Summary
Hier bieden we een gedetailleerd protocol om te isoleren van kleine extracellulaire blaasjes (EVs) hele weefsel, met inbegrip van hersenen en tumor exemplaren. Deze methode biedt een reproduceerbare techniek om EVs extract van solide weefsel voor verder stroomafwaarts analyses.
Abstract
Circulerende en interstitiële kleine membraan-gebonden extracellulaire blaasjes (EVs) vertegenwoordigen veelbelovende doelstellingen voor de ontwikkeling van nieuwe diagnostische of voorspellende biomarker tests en waarschijnlijk fungeren als belangrijke spelers in de progressie van een groot spectrum van ziekten. Huidige onderzoek is gericht op de karakterisatie van blaasjes uitgescheiden door meerdere cel en weefseltypes (HLA) om beter begrijpen van de rol van het EVW in de pathogenese van voorwaarden waaronder neurodegeneratie, ontsteking en kanker. Wereldwijd consistente en reproduceerbare technieken te isoleren en te zuiveren van blaasjes blijven echter aan de gang. Methoden voor de winning van EVs uit solide weefsel ex vivo zijn bovendien nauwelijks beschreven. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het extraheren van kleine EVs van belang heel vers of bevroren weefsel, met inbegrip van hersenen en tumor specimens, voor verdere karakterisering. We tonen het aanpassingsvermogen van deze methode voor meerdere stroomafwaartse analyses, met inbegrip van elektronenmicroscopie en immunophenotypic karakterisering van blaasjes, alsmede kwantitatieve massaspectrometrie van EV eiwitten.
Introduction
Kleine extracellulaire blaasjes (EVs) omvatten endosomal afkomstige exosomes en kleine membraan-loods microvesicles die brede biomedische aanbelangen. Kleine EVs zijn samengesteld uit een heterogene populatie van 50-250 nm membraan-gebonden blaasjes met biologisch actieve eiwitten, lipiden en nucleïnezuren die gezamenlijk worden verondersteld een belangrijke rol spelen in een veelheid van ziekteprocessen. Bevordering van onderzoek is met name betrokken deze blaasjes in neurodegeneratieve en prion aandoeningen, besmettelijke processen, auto-immune of inflammatoire voorwaarden, en tumorgroei en uitzaaiing1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. parallel belang bij de ontwikkeling van reproduceerbaar en rigoureuze methoden voor de isolatie en zuivering van deze blaasjes snel groeiende biomedisch onderzoek in de betekenis van het EVW in de pathogenese van de ziekte heeft gegenereerd.
Een historische en actuele uitdaging in EV karakterisering is het onvermogen om volledig aparte kleine EV subpopulaties. Deze uitdaging is grotendeels te wijten aan ons beperkte begrip van de verschillende moleculaire mechanismen inzake de biogenese van verschillende blaasjes. Overlappende omvang, dichtheid en biologische lading tussen subpopulaties verder windingen dit onderscheid. Een deel van deze uitdaging is ook het gebruik van de wijd uiteenlopende verrijking technieken, verstrekken van inconsistentie in downstream analyse van geïsoleerde blaasjes in laboratoria en ondermijning van de wereldwijde inspanningen voor het verlichten van de categorische EV populaties.
Het is vermeldenswaard dat de meerderheid van de karakterisering van het EV uit in vitro collectie van celkweek supernatant, werd uitgevoerd met recentere in vivo onderzoek met een beschrijving van technieken om te isoleren van de blaasjes van menselijke of dierlijke lichaam vloeistoffen, met inbegrip van plasma, urine , en speeksel. Terwijl EVs aanwezig in grote hoeveelheden in omloop zijn, is het ook erkend dat deze blaasjes spelen een belangrijke rol in de cel-naar-cel communicatie evenementen en aanwezig zijn in het interstitium van cellulaire weefsels. In het kader van kanker, kunnen interstitiële EVs worden met name van belang bij het moduleren van de tumor communicatie voor kankercel zaaien en metastatische groei14,15. Bijgevolg is er waarde in de ontwikkeling en de optimalisatie van technieken om de blaasjes uittreksel uit solide weefsel monsters. Deze methoden zullen een manier bieden waarmee zij rechtstreeks studie orgel - of tumor afkomstige EVs geoogst van klinische specimens, met inbegrip van kleine biopsieën en orgel van de gedeeltelijke of volledige resections.
In deze studie, en in een vorig rapport gepubliceerd door onze laboratorium16, wij streven ernaar te houden met verschillende belangrijke huidige problemen in EV verrijking methodologie: 1) om een reproduceerbare techniek om te isoleren en zuiveren van EVs volgens de hoogste normen momenteel te beschrijven geaccepteerd in het veld; 2) om te proberen om te isoleren van kleine EV subpopulaties hoogverrijkt in endosomal-afgeleide exosomes; en 3) om een protocol voor de winning van deze blaasjes uit solide weefsel monsters met het oog op verdere karakterisering.
Onlangs, Kowal en collega's beschreven een relatief kleinschalige iodixanol dichtheid verloop om te scheiden en zuiveren van EV subpopulaties met grotere werkzaamheid dan vergelijkbare sacharose dichtheid verlopen17. In de aangehaalde studie, werden dendritische cel-afgeleide EVs gevangen in een relatief lichte dichtheid Fractie, overeenstemming met een dichtheid van 1.1 g/mL, hoogverrijkt in endosomal eiwitten beschouwd als meest consistente met een groot aantal exosomes aanwezig in dit breuk. Volgens de auteurs opgenomen deze eiwitten "bonafide" exosomal tumor gevoeligheid gene 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 en verschillende annexin eiwitten17. Wij later deze techniek om te slagen voor een methode van weefsel dissociatie beschreven door Perez-Gonzalez et al.18 en een daaropvolgende differentiële centrifugeren protocol te isoleren van de hele hersenen-afgeleide EVs16aangepast. We toonden ook aan het nut van deze methode in het karakteriseren van EV proteomes door het combineren van een sequentiële protocol voor downstream kwantitatieve en vergelijkende massaspectrometrie van vesiculaire eiwit, beschreven door onze laboratorium-19. Dit werk parallel die van het laboratorium van de heuvel, waarin EVs van de frontale cortex van de hersenen20werden verrijkt.
In deze studie, wij ingaan op deze techniek en verlenging van het protocol onlangs gepubliceerd van onze laboratorium aan het isolement van het EVW van solide Long tumoren. Om onze kennis is dit de eerste studie om te beschrijven een protocol om te verrijken EVs van ex vivo tumor exemplaren. Gezien de grote belangstelling in EVW als nieuwe diagnostische biomarkers en hun rol in de tumorigenesis, zal deze methode waarschijnlijk waardevol voor een toenemend aantal wetenschappelijke onderzoekers blijken. Vanuit het oogpunt van klinische kon interstitiële EVs haven grote diagnostische waarde, met name in specimens waar histologische evaluatie beperkt is. Onze hoop is dat de hier geschetste methode voor een basis voor een reproduceerbare techniek om te oogsten EVs uit vers of bevroren dier of mens chirurgische monsters zorgen zal, de weg vrijmaakt voor toekomstige werkzaamheden aan het licht brengen de belangrijke rol in de pathogenese van de ziekte deze kleine blaasjes kunnen spelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hele hersenen werden verkregen met goedkeuring van de institutionele dier gebruik en Care Comité (IACUC) van de Florida State University. Een totaal van twaalf muis hersenen (3 hersenen uit elke leeftijdsgroep: 2, 4, 6 en 8 maanden) van een C57BL/6 J achtergrond werden gebruikt voor EV extractie, als eerder beschreven16. Long tumor exemplaren waren gedoneerd door Dr. Mandip Sachdeva onder goedkeuring van de Florida landbouw- en mechanische IACUC van de Universiteit. Long tumoren zijn afgeleid van de menselijke adenocarcinoom cellijn H1975 geteeld in immunodeficiëntie Balb/c nu/nu naakt muizen. Gegevens uit twee representatieve tumor wordt gerepliceerd, worden gemarkeerd in deze studie.
Opmerking: Een schematisch overzicht van de vesikel isolatie en zuivering methode wordt gegeven in Figuur 1.
1. de weefsels dissociatie en differentiële centrifugeren
- 10 mL van dissociatie buffer (10 mg papaïne 5.5 mM L-cysteïne 67 µM 2-mercaptoethanol; 1.1 mM EDTA) bereiden in slaapstand-E medium per ongeveer 0,4-1,0 g weefsel. Merk op dat alle oplossingen gebruikt voor EV verrijking en zuivering in ultrazuiver gefilterd water moeten worden verdund.
- Toevoegen hele vers of bevroren weefsel aan dissociatie buffer in een conische tube van 50 mL en broeden in een warm water kan bad bij 37 ° C gedurende 20 min. weefsel worden gesneden in kleinere fragmenten voordat incubatie indien nodig.
- Voeg na de incubatie, protease en phosphatase inhibitors voor de concentratie van een definitieve 1 x aan de dissociatie buffer met het weefsel.
- Giet de oplossing met het weefsel in een los-fit Dounce homogenizer, en zachtjes distantiëren van het weefsel met behulp van ongeveer 30 trage slagen per monster. Het aantal slagen kan worden aangepast op basis van weefsel consistentie.
- Overdracht losgekoppeld weefsel in buffer een conische tube van 50 mL en centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C tot pellet van de cellen en de resterende vezelig of samenhangende weefsel fragmenten.
- Het supernatant overbrengen in een schone 50 mL conische buis en centrifuge op 2.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot pellet en negeren grote cellulaire puin.
- Overdracht van het supernatant weer een schone 50 mL conische buis en centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 40 min bij 4 ° C tot pellet ongewenste grotere blaasjes of kleine apoptotic organen.
Opmerking: Deze pellet kan worden opgeslagen voor aanvullende studie van grotere blaasjes, indien gewenst. - Giet het supernatant door een 0,45 µm filter in een schone 12 mL ultracentrifugatie buis.
Opmerking: Dichtbevolkte fibrotische weefselsteekproeven kunnen niet gemakkelijk worden gefilterd. Deze monsters kunnen worden gefilterd door een 40 µm cel zeef, vervolgens serieel kleiner naalden (18 G, 20 G 22 G) doorlopen voordat het filteren door middel van het 0,45 µm filter. - Ultracentrifuge het monster bij 100.000 x g gedurende 2 uur bij 4 ° C tot kleine EVs pellet.
- De bovendrijvende vloeistof decanteren en laat de ultracentrifugatie buizen omgekeerd voor 5-10 min, onttrekken vaak om te verwijderen van de resterende vloeistof op de zijkanten van de buizen. Resterende vloeistof kan ook worden aanzuiging met behulp van een zuigen vacuüm pipet.
- Resuspendeer de pellet EV in 1,5 mL 0,25 M sacharose buffer (10 mM Tris, pH 7.4). Het is belangrijk om ervoor te zorgen volledige resuspensie van de pellet in deze stap. Om dit te doen, hebben betrekking op de buizen met parafilm voordat vortexing EVs in oplossing. Rock de ultracentrifuge buizen gedurende 15-20 minuten bij kamertemperatuur alvorens een definitieve vortex-mix.
- Kort centrifugeren de buizen bij een snelheid niet meer dan 1.000 x g terug te vorderen van de vloeibare suspensie aan de onderkant van de buis.
- Gaat u verder met de stappen van de kleurovergang zuivering of desgewenst opslaan EV schorsing bij 4 ° C's nachts.
2. dichtheid kleurovergang zuivering
- Voeg 1,5 mL 60% iodixanol (stock oplossing in water) aan de 1,5 mL sacharose/Tris buffer met EVW te maken van een definitieve oplossing met 30% iodixanol. Pipetteer omhoog en omlaag meermaals naar Meng oplossing. Voorzichtig om te voorkomen dat verliezen van de oplossing in de pipet tip, zoals de concentratie hoog iodixanol zeer visceuze is.
- Overbrengen met EVs naar de onderkant van een tube van de ultracentrifugatie 5,5 mL bufferoplossing 30% iodixanol.
- Bereiden van ten minste 1,5 mL 20% en 10% iodixanol oplossingen per monster in ultrazuiver water van de stamoplossing van 60% iodixanol.
- 1.3 mL 20% iodixanol en zorgvuldig laag bovenop de kleurovergang onderlaag met behulp van een spuit en een naald 18 G te meten. Om te voorkomen dat het mengen van de lagen op het raakvlak van de dichtheid, houden van de schuine kant van de naald in contact met de binnenkant van de buis ultracentrifugatie net boven de meniscus en voeg de oplossing ontkleuring.
- Laag 1.2 mL 10% iodixanol-oplossing op de top van de laag van de 20% iodixanol met gebruikmaking van dezelfde techniek als hierboven.
- Zorgvuldig evenwicht en laadt de ultracentrifugatie buizen in de rotor emmers en centrifuge in de rotor van een swing-emmer bij 268,000 x g gedurende 50 minuten bij 4 ° C. De snelheden van de versnelling en vertraging van de centrifuge ingesteld op de minimale tarieven toegestaan om onderbrekingen van de dichtheid lagen te voorkomen.
- Label tien 1,5 mL microcentrifuge buizen voor elk monster overeen moeten komen met breuken 1 t/m 10 van het verloop van de dichtheid. Deel 1 is aangewezen als het bovenste deel, die zullen worden eerst verwijderd, terwijl de breuk 10 is de Fractie van de bodem laatst verwijderd.
- Zodra de kleurovergang ultracentrifugatie heeft voltooid, zachtjes de buizen uit de rotor emmers verwijderen en plaatsen in een stabiele houder. Een zichtbaar band van blaasjes zal vaak worden gezien in de Fractie van belang. Pipetteer tien seriële breuken van 490 µL vanaf de bovenkant van het verloop in de overeenkomstige buizen. Zal er een kleine hoeveelheid van de vloeistof blijft aan de onderkant van de buis van Eustachius waarschijnlijk contaminerende eiwitten bevat. In dit voorbeeld kan worden verwijderd of behouden als breuk 11 indien gewenst.
- Het meten van de brekingsindices van fracties met behulp van een refractometer. Dit kan ook worden uitgevoerd met een verloop van de controle parallel lopen als monster instandhouding nodig is. Pipetteer 20-30 µL van elke breuk met iodixanol op het oppervlak van de refractometer, en de dichtheid te schatten door het vergelijken van de brekingsindices aan bekende iodixanol dichtheden. Opmerking dat breuken kunnen worden opgeslagen 's nachts in de iodixanol-bevattende oplossing indien nodig voordat u verdergaat met de volgende ultracentrifugatie wassen stap.
- Elke fractie overbrengen in een schone 12 mL ultracentrifugatie buis. Voeg 5 mL 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM nb2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) om de buis en mengeling door pipetteren langzaam op en neer.
Opmerking: PBS toegevoegd aan de monsters mag deeltje-vrij, gewaarborgd door steriel PBS door een 0,22 µm filter filteren en opslaan bij kamertemperatuur te vermijden van zout neerslag. - Voeg een extra 6 mL 1 x PBS toe aan de kop en opnieuw meng zorgvuldig.
- Ultracentrifuge de buizen bij 100.000 x g gedurende 2 uur bij 4 ° C tot de pellet opnieuw kleine blaasjes. De bovendrijvende vloeistof decanteren en tik op de buizen droog zijn voordat de lysis van blaasjes voor eiwit analyse (stap 3) of resuspensie van het EVW voor morfologische analyse (stap 5).
3. lysis en Immunoblot bevestiging van EV eiwitten
Opmerking: Als behoud van hele blaasjes voor Morfologische karakterisering of biologische activiteit wordt gewenst, kunnen onderzoekers gaan rechtstreeks naar stap 5. In de eerste experimenten, of vóór de analyse van de Spectrometrie van de massa, moeten alle fracties hersteld door immunoblot te bevestigen van breuken met EV eiwitten worden geanalyseerd.
- Om lyse EVs voor eiwit analyse, voeg toe 40 µL van sterke lysis buffer (5% SDS, 10 mM EDTA, 120 mM Tris-HCl pH 6.8, 2,5% 2-mercaptoethanol, 8 M ureum) met de toevoeging van de proteaseinhibitor aan EV pellet in ultracentrifuge buis.
Opmerking: Desgewenst niet-reducerende omstandigheden zijn voor de opsporing van antilichamen van proteïnen, vervang ultrazuiver water voor 2-mercaptoethanol in de sterke lysis-buffermengsel. - Zorgen voor volledige resuspensie van pellet en lysis van het EVW in de buffer door parafilm plaatsen over de ultracentrifugatie tube, vortexing krachtig, vervolgens schommelen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur alvorens een definitieve vortex.
- Kort centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 30-60 s om de gehele steekproef-volume te herstellen. Overdracht van het monster een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buis en opslag bij-20 ° C tot-80 ° C totdat zij worden verwerkt.
- Ter voorbereiding van gezuiverde lysates immunoblot p.a., voeg toe 5 x Laemmli monster buffer (10% SDS, 250 mM Tris pH 6.8, 1 mg/mL bromophenol blauw, 0.5 M DTT, 50% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol) aan de monsters voor een eindconcentratie van 1 x.
Opmerking: Als niet-reducerende omstandigheden gewenst zijn, vervangen door de DTT en 2-mercaptoethanol ultrazuiver water. - Als hele weefsel homogenaat besturingselementen gewenst zijn, lyse het weefsel in de ureum-bevattende sterke lysis-buffermengsel met proteaseinhibitor hierboven is uiteengezet, vervolgens Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 10 minuten om te verwerpen van de resterende extracellulaire matrix, hele cellen, of intact cellulaire puin. 5 x Laemmli monster buffer aan het homogenaat weefsel voor een eindconcentratie van 1 x toevoegen.
- Kook de buffer van de steekproef met EV of weefsel homogenaat monsters bij 95 ° C gedurende 5-10 min, dan laden gelijk volume (van het equivalent van 0,1-0,3 g weefsel grondstof; 1-2 µg gezuiverde EV eiwit) van breuken 1-10 in een 10% SDS-pagina gel. Gelijke massa van weefsel homogenaat laden. Grotere hoeveelheid monsters kan nodig zijn voor de detectie door minder gevoelig antilichamen.
- Doorgaan met de gelelektroforese van het en westelijke vlekkenanalyse als eerder gedetailleerde21 te bevestigen EV eiwitten in de gezuiverde lysates en relatieve EV overvloed in breuken vergelijken.
Opmerking: Zodra EV eiwit reproducibly is aangetoond in consistente breuken, kan het wassen van de definitieve ultracentrifugatie beschreven in stap 2.12 beperkt worden tot kleurovergang breuken van belang.
4. EV eiwit kwantificering
- Gebruik een wasmiddel - en ureum-compatibele fluorescentie gebaseerde assay desgewenst gevoelige kwantificering van EV eiwitten is voor verdere analyse (Zie Tabel van materialen). Merk op dat sommige fluorescentie gebaseerde testen verenigbaar met de bromophenol blauw in Laemmli monster buffer zijn, vergemakkelijking van directe lysis van de EV-pellet (in stap 2.12) in deze buffer als voorkeur aanwezig.
- Als de bovengenoemde fluorescentie gebaseerde eiwit kwantificering kit wordt gebruikt, plek 1 µL van het monster of standaard in ten minste dupliceren op de meegeleverde filterpapier en verder eiwit kwantificering volgens de instructies van de fabrikant.
5. karakterisering van EV morfologie
- Om te onderzoeken hele blaasjes nadat de definitieve centrifugeren wassen in stap 2.12, grondig resuspendeer EV pellet in PBS deeltje-gratis 1 x. Winkel EVs bij 4 ° C niet langer dan één week totdat zij verwerkt om te voorkomen dat cycli bevriezen-ontdooien.
Opmerking: Het is gunstig voor het eerder breuken consequent verrijkt EV eiwit bevattende door immunoblot analyse te beperken van morfologische analyses naar breuken van belang hebben bevestigd. - Nanoparticle tracking analyse op hele EV monsters om te bepalen van de concentratie en de grootte van blaasjes in preparaten als eerder gedetailleerde22uitvoeren
- Karakteriseren EV morfologie en grootte metingen bevestigen door elektronenmicroscopie van blaasjes, indien gewenst. EM rasters kunnen bereid worden uit vesikel schorsingen na stap 5.123, of als alternatief kunnen worden verwerkt als blok voorbereidingen24 van pellets na stap 2.12.
6. in-gel reiniging en de spijsvertering van de trypsine massaspectrometrie p.a.
- Als karakterisering van EV proteomes door massaspectrometrie gewenst is, laadt u gelijke massa (ten minste 10 µg eiwit) van breuken met EVW in een voorgegoten polyacrylamidegel te scheiden en zuiveren van eiwitten. Fabrikant kopen voorgegoten gels zijn voorkeur om de niveaus van potentieel verontreinigende eiwitten (bijvoorbeeld keratine) wordt ingevoerd in de monsters.
- Het monster ten minste 0,5 inch tegenkomen het polyacrylamidegel voor EiwitReiniging, dan vast en vlekken met Coomassie kleurstof, zoals eerder beschreven in detail25.
- Snijd de rijstroken in 1 mm3 kubussen voor de spijsvertering van de trypsine, als eerder gedetailleerde19,26.
- 5 µL van verteerd peptide monster in LC-MS/MS instrument voor scheiding op de analytische kolom en de daaropvolgende analyse door massaspectrometrie volgens parameters die zijn opgegeven in detail16laden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schematisch overzicht van de weefsel dissociatie, differentiële centrifugeren en kleurovergang zuivering van blaasjes is weergegeven in Figuur 1. De morfologische en immunophenotypic bevestiging van het EVW verloop-gezuiverd wordt gemarkeerd in Figuur 2. Een diagram van reproduceerbare dichtheden na ultracentrifugatie van de helling van de iodixanol 10-30% wordt weergegeven, met twee verschillende vesikel populaties migreren naar boven naar deel 2 (licht EVs) en deel 5 (dichte EVs), afhankelijk van weefseltype. Vertegenwoordiger immunoblots van kleurovergang breuken vertonen de efficiënte scheiding en reiniging van kleine tumor afkomstige EVs in deel 5. Van de nota, Long tumor specimens verscheen verrijkt in dichte EVs vergeleken met licht EVs (in breuk 2) eerder geoogst van hele hersenweefsel, gemarkeerd weer hier. Als een globale weefsel analyse van het EVW ontstaan, op zal zitten interessant voor het bepalen van de verschillende dichtheden van het EVW geproduceerd door unieke weefsels. Vertegenwoordiger nanoparticle tracking analyses en elektronenmicroscopie van weefsel afkomstige blaasjes in de overheersende vesikel-bevattende fractie tonen de verrijking en de instandhouding van hele blaasjes consistent met de bekende grootte en structuur van kleine EVs. Ten slotte, Figuur 3 benadrukt het nut van deze methode bij het bevorderen van de downstream massaspectrometrie karakterisering van verloop-gezuiverd vesikel eiwitten, demonstreren de detectie van veel eiwitten eerder aangeduid in kleine EVs. Veel van deze geïdentificeerde eiwitten zijn in overeenstemming met die verrijkt met kleine endosomal afkomstige EVs eerder voorgesteld door de Théry en Hill labs17,20.
Figuur 1 : Schematisch overzicht van vesikel isolatie en zuivering van hele weefsel. Na weefsel dissociatie, pre-ontruimt differentiële centrifugeren stappen, filtratie en ultracentrifugatie, ruwe EV pellets kan resuspended worden op de bodem van een iodixanol dichtheid verloop voor floating scheiding. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Representatief morfologische en immunophenotypic analyse van weefsel afkomstige EVs. (A) berekend van de dichtheden van iodixanol kleurovergang volgende ultracentrifugatie, gemiddeld over onafhankelijke experimenten, markeren van breuken met licht en dichte EVs. (B) vertegenwoordiger immunoblots van weefsel afkomstige blaasjes aan te tonen het isolement van voornamelijk dichte tumor EVs en licht brain EVs. Vesikel isolaten zijn uitgeput van eiwit van niet-EV-calnexin. H, weefsel homogenaat. (C) Nanoparticle analyse (NTA) volgen van vertegenwoordiger verloop-gezuiverd weefsel EVs. Het kleinste gedetecteerde deeltje in dit voorbeeld was 78 nm, en ongeveer 92% van de blaasjes gedetecteerd werden 250 nm of kleiner, in overeenstemming met een hoge verrijking van kleine EVs. (D) de representatieve elektronenmicroscopie beelden van hersenen weefsel afkomstige EVs. Schaal bars = 200 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Samenvatting van de gemarkeerde vesikel eiwitten gedetecteerd door Spectrometrie van de massa van een vertegenwoordiger weefsel afkomstige EV monster. Na EV extractie en zuivering van de kleurovergang, was in een polyacrylamidegel voor elektroforese en de spijsvertering van de Trypsine van het gel-10 µg EV eiwit in verrijkte fractie geladen. In dit weefsel afkomstige EV representatief, totaal 918 eiwitten werden geïdentificeerd door LC-MS/MS-analyse. Peptiden werden geïdentificeerd, geanalyseerd en worden verrijkt in exosomal, lysosomale, en plasma membraaneiwitten als eerder beschreven16gevonden. Hier tonen we de aanwezigheid van kleine EV of exosomal eiwitten in onze voorbereidingen die zijn beschreven door de Théry en Hill labs17,20. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Veel wetenschappelijke belang is gegenereerd met betrekking tot de rollen die kleine EVs in de communicatie van de tumor, evenals in de ontwikkeling van het orgel, rijping en functie spelen. Over het geheel genomen, deze studie biedt een geoptimaliseerde workflow voor de winning van intact EVs uit hele hersenen of tumor exemplaren. Terwijl wij hier gewoon de toepasselijkheid van deze techniek aan longkanker tumor afkomstige EVs tonen, kan deze methode gemakkelijk worden aangepast voor werk aan andere stevige weefsels, bieden van kansen voor verdere ex vivo karakterisering van kleine secreted blaasjes die van brede biomedische interesse. Terwijl het buiten het bestek van deze studie, zal toekomstige vergelijking van EV inhoud die van oorsprong weefsel expressie het belangrijk om het nut van geïsoleerde blaasjes als weefsel- en ziekte biomarkers.
In de studie eerder gepubliceerd door ons laboratorium, tonen wij duidelijk aan de voordelen van het verloop van de floating gebaseerde dichtheid ten opzichte van sedimentatie verlopen voor zuivering van verrijkte kleine blaasjes. Kortom, verbetert een drijfvermogen gebaseerde scheiding zuivering van blaasjes door het vermijden van verontreiniging migratie door de breuken van belang. Dit beginsel lijkt vooral belangrijk bij het starten van complexe monsters zoals hele weefsel. Ongeacht, benadrukken we het belang van de geïsoleerde blaasjes beschreven, met inbegrip van onderzoek van EV morfologie door complementaire technieken zoals elektronenmicroscopie en nanoparticle voor het bijhouden van analyse, evenals studies vooraf analytische bevestiging Als biochemische analyses, met inbegrip van immunoblotting. EV eiwitten in verrijkte breuken moeten worden bevestigd met ten minste drie erkende EV markers, met inbegrip van een tetraspanin eiwit, zoals aanbevolen door de Minimale informatie voor Studies van EVs (MISEV)-rapport gepubliceerd in de Journal van extracellulaire Blaasjes27. Een negatieve EV marker moet worden aangetoond dat zij afwezig of sterk verminderde in EV breuken ten opzichte van weefsel homogenates. Alle stappen die hierboven vermeld zijn cruciaal voor de waarborging van de kwaliteit van de kleine vesikel zuivering. Daarnaast bespaart vroege demonstratie van laboratorium - en gebruiker-specifieke consistentie in EV-bevattende dichtheid breuken kostbare tijd en kosten in verband met het verwerken en analyseren van alle breuken na de dichtheid kleurovergang ultracentrifugatie stap.
Het is duidelijk dat de blaasjes uit verschillende weefsels naar iets anders dichtheid breuken zweven kunnen, of in overwegend lichte of dichte subpopulaties scheiden kunnen. Deze verschillen werd eerder gezien in de hele hersenen-afgeleide EVs vergeleken met EVs geoogst van dendritische cellen gekweekt in cultuur16,17, en verder in deze studie zijn aangetoond. We laten zien dat Long tumor exemplaren voornamelijk die dichte kleine EVs in vergelijking met de lichter EVs geïsoleerd van hersenweefsel kunnen haven. Deze verschillen gemarkeerd door de methode voorgesteld in deze studie kunnen waardevolle onderzoeken de differentiële samenstelling van EVs, met inbegrip van tumor EVs die gezamenlijk worden met dichte DNA strengen28,29,30 verpakt mogenbevorderen. Vanwege deze verschillen in samenstelling van de EV onderstrepen wij sterk het belang van deze eerste technische experimenten. Toekomstige toepassing van deze techniek aan het isolement van het EVW van exemplaren van uiteenlopende tumor is belangrijk om te bepalen of dichte EVs voornamelijk uitgescheiden in het interstitium van tumor andersoortige ook zijn.
Terwijl de volledige reiniging van kleine EVs en isolatie van duidelijke blaasje subpopulaties een huidige beperking over laboratoria blijft, biedt deze methode een basis voor verdere studies te karakteriseren van kleine blaasjes uit een verscheidenheid van weefsel of tumor typen, en dus een beter begrip van EV diversiteit kunnen vergemakkelijken. Recente scheiding van EV deeltjes door asymmetrische-flow veld-flow fractionering heeft de mogelijkheid van afzonderlijke lading en functies voor kleine (60-80 nm) verlicht versus grotere (90-120 nm) exosomes, en verder geïdentificeerd een subset van niet-membraan gebonden < 50 nm deeltjes die luiden als3231,"exomeres". Echter gevarieerd lading verpakt in de populaties van deze unieke blaasje over cellijnen, markeren de substantiële heterogeniteit van secreted blaasjes en ondersteuning van het belang van uitgebreide in vitro of ex vivo vesikel analyse. In deze studie verrijken we waarschijnlijk voor beide klassen van exosomes geïdentificeerd. Een deel van de kleine microvesicles met soortgelijke dichtheden te exosomes kan aanwezig in isolaten zo goed zijn. Hoewel we niet het uitsluiten van de mogelijkheid van exomeres in onze isolaten, waren membraan-gebonden blaasjes zeker meest overvloedig in de kleurovergang breuken verrijkt met blaasje eiwit. Naast kleine EVs, grote oncosomes (> 1000 nm) geweest van recente interesse tot en met kanker biologen33. Terwijl het protocol beschreven in deze studie filters uit blaasjes groter is dan 450 nm, uitsluiting van deze stap kan vergemakkelijken onderzoek van deze grotere EVs beschreven. Later onderzoek van dichtheden die is gekoppeld aan verschillende vesikel subpopulaties is belangrijk om te onderscheiden van deze entiteiten naast hun beschreven maten.
Tot slot, hoewel wij de beperkingen waarderen, met inbegrip van de kosten en tijd die zijn gekoppeld aan deze voorgestelde techniek, we ook erkennen de noodzaak voor strenge fundamentele methoden te karakteriseren weefsel EVs en om te dienen als een eindproduct vergelijking voor voortdurend zich ontwikkelende en meer geavanceerde methoden in de toekomst. Deze technologieën bevorderen zal hopelijk meer snelle en klinisch-compatibele technieken om EVs extract van medische of chirurgische specimens verlichten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Dr. Richard Nowakowski en de Florida State University laboratorium dier Resources voor de verlening en zorg voor de dieren gebruikt voor het ontwikkelen van dit protocol, met alle respect. Wij danken Liu Xia, Dr. Rakesh Singh en de Florida staat University translationeel Science Laboratory voor hulp met het werk van de Spectrometrie van de massa gebruikt voor downstream vesikel karakterisering, evenals de FSU biologische wetenschap Imaging Resource faciliteit voor het gebruik van het transmissie-elektronenmicroscoop in deze studie. Tot slot bedanken wij Dr. Mandip Sachdeva (Florida A & M University) voor donatie van de specimens van de tumor in de ontwikkeling van deze methode gebruikt. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Florida departement van gezondheid Ed en Ethel Moore Alzheimer's Disease Research Program toegekend aan D.G.M. en J.M.O (6AZ11) en het National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder Award nummer R01CA204621 toegekend aan D.G.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm filter | VWR | 28145-505 | |
| 12 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| 5.5 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| anti-Alix antibody | Santa Cruz | sc-7129 | |
| anti-Calnexin antibody | Santa Cruz | sc-11397 | |
| anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| anti-CD81 antibody | Santa Cruz | sc-9158 | |
| anti-Flotillin 2 antibody | Santa Cruz | sc-25507 | |
| anti-HSC70 antibody | Santa Cruz | sc-7298 | |
| anti-Syntenin-1 antibody | Santa Cruz | sc-100336 | |
| anti-TSG101 antibody | Santa Cruz | sc-7964 | |
| EZQ protein quantification kit | ThermoFisher Scientific | R33200 | |
| FA-45-6-30 rotor | Eppendorf | 5820715006 | |
| FEI CM120 Electron Microscope | TSS Microscopy | ||
| goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) | Genetex | 27171 | |
| HALT phosphatase inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78420 | |
| HALT protease inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78438 | |
| Hibernate E medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| MLS-50 swinging-bucket rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
| NanoSight LM10 | Malvern | ||
| Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Optima XE-100 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Optiprep | Sigma | D1556 | 60% iodixanol in sterile water solution |
| Q Exactive HF Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | ||
| rabbit anti-goat IgG | Genetex | 26741 | |
| rabbit anti-mouse IgG | Genetex | 26728 | |
| Refracto 30PX (refractometer) | Mettler Toledo | 51324650 | |
| S-4-104 rotor | Eppendorf | 5820759003 | |
| SW 41 Ti swinging-bucket Rotor | Beckman Coulter | 333790 | |
| Tabletop 5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 |
References
- Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses. Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- Howitt, J., Hill, A. F. Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases. Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).
- Sardar Sinha, M., et al. Alzheimer's disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers. Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).
- Meckes, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).
- Meckes, D. G. Exosomal communication goes viral. Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).
- Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
- Zhang, X., et al. Exosomes in cancer: small particle, big player. Journal of Hematology Oncology. 8, 83 (2015).
- Janas, A. M., Sapoń, K., Janas, T., Stowell, M. H. Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).
- Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses. Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).
- Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
- Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
- Katsiougiannis, S. Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity. Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Hurwitz, S. N., et al. An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease. Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
- Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space. Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).
- Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).
- Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).
- Hurwitz, S. N., et al. CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.κB Signaling. Journal of Virology. 91 (5), (2017).
- Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).
- Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
- Meckes, D. G. Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).
- Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 6, 23978 (2016).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
- Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nature Communications. 2, 180 (2011).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
- Zijlstra, A., Di Vizio, D. Size matters in nanoscale communication. Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).
- Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. Oncosomes - large and small: what are they, where they came from. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).
