Summary
여기, 우리는 작은 세포 외 소포 (EVs) 뇌와 종양 견본을 포함 하 여 전체 조직에서 분리 하는 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 이 방법은 추가 다운스트림 분석에 대 한 단단한 조직에서 EVs를 추출 하는 재현 기법을 제공 합니다.
Abstract
순환 및 중간 작은 막 도약 extracellular 소포 (EVs) 새로운 진단 이나 예 후 바이오 마커 분석, 개발을 위한 유망한 목표를 대표 하 고 가능성이 역할의 광범위 한 스펙트럼의 진행에 중요 한 선수 질병입니다. 현재 연구는 여러 세포에서 분 비 소포 특성에 집중 하 고 하기 위해서는 더 나은 조직 종류 조건 neurodegeneration, 염증, 암 등의 병 인에서 EVs의 역할을 이해. 그러나, 세계적으로 일관 되 고 재현 가능한 기술을 분리 하 고 소포를 정화 진행에 남아 있습니다. 또한, ex vivo 단단한 조직에서 EVs의 추출 방법 부족 하 게 설명 합니다. 여기, 우리는 추가 특성에 대 한 뇌와 종양 견본을 포함 하 여 전체 신선 또는 냉동 조직에서 관심의 작은 EVs를 추출 하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 여러 다운스트림 분석, 전자 현미경 검사 법 및 소포의 immunophenotypic 특성 EV 단백질의 양이 많은 질량 분석을 포함 하 여이 방법의 적응성을 설명 합니다.
Introduction
작은 세포 외 소포 (EVs) endosomal에서 파생 된 exosomes 등의 광범위 한 생물은 작은 막 창 고 microvesicles. 작은 EVs는 이기종 인구의 50-250 nm 막 도약 소포 포함 하는 생물학적으로 활성 단백질, 지질, 그리고 공동으로 다양 한 질병 과정에에서 중요 한 역할을 믿고 핵 산의 구성 됩니다. 특히 신경 프리온 질환, 전염 성 프로세스, 면역 이나 염증, 및 종양 성장 및 전이1,2,3 에이 소포를 연루는 연구 발전 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. 빠르게 성장 하는 생물 의학 연구 질병 병 인에서 EVs의 중요성으로 재현 하 고 엄격한 격리와 이러한 vesicles의 정화에 대 한 방법을 개발에 병렬 관심을 생성 했다.
EV 특성에서 역사적이 고 현재 도전 못하는 작은 EV 모집단을 완전히 분리 되었습니다. 이 문제는 주로 통치 별개 소포 속 다른 분자 메커니즘의 우리의 제한 된 이해 예정 이다. 크기, 밀도, 그리고 생물 학적 화물 더 부분 모집단 사이 오버랩이 구분 convolutes. 이 과제의 일부 또한 널리 다른 농축 기술, 실험실, 걸쳐 격리 vesicles의 다운스트림 분석에 불일치를 제공 하 고 범주별 EV 인구를 밝히는 글로벌 노력을 훼손 사용 되었습니다.
그것은 대부분 EV 특성화의 플라스마, 소변을 포함 한 동물이 나 인간의 체액에서 소포를 분리 하는 기법을 설명 하는 더 최근의 vivo에서 연구 표면에 뜨는, 세포 배양의 생체 외에서 컬렉션에서 수행 되었습니다 협조할 그리고 타 액. EVs는 순환에 대량에서 존재, 그것은 또한 이러한 vesicles 셀 통신 이벤트에서 중요 한 역할을 하 고 세포 조직의 interstitium에 인식. 암의 맥락에서 중간 EVs는 특히 암 세포 시드 및 전이성 성장14,15종양 microenvironment 변조에 중요 한 있을 수 있습니다. 따라서, 개발 및 단단한 조직 표본에서 소포를 추출 하는 기술의 최적화 값이입니다. 이러한 방법은 직접 연구 기관-수단을 제공할 것입니다 또는 종양에서 파생 된 EVs 작은 biopsies을 부분 또는 전체 기관 절제술을 포함 하 여 임상 표본에서 수확.
이 연구와 우리의 실험실16출판 이전 보고서 우리는 EV 농축 방법론에서 여러 주요 현재 문제를 해결 하고자: 1) 격리 하 고 현재 수준에 EVs를 정화 재현 기술을 설명 하 필드 확인 허용 작은 EV 모집단 endosomal에서 파생 된 exosomes;에 고도로 농축을 시도 2) 그리고 3) 더 특성을 위해 단단한 조직 표본에서 이러한 vesicles의 추출에 대 한 프로토콜을 제공 하.
최근, Kowal 및 동료 상대적으로 소규모 iodixanol 밀도 그라디언트 분리 및 정화 EV 모집단 비교 자당 밀도 기울기17보다 큰 효능을 설명 합니다. 매우 인용된 연구 수지상 세포 유래 EVs에 상대적으로 가벼운 밀도 분수, 1.1 g/mL의 조밀도와 일치 했다 endosomal 단백질이에 exosomes의 높은 비율로 가장 일관 된 것으로 농축 분수입니다. 저자에 따르면이 "진실한" exosomal 단백질 종양 민감성 유전자 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4, 그리고 여러 annexin 단백질17포함. 우리는 나중에 성공 조직 분리 페레즈 곤잘레스 외18 및 전체 두뇌 파생 EVs16을 후속 차등 원심 분리 프로토콜에서 설명 하는 방법에이 기술을 적응. 우리는 또한 우리의 실험실19설명한 기공을 단백질의 다운스트림 양적 및 비교 질량 분석에 대 한 순차적 프로토콜을 결합 하 여 EV proteomes 특성화에이 방법의 유틸리티를 설명 했다. 이 작품은 EVs 두뇌20담당에서 농축 된 힐 연구소에서 그을 평행 시켰다.
이 연구에서 우리이 기술에 대해 자세히 설명 하 고 최근 우리의 실험실에서 고체 폐 종양에서 EVs의 격리에 게시 하는 프로토콜의 응용 프로그램을 확장. 우리의 지식을 하려면이 ex vivo 종양 표본에서 EVs를 풍부 하 게 하는 프로토콜을 설명 하기 위해 첫 번째 연구 이다. 새로운 진단 바이오 마커 및 tumorigenesis에서 그들의 역할 EVs에 광범위 한 관심을 감안할 때,이 방법은 가능성이 증명 과학 연구원의 성장 수에 중요 한. 임상의 관점에서 중간 EVs 더 평가 제한 됩니다 표본에서 특히 훌륭한 진단 가치를 항구 수 있습니다. 우리의 희망은 여기에 설명 된 방법 신선 또는 냉동 동물 또는 인간 수술 표본, 밝히기 위해서 질병 병 인에 중요 한 역할이 작은 미래의 일에 대 한 방법을 포장에서 EVs를 수확 하는 재현 기법에 대 한 기초를 제공할 것입니다. 소포를 재생할 수 있습니다.
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Protocol
전체 두뇌에서 기관 동물 사용 및 관리 위원회 (IACUC) 플로리다 주립 대학교의 승인을 획득 했다. 12 마우스 두뇌의 총 (각 연령 집단에서 두뇌를 3: 2, 4, 6, 및 8 개월) C57BL/6 J에서 배경 앞에서 설명한16EV 추출에 사용 되었다. 폐 종양 표본은 프로 리 다 농업과 기계적인 대학 IACUC의 승인 아래 박사 Mandip Sachdeva에 의해 아낌없이 기부 했다. 폐 종양은 인간의 선 암 세포 선 immunodeficient Balb/c 뉴/뉴 누드 쥐에서 성장 하는 H1975에서에서 파생 되었다. 2 대표적인 종양 복제에서 데이터는이 연구에는 강조 표시 됩니다.
참고: 기 격리 및 정화 방법의 개요 개요는 그림 1에 제공 됩니다.
1. 조직 분리 및 차등 원심 분리
- 약 0.4-1.0 당 최대 절전 모드-전자 매체에서의 분리 버퍼 (papain 10 mg, 5.5 m m L-시스테인, 67 µ M 2-mercaptoethanol, 1.1 mM EDTA) 10 mL를 준비 조직의 g. Note EV 농축 및 정화에 사용 되는 모든 솔루션 초순 필터링 된 물에 희석 한다.
- 전체 신선 또는 냉동 조직 50 mL 원뿔 튜브에 분리 버퍼에 추가 하 고 품 어 따뜻한 물에 20 분 조직에 대 한 37 ° C에서 목욕 수 있습니다 잘라 부 화 하기 전에 작은 조각으로 필요한 경우.
- 부 화, 따라 분리 버퍼를 포함 하는 조직에 최종 1 배 농도 대 한 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제를 추가 합니다.
- 느슨한 맞는 Dounce 균질 화기로는 조직 포함 된 솔루션을 부 어 하 고 부드럽게 샘플 당 약 30 느린 스트로크를 사용 하 여 조직의 해리. 획 수 조직 일관성에 따라 조정할 수 있다.
- 50 mL 원뿔 튜브 및 작은 세포와 나머지 섬유 또는 응집 조직 파편을 4 ° C에서 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리기를 버퍼에 해리 전송 조직.
- 깨끗 한 50 mL 원뿔 튜브 및 작은 큰 세포질 파편 삭제 하 4 ° C에서 10 분 2000 x g 에서 원심 분리기는 상쾌한을 전송 합니다.
- 깨끗 한 50 mL 원뿔 튜브 및 원치 않는 큰 소포 또는 작은 apoptotic 몸 펠 렛을 4 ° C에서 40 분 10000 x g 에서 원심 분리기는 상쾌한을 다시 전송 합니다.
참고: 원하는 경우 더 큰 소포의 추가 연구에 대 한이 펠 릿을 저장할 수 있습니다. - 0.45 μ m 필터를 통해 깨끗 한 12 mL ultracentrifugation 관으로는 상쾌한을 가만히 따르다.
참고: 밀도가 거리 조직 샘플 쉽게 필터링 되지 않을 수 있습니다. 이러한 샘플 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링 다음 0.45 μ m 필터를 통해 필터링 하기 전에 순차적으로 작은 바늘 (18g, 20g, 22 G) 통해 전달 될 수 있습니다. - Ultracentrifuge 작은 EVs를 펠 렛을 4 ° C에서 2 시간에 대 한 100000 x g 에서 샘플.
- 가만히 따르다는 상쾌한 고 5-10 분, 관의 측에 잔여 액체를 제거 하려면 자주 도청 거꾸로 ultracentrifugation 튜브를 둡니다. 또한 aspirating 진공 피 펫을 사용 하 여 잔여 액체를 발음 수 있습니다.
- 다시 0.25 M 자당 버퍼 (10 mM Tris, pH 7.4)의 1.5 ml EV 펠 릿을 일시 중단 합니다. 그것은이 단계에서 펠 릿의 전체 다시 정지를 보장 해야 합니다. 이렇게 하려면 솔루션에 EVs vortexing 전에 parafilm 튜브 커버. 바위 ultracentrifuge 관 최종 소용돌이 혼합 하기 전에 실 온에서 15-20 분.
- 짧게 원심 관 튜브의 바닥에 액체 정지 복구 속도 이상의 1000 x g 에.
- 다음, 그라데이션 정화 단계를 수행 하십시오 또는 필요한 경우, 저장 EV 정지 4 ° C에서 하룻밤.
2. 밀도 그라데이션 정화
- 30 %iodixanol 포함 하는 최종 솔루션을 만드는 EVs를 들어 1.5 mL 자당/Tris 버퍼에 60 %iodixanol (재고 솔루션 물에서)의 1.5 mL를 추가 합니다. 최대 플라스틱 그리고 여러 번 솔루션을 철저 하 게 혼합. 높은 iodixanol 농도 아주 점성으로 피 펫 팁, 솔루션 손실 되지 않도록 주의 해야 합니다.
- EVs는 5.5 mL ultracentrifugation 튜브의 하단에 포함 된 30 %iodixanol 버퍼 솔루션을 전송 합니다.
- 적어도 1.5 mL 초순 물 60 %iodixanol 재고 솔루션에서 샘플 당 20%와 10 %iodixanol 솔루션의 준비.
- 1.3 mL 20 %iodixanol 및 신중 하 게 18 G 바늘 주사기를 사용 하 여 그라디언트 레이어 위에 레이어를 측정 합니다. 혼합 밀도 인터페이스 레이어를 방지 하려면 바로 위에 초승달 모양 ultracentrifugation 튜브의 내부와 접촉 하 여 바늘의 경사를 유지 하 고 dropwise 솔루션을 추가 합니다.
- 위와 같은 기법을 사용 하 여 20 %iodixanol 레이어 위에 10 %iodixanol 솔루션의 1.2 mL 레이어.
- 신중 하 게 균형 및로 터 양동이 4 ° c.에 50 분 268,000 x g 에서 스윙 양동이 터 원심 분리기 ultracentrifugation 튜브 로드 최저 밀도 층의 혼란을 피하기 위해 허용 하는 원심 분리기의 가속 및 감속 속도 설정 합니다.
- 밀도 기울기의 분수 1-10에 해당 하는 각 샘플에 대 한 10 1.5 mL microcentrifuge 튜브 라벨. 분수 1 먼저 제거 될, 분수 10 마지막 제거 바닥 분수는 최상위 부분으로 지정 됩니다.
- 그라데이션 ultracentrifugation 완료 되 면로 터 양동이에서 튜브를 제거 하 고 안정적인 홀더에 부드럽게. 소포의 보이는 밴드는 종종 관심의 일부에서 볼 수 있습니다. 해당 튜브에 그라디언트 위쪽에서 490 µ L의 10 직렬 분수를 플라스틱. 적은 양의 단백질 오염 가능성이 있는 튜브의 하단에 남아 있는 유체 있을 것입니다. 이 샘플, 또는 원하는 경우 분수 11로 유지 될 수 있습니다.
- 굴절 계를 사용 하 여 분수의 굴절율을 측정 합니다. 이 또한 샘플 보전이 필요한 경우 동시에 실행 제어 그라데이션으로 수행할 수 있습니다. 굴절 계 표면에 iodixanol를 포함 하는 각 분수의 20-30 µ L 플라스틱 고 굴절율 알려진된 iodixanol 밀도를 비교 하 여 밀도 추정. Note는 분수에에서 저장할 수 있습니다 하룻밤 iodixanol 포함 된 솔루션 다음 ultracentrifugation 세척 단계를 진행 하기 전에 필요한 경우.
- 깨끗 한 12 mL ultracentrifugation 관에 각 분수를 전송 합니다. 위아래로 천천히 pipetting으로 튜브를 혼합 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, 137 m NaCl, 2.7 m m KCl, 10mm 나2HPO4, 2mm KH2포4, pH 7.4 m) x 1의 5 mL를 추가 합니다.
참고: PBS는 샘플에 추가 입자 무료 살 균 PBS 0.22 μ m 필터를 통해 필터링 하 고 소금 강 수를 피하기 위해 실내 온도에 저장 하 여 보장 되어야 합니다. - 상단에 1 x PBS의 추가 6 mL을 추가 하 고 다시 신중 하 게 혼합.
- Ultracentrifuge 다시 작은 소포를 펠 렛을 4 ° C에서 2 시간에 대 한 100000 x g 에 튜브. 상쾌한 가만히 따르다 하 고 세포의 단백질 분석 (3 단계)에 대 한 소포 또는 형태 론 적 분석 (5 단계)에 대 한 EVs의 다시 정지 하기 전에 건조 튜브를 누릅니다.
3. 세포와 EV 단백질의 Immunoblot 확인
참고: Morphologic 특성 또는 생물 학적 활동에 대 한 전체 소포의 보존을 원하는 경우 연구자 5 단계로 바로 진행할 수 있습니다. 초기 실험, 또는 질량 분석 분석 하기 전에 복구 하는 모든 분수 immunoblot EV 단백질 분수를 확인 하 여 분석 합니다.
- 단백질 분석에 대 한 EVs를 lyse, ultracentrifuge 튜브 펠 릿 EV protease 억제제의 추가 함께 강한 세포의 용 해 버퍼 (5 %SDS, 10 mM EDTA, 120 mM Tris HCl pH 6.8, 2.5 %2-mercaptoethanol, 8 M 요소)의 40 µ L을 추가 합니다.
참고: 경우 비 감소 상태는 단백질의 항 체 검출, 초순 2-mercaptoethanol 강한 세포의 용 해 버퍼에 대 한 대체 합니다. - 완전 한 다시-펠 릿의 펜션과 버퍼에 EVs의 세포는 ultracentrifugation 이상의 parafilm를 배치 하 여 보장 튜브, vortexing 적극적으로, 다음 마지막 소용돌이 전에 실 온에서 20 분 동안 락.
- 짧게 30-60 s 전체 샘플 볼륨을 복구를 위한 1000 x g 에서 원심. 추가 처리까지 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브를-20 ° C ~-80 ° C에 게 샘플을 전송 합니다.
- 순화 lysates immunoblot 분석에 대 한 준비, 1 x의 최종 농도 대 한 샘플을 5 x Laemmli 샘플 버퍼 (10 %SDS, 250 mM Tris pH 6.8, 1 mg/mL bromophenol 블루, 0.5 M DTT, 50% 글리세롤, 5 %2-mercaptoethanol)을 추가 합니다.
참고: 비 감소 조건 바란다면 바꿉니다 DTT와 2-mercaptoethanol 초순. - 경우 전체 조직 homogenate 컨트롤은 원하는 lyse는 우 레 아-들어에 강한 조직 세포의 용 해 버퍼 protease 억제제와 위에 상세한, 다음 10 분 남은 기질, 전체 셀 삭제에 대 한 10000 x g 에서 원심 또는 그대로 세포질 파편입니다. 1 x의 최종 농도 대 한 조직 homogenate를 5 x Laemmli 견본 버퍼를 추가 합니다.
- EV 또는 조직 homogenate 샘플 5-10 분 동안 95 ° C에 포함 된 샘플 버퍼를 끓인 다음 동일한 볼륨 로드 (0.1-0.3의 상응에서 시작 조직 물자의 g; 순화 EV 단백질의 1-2 µ g) 10 %SDS-PAGE 젤으로 분수 1-10의. 조직 homogenate의 동등한 질량을 로드 합니다. 샘플의 큰 볼륨 덜 민감한 항 체에 의해 감지에 대 한 필요할 수 있습니다.
- 젤 전기 이동 법 및 서쪽 오 점 분석 이전 상세한21 순화 lysates의 EV 단백질을 확인 하 고 분수에 상대 EV 풍부 비교로 진행 합니다.
참고: EV 단백질은 일관 된 분수에 reproducibly 입증 되었습니다, 일단 최종 ultracentrifugation 세척 단계 2.12에 설명 된 관심의 그라데이션 분수 제한 수 있습니다.
4. EV 단백질 정량화
- EV 단백질의 중요 한 부 량 추가 분석을 위해 원하는 경우 세제 및 요소 호환 형광 기반 분석 결과 사용 하 여 ( 재료의 표참조). Note 일부 형광 기반 분석 Laemmli 샘플 버퍼, 선호 하는 경우이 버퍼에서 (에서 단계 2.12) EV 펠 릿의 직접 세포의 용 해를 촉진에 bromophenol 블루와 호환 됩니다.
- 상기 형광 기반 단백질 정량화 키트를 사용 하는 경우 샘플 또는에 표준의 자리 1 µ L 적어도 제공된 필터 종이에 복제 그리고 단백질 정량화 제조업체의 지침에 따라 계속.
5입니다. EV 형태의 특성
- 최종 원심 분리 단계 2.12에서 세척 후 전체 소포를 검사, 철저 하 게 다시 일시 중단 EV 펠 릿 1 입자 무료 x PBS에. 4 ° C에서 처리까지 1 주 보다는 더 이상 저장소 EVs freeze-thaw 주기를 피하기 위해
참고: 지속적으로 관심의 분수 형태소 분석을 제한 하려면 immunoblot 분석에 의해 농축된 EV 단백질을 포함 하는 분수 확인 이전에 유리 하다. - 나노 입자 농도 이전 상세한22로 준비, 소포의 크기를 결정 하기 위해 전체 EV 샘플 분석 추적을 수행 합니다.
- EV 형태 특성화 고 크기 측정의 소포, 전자 현미경 필요한 경우 합니다. EM 격자 소포 정지 단계 5.123, 다음에서 준비 될 수 있다 또는 또는 블록 준비24 단계 2.12 따라 펠 릿에서 처리할 수 있습니다.
6.에서-정화와 트립 신 소화를 위한 젤 질량 분석 분석
- 질량 분석에 의해 EV proteomes의 특성을 원하는 경우 분리 하 여 단백질 정화 프리 카스트 polyacrylamide 젤에 EVs를 포함 하는 분수의 동등한 질량 (단백질의 적어도 10 µ g)을 로드 합니다. 프리 카스트 젤 제조 업체 제공 샘플으로 소개 되 고 단백질 (예를 들어, 각 질) 오염 가능성의 수준을 줄이기 위해 선호 됩니다.
- 단백질 정화의 polyacrylamide 젤으로 0.5 인치 이상 샘플을 실행 다음 수정 하 고 세부 사항25에 앞에서 설명한 Coomassie 염료와 얼룩.
- 잘라 레인 1 m m3 큐브 이전 상세한19,26으로 트립 신 소화에 대 한.
- 세부16에 지정 된 매개 변수에 따라 질량 분석에 의해 분리 분석 및 이후 분석에 대 한 LC-MS/MS 계기를 소화 펩 티 드 샘플의 5 µ L를 로드 합니다.
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Representative Results
조직 분리, 차등 원심 분리 및 소포의 그라데이션 정화의 도식 개요는 그림 1에 표시 됩니다. 그라데이션 정화 EVs의 형태 론 적과 immunophenotypic 확인은 그림 2에 강조 표시 됩니다. 재현할 수 밀도의 10-30 %iodixanol 그라데이션 ultracentrifugation 다음 다이어그램 표시 됩니다, 분수 2 (빛 EVs) 및 분수 5 (밀도 EVs), 위쪽으로 마이그레이션 두 가지 기 인구와 조직의 종류에 따라. 그라데이션 분수의 대표 immunoblots 전시 효율적인 분리와 분수 5 작은 종양에서 파생 된 EVs의 정화. 메모의 풍부한 빛 EVs (분수 2) 이전 뇌 조직에서 수확에 비해 밀도 EVs에 등장 하는 폐 종양 표본은 다시 여기 강조. EVs의 글로벌 조직 분석으로 등장, 독특한 조직에 의해 생산 EVs의 뚜렷한 밀도 결정 하는 것이 흥미로울 것 이다. 대표 나노 추적 분석 및 전자 현미경 조직 파생 소포 우세 기 포함 된 분수에서의 농축 및 전체 소포 알려진된 크기와 일치의 보존과의 구조 설명 작은 Ev. 마지막으로, 그림 3 이전 작은 EVs에서 확인 된 많은 단백질의 탐지를 보여주는 유틸리티 그라데이션 정화 기 단백질의 다운스트림 질량 분석 특성화 촉진에이 방법의 하이라이트. 이 확인 된 단백질의 대부분은 그 작은 endosomal 파생 evs 이전 Théry와 힐 연구소17,20에 의해 제안 된 농축과 일치.
그림 1 : 기 격리 및 전체 조직에서 정화의 도식 개요. 조직 분리, 전 개간 차등 원심 분리, 여과, 스텝과 ultracentrifugation, 원유 EV 펠 릿에 따라 부양 분리에 대 한 iodixanol 밀도 기울기의 하단에 resuspended 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 조직 파생 EVs의 대표적인 형태 론 적과 immunophenotypic 분석. (A)의 iodixanol 그라데이션 다음 ultracentrifugation, 독립적인 실험, 빛 및 조밀한 EVs를 포함 하는 분수를 강조 동안 평균 밀도 계산. (B) 대표 immunoblots의 조직에서 파생 된 소포 주로 밀도 종양 EVs와 빛의 절연을 보여주는 EVs 두뇌. 기 분리 비 EV 단백질 calnexin의 고갈 됩니다. H, 조직 homogenate입니다. (C) 나노 대표 그라데이션 정화 조직 EVs의 분석 (NTA)를 추적. 이 샘플에서 가장 작은 검색 된 입자는 78 nm, 그리고 소포 감지의 약 92% 했다 250 nm 또는 더 작은, 작은 EVs의 높은 풍부와 일치. (뇌 조직에서 파생 된 EVs의 D) 대표 전자 현미경 이미지. 스케일 바 = 200 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 요약 강조 소포 단백질의 EV 샘플 조직에서 파생 된 대표자의 질량 분석에 의해 감지. EV 추출 및 그라데이션 정화, EV 단백질 농축 분수에서의 10 µ g polyacrylamide 젤 전기 이동 법에 젤 트립 신 소화에 대 한에 로드 되었습니다. 이 조직에서 파생 된 EV 견본, 918 단백질의 총 LC-MS/MS 분석에 의해 확인 되었다. 펩 티 드 했다 식별, 분석, 그리고 앞에서 설명한16exosomal, lysosomal, 및 플라즈마 막 단백질 농축 수 발견. 여기, 우리는 Théry와 힐 연구소17,20에 의해 설명 된 우리의 준비에 작은 EV 또는 exosomal 단백질의 존재를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
많은 과학적인 관심사 작은 EVs 종양 microenvironment 뿐만 아니라 장기 개발, 성숙, 및 기능을 재생 하는 역할에 관하여 생성 되었다. 전반적으로,이 연구 전체 뇌 또는 종양 표본에서 그대로 EVs의 추출에 대 한 최적화 된 워크플로 제공합니다. 여기 단순히 폐 종양에서 파생 된 EVs에이 기술의 적용 시연,이 방법은 쉽게 수 추가의 작은 분 비 소포 ex vivo 특성에 대 한 기회를 제공, 다른 단단한 조직에 대 한 작업에 대 한 적응 광범위 한 생물 의학 관심입니다. 이 연구의 범위를 넘어 발생 하는 조직 식의 EV 콘텐츠의 미래 비교가 됩니다 생체 조직과 질병으로 고립 된 소포의 유틸리티를 설정 하는 것이 중요.
이전 우리 연구소에 의해 발표 된 연구에서 명확 하 게 침전 그라디언트 풍부한 작은 소포의 정화에 대 한 부양 기반 밀도 기울기의 이점을 설명 합니다. 본질적으로, 부 력 기반 분리의 분수를 통해 오염 마이그레이션 방지 하 여 소포의 정화를 향상 시킵니다. 이 원리는 전체 조직 같은 복잡 한 샘플에서 시작할 때 특히 중요 한 나타납니다. 어쨌든, 우리가 격리 된 소포, 전자 현미경 등 나노 분석, 뿐만 아니라 추적 보완 기술을 통해 EV 형태학의 검사를 포함 하 여의 사전 분석 확인 연구의 중요성을 강조 생 화 확 적인 분석 immunoblotting 등로. EV 단백질 농축된 분수에 Extracellular 저널에 발표 된 연구의 EVs에 대 한 최소한의 정보 (MISEV) 보고서에서 권장 한 tetraspanin 단백질을 포함 하 여 적어도 3 개의 인식 EV 마커, 확인 되어야 한다 소포27 네거티브 EV 마커 없어야 증명 한다 또는 조직 homogenates에 비해 EV 분수에 매우 감소. 위에서 언급 한 모든 단계는 작은 소포 정화의 품질 보증에 대 한 중요 한. 더하여, 포함 하는 EV 밀도 분수에 실험실 및 사용자 특정 일관성의 초기 데모 귀중 한 시간 및 비용 처리 및 모든 분수 다음 밀도 그라데이션 ultracentrifugation 단계 분석과 관련 된 저장할 수 있습니다.
그것은 분명 다양 한 조직에서 소포 약간 다른 밀도 분수, 플 로트 수 있습니다 또는 주로 빛 또는 밀도 모집단으로 분리 수 있습니다. 이러한 차이 이전 볼 되었습니다 전체에서 두뇌 파생 된 EVs EVs 수지상 세포 문화16,17, 재배에서 수확에 비해 고이 연구에서 입증 됩니다. 우리는 폐 종양 표본을 조밀한 작은 EVs 뇌 조직에서 분리 된 가벼운 EVs에 비해 주로 항구 수 있습니다 보여줍니다. 이 연구에서 제시 된 방법으로 강조 하는 이러한 차이 조밀한 DNA 가닥28,,2930으로 포장 될 수 있습니다 종양 EVs를 포함 하 여 EVs의 차동 구성으로 귀중 한 문의 홍보 수 있습니다. EV 구성에서 이러한 차이 때문에 우리가 강력 하 게 이러한 초기 기술 실험의 중요성을 밑줄. 다양 한 종양 표본에서 EVs의 고립에이 기술의 미래 응용 프로그램 밀도 EVs 뿐만 아니라 다른 종양 종류의 interstitium에 분 비 하는 주로 결정 하는 중요 한 것입니다.
동안 작은 EVs의 완전 한 정화 및 개별 소포 모집단의 절연 전류 제한 실험실에서이 방법은 다양 한 조직이 나 종양에서에서 작은 소포 특성을 추가 연구에 대 한 기초를 제공 한다 종류, 그리고 따라서 EV 다양성의 큰 이해를 촉진 수 있습니다. 비대칭 흐름 필드-흐름 분별 하 여 EV 입자의 최근 분리는 더 큰 (90-120 nm) exosomes, 대 작은 (60-80 nm)의 기능 및 개별 화물의 가능성을 조명 하 고 더 비 막 바운드의 하위 집합을 식별 < 50 nm 입자는 "exomeres"31,32로 명명. 그러나, 이러한 독특한 기 인구에 포장 화물 셀 라인, 분 비 소포의 상당한이 강조 하 고 지 원하는 포괄적인 생체 외에서 또는 전 비보 소포 분석의 중요성에 걸쳐 다양 합니다. 이 연구에서 우리는 대부분 exosomes 식별의 두 클래스에 대 한 풍부. Exosomes에 유사한 조밀도 가진 작은 microvesicles의 비율 또한 격리에 존재할 수 있습니다. 비록 우리가 우리의 분리에 exomeres의 가능성을 제외 수 없는, 막 도약 소포 소포 단백질에서 농축 그라데이션 분수에서 확실히 가장 풍부 했다. 작은 EVs, 큰 oncosomes 이외에 (> 1000 nm) 암 생물학33최근 관심의 되었습니다. 이 연구 450 보다 큰 소포 필터링 프로토콜에서 설명 하는 동안 nm,이 단계의 제외 설명 이러한 큰 EVs의 시험 촉진 수 있습니다. 관련 된 다양 한 소포 모집단 밀도의 미래 시험 설명된 크기 뿐 아니라 이러한 엔터티를 구별 하는 것이 중요 있을 것입니다.
마지막으로, 비록 우리가 제한이 제안 기술 관련 된 시간과 비용을 포함 하 여 주셔서 감사 합니다, 우리 또한 인정 조직 EVs를 특성화 하 고 봉사 하는 최종 제품 비교로 지속적으로 엄격한 기초 방법에 대 한 필요 미래에 발전 하 고 더 정교한 방법입니다. 이러한 기술 발전 잘하면 더 빠르고 임상 호환 기술을 의료 또는 외과 표본에서 EVs를 추출 켜 집니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 박사 리처드 Nowakowski와 플로리다 주립 대학 실험실 동물의 리소스를 제공 하 고 정중 하 게이 프로토콜을 개발 하는 데 사용 하는 동물에 대 한 배려 감사 합니다. 우리는 다운스트림 소포 특성 뿐만 아니라 FSU 생물 과학 이미징 리소스 시설 사용 질량 분석 작업과 쌰 Liu, 박사 Rakesh 싱, 그리고 지원에 대 한 플로리다 주립 대학 변환 과학 연구소 감사 이 연구에서 전송 전자 현미경의 사용. 마지막으로, 우리는이 방법의 개발에 사용 되는 종양 견본의 기부에 대 한 박사 Mandip Sachdeva (플로리다 A & M 대학) 감사 합니다. 이 연구는 플로리다 학과의 건강에 드와 델 무어 Alzheimer의 질병 연구 프로그램에서 D.G.M. 및 J.M.O (6AZ11)와 보너스 번호 아래 국립 보건원의 국립 암 연구소 수 여 교부 금에 의해 지원 되었다 R01CA204621 D.G.M.에 게 수 여
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm filter | VWR | 28145-505 | |
| 12 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| 5.5 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| anti-Alix antibody | Santa Cruz | sc-7129 | |
| anti-Calnexin antibody | Santa Cruz | sc-11397 | |
| anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| anti-CD81 antibody | Santa Cruz | sc-9158 | |
| anti-Flotillin 2 antibody | Santa Cruz | sc-25507 | |
| anti-HSC70 antibody | Santa Cruz | sc-7298 | |
| anti-Syntenin-1 antibody | Santa Cruz | sc-100336 | |
| anti-TSG101 antibody | Santa Cruz | sc-7964 | |
| EZQ protein quantification kit | ThermoFisher Scientific | R33200 | |
| FA-45-6-30 rotor | Eppendorf | 5820715006 | |
| FEI CM120 Electron Microscope | TSS Microscopy | ||
| goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) | Genetex | 27171 | |
| HALT phosphatase inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78420 | |
| HALT protease inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78438 | |
| Hibernate E medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| MLS-50 swinging-bucket rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
| NanoSight LM10 | Malvern | ||
| Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Optima XE-100 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Optiprep | Sigma | D1556 | 60% iodixanol in sterile water solution |
| Q Exactive HF Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | ||
| rabbit anti-goat IgG | Genetex | 26741 | |
| rabbit anti-mouse IgG | Genetex | 26728 | |
| Refracto 30PX (refractometer) | Mettler Toledo | 51324650 | |
| S-4-104 rotor | Eppendorf | 5820759003 | |
| SW 41 Ti swinging-bucket Rotor | Beckman Coulter | 333790 | |
| Tabletop 5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 |
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