलीटर-), 25% 2x एसएससी (२५० μl of 2x एसएससी, के साथ सेते क्रमिक रूप से ७५० μl of hyb-), ५०% 2x ssc (५०० μl of 2x ssc, ५०० μl of hyb-), ७५% 2x ssc (७५० μl of 2x ssc, २५० μl of hyb-), १००% 2x ssc (1 mL of 2x ssc) , १००% 0.2 x एसएससी (0.2 x एसएससी की 2 मिलीलीटर) ।
  3. अंतिम चरण के बाद, प्रत्येक 10 मिनट के लिए निम्नलिखित समाधानों में सेते हैं । निंनलिखित इनकुबेशंस के सभी मंच पर आरटी पर जगह ले शेखर: 25% पीबीटी (२५० μl of pbt, ७५० μl of 0.2 x ssc), ५०% पीबीटी (५०० μl of pbt, ५०० μl of 0.2 x ssc), ७५% पीबीटी (७५० μl of pbt, २५० μl of 0.2 x ssc) , १००% पीबीटी (1 मिलीलीटर पीबीटी) ।
  4. एक 10 मिनट ऊष्मायन के बाद, १००% pbt को हटा दें, और प्रत्येक शीशी में mabt के ५०० μl जोड़ें । 5 मिनट के लिए यह चरण दो बार दोहराएं ।

9. दिन 3: अवरुद्ध

  1. प्रत्येक शीशी और ट्यूबों में से एक से premixed अवरुद्ध समाधान के साथ बाढ़ से mabt निकालें (7.1.4 कदम में तैयार). आरटी पर ~ 4 एच के लिए एक nutating मिक्सर पर प्लेस शीशी ।
  2. 10 मिलीलीटर अवरुद्ध समाधान की दूसरी शीशी में एंटी-डीआईजी-एपी फैब अंशों के 2 μl जोड़ें (कदम 7.1.4 में तैयार) और संक्षेप में भंवर ।
  3. प्रत्येक शीशी को लगभग पूरी तरह से अवरुद्ध समाधान (~ 5 मिलीलीटर) के साथ भरें और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रेफ्रिजरेटर में रात भर nutating मिक्सर पर रखें ।

10.4 दिन: mabt rinses

  1. mabt में 10% सामांय बकरी सीरम (ngs) के एक शेयर शीशी तैयार (ngs के १०० μl को ९०० μl के mabt) जोड़ें ।
  2. प्रत्येक शीशी में ब्लॉकिंग समाधान को ड्रा करें और प्रत्येक शीशी में ngs/mabt मिश्रण के ५०० μl जोड़ें । भ्रूण को मंच पर आरटी पर 25 मिनट के लिए सेते करने की अनुमति दें शेखर ।
  3. ngs/mabt मिश्रण को १००% mabt के ५०० μl के साथ बदलें । प्लेटफार्म शेखर पर आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते । इस कुल्ला प्रदर्शन 11 दिन भर में हर 30 मिनट में अधिक बार ।
  4. १००% mabt के साथ शीशी भरें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रेफ्रिजरेटर या वॉक-इन चैंबर में रात भर एक nutating मिक्सर पर रखें ।

11. दिन 5: जांच दृश्य

  1. क्षारीय फॉस्फोटेस (एपी) बफर की एक ५० मिलीलीटर aliquot तैयार ( पूरक फ़ाइल देखें 5). एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में निम्नलिखित का मिश्रण प्रकाश जोखिम को सीमित करने के लिए: 5 मिलीलीटर की 1 मीटर Tris (पीएच ९.५), 5 मिलीलीटर की ५० मिमी mgcl2, 5 मिलीलीटर की 1% 20, 5 मिलीलीटर 1 मीटर nacl, ddH2O की 30 मिलीलीटर ।
  2. mabt निकालें और एपी बफर के 1 मिलीलीटर (ट्यूब पन्नी में लिपटे) के साथ बदलें । इसे 5 मिनट के लिए धो दें । यह दो बार करने के लिए mabt के पूर्ण हटाने सुनिश्चित करते हैं ।
  3. एपी बफर निकालें और ३.५ μl 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3'-इंडोलिफॉस्फेट (bcip) और नाइट्रो-ब्लू टेट्राज़ोलियम (एनबीटी) के ४.५ μl के साथ 1 मिलीलीटर एपी बफर के साथ बदलें । प्रतिक्रिया पूर्ण होने तक हर घंटे में एक बार नए सिरे से तैयार एपी बफर/NBT/bcip के साथ बदलें । बारीकी से मॉनिटर, हर 15 मिनट की जाँच, रंगाई प्रतिक्रिया दाग के वांछित स्तर हासिल किया गया है जब तक जगह लेने के लिए अनुमति देने के लिए. यदि हाला के रूप में शुरू होता है, समाधान जल्दी ही बदल जाते हैं ।
  4. ताजा १००% एपी बफर में भ्रूणों को धोने के द्वारा रंगाई प्रतिक्रिया बंद करो (NBT/bcip के बिना) 5 मिनट के लिए (पृष्ठभूमि धुंधला की ंयूनतम मात्रा के साथ) संकेत के इष्टतम स्तर तक पीबीटी में rinsing जारी है हासिल कर रहे हैं । एपी बफर में पीबीटी की बढ़ती dilutions के साथ नमूनों कुल्ला करने के लिए जारी रखें निम्नानुसार: 25% पीबीटी (२५० μl of pbt, ७५० μl of ap buffer), कुल्ला के लिए 5 min; ५०% पीबीटी (पीबीटी के ५०० μl, एपी बफर के ५०० μl), 5 मिनट के लिए कुल्ला; ७५% पीबीटी (पीबीटी के ७५० μl, एपी बफर के २५० μl), 5 मिनट के लिए कुल्ला ।
  5. के ~ 5 मिलीलीटर में भ्रूण कुल्ला १००% pbt पर जब तक वांछित ंयूनतम पृष्ठभूमि धुंधला तक पहुंच जाता है nutating मिक्सर पर । ताजा पीबीटी के साथ कई बार बाहर स्विच करें । यह कई दिनों तक लग सकता है ।
  6. जब rinsing पूरा हो गया है, एक मंच शेखर पर बाँझ pbs के ५०० μl में भ्रूण धोने । 5 मिनट के लिए इस कुल्ला दो बार प्रदर्शन । पीबीएस washes के बाद, एक मंच शेखर पर आरटी में 1 एच के लिए 4% पीएफए के ५०० μl में नमूनों के बाद ठीक । वैकल्पिक रूप से, 4 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में 4% पीएफए के 1 मिलीलीटर में रात भर ठीक करें ।
  7. ताजा, बाँझ pbs के साथ फिक्टिव बदलें । 5 मिनट के लिए इस कुल्ला को कम से दो बार करें । १००% बाँझ pbs के ~ 4 मिलीलीटर में भ्रूण रखें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि की दुकान ।

12. इमेजिंग

  1. एक पेट्री डिश में एक इमेजिंग प्लेट बनाएं 3% agarose और TAE बफर का उपयोग कर ।
    नोट: मात्रा कितनी प्लेट की जरूरत पर निर्भर करता है । प्लेटें कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है । यह अनुशंसित है कि एक उथले आयताकार मोल्ड पेट्री डिश में रखा गया है, जबकि जेल में ठंडा है ताकि थाली पर भ्रूण युक्त के लिए एक अवसाद पैदा करने के लिए ।
  2. पीबीएस में प्लेट पर भ्रूण रखें ।
    नोट: यह सबसे अच्छा है के लिए धीरे थाली पर भ्रूण डालना के बजाय उंहें बाहर pipetting क्योंकि यह पाया गया है कि वे प्लास्टिक के अंदर पिपेट के लिए छड़ी जाएगा ।
  3. प्रत्येक भ्रूण की कल्पना करने के लिए प्रकाश सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग करें । वांछित स्थिति के लिए भ्रूण पैंतरेबाज़ी करने के लिए एक कुंद जांच का प्रयोग करें ।
  4. एक छवि ले जब भ्रूण वांछित स्थिति में है । ध्यान दें कि दाग के संभावित क्षरण से बचने के लिए पूरे दाग के कुछ हफ्तों के भीतर भ्रूण की छवियों को लेना महत्वपूर्ण है ।

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Representative Results

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इस रिपोर्ट में, हम उच्च गुणवत्ता वाले जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए भ्रूण astyanax नमूनों की लेबलिंग करने के लिए एक सरल और सीधा दृष्टिकोण प्रदान करते हैं । इस तकनीक को या तो चार या पांच दिनों में किया जा सकता है, और प्रक्रिया में प्रत्येक मुख्य चरण को रंग-कोडित फ़्लोचार्ट (चित्र 1) में दर्शाया जाता है । एक बार पूरा होने पर, दाग वाले भ्रूण को एक गहरे बैंगनी रंग के लेबल को बंदरगाह करना चाहिए जो ऊतकों में ब्याज के विशेष जीन को व्यक्त करते हैं । हम सफलतापूर्वक दोनों pachón cavefish में इस प्रोटोकॉल को लागू किया है (चित्रा 2aबी, ई) और भूतल मछली (चित्रा 2aडी, एफ) भ्रूण ।

cavefish भ्रूण दो ट्रांसक्रिप्शन कारकों है कि लेबल जल्दी तंत्रिका शिखा के ऊतकों, Sox9 और Tfap2a5,6के लिए दाग रहे थे । Sox9 अभिव्यक्ति के लिए लेबल में स्पष्ट लेबलिंग का प्रदर्शन विकासशील क्लोम आरकेस्ट्रा और पेक्टोरल फिन (पीला arrowheads, चित्रा 2a) । ध्यान दें कि दाग की जर्द थैली या पार्श्व पर विकासशील सोइट्स में लगभग अनुपस्थित है (चित्रा 2a) । इसी प्रकार, Tfap2a अभिव्यक्ति विकासशील सिर के भागों में स्पष्ट है, साथ ही जल्दी प्रवास तंत्रिका शिखा कोशिकाओं (चित्रा 2b, arrowhead) भ्रूण के पृष्ठीय पार्श्व क्षेत्र के साथ । तीसरे प्रतिनिधि cavefish भ्रूण के लिए प्रस्तुत जीन Phf20aहै, osteoblast भेदभाव के एक मार्कर7। ध्यान दें कि सोमिटिक मध्यजनस्तर और पीछे सिर है कि बोनी ऊतक (चित्रा 2e, arrowheads) को जंम देने के लिए किस्मत में है के हिस्से में सकारात्मक धुंधला ।

सतह मछली भ्रूण में, हम जीन cxcr, Adcyap1a, और Sox10के लिए जांच की । cxcr encodes एक जी प्रोटीन झिल्ली-बाध्य रिसेप्टर कि बांध cxcr chemokines8। धनात्मक लेबलिंग सिर और पार्श्व के पृथक क्षेत्रों (चित्रा 2f, ऐरोहेड) में विद्यमान होती है और साथ ही कुछ एकल कोशिकाएं जर्द कोश को उखाड़ कर जाती हैं । जीन adenylate cyclase सक्रिय पॉलीपेप्टाइड, Adcyap1a, पिट्यूटरी कोशिकाओं सहित केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के क्षेत्रों में व्यक्त किया जाता है. युग्मित, भ्रूण के पृष्ठीय पहलू पर कोशिकाओं के द्विपक्षीय समूहों में अत्यधिक विशिष्ट अभिव्यक्ति ध्यान दें; साथ ही मध्यरेखा अभिव्यक्ति का एक बड़ा क्षेत्र (चित्रा 2c, arrowheads) । अंत में, हम Sox10की अभिव्यक्ति, एक ट्रांसक्रिप्शन कारक है जो जल्दी तंत्रिका शिखा और oligodendrocyte कोशिकाओं10लेबल प्रस्तुत करते हैं । अत्यधिक विशिष्ट सकारात्मक धुंधला पृष्ठीय भ्रूण के बाईं और दाईं तरफ के तंत्रिका शिखा के एक प्रारंभिक मार्कर के रूप में स्पष्ट है (चित्रा 2d, arrowheads) ।

हम एक conसंस्थापकों के दो प्रकार के अंय जांचकर्ताओं मुठभेड़ हो सकता है प्रस्तुत करते हैं । पहली बार एक समस्या समय से मुठभेड़ गैर विशिष्ट लेबलिंग के बिंदुकित तिनको है । इन तिनको अंतिम mabt rinses से हाला के रूप में पैदा हो सकता है, या रंगाई प्रतिक्रियाओं के दौरान एपी बफर. इस गैर-विशिष्ट लेबलिंग का एक उदाहरण Pnp4aकी अभिव्यक्ति के लिए सतह मछली भ्रूण दाग की जर्द थैली पर स्पष्ट है । यह जीन एक एंजाइम को एन्कोड करता है जो इंद्रधनुषी रंजकता11के उत्पादन को सुगम बनाता है । यह जीन पहले विकासशील आंख और तैरने वाले मूत्राशय में स्पष्ट होता है । कुछ सतह नमूनों (चित्रा 3a) में मनाया जाने वाला पंचर तिनको, प्रोटोकॉल के अंतिम चरणों में अक्सर बहाकर और एपी बफर + NBT/bcip के प्रतिस्थापन से सफाया कर दिया गया था (चित्रा 3a). एक दूसरा मुद्दा है कि एक समय के मुठभेड़ों है फैलाना, जीन है कि अंयथा एक अलग अभिव्यक्ति पैटर्न उत्पादन होगा की काफी हद तक गैर विशिष्ट अभिव्यक्ति है । एक उदाहरण के जीन BMP4है, जो नमूना भर में मौजूद क्रोमोजेन के निम्न स्तर के साथ एक मोटे तौर पर फैलाना पैटर्न के रूप में प्रकट होता है (चित्रा 3c). इन जैसे मामलों में, हम आम तौर पर जीन के एक अलग क्षेत्र की पहचान, एक सदिश में बढ़ाना और एक नया जांच संश्लेषण प्रदर्शन ( पूरक फ़ाइल देखें 6). एक नियंत्रण (कोई जांच) नमूना (चित्रा 3 डी) का उदाहरण हमारे विफल BMP4 जांच के फैलाना और गैर विशिष्ट प्रकृति वर्णन करने के लिए प्रदान की जाती है ।

Figure 1
चित्रा 1: स्वस्थानी संकरण में पूरे माउंट के लिए एक सरल फ़्लोचार्ट । यह फ़्लोचार्ट स्वस्थानी संकरण में के प्रमुख चरणों को समझाने के लिए रंग-कोडिंग का उपयोग करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: छह जीन के लिए प्रतिनिधि धुंधला, दोनों गुफा और astyanaxकी सतह morphs का उपयोग कर । () छवि एक ७२ एच पोस्ट-निषेचन (hpf) pachón cavefish (45x) के सही पार्श्व पक्ष पर Sox9 के विशिष्ट धुंधला (पीला तीर) से पता चलता है । () Tfap2a के लिए विशिष्ट धुंधला एक ३६ hpf pachón cavefish (45x) के दाहिने पार्श्व पक्ष पर स्पष्ट है । () Adcyap1a के द्विपक्षीय और मिडलाइन धुंधला (पीला एरोहेड) एक ७२ hpf सतह मछली (100x) के पृष्ठीय क्षेत्र में लेबल रहे हैं । () एक 24 hpf सतह मछली (100x) के तंत्रिका शिखा ऊतकों में Sox10 के धुंधला । () Phf20a एक बेहोश दर्शाता है, लेकिन स्पष्ट, एक 24 hpf pachón cavefish (100x) के पृष्ठीय क्षेत्र में अभिव्यक्ति के पैटर्न । () साइटोकाइन रिसेप्टर, cxcr, एक 24 hpf सतह मछली (100x) के सही पार्श्व पक्ष के अलग क्षेत्रों में व्यक्त की है । A, B, E, F = ०.५ मिमी में स्केल पट्टियां; स्केल सलाखों में सी, डी = २.५ मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: स्वस्थानी संकरण में पूरे माउंट के लिए उप-इष्टतम परिणामों के प्रतिनिधि उदाहरण । () विशिष्ट धुंधला एक ७२ hpf pachón cavefish (100x) के सही पार्श्व पहलू पर गैर विशिष्ट हाला और/या मलबे (लाल arrowhead) के साथ स्पष्ट है । () एक ही जांच एक ७२ hpf pachón cavefish (100x) में हाला या पृष्ठभूमि के बिना एक ही धुंधला पैटर्न का चित्रण, में कल्पना । () एक ७२ hpf pachón cavefish का अधिकार पार्श्व पार्श्व फैलाना, गैर विशिष्ट 45x इज़ाफ़ा पर BMP4 के लिए धुंधला दर्शाता है । () एक ७२ hpf pachón cavefish इस प्रोटोकॉल के अधीन, जांच के अलावा (45x) के बिना । स्केल पट्टियां = ०.५ मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

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आरएनए के क्षरण के लिए जोखिम के कारण, प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक आरएनए जांच के बाँझ संश्लेषण से संबंधित है । हालांकि, अगर एक जांच ध्यान से उत्पंन है, और अच्छे परिणाम प्रदान करता है, यह बाद में धुंधला प्रतिक्रियाओं में पुन: उपयोग किया जा सकता है । एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम प्रोटोकॉल भर में इस्तेमाल सभी अभिकर्मकों के सावधान उत्पादन है । चूंकि इस प्रोटोकॉल में कई दिन और कई छोटे कदम शामिल हैं, इसलिए यह आवश्यक है कि सभी अभिकर्मकों को सही ढंग से उत्पादित किया जाए, और एक बाँझ तरीके से संग्रहित किया जाए । इसके अलावा, यह मौलिक महत्वपूर्ण है कि जांचकर्ता प्रोटोकॉल में प्रत्येक चरण का ध्यान रखें । हमने पाया है कि इस प्रोटोकॉल के प्रत्येक पहलू की सटीक और सटीक पूर्णता सुनिश्चित करने में चरणों की प्रदान की गई चेकलिस्ट अत्यंत उपयोगी हो सकती है ।

हम अक्सर हम यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को संशोधित नहीं है । हालांकि, जांचकर्ताओं को सुझाए गए लोगों की तुलना में विभिन्न तापमान पर जांच इंयूबेशंस प्रदर्शन कर सकते हैं (यानी, ७० डिग्री सेल्सियस) । संकरण तापमान में मामूली परिवर्तन आरएनए जांच के बंधन को प्रभावित करेगा, और इसलिए, इष्टतम संकरण तापमान की मांग सकारात्मक दाग की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकती है । समस्या निवारण के संबंध में, हम दृढ़ता से अन्य जांचकर्ताओं को इस आलेख (पूरक फ़ाइल 1) के साथ प्रदान की गई चेकलिस्ट का उपयोग करने के लिए प्रोत्साहित करते हैं । सावधान रिकॉर्ड बनाए रखने के उच्च गुणवत्ता धुंधला सुनिश्चित करने में एक आवश्यक पहला कदम है । एक दूसरा मामूली संशोधन का सुझाव दिया है के लिए अंतिम रंगाई प्रतिक्रिया के बिना कमाल प्रदर्शन (जैसे, एक मंच शेखर या nutator पर रखने के बिना) । इस के लिए कारण यह है कि आवधिक रूप से हम precipitate के उत्पादन पर ध्यान दें, कि संभवतः एपी बफर समाधान से उठता है । यह एक काले रंग के लिए आमतौर पर overstains वेग और दाग ऊतक पर पंचर (गैर विशिष्ट) पृष्ठभूमि बनाता है । इस precipitate के उत्पादन को कम करने के लिए, हम सिर्फ एक प्रतिक्रिया से पहले निष्फल एपी बफर तैयार करते हैं । इसके अलावा, एक बार NBT और bcip को बफर में जोड़ दिया गया है, हम इसे फ्रेश बफर और NBT/bcip के साथ हर घंटे की जगह तब तक बदलते हैं जब तक कि रंगाई की प्रतिक्रिया पूरी नहीं हो जाती ।

प्रस्तुत विधि के लिए एक सीमा है कि एक रंगीन दाग जीन अभिव्यक्ति दृश्य के लिए इस्तेमाल किया गया था । हम इस दृष्टिकोण पसंद करते है क्योंकि यह लागत प्रभावी है, और केवल प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए कल्पना की आवश्यकता है । यदि एक मात्रात्मक मतभेदों के मूल्यांकन में रुचि रखते थे, हम सुझाव है कि वे एक फ्लोरोसेंट रंगाई प्रतिक्रिया का उपयोग करें । यह अर्ध-quantitation, उदाहरण के लिए, प्रयोगों के बीच अभिव्यक्ति के सापेक्ष फ्लोरोसेंट इकाइयों की तुलना के माध्यम से सक्षम हो जाएगा.

स्वस्थानी संकरण में प्रोटोकॉल वेब पर व्यापक रूप से उपलब्ध हैं12,13, साथ ही वैज्ञानिक प्रकाशनों में । प्रोटोकॉल है कि हम वर्तमान हमारे मॉडल प्रणाली, astyanax mexicanusके लिए विशेष रूप से विकसित किया गया था । हम इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है जीन के कई दर्जनों की अभिव्यक्ति दाग, और लगता है कि यह लगातार उच्च गुणवत्ता के परिणाम प्रदान करता है । इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि इस प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण की सटीक पूर्णता सुनिश्चित करते हुए जांचकर्ता को एकाधिक कार्य करने के लिए सक्षम करने के लिए आइटम की चरण-दर-चरण चेकलिस्ट है । हमें उंमीद है कि इस प्रोटोकॉल के क्षेत्र में अंय जांचकर्ताओं के लिए एक उपयोगी संसाधन के रूप में काम करेंगे और परे, और आशा है कि इस आम प्रयोगशाला तकनीक भविष्य नेत्रहीन मैक्सिकन cavefish में phenotype को जीनोटाइप जोड़ने खोजों का समर्थन करेंगे ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक इस पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणियों के लिए सकल प्रयोगशाला के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम चार हाई स्कूल के छात्रों को स्वीकार करना चाहते हैं, जो २०१७ और २०१८ में गर्मियों में इंटर्नशिप के दौरान इस प्रोटोकॉल का उपयोग क्रिस्टीन काओ, माइकल वार्डन, आकि ली, और डेविड nwankwo सहित । hl २०१७ की गर्मियों के दौरान एक यूसी जीव विज्ञान स्टेम फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था । इस काम के अनुदान द्वारा समर्थित था राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (देब-१४५७६३० करने के लिए jbg), और दंत चिकित्सा और craniofacial अनुसंधान के राष्ट्रीय संस्थानों (nih; DE025033 to jbg).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Serological Pipette VWR 89130-888
1000 mL Filtration Unit VWR 89220-698
15 mL Conical VWR-Greiner 82050-278
25 mL Serological Pipette VWR 89130-890
250 mL Filtration Unit VWR 89220-694
5 mL Serological Pipette VWR 89130-886
50 mL Conical VWR-Falcon 21008-940
500 mL Filtration Unit VWR 89220-696
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma-Roche 11093274910
BCIP Sigma-Aldrich B8503-1G 1 g
Blocking Solution Sigma-Roche 11 096 176 001 50 g
Citric Acid Fisher Scientific A104-500 500 g
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) Sigma-Roche 11175025910
Eppendorf Tubes VWR 20170-577
Ethanol Fisher-Decon 04-355-223 1 Gal
Formamide Thermo Fisher Scientific 17899 100 mL
Glass dram vials VWR 66011-041 1 Dr
Glass Pipettes Fisher Scientific 13-678-8A
HCl Thermal-ScientificPharmco-AAPER 284000ACS 500 mL
Heparin Sigma H3393-25KU
Magnesium Chloride-crystalline Fisher Scientific M33-500 500 g
Maleic Acid Sigma M0375-100g 100g
Methanol Fisher Scientific A452-4 4L
Molecular-grade Water (RNase-free) VWR 7732-18-5 500 mL
NaCl Fisher Scientific S271-3 3 kg
NaOH pellets Fisher Scientific S318-500 500 g
NBT Substrate powder ThermoFisher Scientific 34035 1 g
Normal Goat Serum Fisher-Invitrogen 31873
Nutating Mixer VWR 82007-202
Paraformaldehyde Sigma 158127-500g 500 g
PBS 10x Fisher Scientific BP399-20 20L
Proteinase K (200mg/10ml) Qiagen 19133 10 mL
Plastic Pipettes VWR-Samco 14670-147
RNAse Sigma R2020-250mL 250 mL
Shaking Water Bath 12 L VWR 10128-126 12 L
Standard Analog Shaker VWR 89032-092
Tris Sigma Millipore-OmniPur 9210-500GM 500 g
tRNA Yeast Fisher-Invitrogen 15401011 25 mg
Tween 20 Sigma P9416-50mL 50 mL
Vortex-Genie 2 Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc 50-728-002
Lithium Chloride (LiCl) Sigma-Aldrich 203637-10G 10 g

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References

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<em>astyanax</em> भ्रूण के लिए स्वस्थानी संकरण में wholemount
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Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos. J. Vis. Exp. (145), e59114, doi:10.3791/59114 (2019).More

Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos. J. Vis. Exp. (145), e59114, doi:10.3791/59114 (2019).

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