Summary
在这里, 我们提供了一个详细的方案, 以分离细胞外囊泡 (ev) 从整个组织, 包括大脑和肿瘤标本。该方法提供了一种可重复的技术, 可从固体组织中提取 ev, 以便进一步进行下游分析。
Abstract
循环和间质小膜结合囊泡 (ev) 是开发新的诊断或预后生物标志物检测的有希望的目标, 并可能成为在大量的进展的重要参与者疾病。目前的研究重点是从多种细胞和组织类型分泌的囊泡的特征, 以便更好地了解 ev 在神经退行性变、炎症和癌症等疾病的发病机制中的作用。然而, 全球一致和可重复的分离和纯化囊泡的技术仍在进行中。此外,从体内固体组织中提取 ev 的方法也很少被描述。在这里, 我们提供了一个详细的协议, 从整个新鲜或冷冻组织, 包括大脑和肿瘤标本中提取感兴趣的小电动车, 以便进一步表征。我们证明了该方法在多个下游分析中的适应性, 包括电子显微镜和囊泡的免疫表型表征, 以及 ev 蛋白的定量质谱。
Introduction
小的细胞外囊泡 (ev) 包括内皮衍生的外周细胞和小膜脱落的微囊泡, 具有广泛的生物医学兴趣。小 ev 是由异质种群 50-250 nm 膜结合囊泡, 其中含有生物活性蛋白、脂质和核酸, 这些物质被共同认为在多种疾病过程中发挥着重要作用。推进的研究特别将这些囊泡与神经退行性疾病和 prion 疾病、感染过程、自身免疫性或炎症性疾病以及肿瘤生长和转移1, 2,3有关,4 个,5,6,7.,8,9,10,11,12,13. 对 ev 在疾病发病机制中的重要性的生物医学研究迅速增加, 引起了人们对开发可重复和严格的分离和纯化这些囊泡的方法的平行兴趣。
电动汽车特性的历史和当前挑战是无法完全分离小型 ev 亚群。这一挑战主要是由于我们对不同囊泡的生物发生的不同分子机制的理解有限。亚群之间的重叠大小、密度和生物货物进一步控制了这些区别。这一挑战的部分原因还包括使用截然不同的浓缩技术, 在对实验室间孤立的囊泡进行下游分析方面存在不一致之处, 并破坏了全球为照亮分类电动车种群所做的努力。
值得注意的是, 大多数 ev 特性都是通过体外收集细胞培养上清液进行的, 最近的体内研究描述了从包括血浆、尿液在内的动物或人体体液中分离囊泡的技术, 和唾液。虽然在循环中大量存在的电动车, 但它也认识到, 这些囊泡在细胞间的通信事件中起着重要作用, 并存在于细胞组织的间质中。在癌症的背景下, 间质 ev 可能是特别重要的调节肿瘤微环境的癌细胞种子和转移生长 14,15。因此, 从固体组织标本中提取囊泡的技术的发展和优化具有重要价值。这些方法将提供一种方法, 直接研究有机或肿瘤衍生的 ev 从临床标本, 包括小活检和部分或全部器官切除。
在这项研究中, 以及在我们实验室16发表的上一份报告中, 我们的目标是解决目前在 ev 浓缩方法中关注的几个主要问题: 1) 描述一种可重复的技术, 以分离和净化 ev, 达到目前的最高标准。在该领域被接受;2) 试图分离高富集于内骨源性外显体的小型 ev 亚群;3) 提供从固体组织标本中提取这些囊泡的协议, 以便进一步表征。
最近, kwal 和他的同事描述了一个相对小规模的碘沙诺密度梯度, 以更高的效率分离和纯化 ev 亚群, 比可比的蔗糖密度梯度17。在所引用的研究中, 树突状细胞衍生的 ev 在相对较轻的密度分数下捕获, 与 1.1 g/ml 的密度一致, 在被认为与本报告中存在的高比例外显体的内染色体蛋白中得到了高度丰富的。分数。根据作者的研究, 这些 "真正的" 体外蛋白包括肿瘤易感基因 101 (tsg101)、合成蛋白1、cd81、adam10、ehd4 和几种环素蛋白 17。我们后来调整了这一技术, 以成功的组织离解方法描述的佩雷斯-冈萨雷斯等人18和随后的差分离心协议, 以分离整个脑源 evs16。我们还证明了这种方法在描述 ev 蛋白的效用, 结合顺序协议的下游定量和比较质谱的水泡蛋白, 以前在我们的实验室 19描述。这项工作与希尔实验室的工作是一致的, 在那里, ev 从大脑的额叶皮层丰富了 20。
在这项研究中, 我们详细阐述了这一技术, 并扩大了最近从我们的实验室公布的协议的应用, 以分离电动车从固体肺肿瘤。据我们所知, 这是首次描述从体内肿瘤标本中丰富 evs 的方案的研究。鉴于人们对电动车作为新的诊断生物标志物的广泛兴趣及其在肿瘤形成中的作用, 这种方法可能会对越来越多的科研人员有价值。从临床角度来看, 间质 ev 具有很大的诊断价值, 特别是在组织学评价有限的标本中。我们希望这里概述的方法将为从新鲜或冷冻动物或人类手术标本中获取 ev 的可重复技术提供基础, 为今后的工作铺平道路, 以揭示这些小疾病发病机制中的重要作用小泡可能会发挥。
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Protocol
整个大脑都是在佛罗里达州立大学动物使用和护理机构委员会 (iacuc) 的批准下获得的。如前面所述, c57bl6 j 背景中共有12个老鼠大脑 (每个年龄组3个大脑: 2、4、6和 8个月) 用于电动车提取.经佛罗里达农业机械大学 iacuc 批准, mandip sachdeva 博士慷慨捐赠了肺肿瘤标本。肺肿瘤来源于在免疫缺陷的巴布内裸鼠中生长的人腺癌细胞系 h1975。本研究重点介绍了两个具有代表性的肿瘤复制的数据。
请注意:图 1提供了囊泡分离和纯化方法的示意图概述。
1. 组织分离和微分离心
- 在 hibernate-e 培养基中, 每组织约 0.4-1.0 g, 制备10毫升的离解缓冲液 (10 毫克木瓜蛋白酶; 5.5 mm l-半胱氨酸; 67μm 2-硫醇; 1.1 mm edta)。请注意, 所有用于电动汽车浓缩和净化的溶液都应在超纯过滤水中稀释。
- 将整个新鲜或冷冻组织加入50毫升锥形管的离解缓冲液中, 在37°c 的温水浴中孵育 20分钟. 如有需要, 可在孵育前将组织切割成较小的碎片。
- 孵育后, 在含有组织的离解缓冲液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂, 以获得最后1x 的浓度。
- 将含有该组织的溶液放入宽松的溶出均质机中, 并使用每个样品大约30次慢击轻轻分离组织。中风的数量可以根据组织的一致性进行调整。
- 在4°c 下, 将缓冲液中的离解组织转移到50毫升锥形管和离心机上, 在4°c 下 5分钟, 以颗粒细胞和剩余的纤维或内聚组织碎片。
- 将上清液转移到干净的50毫升锥形管和离心机上, 在4°c 下, 以 2, 000 x克的速度 10分钟, 以颗粒和丢弃较大的细胞碎片。
- 将上清液再次转移到一个干净的50毫升锥形管和离心机在 10, 000 x克在4°c 下 40分钟, 以颗粒不想要的大囊泡或小凋亡体。
请注意:如果需要, 可以保存这种颗粒, 以便对较大的囊泡进行额外的研究。 - 通过0.45μm 过滤器将上清液分解成干净的 12 ml 超离心管。
请注意:纤维化组织样本可能不易过滤。这些样品可以通过40μm 电池过滤器进行过滤, 然后通过连续较小的针头 (18 g、20 g、22 g), 然后通过0.45μm 过滤器进行过滤。 - 在4°c 条件下, 以 100, 000 x克的速度将样品超离心为 2小时, 以子弹状小型 ev。
- 分解上清液, 使超离心管倒置 5-10, 频繁敲击以去除管两侧的残留液体。残余液体也可以使用吸气真空移液器吸气。
- 在 0.25 m 蔗糖缓冲液的 1.5 ml 中重新悬浮 ev 颗粒 (10 mm tris, ph 7.4)。重要的是要确保在这一步中的颗粒完全重新悬浮。要做到这一点, 覆盖与副膜管之前, 涡旋电动车到解决方案。在最后一次涡旋混合之前, 在室温下对超离心管进行15-20 的摇晃。
- 以不超过 1, 000 x克的速度对管材进行简短的离心, 以回收管内底部的液体悬浮液。
- 按照下面的梯度净化步骤, 或如果需要, 将 ev 悬浮液存放在4°c 过夜。
2. 密度梯度净化
- 在含有 ev 的 1.5 ml 蔗糖-tris 缓冲液中加入 1.5 ml 60% 碘沙诺 (水中的库存溶液), 以创建含有30% 碘沙诺的最终溶液。移液器上下多次, 以彻底混合溶液。请注意, 避免失去液尖的溶液, 因为高碘沙诺浓度是相当粘稠的。
- 将含有 ev 的30% 碘沙诺缓冲液转移到 5.5 ml 超离心管的底部。
- 从60% 碘沙诺库存溶液中, 在超纯水中为每个样品制备至少 1.5 ml 的20% 和10% 碘醇溶液。
- 测量1.3 毫升20% 碘沙诺, 并使用注射器和 18 g 针小心地在底部梯度层的顶部层。为了避免在密度界面处混合层, 保持针头的斜面与半月板上方的超离心管内部接触, 并向下添加溶液。
- 使用与上述相同的技术, 在20% 碘化醇层的顶部的10% 碘醇溶液的 1.2 ml ml。
- 在2.8000xg 的秋千桶转子中, 在 24000 x g的情况下, 小心地平衡和加载超离心管转子桶和离心机, 在4°c 下持续50分钟。将离心机的加速和减速速度设置为允许的最小速率, 以避免密度层中断。
- 为每个样品标记 10个 1.5 ml 微离心管, 以对应于密度梯度的分数1到10。分数1被指定为将首先删除的最上面的分数, 而分数10是最后删除的底部分数。
- 梯度超离心完成后, 轻轻地从转子桶中取出管, 放置在一个稳定的支架中。在兴趣的部分, 往往会看到一个可见的囊泡带。将40张水机的10个串行分数490μl 从梯度顶部进入相应的管中。在试管的底部会有少量的液体, 可能含有污染蛋白质。此示例可以被丢弃, 也可以保留为分数 11 (如果需要)。
- 使用折射计测量分数的折射率。如果需要进行样本保存, 也可以在并行运行控制梯度的情况下执行此操作。将含有碘沙诺的每一组分移液器20-30μl 放在折射率仪表面, 并通过将折射率与已知的碘沙诺密度进行比较来估计密度。请注意, 在进行下一个超离心清洗步骤之前, 如果需要, 可以将分数隔夜存放在含碘合醇的溶液中。
- 将每个分数转移到干净的12毫升超离心管。加入5毫升的1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs; 137 mm ncl, 2.7 mm kcl, 10 mL na 2 hpo 4, 2mL kh2 po 4, ph 7.4) 到管中, 通过缓慢向上和向下移液混合.
请注意:样品中添加的 pbs 应无颗粒, 通过0.22μm 过滤过滤无菌 pbs 并在室温下储存以避免盐沉淀。 - 添加额外的6毫升的 1x pbs 的顶部, 并再次仔细混合。
- 在4°c 条件下, 以 100, 000 x克的速度将管材超离心为 2小时, 以重新颗粒小囊泡。在裂解囊泡之前, 将上清液分解并点击干燥管进行蛋白质分析 (第3步) 或重新悬浮电动车进行形态分析 (第5步)。
3. ev 蛋白的裂解和免疫印迹蛋白的测定
请注意:如果需要保存整个囊泡进行形态学表征或生物活性, 研究人员可以直接进入第5步。在初始实验中, 或在质谱分析之前, 所有回收的组分都应通过免疫印迹进行分析, 以确认与 ev 蛋白的组分。
- 为了裂解 ev 进行蛋白质分析, 加入40μl 的强裂解缓冲液 (5% sds, 10 mm edta, 120 mm tris-hcl ph 6.8, 2.5% 2-甲氨基乙醇, 8 m 尿素), 并在超离心管中添加蛋白酶抑制剂。
请注意:如果蛋白质抗体检测需要非还原条件, 则在强裂解缓冲液中用超纯水代替 2-硫代乙醇。 - 确保颗粒的完全重新悬浮和在缓冲液中裂解的 ev, 方法是将副回绝液放在超离心管上, 用力旋涡, 然后在室温下摇晃 20分钟, 然后再进行最后的涡流。
- 以 1, 000 x克的形式进行快速离心, 以恢复整个样品量, 为30-60 秒。将样品转移到新的 1.5 ml 微离心管, 并在-20°c 至-80°c 下存储, 直至进一步加工。
- 为制备免疫印迹分析的纯化裂解物, 在样品中加入 5x laemmli 样品缓冲液 (10% sds、250 mm tris ph 6.8、1 mgml 溴酚蓝、0.5m dtt、50% 甘油、5% 2-硫醇), 最终浓度为1x。
请注意:如果需要非还原条件, 请将 dtt 和 2-硫醇更换为超纯水。 - 如果需要整个组织同质化控制, 用上文详述的蛋白酶抑制剂将含有尿素的强裂解缓冲液中的组织裂解, 然后在 10, 000 x g处离心 10分钟, 丢弃剩余的细胞外基质、整个细胞, 或完整的细胞碎片。在组织均质中加入 5倍 laemmli 样品缓冲液, 最终浓度为1x。
- 将含有 ev 或组织同质样品的样品缓冲液在95°c 下煮沸 5-10, 然后将 1-1-10 的馏分中的相同体积 (从相当于 0.1-0.3 g 的起始组织材料; 1-2 微克纯化的 ev 蛋白) 装入 10% sds-page 凝胶。负载等量的组织均质。可能需要更多的样品才能被不太敏感的抗体检测出来。
- 按照前面的详细介绍, 进行凝胶电泳和西方印迹分析, 以确认纯化裂解液中的 ev 蛋白, 并比较 ev 的相对丰度。
请注意:一旦 ev 蛋白在一致的分数中被重现, 步骤2.12 中描述的最后的超离心清洗可能仅限于感兴趣的梯度分数。
4. ev 蛋白定量
- 如果需要对 ev 蛋白进行敏感定量以进行进一步分析, 请使用与洗涤剂和尿素兼容的荧光检测 (见材料表)。请注意, 某些基于荧光的检测与莱姆利样品缓冲液中存在的溴酚蓝兼容, 如果需要, 可帮助直接裂解此缓冲液中的 ev 颗粒 (步骤 2.12)。
- 如果使用上述基于荧光的蛋白质定量试剂盒, 请在提供的滤纸上发现1μl 样品或标准, 并根据制造商的说明继续进行蛋白质定量。
5. 电动汽车形态的表征
- 步骤2.12 中最后离心清洗后检查整个囊泡, 彻底重新悬浮无颗粒 1x pbs 中的 ev 颗粒。将电动车存放在4°c 下不超过一周, 直到处理, 以避免冻融循环。
请注意:通过免疫印迹分析, 将形态分析限制在感兴趣的分数上, 确定了一致含有浓缩 ev 蛋白的分数是有益的。 - 对整个 ev 样品进行纳米颗粒跟踪分析, 以确定制剂中囊泡的浓度和大小, 如前所述22。
- 如果需要, 通过囊泡的电子显微镜对 ev 形态进行表征, 并确认尺寸测量。在步骤 5.123 之后, 可以从囊泡悬浮液中制备 em 网格, 也可以在步骤2.12 之后从颗粒中处理24块状制剂.
6. 用于质谱分析的凝胶纯化和胰蛋白酶消化
- 如果需要用质谱对 ev 蛋白体进行表征, 将含有 ev 的分数等质量 (至少 10μg) 加载到预铸聚丙烯酰胺凝胶中, 以分离和纯化蛋白质。制造商提供的预铸凝胶是首选的, 以减少潜在的污染蛋白 (如角蛋白) 被引入样品的水平。
- 运行样品至少0.5 英寸的聚丙烯酰胺凝胶的蛋白质纯化, 然后修复和染色与库马西染料, 如前面详细描述 25。
- 按照先前详细说明的 19,26 , 将车道切割成1毫米3立方体,以促进胰蛋白酶消化.
- 将5μl 的消化肽样品加载到 lc-msms 仪器中, 以便在分析柱上分离, 并根据详细指定的参数进行质谱分析16。
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Representative Results
图 1显示了囊泡的组织离解、差动离心和梯度纯化的示意图。图 2突出了梯度纯化 ev 的形态和免疫表型确认。显示了10-30 碘沙诺梯度超离心后的可重复密度图, 两个不同的囊泡种群向上迁移到分数 2 (轻 ev) 和分数 5 (密集 ev), 取决于组织类型。梯度分数的代表性免疫细胞表现出有效的分离和纯化小肿瘤衍生的 ev 在分数5。值得注意的是, 与以前从整个脑组织中采集的轻型 ev (第2部分) 相比, 肺肿瘤标本在密集的 ev 中显得更加丰富, 这里再次强调了这一点。随着对 ev 的全球组织分析的出现, 确定独特组织产生的 ev 的不同密度将是有趣的。代表性纳米颗粒跟踪分析和电子显微镜组织衍生囊泡在主要的囊泡中的含有囊泡的部分表明, 整个囊泡的富集和保存符合已知的大小和结构小电动车。最后,图 3强调了这种方法在促进下游质谱表征梯度纯化囊泡蛋白的效用, 证明了检测到许多以前在小型电动车中发现的蛋白质。许多这些被识别的蛋白质与那些丰富于小型内生动物衍生的电动车之前提出的特里和希尔实验室 17,20.
图 1: 从整个组织中分离和纯化囊泡的原理图概述.经过组织分离、预清除差动离心步骤、过滤和超离心后, 粗 ev 颗粒可重新悬浮在碘沙诺密度梯度的底部进行浮选分离。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 有代表性的组织衍生电动车的形态和免疫表型分析.(a) 超离心后碘沙诺梯度的计算密度, 平均在独立实验中, 突出含有轻和密集 ev 的分数。(b) 组织衍生囊泡的代表性免疫细胞, 表明主要致密的肿瘤电动车和轻脑电动车的分离。叶尖分离株耗尽了非 ev 蛋白的钙质。h, 组织同质化。(c) 具有代表性的梯度纯化组织 ev 纳米粒子跟踪分析 (nta)。在这个样本中检测到的最小颗粒是78纳米, 检测到的囊泡约92% 是250纳米或更小, 与小 ev 的高富集度一致。(d) 大脑组织衍生的电子显微镜图像。刻度条 = 200 纳米。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 由具有代表性的组织衍生 ev 样品的质谱检测到的突出囊泡蛋白摘要.经 ev 萃取和梯度纯化, 将浓缩组分中的 10μg ev 蛋白加载到聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳和凝胶胰蛋白酶消化。在这一具有代表性的组织衍生 ev 样品中, 用 lc-msms 分析鉴定了918种蛋白质。如前所述, 多肽被鉴定、分析并发现在外染色体、溶酶体和质膜蛋白中得到了丰富。在这里, 我们展示了在我们的准备工作中存在小型 ev 或外体蛋白, 这已经描述了泰瑞和希尔实验室17,20。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
对于小电动车在肿瘤微环境中的作用, 以及在器官发育、成熟和功能中的作用, 已经产生了很多科学兴趣。总体而言, 这项研究为从整个大脑或肿瘤标本中提取完整的 ev 提供了优化的工作流程。虽然在这里我们简单地证明了这种技术在肺肿瘤衍生的 ev 中的适用性, 但这种方法可以很容易地适应其他固体组织的工作, 为进一步对小分泌的囊泡进行体内表征提供了机会。广泛的生物医学兴趣。虽然超出了本研究的范围, 但未来 ev 含量与原生组织表达含量的比较对于确定孤立的囊泡作为组织和疾病生物标志物的效用也很重要。
在我们实验室先前发表的研究报告中, 我们清楚地展示了基于浮选的密度梯度相对于沉积梯度在净化富集的小泡方面的优势。从本质上讲, 浮力分离通过避免污染物通过感兴趣的分数迁移, 改善了囊泡的净化。当从复杂的样品 (如整个组织) 开始时, 这一原则显得尤为重要。无论如何, 我们强调了所描述的隔离囊泡的分析前确认研究的重要性, 包括通过电子显微镜和纳米粒子跟踪分析等互补技术对 ev 形态进行检查。作为生化分析, 包括免疫印迹。按照《细胞外杂志》发表的《最小电动车研究信息》 (misev) 的报告的建议, 浓缩分数中的 ev 蛋白应至少使用三个公认的 ev 标记物进行确认, 其中包括一种四帕尼林蛋白水泡27。与组织均质相比, 在 ev 组分中, 应证明阴性 ev 标记物不存在或高度减少。上述所有步骤对于小囊泡纯化的质量保证都是至关重要的。此外, 早期演示含 ev部密度分数中的实验室和用户特定一致性, 可以节省与密度梯度超离心步骤后的处理和分析所有分数相关的宝贵时间和成本。
很明显, 来自不同组织的囊泡可能漂浮到稍有不同的密度分数, 或可能分离成主要的光或密集亚群。这些差异以前在整个大脑衍生的 ev 中已经看到, 与从16、17 培养中生长的树突状细胞中收获的电动车相比, 并在本研究中得到进一步证明。我们表明, 与从脑组织中分离出的较轻的 ev 相比, 肺肿瘤标本可能主要是密集的小 ev。本研究中提出的方法所强调的这些差异可能会促进对 ev 差异成分的有价值的调查, 包括可能含有密集 dna 链28、29、30的肿瘤电动车。由于电动汽车成分的这些差异, 我们强烈强调这些初步技术实验的重要性。这项技术在分离不同肿瘤标本中的 ev 的未来应用对于确定致密的电动车是否主要分泌于其他肿瘤类型的间质也将是重要的。
虽然小 ev 的完全纯化和不同囊泡亚群的分离仍然是实验室目前的局限性, 但这种方法为进一步研究从组织或肿瘤的多样性中描述小囊泡提供了基础类型, 因此可能有助于更好地了解 ev 的多样性。最近通过非对称流动场流分馏分离 ev 颗粒, 阐明了小 (60-80 纳米) 与大 (60-120 纳米) 外质体具有明显的货物和功能的可能性, 并进一步确定了非膜结合和 lt;50 纳米的子集被称为 "外显物"的粒子 31,32。然而, 包装在这些独特的囊泡群体中的货物因细胞系而异, 凸显了分泌囊泡的巨大异质性, 并支持了体外或体外囊泡综合分析的重要性。在这项研究中, 我们很可能丰富了这两类外显子的鉴定。分离株中可能也存在与外质体密度相似的小微泡的比例。虽然我们不能排除在我们的分离物的外显子的可能性, 膜结合囊泡肯定是最丰富的梯度分数丰富的囊泡蛋白丰富。除了小型电动车外, 癌症生物学家最近还对大型肿瘤 (& gt;1,000 nm) 感兴趣.虽然本研究中描述的协议过滤出大于450纳米的囊泡, 但排除这一步骤可能有助于检查所描述的这些较大的 ev。今后对各种囊泡亚群相关的密度的检查对于区分这些实体以及其描述的大小将是非常重要的。
最后, 尽管我们理解与这一拟议技术相关的限制, 包括成本和时间, 但我们也承认需要严格的基本方法来描述组织 ev 的特性, 并作为不断使用的最终产品比较。在未来不断发展和更复杂的方法。这些先进的技术将有望照亮更快速和临床兼容的技术, 从医疗或手术标本中提取电动车。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢理查德·诺瓦科夫斯基博士和佛罗里达州立大学实验动物资源组织恭敬地提供和照顾用于开发该协议的动物。我们感谢刘霞、拉凯什·辛格博士和佛罗里达州立大学转化科学实验室在用于下游囊泡表征的质谱研究方面提供的协助, 并感谢 fsu 生物科学成像资源设施。透射电子显微镜在本研究中的应用。最后, 我们感谢 mandip sachdeva 博士 (佛罗里达 a & m 大学) 捐赠了用于开发这种方法的肿瘤标本。这项研究得到了佛罗里达州卫生部 ed 和 ethel moore 阿尔茨海默氏症研究项目的资助, 该项目颁发给了 d. g. m. 和 j. m. (6az11), 并得到了国家卫生研究院国家癌症研究所颁发的奖项。授予 d. g. m. r01 ca204621。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm filter | VWR | 28145-505 | |
| 12 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| 5.5 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| anti-Alix antibody | Santa Cruz | sc-7129 | |
| anti-Calnexin antibody | Santa Cruz | sc-11397 | |
| anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| anti-CD81 antibody | Santa Cruz | sc-9158 | |
| anti-Flotillin 2 antibody | Santa Cruz | sc-25507 | |
| anti-HSC70 antibody | Santa Cruz | sc-7298 | |
| anti-Syntenin-1 antibody | Santa Cruz | sc-100336 | |
| anti-TSG101 antibody | Santa Cruz | sc-7964 | |
| EZQ protein quantification kit | ThermoFisher Scientific | R33200 | |
| FA-45-6-30 rotor | Eppendorf | 5820715006 | |
| FEI CM120 Electron Microscope | TSS Microscopy | ||
| goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) | Genetex | 27171 | |
| HALT phosphatase inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78420 | |
| HALT protease inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78438 | |
| Hibernate E medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| MLS-50 swinging-bucket rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
| NanoSight LM10 | Malvern | ||
| Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Optima XE-100 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Optiprep | Sigma | D1556 | 60% iodixanol in sterile water solution |
| Q Exactive HF Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | ||
| rabbit anti-goat IgG | Genetex | 26741 | |
| rabbit anti-mouse IgG | Genetex | 26728 | |
| Refracto 30PX (refractometer) | Mettler Toledo | 51324650 | |
| S-4-104 rotor | Eppendorf | 5820759003 | |
| SW 41 Ti swinging-bucket Rotor | Beckman Coulter | 333790 | |
| Tabletop 5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 |
References
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