Method Article

Winning van extracellulaire blaasjes uit hele weefsel

DOI:

10.3791/59143

⸱

February 7th, 2019

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Florida State University College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier bieden we een gedetailleerd protocol om te isoleren van kleine extracellulaire blaasjes (EVs) hele weefsel, met inbegrip van hersenen en tumor exemplaren. Deze methode biedt een reproduceerbare techniek om EVs extract van solide weefsel voor verder stroomafwaarts analyses.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Circulerende en interstitiële kleine membraan-gebonden extracellulaire blaasjes (EVs) vertegenwoordigen veelbelovende doelstellingen voor de ontwikkeling van nieuwe diagnostische of voorspellende biomarker tests en waarschijnlijk fungeren als belangrijke spelers in de progressie van een groot spectrum van ziekten. Huidige onderzoek is gericht op de karakterisatie van blaasjes uitgescheiden door meerdere cel en weefseltypes (HLA) om beter begrijpen van de rol van het EVW in de pathogenese van voorwaarden waaronder neurodegeneratie, ontsteking en kanker. Wereldwijd consistente en reproduceerbare technieken te isoleren en te zuiveren van blaasjes blijven echter aan de gang. Methoden voor de winning van EVs uit solide weefsel ex vivo zijn bovendien nauwelijks beschreven. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het extraheren van kleine EVs van belang heel vers of bevroren weefsel, met inbegrip van hersenen en tumor specimens, voor verdere karakterisering. We tonen het aanpassingsvermogen van deze methode voor meerdere stroomafwaartse analyses, met inbegrip van elektronenmicroscopie en immunophenotypic karakterisering van blaasjes, alsmede kwantitatieve massaspectrometrie van EV eiwitten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kleine extracellulaire blaasjes (EVs) omvatten endosomal afkomstige exosomes en kleine membraan-loods microvesicles die brede biomedische aanbelangen. Kleine EVs zijn samengesteld uit een heterogene populatie van 50-250 nm membraan-gebonden blaasjes met biologisch actieve eiwitten, lipiden en nucleïnezuren die gezamenlijk worden verondersteld een belangrijke rol spelen in een veelheid van ziekteprocessen. Bevordering van onderzoek is met name betrokken deze blaasjes in neurodegeneratieve en prion aandoeningen, besmettelijke processen, auto-immune of inflammatoire voorwaarden, en tumorgroei en uitzaaiing1,2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hele hersenen werden verkregen met goedkeuring van de institutionele dier gebruik en Care Comité (IACUC) van de Florida State University. Een totaal van twaalf muis hersenen (3 hersenen uit elke leeftijdsgroep: 2, 4, 6 en 8 maanden) van een C57BL/6 J achtergrond werden gebruikt voor EV extractie, als eerder beschreven16. Long tumor exemplaren waren gedoneerd door Dr. Mandip Sachdeva onder goedkeuring van de Florida landbouw- en mechanische IACUC van de Universiteit. Long tumoren zijn afgeleid van de menselijke adenocarcinoom cellijn H1975 geteeld in immunodeficiëntie Balb/c nu/nu naakt muizen. Gegevens uit twee representatieve tumor wordt gerep....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een schematisch overzicht van de weefsel dissociatie, differentiële centrifugeren en kleurovergang zuivering van blaasjes is weergegeven in Figuur 1. De morfologische en immunophenotypic bevestiging van het EVW verloop-gezuiverd wordt gemarkeerd in Figuur 2. Een diagram van reproduceerbare dichtheden na ultracentrifugatie van de helling van de iodixanol 10-30% wordt weergegeven, met twee verschillende vesikel populaties migreren .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veel wetenschappelijke belang is gegenereerd met betrekking tot de rollen die kleine EVs in de communicatie van de tumor, evenals in de ontwikkeling van het orgel, rijping en functie spelen. Over het geheel genomen, deze studie biedt een geoptimaliseerde workflow voor de winning van intact EVs uit hele hersenen of tumor exemplaren. Terwijl wij hier gewoon de toepasselijkheid van deze techniek aan longkanker tumor afkomstige EVs tonen, kan deze methode gemakkelijk worden aangepast voor werk aan andere stevige weefsels, bi.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Dr. Richard Nowakowski en de Florida State University laboratorium dier Resources voor de verlening en zorg voor de dieren gebruikt voor het ontwikkelen van dit protocol, met alle respect. Wij danken Liu Xia, Dr. Rakesh Singh en de Florida staat University translationeel Science Laboratory voor hulp met het werk van de Spectrometrie van de massa gebruikt voor downstream vesikel karakterisering, evenals de FSU biologische wetenschap Imaging Resource faciliteit voor het gebruik van het transmissie-elektronenmicroscoop in deze studie. Tot slot bedanken wij Dr. Mandip Sachdeva (Florida A & M University) voor donatie van de specimens van de tumor in de ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 µm filterVWR28145-505
12 mL ultracentrifuge tubesBeckman Coulter331372
5.5 mL ultracentrifuge tubesBeckman Coulter344057
anti-Alix antibodySanta Cruzsc-7129
anti-Calnexin antibodySanta Cruzsc-11397
anti-CD63 antibodyAbcamab59479
anti-CD81 antibodySanta Cruzsc-9158
anti-Flotillin 2 antibodySanta Cruzsc-25507
anti-HSC70 antibodySanta Cruzsc-7298
anti-Syntenin-1 antibodySanta Cruzsc-100336
anti-TSG101 antibodySanta Cruzsc-7964
EZQ protein quantification kitThermoFisher ScientificR33200
FA-45-6-30 rotor Eppendorf5820715006
FEI CM120 Electron MicroscopeTSS Microscopy
goat anti-rabbit IgG (Fab fragment)Genetex27171
HALT phosphatase inhibitor (100x solution)ThermoFisher Scientific78420
HALT protease inhibitor (100x solution)ThermoFisher Scientific78438
Hibernate E mediumThermoFisher ScientificA1247601
MLS-50 swinging-bucket rotorBeckman Coulter367280
NanoSight LM10Malvern
Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge Beckman Coulter393315
Optima XE-100 ultracentrifugeBeckman CoulterA94516
OptiprepSigmaD155660% iodixanol in sterile water solution
Q Exactive HF Mass SpectrometerThermoFisher Scientific
rabbit anti-goat IgGGenetex26741
rabbit anti-mouse IgGGenetex26728
Refracto 30PX (refractometer)Mettler Toledo51324650
S-4-104 rotorEppendorf5820759003
SW 41 Ti swinging-bucket RotorBeckman Coulter333790
Tabletop 5804R centrifugeEppendorf22623508

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses. Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).
  2. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular VesiclesTissue ExtractionEV IsolationUltracentrifugationDensity GradientIodixanol GradientVesicle PurificationElectron MicroscopyWestern BlotNanoparticle Tracking

Related Articles