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Genetics

विखंडन खमीर schizosaccharomyces pombe में एक गहरी sequencing-असिस्टेड, सहज दबानेवाला स्क्रीन

Published: March 7, 2019 doi: 10.3791/59133
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Department of Biology, Wake Forest University, 2Center for Molecular Communication and Signaling, Wake Forest University

Summary

हम विखंडन खमीर में एक सरल दबानेवाला स्क्रीन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस विधि कुशल, mutagen मुक्त है, और उत्परिवर्तन के लिए चयनात्मक है कि अक्सर एक एकल जीनोमिक locus में होते हैं ।  प्रोटोकॉल दमन है कि तरल संस्कृति है कि एक उत्परिवर्तन या एक दवा के कारण होते है में वृद्धि दोषों को कम करने के लिए उपयुक्त है ।

Abstract

उत्परिवर्ती एल्कल्स के लिए एक आनुवंशिक स्क्रीन जो उत्परिवर्तन के कारण होने वाले लक्षणप्ररूपी दोषों को दबाने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण जीन है कि बारीकी से संबंधित जैव रासायनिक रास्ते से जुड़े पहचान करने के लिए है । इस तरह के सिंथेटिक आनुवंशिक सरणी (sga) विश्लेषण के रूप में पिछले तरीकों, और यादृच्छिक mutagenesis तकनीकों का उपयोग पराबैंगनी (यूवी) या एथिल methanesulfonate (ईएमएस) या एन एथिल-एन-nitrosourea जैसे रसायनों, व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है, लेकिन अक्सर महंगा है और श्रमसाध्य. इसके अलावा, इन mutagen आधारित स्क्रीनिंग तरीकों अक्सर जीव पर गंभीर साइड इफेक्ट के साथ जुड़े रहे हैं, कई म्यूटेशन उत्प्रेरण कि दमन को अलग करने की जटिलता को जोड़ने. यहां, हम एक सरल और प्रभावी प्रोटोकॉल वर्तमान म्यूटेंट जो schizosaccharomyces pombeमें एक विकास दोष प्रदान में दबानेवाला उत्परिवर्तनों की पहचान । मानक अमीर तरल मीडिया या सिंथेटिक तरल मीडिया में वृद्धि की कमी के साथ कोशिकाओं की फिटनेस एक विस्तारित अवधि में एक स्वचालित ९६-well प्लेट रीडर का उपयोग कर वसूली के लिए निगरानी की जा सकती है । एक बार एक सेल संस्कृति में एक दबानेवाला उत्परिवर्तन का अधिग्रहण, उसके वंशज माता पिता की कोशिकाओं के उन outcompete । बरामद कोशिकाओं है कि माता पिता की कोशिकाओं पर एक प्रतिस्पर्धी विकास लाभ है तो अलग और पैतृक कोशिकाओं के साथ backcrossed किया जा सकता है । दबानेवाला म्यूटेशन तो पूरे जीनोम अनुक्रमण का उपयोग कर की पहचान कर रहे हैं । इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम सफलतापूर्वक कई दबानेवाला अलग है कि गंभीर विकास Elf1, एक एएए + परिवार atpase है कि परमाणु mrna परिवहन और जीनोमिक स्थिरता के रखरखाव में महत्वपूर्ण है के नुकसान की वजह से दोष कम । वर्तमान में विकास दोष प्रदान करने वाले म्यूटेंट के साथ एस. पोम्बे में ४०० से अधिक जीन हैं । के रूप में इन जीन के कई uncharacterized हैं, हम प्रस्ताव है कि हमारे विधि इस उपयोगकर्ता के अनुकूल, उच्च throughput दृष्टिकोण के साथ उपंयास कार्यात्मक बातचीत की पहचान की गुजारिश करेंगे ।

Introduction

जीन के बीच कार्यात्मक लिंक को समझने का आधार आणविक तंत्र (नों) की पहचान करने की क्षमता पर निर्भर करता है जिसके द्वारा जटिल आनुवंशिक लक्षण विविध phenotypes1का उत्पादन करने के लिए हट जाना. विखंडन खमीर में, schizosaccharomyces pombe (एस pombe), प्रोटीन के बहुमत कोडिंग जीन व्यवहार्यता2के लिए औषधाणु हैं । यह परिणाम इन जीन के महत्व को नहीं बोलता है, बल्कि इस तरह के जीन से संबंधित जैव रासायनिक मार्ग के जटिल क्षतिपूरक तंत्र के लिए है । विदारक इन क्षतिपूरक तंत्र प्रबलता नक्शे है, जो व्यापक आनुवंशिक बातचीत का पर्दाफाश किया है और कार्यात्मक जैव रासायनिक रास्ते की हमारी समझ चौड़ी3,4पैदा की है ।

उच्च throughput तरीकों (उदाहरण के लिए, सिंथेटिक आनुवंशिक सरणी विश्लेषण, या sga) के लिए विकसित किया गया है genome में व्यापक आनुवंशिक संबंधों की पहचान खमीर, और विखंडन खमीर5,6में उपयोग के लिए विस्तार किया गया है । इस तरह के दृष्टिकोण अक्सर सभी व्यवहार्य एकल प्रोटीन से युक्त उपभेदों के एक पुस्तकालय पर भरोसा-जीन विलोपन (३,३०० अगुणित विलोप विखंडन खमीर जीनोम के ९२% से अधिक को कवर muants के आसपास), और एक रोबोट हाथ की आवश्यकता के बीच आनुवंशिक पार प्रदर्शन ब्याज की तनाव और library6 में सभी संभव उपभेदों । इसके अलावा, sga तकनीकों पुस्तकालय उपभेदों की क्षमता पर निर्भर करने के लिए उचित और कुशल संभोग, एक phenotype कि ४४४ के लिए असामांय है वर्तमान में एस pombe2में जीन की विशेषता है ।

आनुवंशिक बातचीत की जटिलता के बावजूद, एक दो जीन के phenotype दो उपभेदों को ले जाने के प्रत्येक जीन के व्यक्तिगत उत्परिवर्तनों के लिए दो उल्लेखनीय परिणामों में से एक हो सकता है एक तनाव के phenotype तुलना: 1) डबल उत्परिवर्ती phenotype है बीमारी के रूप में अपेक्षित गुणनात्मक पैतृक phenotypes से भी बदतर या, सबसे चरम मामले में, lethality । यह एक नकारात्मक आनुवंशिक बातचीत के रूप में संदर्भित किया जाता है, और आम तौर पर एक संकेत है कि दो जीन समानांतर जैविक रास्ते में अधिनियम । 2) डबल उत्परिवर्ती phenotype माता पिता के phenotype के अपेक्षित संयोजन से बेहतर है, यह भी एक सकारात्मक आनुवंशिक बातचीत के रूप में जाना जाता है. एक सकारात्मक आनुवंशिक बातचीत विशेष रूप से दिलचस्प है क्योंकि यह इंगित करता है कि इन जीन एक ही प्रक्रिया में कार्य करते हैं । दो सकारात्मक बातचीत जीन तीन संभावित रिश्ते हैं: एक उत्परिवर्ती जीन हो सकता है अप-एक समानांतर मार्ग में अंय जीन की अभिव्यक्ति को विनियमित, दो जीन एक दूसरे की एक ही मार्ग बहाव के भीतर संगीत कार्यक्रम में काम कर सकते हैं, या दो जीन सांकेतिक शब्दों में बदलना प्रोटीन जो एक दूसरे के साथ सीधे बातचीत करते हैं । इसलिए, सकारात्मक आनुवंशिक बातचीत जीन नियामक नोड्स नक्शा और जैव रासायनिक रास्ते में अवर्णित जीन वर्गीकृत करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता7,8.

एक दबानेवाला एक उत्परिवर्तन है कि एक और जीन के उत्परिवर्तन की बीमारी phenotype को कम कर सकते हैं, आम तौर पर दो जीन9,10के बीच एक सकारात्मक आनुवंशिक बातचीत का प्रतिनिधित्व । उत्परिवर्तन वे दबाने से एक अलग लोकस पर दबानेवाला उत्परिवर्तन extragenic दमन के रूप में जाना जाता है । वे कृत्रिम रूप से घातक phenotype को बचाने के द्वारा गैर-व्यवहार्य आनुवंशिक उत्परिवर्तनों का अध्ययन करने में विशेष रूप से मूल्यवान हैं (यह भी लाजर प्रभाव के रूप में जाना जाता है)11. वे भी वंशानुगत रोगों के इलाज में संभावित चिकित्सीय अनुप्रयोगों है12,13.

इन सभी कारणों के लिए, विभिन्न मॉडल जीवों में दबानेवाला म्यूटेशन की पहचान व्यापक रूप से विभिन्न जैव रासायनिक रास्ते की हमारी समझ की सुविधा के लिए उपयोग किया गया है14,15,16. दमन के लिए स्क्रीनिंग आम तौर पर सवाल में उत्परिवर्तन के phenotype पर आधारित है और यादृच्छिक mutagenesis के संचालन के लिए परिवर्तन है कि phenotype कम होगा अलग करने की आवश्यकता है । लगभग सभी मॉडल जीवों ने यादृच्छिक उत्परिवर्तन विधियों की स्थापना की है । उदाहरण के लिए, एन एथिल-एन-नाइट्रीसौरिया (ENU) और एथिलमेथेन्सल्फोनेट (ईएमएस), दो म्यूटेजेंस जो डीएनए में बिंदु उत्परिवर्तनों को प्रेरित करने में सक्षम हैं, बैक्टीरिया से विभिन्न मॉडलों में व्यापक रूप से कार्यरत हैं17,18,19 . इसके अलावा, मैंगनीज क्लोराइड लंबे समय तक मैन्ज़ी धनायन की क्षमता के लिए डीएनए मरम्मत रास्ते20को बाधित करने के लिए जिये में इस्तेमाल किया गया है । एक अन्य आम दृष्टिकोण यूवी-प्रेरित म्यूटेजेनेसिस है, जो जीनोम-वाइड म्यूटेजेनिक पायरीमिडीन डाईमर्स21,22उत्पन्न करता है ।

हालांकि रसायनिक उत्परिवर्तनों की पहचान करने के लिए रासायनिक मुताजेनेसिस का उपयोग लोकप्रिय है, विधि में कई कमियां हैं, जिनमें खतरनाक रसायनों का उपयोग, अत्यधिक परिवर्तनशील सफलता दर, और अतिरिक्त संस्थापना चर का परिचय कई सेलुलर प्रक्रियाओं पर म्यूजेन के नकारात्मक पक्ष प्रभाव द्वारा प्रस्तुत23,24. इसके अतिरिक्त, रासायनिक mutagenesis अक्सर जीनोम जो आनुवंशिक और अनुक्रमण तकनीकों का उपयोग करने के लिए सटीक उत्परिवर्तन है कि जीव25में दबानेवाला phenotype प्रदान की पहचान करने की जटिलता को जोड़ता में कई उत्परिवर्तनों लाती ।

वर्तमान mutagenesis दृष्टिकोण की कमियों को संबोधित करने के लिए, हम विखंडन खमीर है कि किसी भी mutagenesis या एक विलोपन पुस्तकालय पर भरोसा नहीं करता है में सहज दबानेवाला उत्परिवर्तनों के लिए स्क्रीन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । विधि एक सकारात्मक चयन परख के माध्यम से दमन आइसोलेट्स । इस विधि के सिद्धांत तरल संस्कृति है, जो एक स्वचालित प्लेट रीडर द्वारा निगरानी की जा सकती में उत्परिवर्तकारी उपशमन उप जनसंख्या के विकास के लाभ पर आधारित है । सहवास और मेओसिस का उपयोग केवल तभी किया जाता है जब कोई आनुवंशिक पृष्ठभूमि को साफ करना या पूरे जीनोम अनुक्रमण से पहले दबानेवाला के मोनोजेनिक एल्ल्स की उपस्थिति की पुष्टि करना चाहते हैं । यदि दमन phenotype एक एकल उत्परिवर्तन के कारण होता है, दबानेवाला phenotype 2:2 अलग होगा पैतृक उपभेदों के साथ backcrossing के बाद । दबानेवाला म्यूटेशन तो पूरे जीनोम sequencing का उपयोग कर पहचाना जा सकता है । हम प्रस्ताव है कि इस विधि सभी सूक्ष्मजीवों कि तरल संस्कृति में एक बड़ी आबादी को विकसित कर सकते है में स्क्रीनिंग दमन के लिए लागू है ।

Protocol

1. तनाव निर्माण और तैयारी

  1. उत्पन्न एक उत्परिवर्तन या जीन का विलोपन (yfm, अपने पसंदीदा उत्परिवर्तन) मानक साइट का उपयोग कर-निर्देशित मुताजेनेसिस (SDM) के रूप में पहले26वर्णित.
  2. स्क्रीन शुरू करने से पहले, (बेहतर) आनुवंशिक पृष्ठभूमि को साफ और पैतृक उपभेदों के रूप में ताजा पैदा उत्परिवर्ती कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक जंगली प्रकार के तनाव के साथ उत्परिवर्ती उपभेदों backcross । मानक अमीर मीडिया प्लेटों पर व्यक्तिगत कालोनियों के लिए पैतृक तनाव लकीर । बेतरतीब ढंग से थाली रीडर परख के लिए वांछित परिवर्तन के साथ आठ से सोलह स्वतंत्र कालोनियों (जैविक replicates) उठाओ (३.१ देखें) ।
    नोट: यह प्रोटोकॉल केवल जब पैतृक उपभेदों तरल मीडिया में एक वृद्धि दोष है प्रभावी है (कम या अमीर, के साथ या बिना दवा, या तापमान बदलाव के साथ कि विकास दोष का कारण). सभी पैतृक उपभेदों अगुणित किया जाना चाहिए और इस प्रकार आनुवंशिक रूप से एक पूरक संभोग प्रकार के साथ अंय अगुणित उपभेदों के साथ पार कर सकता है ।

2. प्लेट रीडर परख

  1. एक बाँझ applicator के साथ, कदम में तैयार कालोनियों में से प्रत्येक की एक छोटी राशि ले १.१ (कोई सटीक राशि शुरू संस्कृति संरोपण करने के लिए आवश्यक) और एक ९६-अच्छी तरह से polystyrene माइक्रोप्लेट में जगह. उचित तरल मीडिया के २०० μl में कालोनियों में से प्रत्येक को निलंबित (अमीर या न्यूनतम, के साथ या बिना दवा). एक ही मीडिया (कोई कोशिकाओं) की २०० μl युक्त थाली पर हर पंक्ति के लिए एक खाली अच्छी तरह से शामिल हैं ।
  2. एक स्वचालित microplate-पाठक से जुड़े एक थाली रीडर का पता लगाने सॉफ्टवेयर पर निम्नलिखित प्रोटोकॉल चलाने के लिए: 30 डिग्री सेल्सियस पर 24 एच और तापमान के लिए एक काइनेटिक कार्यक्रम सेट, निरंतर तेजी से कक्षीय मिलाते (४२५ सीपीएम, 3 मिमी आयाम) के साथ । ऑप्टिकल घनत्व के लिए 600nm की तरंग दैर्घ्य पर प्रकाश बिखराव को मापने के लिए लाइट सेट पढ़ता है, और प्रकाश सेट करने के लिए एक पढ़ने की आवृत्ति पर थाली के नीचे से पढ़ने के लिए 2 मिनट (७२१ कुल पढ़ता है पर एक 24-एच अवधि प्रति अच्छी तरह से).
  3. 24 एच के बाद, अंतिम blanked ऑप्टिकल घनत्व रीडिंग रिकॉर्ड (blanked OD600) और निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करने के लिए नीचे दिए गए नमूनों में से प्रत्येक को पतला करने के लिए आवश्यक मात्रा निर्धारित करने के लिए आयुध डिपो = ०.१:
    Equation
    नोट: थाली रीडर सॉफ्टवेयर से डेटा निर्यात और बैच प्रक्रिया के लिए एक समारोह के रूप में उपरोक्त सूत्र डालने के लिए एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए प्रत्येक प्रयोगात्मक अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा करने के लिए कमजोर पड़ने की मात्रा.
  4. हर 24 एच, दिन के रूप में एक ही मीडिया का उपयोग कर नमूनों में से प्रत्येक को पतला करने के लिए 0 आयुध डिपो = ०.१ (के बारे में १.५ x 106 कोशिकाओं/ सहेजें सभी विकास घटता दैनिक उत्पन्न और किसी भी व्यक्ति कॉलोनी कि एक वृद्धि की दर से पता चलता है ध्यान दें, एक अंतिम आयुध डिपो है कि एक ही आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ या एक वृद्धि वक्र है कि के समान है के साथ समानता के आराम से काफी अधिक है द्वारा ंयाय जंगली प्रकार कालोनियों ।
    नोट: इस परख आमतौर पर के बारे में 7-14 दिन लगते हैं । बाँझ शर्तों के तहत सभी चरणों का पालन करें ।

3. दमन कालोनियों का चयन और phenotype की पुष्टि ।

  1. थाली रीडर परख (चरण २.४) के अंतिम दिन से, तरल संस्कृतियों है कि एक काफ़ी वृद्धि दर, संभवतः एक दबानेवाला उत्परिवर्तन है कि पैतृक उत्परिवर्तन के phenotype कम कर सकते है पाने के द्वारा बरामद बचा है । स्थानांतरण और मिश्रण २५० μl तरल संस्कृति को एक cryotube युक्त २५० μl of ५०% ग्लिसरीन. फ्लैश तरल नाइट्रोजन में कोशिकाओं फ्रीज और-80oc अनिश्चित काल में उपभेदों को बचाने के ।
  2. पुष्टि करने के लिए कि दबानेवाला उत्परिवर्तन एक आनुवंशिक रूप से विसंगत तत्व है, मानक आनुवंशिक पार तरीकों का उपयोग करने yfm पी पार (माता पिता के लिए, तनाव थाली रीडर परख की शुरुआत में इस्तेमाल किया) yfm एस के साथ (दमन के लिए, तनाव अंत में सहेजा थाली पाठक परख के) । यदि दबानेवाला उत्परिवर्तन वास्तव में एक आनुवंशिक रूप से विसंगत तत्व है, yfm पी × yfm एस tetrads उपज चाहिए, जिसमें दो कालोनियों माता पिता का तनाव और दो कालोनियों की बीमारी phenotype है दमन की वसूली की वृद्धि दर है तनाव.
  3. चरण ३.२ के पार से, दबानेवाला phenotype के साथ तीन कालोनियों उठाओ (एस तनाव) और पैतृक phenotype के साथ तीन कालोनियों (पी तनाव) एक ही आनुवंशिक पार से (3 जैविक प्रत्येक के लिए प्रतिकृति), और जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ना और नीचे दिए गए चरण अनुक्रमण ।
    नोट: चरण ३.२ और ३.३ अत्यधिक अनुशंसित हैं, लेकिन आवश्यक नहीं हैं । वैकल्पिक रूप से, एक बरामद तरल समृद्ध माध्यम पर एक कालोनियों में ३.१ से एकत्र संस्कृति फैल सकता है, तो बेतरतीब ढंग से आगे आनुवंशिक पुष्टि के बिना पूरे जीनोम अनुक्रमण के लिए जैविक triplicates के रूप में तीन कालोनियों उठाओ । इस मामले में, जीनोमिक अनुक्रमण तुलना के लिए माता-पिता के तनाव के तीन जैविक triplicates का उपयोग किया जाना चाहिए ।

4. जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण, पुस्तकालय उत्पादन और अनुक्रमण ।

  1. डीएनए निष्कर्षण के लिए, पुस्तकालय तैयारी, और अनुक्रमण, बेतरतीब ढंग से yfm पी तनाव प्रति तीन जैविक प्रतिकृति उठाओ, और एक व्यक्तिगत रूप से उत्पंन yfm एस उपभेदों के तीन जैविक प्रतिकृति आनुवंशिक पार से (कदम ३.२) या से प्लेटें जो एस तनाव (चरण ३.३ नोट) की एकल कालोनियों को प्राप्त करने के लिए फैलाई गई हैं ।
  2. अमीर मीडिया में 10 मिलीलीटर संस्कृतियों में उपभेदों के मध्य लॉग चरण के लिए (आयुध डिपो = 0.5-0.8, के बारे में ०.७५-१.२ x 107 कोशिकाओं/एमएल), और एक मिलाते हुए इनकोबेटर का उपयोग करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर तरल संस्कृतियों के बढ़ने के साथ लगातार २५० rpm पर मिलाते हुए । १००० एक्स जीपर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रेगेशन द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें ।
  3. डीएनए निष्कर्षण बफर (2% ट्राइटन एक्स-१००, 1% एसडीएस, १०० मिमी nacl, 10 मिमी Tris-सीएल (पीएच ८.०), 1mm ना2-edta) के ४०० μl में pelleted कोशिकाओं को निलंबित, तो गिलास मोती के ४०० μl और ४०० phenol के 25:24:1 μl जोड़ें: क्लोरोफॉर्म: isoamyl अल्कोहल । भंवर 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए जोरदार ।
  4. डीएनए निष्कर्षण बफर के एक अतिरिक्त २०० μl जोड़ें और कई बार उलटा करके मिक्स । २०,००० एक्स जीपर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेंट्रेसेज
  5. एक साफ ट्यूब के लिए जलीय चरण स्थानांतरण rnase a/T1 मिश्रण के 20 μg जोड़ने, और 15 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते ।
  6. 25:24:1 phenol की एक बराबर मात्रा में जोड़ें: कोरोफॉर्म: isoamyl शराब, 5 मिनट के लिए स्पिन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर २०,००० एक्स जी, तो एक साफ ट्यूब के लिए जलीय चरण हस्तांतरण.
  7. क्लोरोफॉर्म की एक समान मात्रा जोड़ें, कई बार उलटा करके मिक्स करें, फिर २०,००० एक्स जीपर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए स्पिन करें, फिर जलीय चरण को एक साफ ट्यूब में स्थानांतरित कर दें ।
  8. १००% इथेनॉल के दो संस्करणों के साथ डीएनए precipitate प्लस 3 एम naoac की 10% मात्रा (पीएच ४.३) कम से कम 2 एच के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर २०,००० एक्स जी में 5 मिनट के लिए स्पिन और गोली इकट्ठा ।
  9. ठंडा ७०% इथेनॉल (अपकेंद्रिका २०,००० एक्स जी, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पर) के साथ दो बार गोली (डीएनए उपजी) और 10 मिमी Tris बफर (पीएच ७.४) के ५० μl में गोली निलंबित कर देते हैं ।
  10. पूरे जीनोम अनुक्रमण पुस्तकालय तैयार करने के लिए निर्माता की सिफारिशों के अनुसार एक पुस्तकालय तैयारी किट ( सामग्री की तालिकादेखें) का प्रयोग करें ।
    नोट: हम सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध किट की सलाह देते हैं क्योंकि यह पीसीआर प्रवर्धन के बिना जीनोमिक लाइब्रेरी के निर्माण की अनुमति देता है, जो पीसीआर प्रवर्धन के दौरान उत्पन्न त्रुटि उत्परिवर्तनों को कम करता है । इसके अलावा, जीनोमिक लाइब्रेरी तैयारी के दौरान, मनका सुखाने के समय को 1 – 2 मिनट तक छोटा करके मोती को पूरी तरह से सूखने की अनुमति न दें ।
  11. पुस्तकालय की तैयारी के दौरान कर्तन मापदंडों के लिए, एक केंद्रित sonicator का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) और 20% करने के लिए कर्तव्य कारक सेट, १७५ डब्ल्यू के लिए पीक शक्ति, २०० के साथ फट प्रति चक्र, और आवृत्ति व्यापक मोड पर 5.5 oc के लिए 6 ° c करने के लिए ४५ s. वैकल्पिक रूप से, का उपयोग करें डीएनए और चोमेटिन बाल काटना प्रणाली ( सामग्री की तालिकादेखें) निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ: पल्स मोड के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर ५०% आयाम, 15 एस पर और 15 एस के लिए बंद 10 मिनट, 20 मिनट की कुल प्रसंस्करण समय के साथ.
  12. यह देखभाल के साथ इस कदम में इस्तेमाल खतरनाक सामग्री को संभालने के लिए आवश्यक है । naoac, इथेनॉल, 25:24:1 phenol: क्लोरोफॉर्म: आइसोऐमिल अल्कोहल और क्लोरोफॉर्म से निपटने के लिए उपयुक्त सामग्री सुरक्षा डेटा शीट्स और संस्था के पर्यावरणीय स्वास्थ्य और सुरक्षा कार्यालय से परामर्श करें ।
  13. परिणामस्वरूप जीनोमिक पुस्तकालयों अनुक्रम । पूरे अनुक्रमण पढ़ता एक एकल न्यूक्लियोटाइड रेंज में संकल्प के साथ पूरे जीनोम के कम से तीन बार कवर करना चाहिए । युग्मित-एंडेड अनुक्रमण (या नवीनतम प्रौद्योगिकी) की सिफारिश की है ।

5. उपशमन म्यूटेशन की पहचान के लिए जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण

  1. जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण करने के लिए जीनोमिक परिवर्तन है कि लगातार पैतृक और सभी जैविक replicates में yfm उपभेदों दबा के बीच की पहचान कर रहे है पर ध्यान केंद्रित ।
    नोट: पूरी पाइपलाइन प्रक्रिया नीचे वर्णित है, लेकिन, इसके साथ ही, दो सादे-पाठ BASH-स्क्रिप्ट फ़ाइलें, fastq_to_vcf. sh और vcfprocess.sh, के रूप में शामिल किए गए है वर्कफ़्लो के संसाधन से vcf भिन् न करने के लिए कार्यप्रवाह के उदाहरण दिखाने के लिए पूरक सामग्री फ़ाइलें और प्रसंस्करण और vcf फ़ाइलों के चौराहे, क्रमशः ।
  2. ट्रिम कम-पढ़ता का उपयोग कर कतरनी (https://github.com/jbpease/shear) आदेश लाइनों (सभी अन्य विकल्प डिफ़ॉल्ट) निम्नलिखित:
    shear.py--fq1 $FASTQ 1--fq2 $FASTQ 2--out1 $OUTFQ 1--out2 $OUTFQ 2 \
    --barcodes1 $BARCODE-मंच truseq--trimqual 20:20 \
    --तृंपोलयात 0--trimambig--filterlength ५०--filterunयुग्मित
  3. मानचित्र को एस. पोम्बे संदर्भ जीनोम v 2.30 से प्राप्त किया जाता है जो पॉमबेस (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/pombase/pombe/Chromosome_Dumps/fasta/) का उपयोग करते हुए bwa v 0.7.1527. निम्न आदेश पंक्ति (अन्य सभी विकल्प डिफ़ॉल्ट) का उपयोग करें:
    bwa मेम-टी 8 $GENOME $OUTFQ 1 $OUTFQ 2 > $SAM 1
  4. संरेखण सैम फ़ाइलें gatk सर्वोत्तम प्रथाओं के माध्यम से रखो पाइपलाइन28 संस्करण gatk v 3.629का उपयोग कर कॉलिंग के लिए, picardtools v 2.5.0 (http://broadinstitute.github.io/picard), और samtools v 1.3.130. निम्न आदेश पंक्तियाँ और पैरामीटर्स (अन्य सभी विकल्प डिफ़ॉल्ट) का उपयोग करें:
    जावा-Xmx30g-jar picard. jar addorreplacereadgroups इनपुट = $SAM 1 \
    आउटपुट = $BAMMARKED rgid = 1 rglb = lib01 rgpl = illumina \
    RGPU = $BARCODE RGPU = $SAMPLENUMBER
    समऔजार fixmate-O bam $BAMMARKED $BAMFIXED
    samtools सॉर्ट करें-o bam-o $BAMSORTED-T/home/peasejb/tmp $BAMFIXED
    समउपकरण अनुक्रमणिका $BAMSORTED
    जावा-Xmx30g-jar जीनोमेएनालिसिस्क. जार-टी हैप्लोटाइपकॉलर \
    -R $GENOME-I $BAMSORTED--genotyping_mode डिस्कवरी \
    -stand_emit_conf 10-stand_call_conf 30-ओ $VCFRAW
  5. संपीड़ित करें और अनुक्रमणिका vcf फ़ाइलें tabix का उपयोग करते हुए:
    bgzip $VCFRAW. vcf
    tabix $VCFRAW. vcf. gz
  6. तुलना vcf फ़ाइलों के बीच पैतृक और दबानेवाला उपभेदों अनुक्रमण प्रतिकृति bcftools v 1.3.127का उपयोग कर । निम्न आदेश पंक्तियों और पैरामीटर्स (सभी अन्य विकल्प डिफ़ॉल्ट छोड़ दिया) का उपयोग करें:
    bcftools आइसेक-n + 1 $VCFPARENTAL 1. gz $VCFPARENTAL 2. gz $VCFPARENTAL 3. gz \
    $VCFMUTANT 1. gz $VCFMUTANT 2. gz $VCFMUTANT 3. gz > common_variants. list
    नोट: यह आदेश एक बाइनरी पैटर्न के साथ इनकोडिंग फ़ाइल जहां अनुक्रम पहले उत्परिवर्ती में प्रदर्शित होने वेरिएंट केवल द्विआधारी होगा "०००१००" के रूप में, दूसरा उत्परिवर्ती केवल "000010", के रूप में "०००१११," के रूप में सभी तीन म्यूटेंट, आदि । इन फ़ाइलों के प्रत्येक सेट के लिए जनरेट किया गया पैतृक और उत्परिवर्ती vcf फ़ाइलों को दोहराने ।
  7. फ़ाइल नाम UNIX grep आदेश का उपयोग कर प्रत्येक पंक्ति के लिए जोड़े के साथ भिन् न प्रतिच्छेदन सूची फ़ाइलों को संकलित करें:
    grep "." *. सूची > सभी. list
  8. किसी कस्टम Python स्क्रिप्ट (variant_characterize. py) का उपयोग कर वर्तमान GFF3 एनोटेशन फ़ाइल (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/pombase/pombe/Chromosome_Dumps/gff3/schizosacchar omyces_pombe. chr. GFF3) के साथ पूर्ण भिन् न सूची क्रॉस-संदर्भ प्रोटीन में सुसंगत snp साइटों की पहचान करने के लिए-क्षेत्रों कोडिंग (पर्याय बन गया है और गैर पर्याय), 5 ' और 3 ' utrs, और ncrna ।
    python3 variant_characterize. py--सूची common_variants. list \
    --gff schizosaccharomyces_pombe. chr. gff3 \
    --fasta schizosaccharomyces_pombe. asm294v 2.30. डीएनए. जीनोम. एफए \
    --पैटर्न ०००१००-बाहर सभी. list. filter. 000100
    इस स्क्रिप्ट को दोहराएं--प्रतिमान और आउटपुट फ़ाइल का प्रत्यय (--आउट) बाइनरी का उपयोग कर संशोधित करें
    पैटर्न: 000010, 000001, ०००११०, 000011, ०००१०१, और ०००१११
  9. इन सभी स्क्रिप्ट से आउटपुट को एक स्प्रेडशीट के रूप में देखने के लिए टैब-सेपरेटेड फ़ाइल में संयोजित करें । एनोटेटेड टेबल वेरिएंट की पृष्ठभूमि के सापेक्ष या तो एक या दोनों उत्परिवर्ती तनाव (ओं) में दिखाई देते हैं कि उन शामिल हैं । द्विआधारी झंडा क्षेत्र एक एकल उत्परिवर्ती तनाव (०००१००, 000010, 000001), दो उत्परिवर्ती उपभेदों (000011, ०००१०१, ०००११०), या सभी तीन उत्परिवर्ती उपभेदों (०००१११) में या तो उपस्थिति को दर्शाता है ।
  10. पैरेंटल नमूनों में नहीं मिला वेरिएंट के आउटपुट एनोटेटेड सूचियों का विश्लेषण, लेकिन एक में पाया, दो, या सभी तीन उत्परिवर्ती नमूने. एनोटेशन दोनों जीनोमिक स्थान और संस्करण (एक कोडिंग क्षेत्र में पर्यायवाची/गैर-पर्याय, 3 '/5 ' utr, नॉन-कोडिंग, आदि) की श्रेणी को निर्दिष्ट करता है । उंमीदवार के परिवर्तन की इस सूची से, एक दृढ़ता से प्रासंगिक उंमीदवारों का एक उदाहरण के एक गैर पर्यायवाची कोडिंग सभी तीन उपभेदों में लगातार प्रदर्शित संस्करण हो सकता है । मजबूत उंमीदवार का एक अंय प्रकार के विभिंन गैर का एक संचय होगा पर्याय या उत्परिवर्ती उपभेदों में एक साथ या एक ही जीन के भीतर प्रदर्शित होने में ख्यात नियामक उत्परिवर्तन ।

Representative Results

धीमी गति से बढ़ म्यूटेंट तरल संस्कृति में लक्षणप्ररूपी वसूली दिखाएँ
हम एक बीमार, धीमी गति से बढ़ रही है, phenotype के साथ जैविक रास्ते की एक किस्म में शामिल तीन म्यूटेंट का चयन: एएए परिवार atpase Elf1, हिस्टोन deacetylase Clr6, और exon जंक्शन जटिल घटक Fal1. एक जंगली प्रकार के तनाव और इन तीन जीन है कि जंगली प्रकार उपभेदों के साथ backcrossed किया गया था के म्यूटेशन ले जाने के उपभेदों व्यक्तिगत कालोनियों के लिए streaked थे, और 16 एकल कालोनियों बेतरतीब ढंग से अमीर तरल मीडिया में सुसंस्कृत को चुना गया ९६ का उपयोग कर अच्छी तरह से थाली के रूप में ऊपर वर्णित है । व्यक्तिगत कालोनियों के विकास घटता प्रारंभिक समय बिंदु (0 दिन) पर दर्ज की गई और लगातार निगरानी के साथ 6 दिनों के लिए थाली रीडर का उपयोग कर रहे थे । उम्मीद के रूप में, जंगली-प्रकार के उपनिवेशों का प्रयोग31 (चित्र 1) के दौरान उनके विकास घटता में कोई महत्त्वपूर्ण परिवर्तन नहीं दिखाता है । विशेष रूप से, elf1 δ पृष्ठभूमि और एक fal1 δ कॉलोनी के साथ चार कालोनियों के विकास में धीमी गति से विकास के कुछ अलग स्तरों के समान या जंगली प्रकार कालोनियों के करीब है कि एक नाटकीय बदलाव दिखा । नाटकीय रूप से, सभी clr6-1 म्यूटेंट एक सुसंगत लक्षणप्ररूपी वसूली दिखाने के लिए, परख31 (चित्रा 1) के अंत तक एक तेज दर से बढ़ रही है । विभिंन phenotypes की विशेषता है, हम मूल उपभेदों कि धीमी गति से बढ़ रहे है के रूप में "पी उपभेदों" (या माता पिता के उपभेदों) और "एस उपभेदों के रूप में लक्षणप्ररूपी वसूली दिखा रहा है" (या दबा हुआ संवेदनहीन) को देखें । कृपया ध्यान दें कि चित्रा 1 स्क्रीनिंग प्रयोग के एक दौर का एक उदाहरण है, और पहचान की कुल गैर पूरक दबानेवाला का प्रतिनिधित्व नहीं करता है और निंनलिखित प्रतिनिधि परिणामों में अनुक्रम ।

phenotypic वसूली के लिए उत्तरदायी लक्षण है
एस pombe अमीर मीडिया में एक अगुणित के रूप में विकसित कर सकते हैं, लेकिन पूरक संभोग प्रकार के साथ दो अगुणित उपभेदों नाइट्रोजन भुखमरी के तहत दोस्त । विखंडन खमीर में मेओसिस कोशिका विभाजन के दो दौरों के बाद डुप्लिकेशन के एक दौर पर जोर देता है । यौन चक्र के परिणामस्वरूप चार हप्लोइड बीजाणु होते हैं जो माता-पिता के तनाव की आनुवंशिक सामग्री को ले जाते हैं, जिसमें शास्त्रीय मेन्डेलीय आनुवंशिकी (चित्रा 2a) के नियमों के बाद आनुवंशिक लक्षण का 2:2 पृथक्करण होता है । जब समय की एक ही राशि के लिए एक ही थाली पर उगाया, हम 2:2 अलगाव की पुष्टि की जब वापस सभी दबा उपभेदों (एस उपभेदों) उनके पैतृक उपभेदों (पी उपभेदों) है, जो 2 छोटे (विकास दोष) और 2 बड़े (दमन phenotype) के परिणाम के साथ पार कालोनियों. चित्र 2bमें दमित elf1 ∆, clr6-1 तथा fal1 ∆ कोशिकाओं के लिए वैयक्तिक उदाहरण दर्शाए गए हैं । हमने पुष्टि की है कि सभी पृथक एस उपभेदों एक वैश् आनुवंशिक तत्व है कि उनके पी उपभेदों की धीमी गति से बढ़ रही phenotype को रोकता है (डेटा नहीं दिखाया) ले ।

पूरे जीनोम अनुक्रमण सफलतापूर्वक दबानेवाला म्यूटेशन की पहचान करता है
एक उदाहरण के रूप में, हम elf1 ∆ एस उपभेदों में लक्षणप्ररूपी वसूली के लिए जिंमेदार आनुवंशिक तत्वों की पहचान करने के लिए युग्मित अंत पूरे जीनोम अनुक्रमण का इस्तेमाल किया । डेटा विश्लेषण का एक और पूरा विवरण ऑनलाइन31उपलब्ध है । संक्षेप में, हम दो स्वतंत्र रूप से उत्पन्न की जैविक triplicates elf1 ∆ P उपभेदों और elf1 ∆ S उपभेदों के पांच गैर-पूरक समूहों के जैविक डुप्लिकेट, जिनमें से प्रत्येक अलग दमन शामिल हैं । हम जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण (6.1-10) से एनोटेटेड वेरिएंट की एक सूची प्राप्त करने के बाद, हम हमारे विश्लेषण के लिए प्रासंगिक थे कि वेरिएंट के कुछ वर्गों को प्राथमिकता दी । हम सुसंगत जीनोमिक परिवर्तनों की पहचान पर ध्यान केंद्रित करते हैं जो उनके पैतृक elf1 ∆ प उपभेदों (चित्र 3 और पूरक तालिकाओं 1-4) की तुलना में वैयक्तिक elf1 ∆ स के उपभेदों के सभी जैविक प्रतिज्ञाओं में समरूप थे । ). हमने सीडीएस क्षेत्रों में, rli1 +, spbpj 4664.02, cue2 + और rpl2702 +सहित सभी पांच भिन्न elf1 ∆ नों के उपभेदों में पांच अपर्यायवाची परिवर्तनों की पहचान की है । दोनों s-A1 और s-A2 उत्परिवर्तित spbpj 4664.02होते हैं, यद्यपि म्यूटेशन भिन्न एमिनो एसिड पर होते हैं । क्योंकि spbpj 4664.02 एक लंबी जीन है (११,९१६ न्यूक्लियोटाइड) दोहराता के सैकड़ों के साथ, म्यूटेशन अनुक्रमण द्वारा पीछा किया पीसीआर प्रदर्शन द्वारा पुष्टि करने में असमर्थ थे. S-A3 दोनों जैविक डुप्लिकेट में संगत है rli1 में एक हटाने उत्परिवर्ती शामिल हैं । हालांकि, उत्परिवर्ती elf1 δ पृष्ठभूमि में एस phenotype के साथ सह-अलग नहीं किया । हम एक cue2 उत्परिवर्ती (cue2-1) एस B1 में, एमिनो एसिड 396-400 लापता के साथ की पहचान की । S-B2 में एक rpl2702 उत्परिवर्ती (rpl2702-1) होता है, जो ४५ की स्थिति में एमिनो एसिड को ग्लाइसिन से एस्पार्टेट31में बदलता है । cue2-1 और rpl2702-1 दोनों को नीचे दर्शाए अनुसार elf1 ∆ दमन के रूप में पुष्टि की गई ।

अभिज्ञात दबानेवाला उत्परिवर्तन की आनुवंशिक पुष्टि वसूली phenotype की धधनीयता की पुष्टि
दो की पहचान nonसमानार्थी परिवर्तन, cue2-1 और rpl2702-1, प्रयोगशाला में खंगाला गया साइट के लिए मानक प्रोटोकॉल का उपयोग-निर्देशित mutagenesis । डबल उत्परिवर्ती उपभेदों cue2-1 elf1 ∆ प और rpl2702-1 elf1 ∆ प को मानार्थ elf1 ∆ प विकृति31 (चित्र 4) से पार कर लिया गया । यदि इस स्क्रीन के माध्यम से पहचाने गए nonसमानार्थी परिवर्तन, elf1 δ Pको दबाने के लिए पर्याप्त थे, तो परिणामस्वरूप tetrads प्रत्येक tetrads में 4 बीजाणु से उत्पन्न कालोनियों में बड़े अनुपात के लिए एक 2:2 छोटे दिखाएगा । वास्तव में, आनुवंशिक पार से पता चला है कि पहचान दबानेवाला उत्परिवर्तन elf1 δ P के धीमी गति से बढ़ रही phenotype दबाने में सफल रहे है और heritable हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: phenotypic वसूली एक थाली रीडर में विकास घटता रिकॉर्डिंग द्वारा निगरानी की जा सकती है. जंगली-प्रकार (wt), elf1 ∆, clr6-1और fal1 ∆ की सोलह एकल कालोनियाँ ९६-well प्लेट में रखी गई थीं । विकास घटता एक 24 एच अवधि में दर्ज की गई और कालोनियों फिर से अमीर मीडिया में दैनिक पतला थे । विकास दोष कम absorbance द्वारा स्पष्ट है (आयुध डिपो) 0 दिन पर 24 घंटे की अवधि के अंत में । phenotypically बरामद उपभेदों उन है कि एक समान विकास वक्र प्रदर्शित कर रहे हैं, या के करीब है, कि जंगली प्रकार के 24 दिन 6 पर एच अवधि से अधिक । elf1 δकी चार कालोनियों, fal1 ∆की एक कॉलोनी, और clr6-1 की सभी कालोनियों में 6 दिनों के बाद विभिन्न स्तर की लक्षणप्ररूपी वसूली दिखाई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: आनुवंशिक पार की पुष्टि कर सकते है कि लक्षणप्ररूपी वसूली के लिए जिंमेदार ठहराया है एक एकल अनुयाई allele । (क) जब विखंडन खमीर कोशिकाओं नाइट्रोजन भुखमरी के अधीन हैं, एक पूरक संभोग प्रकार के साथ दो अगुणित कोशिकाओं एक युग्मज जो 4 sporulates के एक चतुष्क उत्पंन sporulates उत्पंन कर सकते हैं । पैतृक आनुवंशिक सामग्री मेंडेलीय आनुवंशिकी के नियमों के बाद अर्द्धसूत्रण के दौरान अलग होगा । (ख) phenotypically बरामद कालोनियों (लेबल के लिए, दबाया के लिए) के साथ संकेत पैतृक जीनोटाइपों वापस उनके मानार्थ पैतृक कॉलोनी के साथ पार कर रहे थे (जो कोई लक्षणप्ररूपी वसूली, लेबल पी, माता पिता के लिए) से पता चलता है । आनुवंशिक बड़े (बरामद फिटनेस) के लिए 2:2 छोटे (खराब फिटनेस) दिखा रहा पार कालोनियों का प्रदर्शन है कि लक्षणप्ररूपी वसूली है और एक एकल आनुवंशिक तत्व के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । लाल बक्से दबानेवाला एलील ले कालोनियों रहे हैं, और नीले बक्से पैतृक allele ले कालोनियों हैं । यह आंकड़ा marayati एट अल., २०१८31से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: जीनोम-वाइड अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण लक्षणप्ररूपी वसूली के जिम्मेदार आनुवंशिक तत्वों की पहचान करने के लिए. दो पैतृक "पी" उपभेदों (पी-ए और पी-बी) के तीन जैविक प्रतिकृति, और पांच phenotypically के दो जैविक प्रतिकृति बंद "एस" उपभेदों (एस-A1, एस-A2, और एस-A3 बरामद पी से एक; s-B1 और p-B से s-B2), अनुक्रम थे और उत्परिवर्तन बरामद तनाव में प्रत्येक उत्परिवर्तनों की एक सूची के रूप में आयोजित किया गया था के रूप में पैतृक तनाव जीनोम यह से व्युत्पंन किया गया था की तुलना में (जैसे, पी-एक बनाम एस-A1, आदि) । इस तरह के सभी जब pairwise तुलना के पूरे जीनोम भर में पता लगाया परिवर्तन की कुल संख्या ६६० थी । एक कुल के ४४ म्यूटेशन की पहचान की गई जब केवल परिवर्तन है कि एक ही "S" तनाव के दोनों जैविक प्रतिकृति में हो चुना गया । ४४ म्यूटेशन में से 12 म्यूटेशन को संमिलन/विलोपन (indel) या गैर-पर्यायवाची परिवर्तन किया गया । 12 indel या गैर पर्यायवाची म्यूटेशन में से, पांच प्रोटीन कोडिंग अनुक्रम में हुई । पांच परिवर्तन संभावित phenotypically बरामद उपभेदों के लिए जिंमेदार एकल आनुवंशिक तत्व के साथ सहसंबंधी: एस में पाया 4664.02 -A1 और एस-A2 में एक गैर पर्याय उत्परिवर्तन, rli1 में indel एस में पाया-A3, indel में cue2 s-B1 में पाया गया, और rpl2702 में गैर-पर्यायवाची म्यूटेशन s-B2 में पाया गया । विस्तृत अनुक्रम जानकारी पर म्यूटेशन और फ़िल्टर की गई पृष्ठभूमि में पूरक तालिकाओं 1-4शामिल है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: पूरे जीनोम sequencing के माध्यम से पहचाने दमन की पुष्टि । पूरे जीनोम अनुक्रमण से परिणाम स्वतंत्र रूप से उत्परिवर्तन पैदा करने और एक elf1 ∆ P तनाव के साथ एक elf1 ∆ cue2-1 तनाव को पार करके लक्षणप्ररूपी वसूली की पुष्टि करने के लिए आनुवंशिक पार प्रदर्शन द्वारा पुष्टि की गई, और elf1 ∆ rpl2702-1 elf1 ∆ प विकृति के साथ । तीन प्रतिनिधि कार्यक्षेत्र टेट्राड दिखाए गए हैं. लाल बक्से डबल उत्परिवर्ती कालोनियों (elf1 cue2-1, या elf1 rpl2702-1) कर रहे हैं; नीले बक्से elf1 δ कालोनियों हैं । यह आंकड़ा marayati एट अल., २०१८31से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल स्वत दबानेवाला उत्परिवर्तन के लिए एक उपंयास और सरल स्क्रीन का प्रतिनिधित्व करता है विखंडन खमीर, एस pombe में ४०० से अधिक जीन के एक phenotype विशेषता में धीमी वृद्धि प्रदान उत्परिवर्तन के लक्षणप्ररूपी वसूली के माध्यम से detectable, जिनमें से कई का कार्य अज्ञात2,३२रहता है । पिछले तरीकों सूक्ष्म जीवों में शमन उत्परिवर्तनों के लिए स्क्रीन करने के लिए अन्य दृष्टिकोण ले लिया है, mutagens21का उपयोग, या तापमान के प्रति संवेदनशील उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में एक तापमान बदलाव के आवेदन सहित३३. इसके विपरीत, इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि लक्षणप्ररूपी वसूली अतिरिक्त पर्यावरणीय/रासायनिक हस्तक्षेप के बिना होता है और अंत में तरल में उपलब्ध संसाधनों पर लेने दमन म्यूटेशन की वृद्धि के फिटनेस लाभ पर प्रकाश डाला गया संस्कृति. यह स्क्रीन दोनों बाईपास दमन या अंतःक्रिया दमन के अलगाव की अनुमति देता है क्योंकि यह elf1 ∆ या fal1 ∆ और इस तरह के रूप में clr6-1के रूप में बिंदु उत्परिवर्तनों, के रूप में लंबे समय म्यूटेंट के रूप में दोनों के नुकसान के समारोह उत्परिवर्तन के लिए प्रभावी है तरल संस्कृति में फिटनेस दोष का प्रदर्शन ।

अब तक, सभी बरामद एस उपभेदों कि हम जांच की है लक्षणप्ररूपी वसूली की डिग्री बदलती का प्रदर्शन किया है । के रूप में आनुवंशिक पार के माध्यम से पता चला, बरामद phenotype एक एकल आनुवंशिक तत्व के कारण है और ह्य (उदाहरण चित्रा 2में दिखाया गया है) । यह रासायनिक आधारित या यूवी आधारित दबानेवाला स्क्रीन है, जो अक्सर कई जीनोमिक loci लक्ष्य की तुलना में इस विधि का सबसे महत्वपूर्ण लाभ में से एक है । 16 कालोनियों में से एक या दो कालोनियों का निरीक्षण करना आम है (लगभग 10%) एक सप्ताह के भीतर । हालांकि, हमने नोटिस किया है कि कुछ म्यूटेंट, जैसे कि Rrp6, परमाणु-विशिष्ट exosome उपइकाई के नुकसान के समारोह, कभी नहीं लगभग जंगली प्रकार की वृद्धि दर को बरामद किया elf1Δ कोशिकाओं में मनाया31। यह संभव है कि Rrp6 के समारोह में केवल आंशिक रूप से suppressors द्वारा मुआवजा किया जा सकता है, अन्य म्यूटेंट परीक्षण के समारोह के विपरीत, fal1 δसहित, जो नियामक में अपने महत्वपूर्ण समारोह के माध्यम से एक गंभीर अर्धसूत्री दोष पैदा करने के लिए दिखाया गया था ब्याह३४. हम मानते हैं कि वैकल्पिक दबानेवाला स्क्रीनिंग तरीके एक ही समस्या के अधीन होंगे जब yfg के सेल विकास में अद्वितीय, गैर-बदली भूमिकाओं है.

जीनोमिक अनुक्रमण प्रदर्शन से पहले, यह वापस करने के लिए इष्टतम है-phenotypically बरामद कालोनियों को पार, थाली से पहचाना-पाठक, आनुवंशिक पृष्ठभूमि स्पष्ट और जैविक replicates प्राप्त करने के लिए पैतृक उपभेदों के साथ । इसके अलावा, गहरी पूरे जीनोम अनुक्रमण एकल न्यूक्लिओटाइड परिवर्तन के सैकड़ों की पहचान करता है, जिनमें से ज्यादातर स्क्रीनिंग के लिए कम ब्याज की हैं कि जैविक प्रतिकृति के बीच समान नहीं हैं । उदाहरण के लिए, हम दो elf1Δ P और पांच अलग एस संवेदनहीन (चित्रा 3) के बीच सभी तीन गुणसूत्रों में ६६० जीनोमिक परिवर्तन की कुल पाया । हम आमतौर पर प्रत्येक तनाव के अनुक्रम जैविक प्रतिकृति के बीच समान परिवर्तन का पालन नहीं किया, सुझाव है कि या तो नए म्यूटेशन जीनोमिक पुस्तकालय निर्माण या यादृच्छिक त्रुटियों से पहले elf1Δ कोशिकाओं के संवर्धन के दौरान पैदा हो सकता है पुस्तकालय निर्माण और अनुक्रमण के दौरान शुरू की । इसलिए, अलग उत्परिवर्तन कि जैविक प्रतिकृति भर में लगातार कर रहे है दमन की सफल पहचान में एक महत्वपूर्ण पहलू पूरे जीनोम अनुक्रमण का उपयोग कर रहा है ।

हम की पहचान की और पांच अनुक्रम S उपभेदों में सीडीएस क्षेत्रों में दो दमन की पुष्टि की । हालांकि spbpj 4664.02 में म्यूटेशन दोनों एस-a1 और एस-a2 उपभेदों में पाए गए थे, यह संभावना नहीं है कि spbpj 4664.02 एक वैध दबानेवाला है क्योंकि एस-a1 और एस-एक्सएक्सएक्स एक ही जीन पर एक दबानेवाला नहीं है क्योंकि वे एक दूसरे के साथ पूरक नहीं हैं ( डेटा नहीं दिखाया गया है) । हम भी एस में rli1 की पुष्टि नहीं A3, जो एस phenotype के साथ सह अलग नहीं किया था जब elf1Δके साथ backcrossed । वैकल्पिक रूप से, हमने s-A1, s-A2 और s-A3 में गैर-कोडिंग क्षेत्रों में विशिष्ट म्यूटेशन पाया. यह संभव है कि इन बदल गैर कोडिंग जीनोमिक क्षेत्रों elf1Δ phenotype, जो हमारे भविष्य के अध्ययन में संबोधित किया जाएगा कम है । इस तरह के एक लिंकेज परख, जो साल लग सकते है एक आनुवंशिक उत्परिवर्तन नक्शा के रूप में पारंपरिक तरीकों की तुलना में, हम दो महीनों के भीतर दो दमन की पुष्टि के बाद कि एक वैश् तत्व एस phenotype कारण की पहचान की । पूरे जीनोम अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के तेजी से विकास के साथ, हम आशावादी है कि इस पद्धति को निकट भविष्य में सुसंगत आनुवंशिक उत्परिवर्तनों की पहचान करने के लिए और अधिक कुशल हो जाएगा रहे हैं ।

संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक तरल संस्कृति में एक धीमी गति से बढ़ दोष के साथ ब्याज के किसी भी जीन के लिए शमन म्यूटेशन की पहचान करने के लिए कदम दर कदम निर्देश प्रदान करता है. इस परख की सादगी छोटे हाथ से प्रशिक्षण पर ब्याज की कई आनुवंशिक पृष्ठभूमि के बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है । वहां कमरे में एक तरल हैंडलिंग रोबोट का उपयोग करने के लिए दैनिक dilutions प्रदर्शन द्वारा प्रक्रिया को स्वचालित है । के बाद से सूक्ष्मजीवों के प्रयोगशाला हेरफेर अनिवार्य रूप से तरल संस्कृति में वृद्धि की आवश्यकता है, एक प्रक्रिया है कि स्वाभाविक रूप से फिटनेस के लिए चयनात्मक है, हम प्रस्ताव है कि इस प्रोटोकॉल मोटे तौर पर अंय बड़े जनसंख्या मॉडल जीवों के लिए लागू किया जा सकता है जैसे बैक्टीरिया और अंय खमीर प्रजातियों ।

Disclosures

लेखक इस विधि में इस्तेमाल उपकरणों के निर्माताओं द्वारा कोई विज्ञापन की घोषणा, और कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों ।

Acknowledgments

यह काम जनरल मेडिकल साइंसेज के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित था, अनुदान 1r15gm119105-01 से k.z. हम व्यावहारिक टिप्पणियों के लिए सभी समीक्षक धंयवाद । हम भी इस पांडुलिपि पर चर्चा और टिप्पणियों के लिए जेंस tucker, एलिसिया एंडरसन, एलिजाबेथ काले और ग्लेन marrs धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenine, Powder Acros Organics 147441000 Use at 75 mg/L to make liquid and solid rich media (YEA)
Bacteriology Petri Dish Corning, Falcon C351029 100 ×15 mm, use to grow strains to single colonies on solid rich media
D-Glucose Anhydrous, Powder Fisher Chemical D16-1 Use at 30 g/L to make liquid and solid rich media (YEA)
Difco Agar, Granuated Becton, Dickinson and Co. 214530 Use at 20 g/L to make solid rich media (YEA)
DNA extraction buffer 2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1mM Na2-EDTA
Focused-ultrasonicator Covaris Inc. S220 Alternatively, use QSonica Q800R sonicator/DNA and chromatin shearing system
Gen5 Data Collection and Analysis Software Biotek, Inc. GEN5SECURE Or equivalent, must be compatible with the micro-plate reader, use to export data readings from the micro-plate reader
Hydrochloric Acid 1N, Liquid Fisher Chemical SA48-4 Use to adjust pH to 5.5 in liquid and solid rich media
Liquid Rich Media (liquid YEA) 30 g/L D-Glucose, 5 g/L Yeast Extract, 75 mg/L Adenine, pH adjusted to 5.5 with 1 M HCl
Microplate Reader, Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader Biotek, Inc. BTH1MG Or equivalent, must read visible light at 600 nm wavelength range
Rich Media agar plates (YEA plates) 30 g/L D-Glucose, 5 g/L Yeast Extract, 75 mg/L Adenine, 20 g/L Agar, pH adjusted to 5.5 with 1 M HCl.
RNase A/T1 mix Thermo Fisher Scientific EN0551 Use according to manufacturer recommendation
Sterile Polystyrene Inoculating Loop Corning, Inc. OS101 Or equivalent, use to transfer colonies from agar plates to 96-well plate
Sterile workspace and burners
Tissue Culture Plate, 96-well Optical Flat Bottom with Low Evaporation Lid Corning, Falcon C353072 Or equivalent, must have optical flat bottom for micro-plate ready
TruSeq DNA PCR-Free LT/HT Library Prep Kit Illumina, Inc. 20015962 Use to prepare the whole-genome sequencing library
Yeast Extract, Powder Fisher Chemical BP1422-500 Use at 5 g/L to make liquid and solid rich media (YEA)

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विखंडन खमीर <em>schizosaccharomyces pombe</em> में एक गहरी sequencing-असिस्टेड, सहज दबानेवाला स्क्रीन
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Marayati, B. F., Pease, J. B.,… More

Marayati, B. F., Pease, J. B., Zhang, K. A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe. J. Vis. Exp. (145), e59133, doi:10.3791/59133 (2019).

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