Summary
هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لعزل حويصلات خارج الخلية الصغيرة (EVs) من الأنسجة كاملة، بما في ذلك عينات المخ والورم. ويوفر هذا الأسلوب أسلوب استنساخه لاستخراج المركبات الكهربائية من الأنسجة الصلبة للمزيد من التحليلات المتلقين للمعلومات.
Abstract
تعميم والمتداخلة الصغيرة الغشاء زمنياً خارج الخلية حويصلات (EVs) تمثل أهداف واعدة لتطوير فحوصات رواية العلامات البيولوجية التشخيص أو تشخيصية، ويرجح أن تكون بمثابة جهات فاعلة هامة في التقدم من طائفة واسعة من الأمراض. تركز الأبحاث الحالية على توصيف حويصلات تفرز من خلايا متعددة وأنواع الأنسجة بغية تحسين فهم دور المركبات الكهربائية في الآلية المرضية للشروط بما في ذلك نيوروديجينيريشن، والالتهابات، والسرطان. ومع ذلك، تظل أساليب متسقة على الصعيد العالمي واستنساخه لعزل وتنقية حويصلات في التقدم. وعلاوة على ذلك، نادراً ما يتم وصف طرق لاستخراج المركبات الكهربائية من الأنسجة الصلبة السابقين فيفو . هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لاستخراج المركبات الكهربائية الصغيرة لمصلحة من الأنسجة كاملة الطازجة أو المجمدة، بما في ذلك عينات المخ والورم، لمزيد من الوصف. علينا أن نظهر قدرة التكيف مع هذا الأسلوب لتحليلات المصب متعددة، بما في ذلك الميكروسكوب الإلكتروني وتوصيف إيمونوفينوتيبيك من حويصلات، وكذلك الكمية الكتلي من البروتينات EV.
Introduction
وتشمل حويصلات صغيرة خارج الخلية (EVs) المستمدة من اندوسومال اكسوسوميس وميكروفيسيكليس الغشاء-تسلط الصغيرة التي من مصلحة الطب الأحيائي الواسع. المركبات الكهربائية الصغيرة تتكون من عدد السكان غير متجانسة من 50-250 نانومتر غشاء زمنياً الحويصلات المحتوية على البروتينات النشيطة بيولوجيا والدهون والأحماض النووية التي يعتقد أنها مجتمعة على القيام بأدوار هامة في العديد من عمليات المرض. النهوض بالبحوث وبخاصة قد تورط هذه الحويصلات في الأعصاب واضطرابات بريون، العمليات المعدية والظروف الذاتية أو التحريضية، ونمو الورم وورم خبيث1،،من23 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13-البحوث الطبية الحيوية التي تنمو بسرعة إلى أهمية المركبات الكهربائية في إمراضية المرض قد أثارت الاهتمام الموازي في تطوير أساليب استنساخه وصارمة لعزل وتنقية هذه الحويصلات.
وكان تحدي التاريخي والحالي في توصيف EV عدم القدرة على فصل الفئات السكانية الفرعية EV الصغيرة تماما. هذا التحدي إلى حد كبير نتيجة لفهمنا المحدود للآليات الجزيئية المختلفة التي تحكم نشوء حيوي حويصلات متميزة. تداخل في الحجم والكثافة والشحنات بيولوجي بين الفئات السكانية الفرعية كذلك كونفولوتيس هذه الفروق. وكان جزءا من هذا التحدي أيضا استخدام اختلاف تقنيات تخصيب اليورانيوم على نطاق واسع، وتوفير عدم تناسق في تحليل المتلقين للمعلومات من الحويصلات المعزولة عبر المختبرات وتقويض الجهود العالمية لإلقاء الضوء على القاطع EV السكان.
تجدر الإشارة إلى أن غالبية توصيف EV قد أنجز من جمع في المختبر لخلية ثقافة طافية، مع أكثر حداثة الدراسات المجراة في وصف تقنيات لعزل حويصلات من سوائل جسم الحيوان أو الإنسان، بما في ذلك البلازما، البول ، واللعاب. بينما المركبات الكهربائية موجودة بكميات كبيرة في الدورة الدموية، كما أقر بأن هذه الحويصلات تلعب أدواراً هامة في أحداث خلية لخلية الاتصال وموجودة في إينتيرستيتيوم الأنسجة الخلوية. في السياق السرطان، قد تكون المركبات الكهربائية المتداخلة أهمية خاصة في تحوير وورم المكروية للخلايا السرطانية البذر والنمو المنتشر14،15. ونتيجة لذلك، هناك قيمة في تطوير وتحسين تقنيات استخراج حويصلات من عينات الأنسجة الصلبة. هذه الأساليب سوف توفر وسيلة لمباشرة دراسة الجهاز-أو الورم المشتقة من المركبات الكهربائية التي تحصد من العينات السريرية، بما في ذلك الخزعات الصغيرة وريسيكشنز الجهاز الجزئي أو الكامل.
في هذه الدراسة، وفي تقرير سابق نشرته لدينا مختبر16، نحن نهدف إلى معالجة العديد من الشواغل الرئيسية الحالية في منهجية الإثراء EV: 1) لوصف تقنية استنساخه لعزل وتنقية المركبات الكهربائية بأعلى معايير حاليا قبلت في هذا الميدان؛ 2) في محاولة لعزل الفئات السكانية الفرعية الصغيرة EV عالي التخصيب في اكسوسوميس المستمدة من اندوسومال؛ و 3) تقديم بروتوكول لاستخراج هذه الحويصلات من عينات الأنسجة الصلبة غرض مزيد من الوصف.
في الآونة الأخيرة، وصف Kowal والزملاء تدرج كثافة إيوديكسانول صغيرة نسبيا لفصل وتنقية EV الفئات السكانية الفرعية بفعالية أكبر من السكروز مقارنة كثافة التدرجات17. في الدراسة المذكورة، والمركبات المستمدة من الخلايا الجذعية استولت في كسر كثافة خفيفة نسبيا، اتساقا مع كثافة 1.1 غ/مل، تم التخصيب في البروتينات اندوسومال ويعتقد أن يكون أكثر اتساقا مع نسبة عالية من اكسوسوميس في هذا كسر. وشملت هذه البروتينات اكسوسومال "حسن النية" وفقا للمؤلفين، الورم قابلية الجينات 101 (TSG101)، سينتينين-1، CD81، ADAM10، EHD4، والعديد من البروتينات أنيكسين17. ونحن في وقت لاحق تكييف هذا الأسلوب أن ينجح أسلوب تفكك النسيج التي وصفها جونزاليز بيريز وآخرون18 وبروتوكول الطرد المركزي تفاضلي لاحقة لعزل المركبات الكهربائية المستمدة من الدماغ كله16. كما أظهرنا في جدوى هذا الأسلوب في وصف بروتيوميس EV بالجمع بين بروتوكول متسلسلة للمتلقين للمعلومات الكمية والنسبية الكتلي للبروتين حويصلية، الموصوفة سابقا لدينا مختبر19. توازي هذا العمل أن من المختبر هيل، الذي كانت أثري المركبات الكهربائية من قشرة المخ20أمامي.
في هذه الدراسة، وضع على هذا الأسلوب، وتوسيع نطاق تطبيق البروتوكول نشرت مؤخرا من المختبر لعزل المركبات الكهربائية عن أورام الرئة صلبة. على حد علمنا، هذا هو أول دراسة لوصف وضع بروتوكول لإثراء المركبات الكهربائية من السابقين فيفو الورم العينات. ونظرا للاهتمام الواسع النطاق في المركبات الكهربائية كرواية المؤشرات الحيوية التشخيصية ودورها في توموريجينيسيس، هذا الأسلوب يحتمل أن يتضح أن قيمة بالنسبة لعدد متزايد من الباحثين العلميين. من وجهة نظر سريرية، يمكن إيواء المركبات الكهربائية المتداخلة قيمة تشخيصية كبيرة، لا سيما في العينات حيث يقتصر تقييم نسيجية. وأملنا أن الأسلوب المبين هنا سيوفر أساس لتقنية استنساخه لحصاد المركبات الكهربائية من الطازجة أو المجمدة الحيوانية أو البشرية الجراحية العينات، مما يمهد الطريق للعمل في المستقبل لكشف الأدوار الهامة في إمراضية المرض هذه الصغيرة وقد لعب حويصلات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على العقول كلها بموافقة من "استخدام الحيوان المؤسسية" ولجنة الرعاية (إياكوك) من جامعة ولاية فلوريدا. ما مجموعة اثنا عشر الماوس العقول (3 العقول من كل فئة عمرية: 2، 4، 6، و 8 أشهر) من "ي" C57BL/6 الخلفية كانت تستخدم لاستخراج EV، كما هو موضح سابقا16. الدكتور ومانديب ساشديفا سخاء تبرعت عينات من ورم الرئة تحت الموافقة على ولاية فلوريدا الزراعية والميكانيكية جامعة إياكوك. أورام الرئة مستمدة من خط خلية غدية البشرية H1975 نمت في الفئران عارية نو/نو بالب/ج العوز. يتم تمييز البيانات من اثنين الورم الممثل replicates في هذه الدراسة.
ملاحظة: نظرة تخطيطية لطريقة العزل وتنقية حويصلة يرد في الشكل 1.
1-الأنسجة الانفصال والطرد المركزي التفاضلي
- إعداد 10 مل من تفكك المخزن المؤقت (10 مغ غراء مم 5.5 L-سيستين 2 ميكرومتر 67-mercaptoethanol; 1.1 مم يدتا) في المتوسط ه إسبات الواحدة حوالي 0.4-1.0 ز أنسجة. لاحظ أن كافة الحلول المستخدمة لتخصيب EV وتنقية ينبغي إضعاف في المياه التي تمت تصفيتها عالي النقاوة.
- إضافة أنسجة كاملة طازجة أو مجمدة إلى المخزن المؤقت للانفصال في أنبوب 50 مل مخروطية، واحتضان في مياه دافئة قد قطع حمام في 37 درجة مئوية للأنسجة 20 دقيقة إلى شظايا أصغر قبل الاحتضان إذا لزم الأمر.
- الحضانة، وبعد إضافة مثبطات البروتياز والفوسفاتيز لتركيز x 1 نهائي للانفصال من المخزن المؤقت الذي يحتوي على الأنسجة.
- من أجل الحل الذي يحتوي على الأنسجة في الخالطون دونس تناسب فضفاضة، وتنأى بلطف الأنسجة استخدام حوالي 30 ضربات بطيئة كل عينة. يمكن تعديل العدد من السكتات الدماغية استناداً إلى تناسق الأنسجة.
- نقل فصل الأنسجة في المخزن المؤقت إلى 50 مل الأنبوبة المخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية بيليه بالخلايا وتبقى أنسجة ليفية أو متماسك الأجزاء.
- نقل المادة طافية إلى أنبوب مخروطي نظيف 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 2,000 س ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لبيليه وتجاهل الحطام الخلوية الكبيرة.
- نقل المادة طافية مرة أخرى إلى أنبوب مخروطي نظيف 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 10,000 س ز لمدة 40 دقيقة في 4 درجات مئوية بيليه حويصلات أكبر غير مرغوب فيها أو الهيئات الصغيرة أبوبتوتيك.
ملاحظة: يمكن حفظ هذا بيليه لدراسة إضافية من حويصلات أكبر إذا رغبت في ذلك. - صب المادة طافية من خلال عامل تصفية 0.45 ميكرومتر في أنبوب تنبيذ فائق نظيفة 12 مل.
ملاحظة: قد لا تتم تصفيته عينات الأنسجة تليفية المكتظ بسهولة. هذه العينات يمكن تصفيتها من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر، ثم مرت الإبر أصغر تسلسلياً (ز 18، 20 غ، ز 22) قبل عملية التصفية من خلال تصفية 0.45 ميكرومتر. - أولتراسينتريفوجي العينة في 100,000 س ز 2 ح في 4 درجات مئوية بيليه المركبات الكهربائية الصغيرة.
- صب المادة طافية وتترك أنابيب تنبيذ فائق مقلوب ل 5-10 دقيقة، التنصت على كثيرا لإزالة بقايا السائل على جانبي أنابيب. ويمكن أيضا يستنشق السوائل المتبقية باستخدام ماصة فراغ يسفط.
- إعادة تعليق بيليه EV في 1.5 مل من 0.25 م السكروز المخزن المؤقت (10 ملم تريس، درجة الحموضة 7.4). من المهم لضمان إعادة تعليق كامل لبيليه في هذه الخطوة. للقيام بذلك، تغطي هذه الأنابيب مع بارافيلم قبل فورتيكسينج المركبات الكهربائية في الحل. روك أنابيب أولتراسينتريفوجي لمدة 15-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل مزيج دوامة نهائي.
- باختصار الطرد المركزي هذه الأنابيب في سرعة ليس أكثر من 1,000 x ز لاسترداد تعليق السائل في الجزء السفلي من الأنبوب.
- الشروع في تنقية التدرج الخطوات المذكورة أدناه، أو إذا لزم الأمر، تخزين تعليق EV عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
2-الكثافة تنقية التدرج
- إضافة 1.5 مل من 60% إيوديكسانول (حل الأسهم في المياه) إلى المخزن المؤقت السكروز/تريس 1.5 مل المحتوية على المركبات الكهربائية لإنشاء حل نهائي الذي يحتوي على إيوديكسانول 30%. "الماصة؛" أعلى وأسفل عدة مرات لخلط حل شامل. توخي الحذر لتجنب فقدان الحل في تلميح ماصة، كما أن تركيز إيوديكسانول عالية لزج جداً.
- نقل المخزن المؤقت إيوديكسانول 30% الحل التي تحتوي على المركبات الكهربائية للجزء السفلي من أنبوب تنبيذ فائق 5.5 مل.
- إعداد على الأقل 1.5 مل 20% و 10% من الحلول إيوديكسانول كل عينة في الماء عالي النقاوة من الحل الأسهم إيوديكسانول 60%.
- قياس 1.3 مل إيوديكسانول 20% والطبقة فوق الطبقة السفلي التدرج باستخدام المحاقن والإبر ز 18 عناية. لتجنب الخلط بين الطبقات في الواجهة الكثافة، الحفاظ على شطبه الإبرة على اتصال داخل الأنبوب تنبيذ فائق فقط أعلاه غضروف وإضافة الحل دروبويسي.
- طبقة 1.2 مل من محلول 10% إيوديكسانول فوق طبقة إيوديكسانول 20% باستخدام نفس الأسلوب كما ذكر أعلاه.
- توازن بعناية وتحميل أنابيب تنبيذ فائق في دلاء الدوار وأجهزة الطرد المركزي في دوار سوينغ-دلو في س 268,000 ز لمدة 50 دقيقة في 4 درجات مئوية. تعيين سرعات التسارع والتباطؤ أجهزة الطرد المركزي على معدلات الحد الأدنى المسموح به لتجنب الإخلال بكثافة الطبقات.
- قم بتسمية عشرة أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل لكل عينة لتتوافق مع الكسور 1 إلى 10 من التدرج الكثافة. يعين الكسر الأعلى التي سيتم إزالتها أولاً، بينما الكسر 10 هو الكسر أسفل آخر إزالة جزء 1.
- بمجرد اكتمال تنبيذ فائق التدرج، بلطف إزالة الأنابيب من الدلاء الدوار ومكان في حامل مستقرة. وكثيراً ما سيتبين عصابة مرئية من حويصلات في جزء يسير الاهتمام. "الماصة؛" عشر كسور المسلسل من 490 ميليلتر من الأعلى من التدرج في أنابيب المقابلة. وسوف يكون هناك كمية صغيرة من السوائل المتبقية في الجزء السفلي من الأنبوب الذي يرجح أن تحتوي على بروتينات تلويث. يمكن تجاهل هذه العينة، أو الاحتفاظ بها ككسر 11 إذا رغبت في ذلك.
- قياس الانكسار من الكسور باستخدام إنكسار. يمكن أيضا إجراء هذا بتدرج تحكم تشغيل في نفس الوقت إذا لزم الأمر حفظ العينة. "الماصة؛" 20-30 ميليلتر لكل جزء يحتوي على إيوديكسانول على سطح الانكسار، وتقدير الكثافة بمقارنة الانكسار إلى الكثافة إيوديكسانول المعروفة. ملاحظة أن الكسور يمكن تخزينها بين عشية وضحاها في الحل الذي يحتوي على إيوديكسانول إذا لزم الأمر قبل المضي قدما إلى الخطوة التالية أغسل تنبيذ فائق.
- نقل كل جزء في أنبوب تنبيذ فائق نظيفة 12 مل. إضافة 5 مل 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (برنامج تلفزيوني؛ 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 مم بوكل، 10 مم نا2هبو4، 2 مم خ2ص4، ودرجة الحموضة 7.4) للأنبوب ومزيج من بيبيتينج ببطء صعودا وهبوطاً.
ملاحظة: ينبغي أن يكون برنامج تلفزيوني إضافة إلى العينات خالية من الجسيمات، ويضمن تصفية PBS العقيمة من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لتجنب ترسيب الملح. - إضافة مل 6 إضافية من برنامج تلفزيوني x 1 إلى الأعلى ومرة أخرى تخلط بعناية.
- أولتراسينتريفوجي الأنابيب في 100,000 س ز 2 ح في 4 درجات مئوية إعادة بيليه حويصلات صغيرة. صب المادة طافية والاستفادة من الأنابيب الجافة قبل تحلل حويصلات لتحليل البروتين (الخطوة 3) أو إعادة تعليق من المركبات الكهربائية لتحليل السمات (الخطوة 5).
3-تحلل وتأكيد Immunoblot البروتينات EV
ملاحظة: إذا كان المطلوب هو الحفاظ على حويصلات كله لتوصيف السمات أو النشاط البيولوجي، يمكن متابعة الباحثين مباشرة إلى الخطوة 5. في التجارب الأولية، أو قبل تحليل الطيف الكتلي، يجب أن يتم تحليل جميع الكسور استردادها من إيمونوبلوت تأكيد الكسور مع البروتينات EV.
- للمركبات الكهربائية لتحليل البروتين، إضافة 40 ميليلتر من تحلل قوي المخزن المؤقت (5% الحزب الديمقراطي الصربي، 10 مم يدتا، 120 مم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 6.8، 2.5% 2-mercaptoethanol، اليوريا م 8) بالإضافة إلى مثبطات البروتياز إلى بيليه EV في أنبوب أولتراسينتريفوجي.
ملاحظة: إذا كانت شروط الحد من غير المرغوب فيها للكشف عن الأجسام المضادة للبروتينات، تحل محل الماء عالي النقاوة ل 2-mercaptoethanol في المخزن المؤقت لتحلل قوية. - ضمان إكمال إعادة تعليق بيليه وتحلل المركبات الكهربائية في المخزن المؤقت عن طريق وضع بارافيلم فوق تنبيذ فائق أنبوب، فورتيكسينج بقوة، ثم التأرجح لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل دوامة نهائي.
- الطرد المركزي بإيجاز في 1,000 س ز 30-60 ثانية لاستعادة حجم العينة كاملة. نقل العينة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل الجديدة ومخزن في-20 درجة مئوية إلى-80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
- لإعداد ليساتيس المنقي لتحليل إيمونوبلوت، إضافة 5 x Laemmli المخزن المؤقت (10% الحزب الديمقراطي الصربي، 250 ملم تريس الأس الهيدروجيني 6.8، 1 ملغ/مل بروموفينول الأزرق، 0.5 م DTT، والغليسيرول 50%، 5% 2-mercaptoethanol) عينة للعينات لتركيز نهائي العاشر 1.
ملاحظة: إذا هي رغبت في الحد من غير شروط، باستبدال DTT و 2-ميركابتوثانول بالماء عالي النقاوة. - إذا هوموجيناتي كل الأنسجة المرغوب فيها الضوابط، الأنسجة في اليوريا التي تحتوي على قوي المخزن المؤقت لتحلل بالتفصيل أعلاه مع مثبطات البروتياز، ثم الطرد المركزي في 10,000 س ز لمدة 10 دقيقة لتجاهل في المصفوفة خارج الخلية المتبقية، وخلايا كاملة، أو الحطام الخلوية سليمة. إضافة x Laemmli 5 عينة المخزن المؤقت إلى هوموجيناتي الأنسجة لتركيز 1 x نهائي.
- تغلي العينة المخزن المؤقت الذي يحتوي على عينات هوموجيناتي EV أو الأنسجة في 95 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة، ثم تحميل وحدة التخزين متساوية (من ما يعادل 0.1-0.3 ز من ابتداء من مواد النسيج؛ 1-2 ميكروغرام لتنقية البروتين EV) الكسور 1-10 إلى هلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 10%. تحميل الكتلة مساوية للأنسجة هوموجيناتي. ربما تحتاج كميات أكبر من العينات للكشف عن الأجسام المضادة أقل حساسية.
- المضي قدما في جل التفريد وتحليل لطخة غربية ك مفصلة قبل21 إلى تأكيد البروتينات EV في ليساتيس النقية وقارن الوفرة النسبية EV في الكسور.
ملاحظة: مجرد EV البروتين أثبت تكاثر في الكسور متسقة، قد يكون الغسيل تنبيذ فائق النهائي هو موضح في "الخطوة 2، 12" محدودة للكسور التدرج من الفائدة.
4-EV البروتين الكمي
- استخدام تحليل القائم على الأسفار متوافقة منظفات ويوريا إذا كان التحديد الكمي الحساسة للبروتينات EV هو المطلوب لمزيد من التحليل (انظر الجدول للمواد). لاحظ أن بعض الاختبارات المستندة إلى الأسفار متوافقة مع الأزرق بروموفينول الموجودة في المخزن المؤقت عينة لايملي، تسهيل تحلل مباشرة بيليه EV (في الخطوة 2، 12) في هذا المخزن المؤقت إذا فضلت.
- إذا تم استخدام طقم الكمي البروتين المستندة إلى الأسفار المذكورة آنفا، ميليلتر 1 بقعة من معيار بعينه أو على الأقل مكررة على ورق الترشيح المقدمة، ومواصلة تحديد مقدار البروتين طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة.
5-تحديد خصائص مورفولوجية EV
- دراسة الحويصلات كله بعد الطرد المركزي النهائي تغسل في "الخطوة 2، 12"، شاملة إعادة تعليق بيليه EV في برنامج تلفزيوني x 1 خالية من الجسيمات. تخزين المركبات الكهربائية عند 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد على أسبوع واحد حتى دورات المعالجة لتجنب تجميد أذاب.
ملاحظة: أنه من المفيد قد أكد سابقا الكسور دائماً يحتوي على بروتين EV المخصب بتحليل إيمونوبلوت للحد من التحليلات المورفولوجية للكسور للفائدة. - أداء نانوحبيبات تتبع التحليل كله EV العينات لتحديد تركيز وحجم الحويصلات في الأعمال التحضيرية، كما سبق مفصلاً22.
- تميز مورفولوجيا EV وتأكيد قياسات الحجم بواسطة المجهر الإلكتروني من حويصلات، إذا رغبت في ذلك. م الشبكات يمكن أن تكون مستعدة من المعلقات حويصلة عقب 5.1 الخطوة23، أو بدلاً من ذلك يمكن معالجتها ككتلة الأعمال التحضيرية24 من الكريات بعد "الخطوة 2، 12".
6-في جل التربسين الهضم وتنقية لتحليل الطيف الكتلي
- إذا كان المطلوب هو وصف بروتيوميس EV بالطيف الكتلي، تحميل الكتلة تساوي (على الأقل 10 ميكروغرام من البروتين) للكسور التي تحتوي على المركبات الكهربائية في جل polyacrylamide مسبقة الصب لفصل وتنقية البروتينات. ويفضل الجل مسبقة الصب المصنعة المتوفرة للحد من مستويات احتمال تلويث البروتينات (مثل الكيراتين) يجري إدخالها في النماذج.
- تشغيل العينة 0.5 بوصة على الأقل في جل polyacrylamide لتنقية البروتين، ثم إصلاح ووصمة عار مع أخذ صبغ، كما سبق ذكره في التفصيل25.
- قطع الممرات في 1 ملم3 مكعبات الهضم التربسين، كما سبق مفصلاً19،26.
- تحميل 5 ميليلتر من عينة الببتيد هضمها في الصك LC-MS/MS للانفصال عن العمود التحليلية والتحليل اللاحق بالطيف الكتلي وفقا للمعلمات المحددة في التفصيل16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم عرض لمحة تخطيطي لتفكك النسيج والطرد المركزي التفاضلي، وتنقية التدرج من حويصلات في الشكل 1. يتم إبراز تأكيد مورفولوجك وإيمونوفينوتيبيك من المركبات الكهربائية تنقية التدرج في الشكل 2. رسم تخطيطي لاستنساخه بكثافة بعد تنبيذ فائق التدرج إيوديكسانول 10-30% يظهر، مع اثنين من السكان حويصلة متميزة يهاجرون إلى أعلى جزء 2 (ضوء المركبات الكهربائية) والكسر 5 (كثافة المركبات الكهربائية)، اعتماداً على نوع النسيج. إيمونوبلوتس الممثل للكسور التدرج يحمل كفاءة فصل وتنقية المركبات الكهربائية الصغيرة المستمدة من ورم في جزء 5. من المذكرة، عينات ورم الرئة ظهرت المخصب في كثافة المركبات الكهربائية الخفيفة المركبات الكهربائية (في جزء 2) قبل حصادها من أنسجة المخ كله، بالمقارنة مع أبرز مرة أخرى هنا. الظهور كإجراء تحليل أنسجة عالمية للمركبات الكهربائية، وسيكون من المثير للاهتمام لتحديد كثافة متميزة من المركبات الكهربائية التي تنتجها الأنسجة فريدة من نوعها. نانوحبيبات الممثل تتبع التحليلات والمجهر الإلكتروني من حويصلات المستمدة من الأنسجة في الغالب الكسر المحتوية على حويصلة إثبات الإثراء والحفاظ عليها حويصلات كله يتفق مع حجم معروف وهيكل المركبات الكهربائية الصغيرة. وأخيراً، يبرز الشكل 3 فائدة هذا الأسلوب في تيسير توصيف المصب الكتلي حويصلة التدرج تنقية البروتينات، مما يدل على الكشف عن العديد من البروتينات التي سبق تحديدها في المركبات الكهربائية الصغيرة. العديد من هذه البروتينات التي تم تحديدها متسقة مع تلك التي أثرت في المركبات الصغيرة المستمدة من اندوسومال سبق أن اقترحها Théry وتلة17،مختبرات20.
الشكل 1 : نظرة عامة التخطيطي حويصلة العزلة وتنقيتها من كل الأنسجة. يمكن حراكه الأنسجة الكريات EV الخام تنبيذ فائق، والترشيح، الانفصال والمقاصة قبل الطرد المركزي التفاضلي الخطوات التالية في الجزء السفلي من التدرج إيوديكسانول الكثافة لفصل التعويم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تحليل السمات وإيمونوفينوتيبيك الممثل للمركبات الكهربائية المستمدة من الأنسجة. (أ) تحسب كثافة إيوديكسانول التدرج التالي تنبيذ فائق، بلغ متوسط عن تجارب مستقلة، تسلط الضوء على الكسور التي تحتوي على المركبات الكهربائية الخفيفة والكثيفة. (ب) ممثل إيمونوبلوتس من حويصلات الأنسجة المستمدة مما يدل على عزل يغلب الورم كثافة المركبات الكهربائية والضوء الدماغ المركبات الكهربائية. يعزل حويصلة تنضب من البروتين غير EV كالنيكسين. ح، هوموجيناتي الأنسجة. (ج) نانوحبيبات تتبع تحليل (NTA) للممثل الأنسجة التدرج تنقية المركبات الكهربائية. أصغر الجسيمات المكتشفة في هذه العينة كان 78 كانت شمال البحر الأبيض المتوسط، وحوالي 92% من حويصلات الكشف عن 250 نيوتن متر أو أصغر، تمشيا مع تخصيب العالي من المركبات الكهربائية الصغيرة. (د) صور المجهر الإلكتروني ممثل للمركبات الكهربائية المستمدة من أنسجة المخ. تغيير حجم أشرطة = 200 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : ملخص للبروتينات حويصلة أبرز الكشف عنها بواسطة الكتلي ممثل المستمدة من الأنسجة عينة EV. بعد استخراج EV وتنقية التدرج، تم تحميل 10 ميكروغرام من البروتين EV في كسر المخصب هلام polyacrylamide للتفريد والهضم في جل التربسين. في هذه الأنسجة المشتقة EV عينة تمثيلية، حددت مجموعة بروتينات 918 تحليل LC-MS/MS. وحددت الببتيدات، وتحليلها، والعثور على الإثراء في اكسوسومال، الليزوزومية، وبروتينات غشاء البلازما كما هو موضح سابقا16. هنا، نحن إثبات وجود EV الصغيرة أو البروتينات اكسوسومال في تحضيراتنا قد وصف Théry وتلة17،مختبرات20. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم إنشاؤها الاهتمام العلمي كثيرا فيما يتعلق بالأدوار التي تلعب المركبات الكهربائية الصغيرة في ورم المكروية، وكذلك في تطوير الجهاز والنضج، والدالة. وتوفر هذه الدراسة الشاملة، سير العمل أمثل لاستخراج المركبات الكهربائية سليمة من الدماغ كله أو عينات من الورم. بينما هنا نحن ببساطة توضح إمكانية تطبيق هذه التقنية للمركبات الكهربائية المستمدة من ورم الرئة، هذا الأسلوب يمكن بسهولة تكييف للعمل على الأنسجة الصلبة الأخرى، توفير فرص لزيادة السابقين فيفو توصيف من حويصلات يفرز الصغيرة التي من الفائدة الطبية واسعة النطاق. بينما يتجاوز نطاق هذه الدراسة، سيكون المستقبل مقارنة المحتوى EV إلى أن تنشأ الأنسجة التعبير المهم إنشاء الأداة المساعدة من الحويصلات المعزولة كالمؤشرات الحيوية الأنسجة والأمراض.
في دراسة نشرت سابقا بالمختبر، ونحن تبين بوضوح مزايا التدرج كثافة المستندة إلى التعويم على التدرجات الترسيب لتنقية حويصلات صغيرة المخصب. في جوهرها، يحسن فصل القائم على الطفو تنقية حويصلات عن طريق تجنب الهجرة الملوث من خلال الكسور للفائدة. يظهر هذا المبدأ أهمية خاصة عند ابتداء من العينات المعقدة مثل النسيج كله. بغض النظر، نشدد على أهمية الدراسات التحليلية قبل تأكيد من الحويصلات المعزولة المذكورة، بما في ذلك دراسة مورفولوجيا EV من خلال تقنيات تكميلية مثل الميكروسكوب الإلكتروني ونانوحبيبات تتبع التحليل، وكذلك التحاليل الكيميائية الحيوية بما في ذلك إيمونوبلوتينج. أكد البروتينات EV في الكسور المخصب مع مالا يقل عن ثلاثة علامات EV المعترف بها، بما في ذلك واحدة من البروتين تيتراسبانين، كما أوصى بذلك التقرير حدا أدنى من المعلومات "الدراسات للمركبات الكهربائية" (مسعف) نشرت في "مجلة خارج الخلية" 27من الحويصلات. ينبغي إظهار علامة EV سلبية لغيابه أو مخفضة للغاية في الكسور EV مقارنة بالانسجة هوموجيناتيس. جميع الخطوات المذكورة أعلاه تعتبر حاسمة لضمان الجودة لتنقية حويصلة صغيرة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن حفظ مظاهرة مبكرة من الاتساق الخاصة بالمختبرات والمستخدم في كثافة الكسور التي تحتوي على قيمة المنشأة قيمة الوقت والتكلفة المرتبطة بمعالجة وتحليل جميع الكسور في أعقاب الخطوة التدرج تنبيذ فائق الكثافة.
فمن الواضح أن حويصلات من أنسجة متنوعة قد تعدت للكسور كثافة مختلفة قليلاً، أو قد فصل في الغالب الخفيفة أو الكثيفة الفئات السكانية الفرعية. وقد شوهدت هذه الاختلافات سابقا في كل المركبات الكهربائية المستمدة من المخ مقارنة بالمركبات الكهربائية التي تحصد من الخلايا الجذعية تزرع في الثقافة16،17، وكذلك أثبتت في هذه الدراسة. نظهر أن عينات من ورم الرئة قد تأوي يغلب المركبات الكهربائية الصغيرة كثيفة مقارنة بالمركبات الكهربائية أخف المعزولة من أنسجة المخ. هذه الاختلافات وأبرز الطريقة المقترحة في هذه الدراسة قد تشجع التحقيقات القيمة في تشكيل فرق من المركبات الكهربائية، بما في ذلك الورم المركبات الكهربائية التي قد تكون معبأة مع الحمض النووي كثيفة خيوط28،،من2930. وبسبب هذه الاختلافات في تكوين EV، نؤكد بشدة أهمية هذه التجارب التقنية الأولية. ستكون هامة تحديد ما إذا كانت المركبات الكهربائية الكثيفة يغلب يفرز في إينتيرستيتيوم لأنواع أخرى من الأورام، وكذلك التطبيق المستقبلي لهذا الأسلوب لعزل المركبات الكهربائية من عينات الورم المتنوعة.
حين تنقية كاملة من المركبات الكهربائية الصغيرة وعزل الفئات السكانية الفرعية حويصلة متميزة لا يزال القيد الحالي عبر المختبرات، هذا الأسلوب يوفر أساسا لإجراء مزيد من الدراسات لتوصيف حويصلات صغيرة من مجموعة متنوعة من الأنسجة أو الورم أنواع، وقد يسهل ذلك فهم أكبر للتنوع EV. الأخيرة فصل جزيئات EV بوجود حقل التدفق غير المتناظر تدفق مضيئة في إمكانية شحن متميزة والمهام الصغيرة (60-80 نانومتر) مقابل أكبر (90-120 نانومتر) اكسوسوميس، وكذلك تحديد مجموعة فرعية من غشاء غير منضم < 50 نانومتر جسيمات تسمى "اكسوميريس"،من3132. ومع ذلك، متنوعة البضائع وتعبئتها في هؤلاء السكان حويصلة فريدة من نوعها عبر خطوط الخلايا، تسليط الضوء على تباين كبير من حويصلات يفرزها، ودعم أهمية تحليل حويصلة في المختبر أو السابقين فيفو شامل. في هذه الدراسة، ونحن إثراء الأكثر احتمالاً لكلا الفئتين من اكسوسوميس المحددة. قد تكون نسبة ميكروفيسيكليس الصغيرة بكثافة مماثلة اكسوسوميس موجودة في يعزل كذلك. على الرغم من أن لا يمكننا أن نستبعد إمكانية اكسوميريس في أن يعزل، الحويصلات الغشاء زمنياً تم التأكيد الأكثر وفرة في كسور التدرج أثري في حويصلة البروتين. بالإضافة إلى المركبات الكهربائية الصغيرة، أونكوسوميس كبير (> 1,000 nm) كانت من الاهتمام مؤخرا بالسرطان البيولوجيون33. بينما وصف البروتوكول في هذه الدراسة بتصفية حويصلات أكبر من 450 نانومتر، استبعاد هذه الخطوة قد تسهل دراسة هذه المركبات الكهربائية الكبيرة ووصف. النظر مستقبلا في كثافة المرتبطة بمختلف الفئات السكانية الفرعية في حويصلة سيكون من المهم التمييز بين هذه الكيانات بالإضافة إلى أحجام وصف الخاصة بهم.
أخيرا، على الرغم من أننا نقدر القيود بما في ذلك التكاليف والوقت المرتبطة بهذه التقنية المقترحة، علينا أيضا الاعتراف بالحاجة إلى أساليب التأسيسية صارمة تميز الأنسجة المركبات الكهربائية وأن تكون بمثابة إجراء مقارنة الناتج النهائي لاستمرار أساليب متطورة وأكثر تطورا في المستقبل. نأمل أن هذه النهوض بالتكنولوجيات سوف تضيء أكثر سرعة وسريريا متوافق مع تقنيات لاستخراج المركبات الكهربائية من العينات الطبية أو الجراحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون الدكتور ريتشارد نوواكووسكي والموارد الحيوانية فلوريدا دولة جامعة المختبر لتقديم ورعاية الحيوانات المستخدمة لوضع هذا البروتوكول، مع الاحترام. ونحن نشكر ليو شيا والدكتور راكيش سينغ، وفلوريدا دولة جامعة متعدية علوم المختبر للمساعدة مع عمل الكتلي المستخدمة لوصف حويصلة المتلقين للمعلومات، فضلا عن مرفق "الموارد التصوير العلوم البيولوجية الاتحاد السوفياتي السابق" في استخدام المجهر الإلكتروني الإرسال في هذه الدراسة. وأخيراً، نشكر الدكتور ومانديب ساشديفا (فلوريدا جامعة أية آند أم) للتبرع بورم في العينات المستخدمة في تطوير هذا الأسلوب. هذه الدراسة كانت تدعمها المنح من "برنامج البحوث" بفلوريدا وزارة الصحة اد واثيل مور الزهايمر المرض الممنوحة إلى D.G.M. و J.M.O (6AZ11) والمعهد الوطني للسرطان من "المعاهد الوطنية للصحة" تحت "رقم جائزة" R01CA204621 إلى D.G.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm filter | VWR | 28145-505 | |
| 12 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| 5.5 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| anti-Alix antibody | Santa Cruz | sc-7129 | |
| anti-Calnexin antibody | Santa Cruz | sc-11397 | |
| anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| anti-CD81 antibody | Santa Cruz | sc-9158 | |
| anti-Flotillin 2 antibody | Santa Cruz | sc-25507 | |
| anti-HSC70 antibody | Santa Cruz | sc-7298 | |
| anti-Syntenin-1 antibody | Santa Cruz | sc-100336 | |
| anti-TSG101 antibody | Santa Cruz | sc-7964 | |
| EZQ protein quantification kit | ThermoFisher Scientific | R33200 | |
| FA-45-6-30 rotor | Eppendorf | 5820715006 | |
| FEI CM120 Electron Microscope | TSS Microscopy | ||
| goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) | Genetex | 27171 | |
| HALT phosphatase inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78420 | |
| HALT protease inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78438 | |
| Hibernate E medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| MLS-50 swinging-bucket rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
| NanoSight LM10 | Malvern | ||
| Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Optima XE-100 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Optiprep | Sigma | D1556 | 60% iodixanol in sterile water solution |
| Q Exactive HF Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | ||
| rabbit anti-goat IgG | Genetex | 26741 | |
| rabbit anti-mouse IgG | Genetex | 26728 | |
| Refracto 30PX (refractometer) | Mettler Toledo | 51324650 | |
| S-4-104 rotor | Eppendorf | 5820759003 | |
| SW 41 Ti swinging-bucket Rotor | Beckman Coulter | 333790 | |
| Tabletop 5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 |
References
- Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses. Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- Howitt, J., Hill, A. F. Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases. Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).
- Sardar Sinha, M., et al. Alzheimer's disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers. Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).
- Meckes, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).
- Meckes, D. G. Exosomal communication goes viral. Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).
- Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
- Zhang, X., et al. Exosomes in cancer: small particle, big player. Journal of Hematology Oncology. 8, 83 (2015).
- Janas, A. M., Sapoń, K., Janas, T., Stowell, M. H. Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).
- Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses. Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).
- Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
- Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
- Katsiougiannis, S. Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity. Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Hurwitz, S. N., et al. An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease. Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
- Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space. Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).
- Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).
- Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).
- Hurwitz, S. N., et al. CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.κB Signaling. Journal of Virology. 91 (5), (2017).
- Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).
- Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
- Meckes, D. G. Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).
- Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 6, 23978 (2016).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
- Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nature Communications. 2, 180 (2011).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
- Zijlstra, A., Di Vizio, D. Size matters in nanoscale communication. Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).
- Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. Oncosomes - large and small: what are they, where they came from. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).
