Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Extraction des vésicules extracellulaires du tissu entier

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/59143
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Florida State University College of Medicine

Summary

Ici, nous fournissons un protocole détaillé afin d’isoler les petites vésicules extracellulaires (EVs) de tissus entiers, y compris des échantillons de cerveau et la tumeur. Cette méthode offre une technique reproductible pour extraire les EVs de tissu plein pour approfondir les analyses en aval.

Abstract

Circulation et interstitielles petits extracellulaires vésicules membranaires (EVs) représentent des cibles prometteuses pour le développement de tests de nouveaux biomarqueurs diagnostiques et pronostiques et probablement servent comme des acteurs importants dans la progression d’un vaste éventail de maladies. La recherche actuelle est axée sur la caractérisation des vésicules sécrétées par les cellules multiples et les types de tissus afin de mieux comprennent le rôle des véhicules électriques dans la pathogenèse de conditions, y compris la neurodégénérescence, l’inflammation et le cancer. Cependant, les techniques à l’échelle mondiale cohérentes et reproductibles pour isoler et purifier les vésicules demeurent en cours. En outre, méthodes d’extraction d’EVs de tissu solide ex vivo sont guère décrits. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour extraire l’EVs petits intérêt de tissus entiers frais ou congelés, y compris des échantillons de cerveau et tumeur, pour davantage de caractérisation. Nous avons démontré la capacité d’adaptation de cette méthode pour plusieurs analyses en aval, y compris la microscopie électronique et immunophénotypiques caractérisation des vésicules, ainsi que la spectrométrie de masse quantitative des protéines EV.

Introduction

Petites vésicules extracellulaires (EVs) incluent exosomes dérivés endosomale et petite membrane-hangar microvésicules qui sont d’intérêt biomédical en général. Petits EVs sont composées d’une population hétérogène de 50 à 250 nm membranaires vésicules contenant des protéines biologiquement actives, des lipides et des acides nucléiques qui sont censés collectivement jouent un rôle important dans une multitude de processus morbides. Faire avancer la recherche a impliqué notamment ces vésicules neurodégénératives et maladies à prions, processus infectieux, conditions autoimmunes ou inflammatoires et la croissance tumorale et métastase1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. essor de la recherche biomédicale dans la signification du SVE dans la pathogenèse de la maladie a suscité un intérêt parallèle à l’élaboration des méthodes reproductibles et rigoureux pour l’isolement et la purification de ces vésicules.

Un défi historique et actuel dans la caractérisation de l’EV a été l’incapacité de séparer entièrement petites sous-populations EV. Ce défi est en grande partie en raison de notre compréhension limitée des différents mécanismes moléculaires régissant la biogenèse des vésicules distinctes. Chevauchement de taille, densité et biologiques marchandises entre sous-populations plus matérielle de ces distinctions. Partie de ce défi a été également l’utilisation de différentes techniques d’enrichissement largement, offrant des incohérence dans l’analyse en aval de vésicules isolées dans les laboratoires et saper l’effort mondial visant à éclairer les populations EV catégoriques.

Il est à noter que la majorité des EV caractérisation a été effectuée de la collection in vitro de culture cellulaire surnageante, avec les plus récentes études in vivo, décrivant des techniques pour isoler les vésicules de sécrétions animales ou humaines, y compris plasma, urine et la salive. Alors que le serveur virtuel Exchange est présents en grande quantité en circulation, il est également reconnu que ces vésicules jouent un rôle important dans les événements de communication de cellule-cellule et sont présents dans l’interstitium des tissus cellulaires. Dans le contexte du cancer, EVs interstitielles peuvent être particulièrement importants dans la modulation du microenvironnement tumoral pour cellule cancéreuse semis et croissance métastatique14,15. Par conséquent, il y a valeur dans le développement et l’optimisation des techniques pour extraire des vésicules d’échantillons de tissus solides. Ces méthodes fournira un moyen d’étudier directement orgue - ou tumeur dérivée EVs récoltées à partir des échantillons cliniques, y compris les petites biopsies et résection partielle ou totale des organes.

Dans cette étude et dans un précédent rapport, publié par notre laboratoire16, nous avons pour objectif d’aborder plusieurs grandes préoccupations actuelles dans la méthodologie d’enrichissement EV : 1) pour décrire une technique reproductible pour isoler et purifier les EVs au plus haut niveau actuellement acceptée dans le domaine ; 2) pour tenter d’isoler les petites sous-populations EV fortement enrichies en dérivés endosomale exosomes ; et 3) de fournir un protocole pour l’extraction de ces vésicules provenant d’échantillons de tissu solide aux fins de la caractérisation plus loin.

Récemment, Kowal et collègues ont décrit un gradient de densité relativement petits iodixanol pour séparer et purifier les sous-populations EV avec une plus grande efficacité que saccharose comparables densité dégradés17. Dans l’étude citée, les EVs de culture cellulaire dendritiques capturés en une fraction de densité relativement légers, compatible avec une densité de 1,1 g/mL, ont été fortement enrichis en protéines endosomale censés être plus compatible avec une forte proportion des exosomes présent dans cette fraction. Selon les auteurs, ces protéines exosomal « bona fide » incluent gène de susceptibilité tumeur 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 et plusieurs annexin protéines17. Plus tard, nous avons adapté cette technique pour réussir une méthode de dissociation tissulaire décrite par Perez-Gonzalez et al.18 et un protocole de centrifugation différentielle suivantes pour isoler ensemble encéphales EVs16. Nous avons aussi démontré l’utilité de cette méthode pour la caractérisation des protéomes EV en combinant un protocole séquentiel pour la spectrométrie de masse quantitative et comparative en aval de protéine vésiculaire, déjà décrite par notre laboratoire19. Ce travail est parallèle à celle du laboratoire Hill, où EVs ont été enrichies du cortex frontal du cerveau20.

Dans cette étude, nous avons des précisions sur cette technique et étendre l’application du protocole a récemment publié dans notre laboratoire à l’isolement du SVE de tumeurs pulmonaires solide. À notre connaissance, c’est la première étude pour décrire un protocole afin d’enrichir les EVs d’ex vivo les échantillons de tumeur. Compte tenu de l’intérêt général suscité par EVs comme nouveaux biomarqueurs diagnostiques et leur rôle dans la tumorigenèse, cette méthode s’avérera sans doute précieuse pour un nombre croissant de chercheurs scientifiques. D’un point de vue clinique, EVs interstitielles pourraient abriter grande valeur diagnostique, en particulier dans les échantillons où évaluation histologique l'est limitée. Notre espoir est que la méthode décrite ici constituera un fondement pour une technique reproductible pour récolter des EVs des échantillons frais ou congelés animales ou humaines chirurgicales, ouvrant la voie à des travaux futurs découvrir le rôle important dans la pathogenèse de la maladie ces petites les vésicules peuvent jouer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Cerveau entier ont été obtenus avec l’approbation de l’Institutional Animal Use et soin Comité (IACUC) de l’Université d’Etat de Floride. Un total de douze cerveaux de souris (3 cerveaux de chaque groupe d’âge : 2, 4, 6 et 8 mois) d’un J C57BL/6 fond ont été utilisés pour l’extraction de EV, comme précédemment décrit16. Les échantillons de tumeur pulmonaire ont été généreusement donnés par Dr Mandip Sachdeva sous approbation de la Florida Agricultural and IACUC mécanique de l’université. Tumeurs pulmonaires ont été dérivées de la lignée de cellules d’adénocarcinome humain H1975 cultivé en Balb/c nu/nu nue des souris immunodéficientes. Données provenant de deux répétitions de tumeur représentatifs sont mises en évidence dans cette étude.

Remarque : Un aperçu schématique de la méthode d’isolement et de purification de vésicule est fourni à la Figure 1.

1. tissu Dissociation et Centrifugation différentielle

  1. Préparer 10 mL de tampon de dissociation (10 mg de papaïne, 5,5 mM de L-cystéine, 67 µM 2-mercaptoéthanol ; 1,1 mM EDTA) dans un milieu Hibernate-E par environ 0,4 à 1,0 g de tissu. Notez que toutes les solutions utilisées pour la purification et l’enrichissement de l’EV doivent être diluées dans l’eau filtrée ultrapure.
  2. Ajouter des tissus entiers frais ou congelés au tampon de dissociation dans un tube conique de 50 mL et incuber dans une eau chaude bain à 37 ° C pendant 20 min. de tissu peut être coupé en fragments plus petits avant incubation si nécessaire.
  3. Après l’incubation, ajouter des inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase pour une concentration finale de 1 x vers le tampon de dissociation contenant le tissu.
  4. Versez la solution contenant le tissu dans un homogénéisateur de Dounce loose-fit et doucement se dissocient les tissus à l’aide d’environ 30 coups lents par exemple. Le nombre de traits peut-être être ajusté en fonction sur la cohérence du tissu.
  5. Tissu de transfert dissocié dans le tampon d’un tube conique de 50 mL et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 ° C pour granuler les cellules et les fragments restants de tissu fibreux ou cohésifs.
  6. Transférer le surnageant dans un tube à fond conique propre de 50 mL et centrifuger à 2 000 x g pendant 10 min à 4 ° C à pellet et jeter les gros débris cellulaires.
  7. Transférer le surnageant à nouveau à un tube à fond conique propre de 50 mL et centrifuger à 10 000 x g pendant 40 min à 4 ° C pour granuler indésirables plus grandes vésicules ou corps apoptotiques petit.
    Remarque : Cette pastille peut être enregistrée pour une étude supplémentaire de grandes vésicules si vous le souhaitez.
  8. Éliminer le surnageant à travers un filtre de 0,45 µm dans un tube d’ultracentrifugation propre de 12 mL.
    Remarque : Échantillons de tissu fibreux dense ne peuvent être facilement été filtrés. Ces échantillons peuvent être filtrés à travers un tamis de cellule 40 µm, puis transmises en série de petites aiguilles (18 G, 20 G, 22 G) avant de filtrer à travers le filtre de 0,45 µm.
  9. Ultracentrifugeuse l’échantillon à 100 000 x g pendant 2 h à 4 ° C pour granuler petits EVs.
  10. Éliminer le surnageant et laisser les tubes d’ultracentrifugation inversés pendant 5-10 min, taraudage fréquemment pour éliminer le liquide résiduel sur les côtés des tubes. Liquide résiduel peut aussi être aspiré à l’aide d’une pipette à aspiration sous vide.
  11. Resuspendre le culot de EV en 1,5 mL de tampon de saccharose de 0,25 M (10 mM Tris, pH 7,4). Il est important de s’assurer la complète remise en suspension de l’extrait concentré dans cette étape. Pour ce faire, couvrir les tubes avec parafilm avant vortex EVs en solution. Roche l’ultracentrifugeuse tubes pendant 15-20 min à température ambiante avant un mélange final vortex.
  12. Brièvement centrifuger les tubes à une vitesse pas plus de 1 000 x g pour récupérer la liquide de la suspension au fond du tube.
  13. Passez à la procédure de purification gradient ci-dessous, ou le cas échéant, Ranger EV suspension à 4 ° C durant la nuit.

2. Purification de Gradient de densité

  1. Ajouter 1,5 mL d’iodixanol de 60 % (solution dans l’eau) vers la mémoire tampon saccharose/Tris de 1,5 mL contenant des EVs pour créer une solution finale contenant 30 % iodixanol. Pipetter vers le haut et vers le bas plusieurs fois pour bien mélanger la solution. Faire preuve de prudence pour éviter de perdre la solution dans l’embout de la pipette, comme la concentration élevée d’iodixanol est assez visqueuse.
  2. Transférer la solution tampon d’iodixanol 30 % EVs au fond d’un tube d’ultracentrifugation 5,5 mL.
  3. Préparer au moins 1,5 mL de 20 % et 10 % d’iodixanol solutions par échantillon dans de l’eau ultrapure de la solution mère d’iodixanol de 60 %.
  4. Mesurer 1,3 mL d’iodixanol de 20 % et soigneusement calque au-dessus du calque de fond dégradé à l’aide d’une seringue et une aiguille 18 G. Pour éviter de mélanger les couches à l’interface de densité, garder le biseau de l’aiguille en contact avec l’intérieur du tube ultracentrifugation juste au-dessus du ménisque et ajouter la solution goutte à goutte.
  5. Couche de 1,2 mL de solution d’iodixanol de 10 % sur le dessus de la couche d’iodixanol de 20 % en utilisant la même technique que ci-dessus.
  6. Soigneusement équilibrer et charger les tubes d’ultracentrifugation dans les seaux de rotor et centrifuger à un rotor de swing-seau à 268 000 x g pendant 50 min à 4 ° C. Définir la vitesse d’accélération et de décélération de la centrifugeuse aux taux minimal autorisé pour éviter une désorganisation dans les couches de densité.
  7. Dix tubes de microcentrifuge de 1,5 mL pour chaque échantillon afin de correspondre à des fractions de 1 à 10 de la gradient de densité de l’étiquette. Fraction 1 est désignée comme la fraction supérieure qui sera tout d’abord supprimée, tandis que la fraction 10 est la fraction de fond dernière retirée.
  8. Une fois terminée l’ultracentrifugation dégradée, délicatement retirer les tubes des seaux de rotor et placer dans un support stable. On constatera souvent une bande visible des vésicules dans la fraction d’intérêt. Pipetter dix fractions séries de 490 µL du haut de la pente dans les tubes correspondants. Il y aura une petite quantité de liquide restant au fond du tube qui contient probablement des protéines contaminantes. Cet exemple peut être mis au rebut, ou conservé sous forme de fraction 11 si vous le souhaitez.
  9. Mesurer les indices de réfraction des fractions à l’aide d’un réfractomètre. C’est possible aussi avec un dégradé de contrôle s’exécuter en parallèle si la conservation de l’échantillon est nécessaire. Distribuer 20-30 µL de chacune des fractions contenant iodixanol sur la surface du réfractomètre et d’estimer la densité en comparant les indices de réfraction à densités connues iodixanol. Notez que fractions peuvent être stockées pendant la nuit dans la solution contenant de l’iodixanol si nécessaire avant de passer à la prochaine étape de lavage d’ultracentrifugation.
  10. Transférer chaque fraction dans un tube d’ultracentrifugation propre de 12 mL. Ajouter 5 mL de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; 137 mM NaCl, KCl, 2,7 mM 10 mM Na2HPO4mM 2 KH2PO4, pH 7,4) au tube et mélanger en pipettant également lentement de haut en bas.
    Remarque : PBS ajoutés aux échantillons devrait être exempt de particules, assurée par filtrage de PBS stérile à travers un filtre de 0,22 µm et stocker à température ambiante pour éviter la précipitation de sel.
  11. Ajoutez une autre 6 mL de solution 1 PBS x au début et à nouveau mélanger soigneusement.
  12. Ultracentrifugeuse les tubes à 100 000 x g pendant 2 h à 4 ° C pour re-granuler petites vésicules. Éliminer le surnageant et tapoter les tubes secs avant la lyse des vésicules pour l’analyse des protéines (étape 3) ou de la remise en suspension des véhicules électriques pour l’analyse morphologique (étape 5).

3. lyse et Immunoblot Confirmation des protéines EV

Remarque : Si la conservation des vésicules entières pour caractérisation morphologique ou activité biologique est souhaitée, chercheurs peuvent procéder directement à l’étape 5. Dans les premières expériences, ou avant l’analyse par spectrométrie de masse, toutes les fractions récupérées devraient être analysées par immunoblot pour confirmer des fractions avec des protéines de l’EV.

  1. Pour lyser EVs pour analyse des protéines, ajouter 40 µL de tampon de lyse forte (5 % SDS, 10 mM EDTA, 120 mM Tris-HCl pH 6,8, 2,5 % de 2-mercaptoéthanol, urée 8 M) avec l’ajout de l’inhibiteur de protéase à pellet EV en tube ultracentrifugeuse.
    Remarque : Si non réductrice des conditions sont nécessaires pour la détection des anticorps des protéines, remplacer l’eau ultrapure pour le 2-mercaptoéthanol dans le tampon de lyse forte.
  2. Assurer la complète remise en suspension des granulés et lyse des EVs dans le tampon en plaçant parafilm sur l’ultracentrifugation tube, vortex vigoureusement, puis bascule pendant 20 min à température ambiante avant un vortex final.
  3. Centrifuger brièvement à 1 000 x g pendant 30-60 s pour récupérer le volume de l’échantillon entier. Transférer l’échantillon dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL et les conserver à-20 ° C à-80 ° C jusqu'à ce que la poursuite de la procédure.
  4. Pour préparer les lysates purifiés pour l’analyse par immunotransfert, ajouter 5 x Laemmli solution tampon (10 % SDS, 250 mM Tris pH 6,8, 1 mg/mL de bleu, de bromophénol 0,5 M DTT, glycérol à 50 %, 5 % de 2-mercaptoéthanol) pour les échantillons destinés à une concentration finale de 1 x.
    Remarque : Si vous désirez des conditions non réducteur, remplacer le DTT et le 2-mercaptoéthanol avec de l’eau ultrapure.
  5. Si l’homogénat tissulaire tout contrôles sont souhaitées, lyse le tissu dans l’urée contenant fort tampon de lyse détaillés ci-dessus avec inhibiteur de protéase, puis centrifuger à 10 000 g pendant 10 min à jeter le reste de la matrice extracellulaire, cellules entières, ou débris cellulaires intacts. Ajouter 5 x Laemmli solution tampon à l’homogénat tissulaire pour une concentration finale de 1 x.
  6. Faire bouillir la solution tampon contenant des échantillons de l’homogénat EV ou tissulaires à 95 ° C pendant 5-10 min, puis charger le volume égal (de l’équivalent de 0,1 et 0,3 g de démarrage de matériel tissulaire ; 1 à 2 µg de protéine purifiée de EV) des fractions 1-10 en gel SDS-PAGE 10 %. Charger une masse égale d’homogénat tissulaire. Accroître le volume d’échantillons peut être nécessaire pour la détection par anticorps moins sensibles.
  7. Procéder à l’électrophorèse sur gel et analyse par Western blot comme précédemment détaillées21 pour confirmer les protéines EV dans les lysats purifiés et comparer l’abondance relative d’EV dans les fractions.
    Remarque : Une fois que la protéine EV a été démontrée reproductible dans les fractions cohérentes, le lavage final ultracentrifugation décrit dans étape 2.12 peut être limité aux fractions gradients d’intérêt.

4. Quantification des protéines EV

  1. Utiliser un test compatible détergent et urée fluorescence si sensible quantification des protéines EV est souhaitée pour une analyse plus approfondie (voir Table des matières). Notez que certains tests basés sur la fluorescence sont compatibles avec le bleu de bromophénol présent dans le tampon de Laemmli échantillon, facilitant lyse directe du culot EV (en étape 2.12) dans cette mémoire tampon si vous préférez.
  2. Si le kit de quantification de ladite protéine basés sur la fluorescence est utilisé, spot 1 µL de l’échantillon ou de la norme au moins dupliquer sur du papier filtre fourni et continuer la quantification des protéines selon les instructions du fabricant.

5. caractérisation de la morphologie de l’EV

  1. Pour examiner les vésicules entières après la centrifugation finale lavez dans étape 2.12, soigneusement resuspendre EV culot en particules libres 1 x PBS. Magasin EVs à 4 ° C pour pas plus d’une semaine avant le traitement pour éviter les cycles de gel-dégel.
    Remarque : Il est bénéfique pour ont déjà confirmé les fractions contenant constamment enrichi de protéines EV par immunobuvardage de limiter les analyses morphologiques aux fractions d’intérêt.
  2. Effectuer des nanoparticules suivi d’analyse sur des échantillons de EV ensemble pour déterminer la concentration et la taille des vésicules dans les préparations, comme précédemment détaillées22.
  3. Caractériser la morphologie EV et confirmer les mesures de taille par microscopie électronique des vésicules, si vous le souhaitez. EM grilles peuvent être préparés à partir de suspensions de vésicule suite 5.1 étape23, ou alternativement, peuvent être traitées comme bloc préparations24 de boulettes suivant étape 2.12.

6. en gel Purification et Digestion Trypsique pour analyse par spectrométrie de masse

  1. Si vous souhaitez caractérisation des protéomes EV par spectrométrie de masse, charge masse égale (au moins 10 µg de protéines) des fractions contenant des EVs dans un préfabriqué sur gel de polyacrylamide pour séparer et purifier les protéines. Fabricant fourni préfabriquées gels sont préférables pour réduire les niveaux de potentiel contaminant des protéines (p. ex., kératine) introduits dans les échantillons.
  2. Exécuter l’exemple au moins 0,5 pouces dans le gel de polyacrylamide pour la purification de la protéine, puis fixer et colorer avec un colorant bleu de Coomassie, comme décrit dans le détail,25.
  3. Couper les voies en 1 mm3 cubes pour la digestion trypsique, comme précédemment détaillées19,26.
  4. Charger 5 µL de l’échantillon digéré peptide en instrument de LC-MS/MS pour la séparation sur la colonne analytique et l’analyse ultérieure par spectrométrie de masse selon les paramètres spécifiés dans le détail,16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Un aperçu schématique de la dissociation tissulaire, centrifugation différentielle et gradient purification des vésicules est affiché à la Figure 1. La confirmation morphologique et immunophénotypiques des EVs purifiés par gradient est mis en évidence dans la Figure 2. Un schéma des densités reproductibles après ultracentrifugation du gradient iodixanol 10 à 30 % est donné, avec deux populations distinctes de vésicules migrent vers le haut vers la fraction 2 (lumière EVs) et fraction 5 (EVs denses), dépendant du type de tissu. Représentant l’immuno-blot des fractions gradients présentent la séparation efficace et la purification des petits véhicules électriques dérivées de tumeurs dans la fraction 5. À noter, échantillons de tumeur poumon apparus enrichis en EVs denses par rapport à la lumière EVs (en fraction 2) précédemment récoltés sur le tissu de cerveau entier, encore une fois mis en évidence ici. Comme une analyse des tissus mondial du SVE émergent, il sera intéressant de déterminer les densités distinctes des véhicules électriques produits par les tissus uniques. Analyses de suivi représentant de nanoparticules et microscopie électronique des vésicules dérivés de tissus dans la fraction contenant des vésicules prédominante démontrent l’enrichissement et à la préservation des vésicules tout compatibles avec la taille connue et la structure de petits véhicules électriques. Enfin, la Figure 3 met en lumière l’utilité de cette méthode pour faciliter la caractérisation de la spectrométrie de masse en aval des protéines purifiées gradient vésicule, démontrant la détection de nombreuses protéines a été détecté chez des petits véhicules électriques. Bon nombre de ces protéines identifiées sont conformes à celles enrichies en petits dérivé endosomale EVs précédemment proposés par le Théry et Hill laboratoires17,20.

Figure 1
Figure 1 : Aperçu schématique des vésicules isolation et la purification du tissu entier. Suite tissu dissociation, étapes de centrifugation différentielle pré-défrichage, filtration et ultracentrifugation, brut EV granulés peut être charriée sur le fond d’un gradient de densité d’iodixanol pour la séparation de la flottaison. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Représentant analyse morphologique et immunophénotypiques des tissus dérivés EVs. (A) calculé la densité de gradient ultracentrifugation suivant iodixanol, moyennée sur les expériences indépendantes, mettant en évidence les fractions contenant des EVs légères et denses. (B) représentant l’immuno-blot de vésicules dérivés de tissus démontrant l’isolement de tumeur dense surtout EVs et la lumière du cerveau EVs. Vésicule isolats sont dépourvus de protéines non-EV calnexine. H, l’homogénat tissulaire. (C) nanoparticules de suivi analyse (NTA) du représentant purifiés par gradient tissu SVE. La plus petite particule détectée dans cet échantillon était 78 nm et environ 92 % des vésicules détectés étaient 250 nm ou plus petits, en conformité avec un enrichissement élevé des petits véhicules électriques. (D) la microscopie électronique représentant des images du cerveau tissuent-dérivées EVs. Barreaux de l’échelle = 200 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Synthèse des protéines de la vésicule en surbrillance détecté par spectrométrie de masse d’un représentant dérivés de tissus EV échantillon. Suite EV extraction et purification de gradient, 10 µg de protéines EV en fraction enrichie a été chargé dans un gel de polyacrylamide pour électrophorèse et la digestion trypsique en gel. Dans cet échantillon représentatif sur les EV de dérivés de tissus, un total de 918 protéines ont été identifiés par analyse LC-MS/MS. Peptides ont été identifiés, analysés et trouvés à être enrichis en exosomal, lysosomes et les protéines de la membrane plasmique comme précédemment décrit16. Ici, nous démontrons la présence de petite EV ou exosomal protéines dans nos préparatifs qui ont été décrits par le Théry et Hill laboratoires17,20. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Intérêt scientifique s’est dégagé en ce qui concerne les rôles Qu'evs petits jouent dans le microenvironnement de la tumeur, ainsi que dans la fonction, la maturation et le développement de l’orgue. Dans l’ensemble, cette étude fournit un flux de travail optimisé pour l’extraction du SVE intact du cerveau entier ou les échantillons de tumeur. Alors qu’ici nous avons tout simplement démontrer l’applicabilité de cette technique au poumon dérivées de tumeurs SVE, cette méthode pourrait facilement être adaptée pour des travaux sur les autres tissus solides, offrant des possibilités pour plus ex vivo caractérisation des petites vésicules sécrétées qui sont des grand intérêt biomédical. Bien que pas dans le cadre de cette étude, une comparaison future du contenu EV à celui de « originaires » expression tissu sera également importante d’établir l’utilité des vésicules isolées comme biomarqueurs tissulaires et les maladies.

Dans l’étude précédemment publiée par notre laboratoire, nous démontrons clairement les avantages de la gradient de densité de flottaison-basé par gradients de sédimentation pour la purification d’enrichi petites vésicules. En substance, une séparation axée sur la flottabilité améliore la purification des vésicules en évitant la migration des contaminants à travers les fractions d’intérêt. Ce principe est particulièrement important au démarrage à partir des échantillons complexes comme tissus entiers. Peu importe, nous soulignons l’importance des études confirmation pré-analytique des vésicules isolées décrites, incluant l’examen des EV morphologie grâce à des techniques complémentaires telles que la microscopie électronique et nanoparticules suivi analyse, aussi bien comme des analyses biochimiques dont immunoblotting. EV protéines en fractions enrichies doivent être confirmées au moins trois marqueurs de EV reconnues, y compris une protéine tétraspanines, tel que recommandé par le rapport Des informations minimales pour les études du SVE (MISEV) publié dans le Journal d’extracellulaire 27de vésicules. Un marqueur de EV négatif doit être démontré à s’absenter ou fortement réduits dans les fractions EV par rapport à des homogénats de tissu. Toutes les étapes ci-dessus sont indispensables pour l’assurance de la qualité de la purification de petites vésicules. En outre, une démonstration de cohérence spécifiques de l’utilisateur et du laboratoire en EV-contenant des fractions de densité peut sauver un temps précieux et les coûts associés avec le traitement et l’analyse de toutes les fractions après l’étape d’ultracentrifugation gradient de densité.

Il est clair que les vésicules provenant de divers tissus peuvent flotter aux fractions de densité légèrement différente, ou peuvent séparer en principalement légère ou denses sous-populations. Ces différences ont été vus précédemment en totalité encéphales EVs par rapport aux EVs récoltées à partir des cellules dendritiques cultivés en culture16,17et sont illustrés plus loin dans la présente étude. Nous montrons que les échantillons de tumeur pulmonaire peuvent abritent principalement que denses EVs petits par rapport à l’EVs briquet isolées du tissu cérébral. Ces différences a mis en évidence par la méthode proposée dans la présente étude peuvent favoriser des enquêtes précieuses sur la composition différentielle des véhicules électriques, y compris les EVs de tumeur qui peuvent être emballés avec dense ADN brins28,29,30. En raison de ces différences dans la composition de l’EV, nous insistons fortement sur l’importance de ces premières expériences techniques. L’application future de cette technique pour l’isolation des véhicules électriques provenant d’échantillons de tumeurs diverses sera importante pour déterminer si denses EVs sont principalement sécrétée dans l’interstitium d’autres types de tumeur.

Alors que la purification complète des petits véhicules électriques et l’isolement des sous-populations distinctes vésicule restent une limitation de courant à travers des laboratoires, cette méthode fournit une base pour poursuivre ses études caractériser des petites vésicules d’une diversité de tissus ou de tumeur types et peuvent donc faciliter une meilleure compréhension de la diversité de l’EV. Récente séparation des particules de EV par fractionnement de champ-débit débit asymétrique a illuminé la possibilité de cargaison distincte et les fonctions des petits (60 à 80 nm) par rapport aux plus grands (90-120 nm) exosomes et identifiés plus loin un sous-ensemble de non membrane bondissent < 50 nm particules appelés « exomeres »31,32. Cependant, fret emballé dans ces populations de vésicule unique varié en lignées cellulaires, mettant en évidence l’hétérogénéité substantielle des vésicules sécrétées et soutenant l’importance de l’analyse complète in vitro ou ex vivo de vésicule. Dans cette étude, nous l’enrichissons très probablement pour les deux classes des exosomes identifiés. Une proportion de microvésicules petite avec des densités similaires à exosomes peut-être être présente dans les isolats ainsi. Bien que nous ne pouvons exclure la possibilité d’exomeres dans nos isolats, vésicules membranaires étaient certainement plus abondants dans les gradients fractions enrichies en protéines de la vésicule. En plus de petites EVs, grand oncosomes (> 1 000 nm) ont suscité un intérêt récent de cancer biologistes33. Alors que le protocole décrit dans cette étude filtre les vésicules supérieures à 450 nm, exclusion de cette étape peut faciliter l’examen de ces grandes EVs décrits. Des examens ultérieurs des densités associées à différentes sous-populations de vésicules sera important de distinguer ces entités en plus de leurs tailles décrits.

Enfin, bien que nous apprécions les limitations, y compris le coût et le temps associé à cette technique proposée, nous reconnaissons également la nécessité de méthodes fondamentales rigoureux afin de caractériser les tissus EVs et pour servir une comparaison du produit final pour constamment méthodes en constante évolution et plus sophistiqués dans le futur. Ces advancing technologies s’allumera si tout va bien des techniques plus rapides et cliniquement compatibles pour extraire des EVs d’échantillons médicaux ou chirurgicaux.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Dr Richard Nowakowski et la Floride état Université laboratoire Animal ressources pour fournir et prendre soin des animaux utilisés afin d’élaborer ce protocole, respectueusement. Nous remercions Liu Xia, Dr Rakesh Singh et la Florida State University translationnelle Science Laboratory d’assistance avec le œuvre de spectrométrie de masse utilisée pour la caractérisation de la vésicule en aval, ainsi que la facilité aus Biological Sciences Imaging Resource l’utilisation du microscope électronique à transmission dans cette étude. Enfin, nous remercions le Dr Mandip Sachdeva (Florida A & M University) pour don des spécimens tumeur utilisés dans le développement de cette méthode. Cette étude a été financée par des subventions de la Floride ministère de la santé Ed et Ethel Moore Alzheimer maladie recherche programme attribué à D.G.M. et J.M.O (6AZ11) et le National Cancer Institute de la National Institutes of Health, sous le numéro Award R01CA204621 attribué à D.G.M.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 µm filter VWR 28145-505
12 mL ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 331372
5.5 mL ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 344057
anti-Alix antibody Santa Cruz sc-7129
anti-Calnexin antibody Santa Cruz sc-11397
anti-CD63 antibody Abcam ab59479
anti-CD81 antibody Santa Cruz sc-9158
anti-Flotillin 2 antibody Santa Cruz sc-25507
anti-HSC70 antibody Santa Cruz sc-7298
anti-Syntenin-1 antibody Santa Cruz sc-100336
anti-TSG101 antibody Santa Cruz sc-7964
EZQ protein quantification kit ThermoFisher Scientific R33200
FA-45-6-30 rotor  Eppendorf 5820715006
FEI CM120 Electron Microscope TSS Microscopy
goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) Genetex 27171
HALT phosphatase inhibitor (100x solution) ThermoFisher Scientific 78420
HALT protease inhibitor (100x solution) ThermoFisher Scientific 78438
Hibernate E medium ThermoFisher Scientific A1247601
MLS-50 swinging-bucket rotor Beckman Coulter 367280
NanoSight LM10 Malvern
Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge  Beckman Coulter 393315
Optima XE-100 ultracentrifuge Beckman Coulter A94516
Optiprep Sigma D1556 60% iodixanol in sterile water solution
Q Exactive HF Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific
rabbit anti-goat IgG Genetex 26741
rabbit anti-mouse IgG Genetex 26728
Refracto 30PX (refractometer) Mettler Toledo 51324650
S-4-104 rotor Eppendorf 5820759003
SW 41 Ti swinging-bucket Rotor Beckman Coulter 333790
Tabletop 5804R centrifuge Eppendorf 22623508

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses. Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).
  2. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  3. Howitt, J., Hill, A. F. Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases. Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).
  4. Sardar Sinha, M., et al. Alzheimer's disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers. Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).
  5. Meckes, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).
  6. Meckes, D. G. Exosomal communication goes viral. Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).
  7. Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
  8. Zhang, X., et al. Exosomes in cancer: small particle, big player. Journal of Hematology Oncology. 8, 83 (2015).
  9. Janas, A. M., Sapoń, K., Janas, T., Stowell, M. H. Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).
  10. Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses. Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).
  11. Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  12. Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
  13. Katsiougiannis, S. Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity. Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).
  14. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
  15. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  16. Hurwitz, S. N., et al. An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease. Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).
  17. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
  18. Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space. Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).
  19. Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).
  20. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).
  21. Hurwitz, S. N., et al. CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.κB Signaling. Journal of Virology. 91 (5), (2017).
  22. Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).
  23. Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).
  24. Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
  25. Meckes, D. G. Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).
  26. Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 6, 23978 (2016).
  27. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
  28. Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
  29. Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nature Communications. 2, 180 (2011).
  30. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  31. Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
  32. Zijlstra, A., Di Vizio, D. Size matters in nanoscale communication. Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).
  33. Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. Oncosomes - large and small: what are they, where they came from. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).

Tags

Recherche sur le cancer numéro 144 exosomes vésicule extracellulaire tissus cerveau tumeur spectrométrie de masse gradient de densité ex vivo oncosomes biomarqueurs
Extraction des vésicules extracellulaires du tissu entier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hurwitz, S. N., Olcese, J. M.,… More

Hurwitz, S. N., Olcese, J. M., Meckes Jr., D. G. Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue. J. Vis. Exp. (144), e59143, doi:10.3791/59143 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter