本文提供了一种从完整组织（包括脑组织和肿瘤样本）中分离小细胞外囊泡（EVs）的详细方案。该方法可重复地从实体组织中提取EVs，用于后续下游分析。
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本文内容
摘要
摘要
循环系统和组织间液中的小型膜结合细胞外囊泡（EVs）是开发新型诊断或预后生物标志物检测方法的潜在靶标，并可能在多种疾病的发生发展中发挥重要作用。目前的研究致力于表征来自不同细胞和组织类型的囊泡，以更深入地理解EVs在神经退行性疾病、炎症和癌症等疾病发病机制中的作用。然而，全球范围内尚缺乏统一且可重复的囊泡分离与纯化技术。此外，关于从实体组织中体外（ex vivo）提取EVs的方法报道甚少。本文提供了一种详细的实验方案，用于从完整的新鲜或冷冻组织（包括脑组织和肿瘤样本）中提取目标小EVs，以便进一步分析。我们展示了该方法适用于多种下游分析的灵活性，包括囊泡的电子显微镜观察和免疫表型鉴定，以及EV蛋白的定量质谱分析。
引言
小型细胞外囊泡（EVs）包括内体来源的外泌体和小型膜脱落微囊泡，具有广泛的生物医学研究价值。小型EVs由一群异质性的、直径为50–250 nm的膜结合囊泡组成，含有具有生物活性的蛋白质、脂质和核酸，普遍认为它们在多种疾病过程中发挥重要作用。不断深入的研究尤其表明，这些囊泡参与神经退行性疾病和朊病毒病、感染过程、自身免疫或炎症性疾病，以及肿瘤生长与转移1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。随着EVs在疾病发病机制中重要性的生物医学研究迅速发....
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方案
全脑组织经佛罗里达州立大学机构动物使用与护理委员会（IACUC）批准获取。本研究使用了来自C57BL/6 J背景的共十二只小鼠的脑组织（每个年龄组3只，分别为2、4、6和8个月龄），用于细胞外囊泡（EV）的提取，提取方法如前所述16。肺部肿瘤标本由曼迪普·萨奇德瓦博士在佛罗里达农工大学IACUC批准下慷慨提供。这些肺部肿瘤来源于在免疫缺陷型Balb/c nu/nu裸鼠体内生长的人肺腺癌细胞系H1975。本研究重点展示了两个代表性肿瘤重复样本的数据。
注意： 囊泡分离与纯化方法的示意图见图1。
1. 组织解离与差速离心
- 每约 0.4–1.0 g 组织，用 Hibernate-E 培养基配制 10 mL 解离缓冲液（含 10 mg 木瓜蛋白酶；5.5 mM L-半胱氨酸；67 µM 2-巯基乙醇；1.1 mM EDTA）。注意，用于细胞外囊泡（EV）富集和纯化的所有溶液均应使用超纯过滤水稀释。
- 将完整的新鲜或冷冻组织加入 50 mL 锥形管中的解离缓冲液内，于 37 °C 水浴中孵育 20 分钟。如有需要，可在孵育前将组织切成更小的碎片。
- 孵育结束后，向含组织的解离缓冲液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，使其终浓度为....
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结果
组织解离、差速离心及囊泡梯度纯化的示意图见图1。梯度纯化细胞外囊泡（EVs）的形态学和免疫表型鉴定结果在图2中突出显示。图中展示了10-30%碘克沙醇梯度超速离心后可重复的密度分布情况，两种不同的囊泡群体根据组织类型的不同分别向上迁移至第2组分（轻度EVs）和第5组分（致密EVs）。梯度组分的代表性免疫印迹显示，在第5组分中实现了小肿瘤来源EVs的有效分离与纯化。值得注意的是，与此前从全脑组织中获得的轻度EVs（位于第2组分）相比，肺肿瘤样本中致密EVs含量更为丰富，这一点在本研究中再次得到证实。随着对不同组织来源EVs的全局性分析逐步开展，明确不同组织所产生的EVs各自特有的密度特征将具有重要意义。对主要含囊泡组分中组织来源囊泡进行的代表性纳米颗粒追踪分析和电子显微镜观察表明，完整囊泡得到了富集并保持了良好的结构，其大小和形态符合已知的小EVs特征。最后，图3展示了该方法在推动下游质谱分析梯度.......
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讨论
关于小型细胞外囊泡（EV）在肿瘤微环境以及器官发育、成熟和功能中所起作用的研究已引起广泛关注。总体而言，本研究提供了一种从完整脑组织或肿瘤样本中提取完整EV的优化流程。尽管本文仅展示了该技术在肺癌来源EV中的应用，但该方法可轻松适用于其他实体组织，为深入进行体外表征具有广泛生物医学研究价值的小型分泌囊泡提供了可能。虽然超出本研究范围，但未来对EV内容物与其来源组织表达谱的比较分析，对于确立分离囊泡作为组织和疾病生物标志物的实用性也具有重要意义。
在我们实验室先前发表的研究中，我们明确展示了基于漂浮的密度梯度相较于沉降梯度在富集小细胞外囊泡纯化过程中的优势。本质上，基于浮力的分离方法通过避免污染物迁移至目标组分中，从而提高了囊泡的纯化效果。当起始材料为全组织等复杂样本时，这一原理显得尤为重要。尽管如此，我们仍强调对所分离囊泡进行分析前验证研究的重要性，包括通过电子显微镜和纳米颗粒追踪分析等互补技术对细胞外囊泡（EV）形态进行检测，以及包括免疫印迹在内的生物化学分析。在富集组分中，应至少使用三种公认的EV标志物（包括一种四跨膜蛋白）来确认EV蛋白的存在，如国际细胞外囊泡学会（ISEV）.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨向理查德·诺瓦科夫斯基博士（Dr. Richard Nowakowski）以及佛罗里达州立大学实验动物资源中心（Florida State University Laboratory Animal Resources）致以诚挚感谢，感谢他们为本方案的开发提供了实验动物并给予悉心照料。我们感谢刘霞、拉克什·辛格博士（Dr. Rakesh Singh）以及佛罗里达州立大学转化科学实验室（Florida State University Translational Science Laboratory）在用于后续囊泡表征的质谱分析工作中提供的协助，同时也感谢佛罗里达州立大学生物科学成像资源中心（FSU Biological Science Imaging Resource facility）为本研究提供透射电子显微镜的使用支持。最后，我们感谢佛罗里达农工大学（Florida A&M University）的曼迪普·萨赫德瓦博士（Dr. Mandip Sachdeva）捐赠了本方法开发过程中所使用的肿瘤标本。本研究得到了佛罗里达州卫生部Ed和Ethel Moore阿尔茨海默病研究项目向D.G.M.和J.M.O.（项目编号：6AZ11）提供的资助，以及美国国立卫生研究院国家癌症研究所（National Cancer Institute of the National Institutes of Health）向D.G.M.授予的R01CA204621项目基金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.45 µm 滤膜 | VWR | 28145-505 | |
| 12 mL 超速离心管 | Beckman Coulter | 331372 | |
| 5.5 mL 超速离心管 | Beckman Coulter | 344057 | |
| 抗 Alix 抗体 | Santa Cruz | sc-7129 | |
| 抗 Calnexin 抗体 | Santa Cruz | sc-11397 | |
| 抗 CD63 抗体 | Abcam | ab59479 | |
| 抗 CD81 抗体 | Santa Cruz | sc-9158 | |
| 抗 Flotillin 2 抗体 | Santa Cruz | sc-25507 | |
| 抗 HSC70 抗体 | Santa Cruz | sc-7298 | |
| 抗 Syntenin-1 抗体 | Santa Cruz | sc-100336 | |
| 抗 TSG101 抗体 | Santa Cruz | sc-7964 | |
| EZQ 蛋白定量试剂盒 | ThermoFisher Scientific | R33200 | |
| FA-45-6-30 转子 | Eppendorf | 5820715006 | |
| FEI CM120 电子显微镜 | TSS Microscopy | ||
| 山羊抗兔 IgG（Fab 片段） | Genetex | 27171 | |
| HALT 磷酸酶抑制剂（100 倍溶液） | ThermoFisher Scientific | 78420 | |
| HALT 蛋白酶抑制剂（100 倍溶液） | ThermoFisher Scientific | 78438 | |
| Hibernate E 培养基 | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| MLS-50 摆桶转子 | Beckman Coulter | 367280 | |
| NanoSight LM10 | Malvern | ||
| Optima MAX-XP 台式超速离心机 | Beckman Coulter | 393315 | |
| Optima XE-100 超速离心机 | Beckman Coulter | A94516 | |
| Optiprep | Sigma | D1556 | 60% 碘克沙醇无菌水溶液 |
| Q Exactive HF 质谱仪 | ThermoFisher Scientific | ||
| 兔抗山羊 IgG | Genetex | 26741 | |
| 兔抗小鼠 IgG | Genetex | 26728 | |
| Refracto 30PX（折光仪） | Mettler Toledo | 51324650 | |
| S-4-104 转子 | Eppendorf | 5820759003 | |
| SW 41 Ti 摆桶转子 | Beckman Coulter | 333790 | |
| 台式 5804R 离心机 | Eppendorf | 22623508 |
参考文献
- Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses. Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology.
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重印与许可
