Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Utvinning av ekstracellulære blemmer fra hele vev

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/59143
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Florida State University College of Medicine

Summary

Her gir vi en detaljert protokoll for å isolere små ekstracellulære blemmer (EVs) fra hele vev, inkludert hjernen og tumor prøver. Denne metoden gir en reproduserbar teknikk for å trekke ut EVs fra solid vev for videre nedstrøms analyser.

Abstract

Sirkulerende og interstitiell små membran-bundet ekstracellulære blemmer (EVs) representerer lovende mål for utviklingen av romanen diagnostiske eller prognostiske biomarkør analyser, og trolig tjene som viktige spillere i utviklingen av et stort spekter av sykdommer. Nåværende forskning fokuserer på karakterisering av blemmer skilles ut fra flere celle og vev typer for å bedre forstå EVs rolle i patogenesen av inkludert neurodegeneration, betennelse og kreft. Imidlertid fortsatt globalt konsistent og reproduserbar teknikker å isolere og rense blemmer pågår. Videre beskrives metoder for utvinning av EVs fra solid vev ex vivo knapt. Her gir vi en detaljert protokoll for å trekke ut små EVs rundt fra helt friske eller frosne vev, inkludert hjernen og tumor eksemplarer, for ytterligere karakterisering. Viser vi tilpasningsevne denne metoden for flere nedstrøms analyser, inkludert elektronmikroskop og immunophenotypic karakteristikk av blemmer og kvantitative massespektrometri EV proteiner.

Introduction

Små ekstracellulære blemmer (EVs) inkluderer endosomal-avledet exosomes og små membran-skur microvesicles av bred biomedisinsk interesse. Liten EVs består av en heterogen befolkning av 50-250 nm membran-bundet blemmer som inneholder biologisk aktive proteiner og lipider nukleinsyrer som kollektivt spille en viktig rolle i et mangfold av sykdom prosesser. Fremme forskning har spesielt innblandet disse vesikler i nevrodegenerative og prion sykdommer, smittsomme prosesser, autoimmune eller inflammatorisk forhold, og tumor vekst og metastasering1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. raskt voksende biomedisinsk forskning inn i betydningen av EVs i sykdom patogenesen har generert parallelle interesse i å utvikle reproduserbare og strenge metoder for isolasjon og rensing av disse vesikler.

Historiske og dagens utfordring i EV karakterisering har vært manglende evne å fullt skille små EV subpopulasjoner. Denne utfordringen er vår begrensede forståelse av de ulike molekylære mekanismene som styrer biogenesis av forskjellige blemmer. Overlappende størrelse, tetthet og biologiske Last mellom subpopulasjoner ytterligere convolutes disse forskjellene. En del av denne utfordringen har også vært bruken av mye forskjellig berikelse teknikker, gir inkonsekvens i nedstrøms analyse av isolerte blemmer over laboratorier og undergrave global innsats for å belyse kategoriske EV populasjoner.

Det er verdt å merke seg at fleste EV karakteristikk er utført fra i vitro samling av cellekultur supernatant, med nyere i vivo studier som beskriver teknikker for å isolere blemmer fra dyr eller human kroppsvæsker, inkludert plasma, urin , og spytt. Mens EVs finnes i store mengder i omløp, anerkjent det også at disse vesikler spille en viktig rolle i celle til celle kommunikasjon arrangementer og i interstitium av mobilnettet vev. I forbindelse med kreft være interstitiell EVs spesielt viktig i modulerende svulst microenvironment for kreftcelle såing og metastatisk vekst14,15. Derfor er det verdi i utvikling og optimalisering av teknikker for å trekke ut blemmer fra solid vevsprøver. Disse metodene vil gi et middel til å direkte studere orgel - eller svulst - avledet EVs høstet fra klinisk eksemplarer, inkludert små biopsier og delvis eller full organ resections.

I denne studien, og i en tidligere rapport utgitt av vårt laboratorium16, vi rettet mot flere store gjeldende bekymringer i EV berikelse metodikk: 1) å beskrive en reproduserbar teknikk for å isolere og rense EVs til de høyeste standardene for øyeblikket akseptert i feltet. 2) å forsøke å isolere liten EV subpopulasjoner høyanriket i endosomal-avledet exosomes; og 3) å gi en protokoll for utvinning av disse vesikler fra solid vevsprøver for ytterligere karakterisering.

Nylig beskrevet Kowal og kolleger en relativt mindre iodixanol tetthet gradert å skille og rense EV subpopulasjoner med større effekt enn sammenlignbare sukrose tetthet forløpninger17. I den siterte studien, var dendrittiske celle-avledet EVs fanget i en relativt lett tetthet brøk, samsvarer med en tetthet på 1,1 g/mL, svært beriket i endosomal proteiner antas å være mest konsistente med en høy andel exosomes i dette brøk. Ifølge forfatterne inkludert disse "bona fide" exosomal proteiner svulst mottakelighet genet 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 og flere annexin proteiner17. Vi tilpasset senere denne teknikken for å lykkes en metode for vev dissosiasjon beskrevet av Perez-Gonzalez et al18 og en påfølgende differensial sentrifugering protokoll isolere hele hjerne-avledet EVs16. Vi viste også nytten av denne metoden i karakteriserer EV proteomes ved å kombinere en sekvensiell protokoll for nedstrøms kvantitative og komparativ massespektrometri vesicula protein, tidligere beskrevet av vårt laboratorium19. Dette arbeidet paralleller som fra Hill laboratoriet, der EVs ble beriket fra frontal cortex av hjernen20.

I denne studien vi utdype denne teknikken og utvide bruken av protokollen nylig publisert fra vårt laboratorium i isolasjon av EVs fra solid lunge svulst. Vi vet er dette den første studien å beskrive en protokoll for å berike EVs fra ex vivo svulst prøver. Gitt den utbredte interessen EVs som roman diagnostiske biomarkers og deres rolle i tumorigenesis, vil denne metoden trolig være verdifulle for et økende antall forskere. Fra en klinisk perspektiv, kan interstitiell EVs havn stor diagnostiske verdi, spesielt i prøver der histologic evaluering er begrenset. Vårt håp er at metoden skissert her vil gi grunnlag for en reproduserbar metode å høste EVs fra friske eller frosne dyr eller human kirurgisk prøver, banet vei for fremtiden å avdekke den betydelige roller i sykdom patogenesen disse små blemmer kan spille.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hele hjernen ble innhentet med godkjenning fra institusjonelle dyr bruk og omsorg Committee (IACUC) i Florida State University. Totalt tolv musen hjerner (3 hjernen fra hver aldersgruppe: 2, 4, 6 og 8 måneder) fra en C57BL/6 J bakgrunnen ble brukt for EV utvinning, som beskrevet tidligere16. Lunge svulst eksemplarer ble sjenerøst donert av Dr. Mandip Sachdeva under godkjenning av Florida landbruket og mekanisk University IACUC. Lunge svulst var avledet fra menneskelige adenocarcinoma cellen linje H1975 vokst i immunodeficient Balb/c nu nu naken mus. Data fra to representant svulst gjentak utheves i denne studien.

Merk: En skjematisk oversikt over vesicle isolasjon og rensing metoden finnes i figur 1.

1. vev dissosiasjon og differensial sentrifugering

  1. Forberede 10 mL av dissosiasjon buffer (10 mg papain, 5,5 L-cystein, 67 µM 2-mercaptoethanol, 1.1 mM EDTA) i dvalemodus-E medium per ca 0,4-1.0 g av vev. Merk at alle løsninger for EV berikelse og rensing bør fortynnet i ultrapure filtrert vann.
  2. Legge til helt friske eller frosne vev dissosiasjon buffer i et 50 mL konisk rør og ruge i et varmt vann bad på 37 ° C i 20 min. vev kan bli kuttet i mindre biter før inkubasjon hvis nødvendig.
  3. Etter inkubasjon, legge til protease og fosfatase hemmere for en siste 1 x konsentrasjon dissosiasjon bufferen som inneholder vevet.
  4. Hell løsningen som inneholder vevet i en løs-fit Dounce homogenizer, og forsiktig distansere vevet bruker ca 30 sakte slag per prøve. De kan bli justert basert på vev konsistens.
  5. Forflytning dissosiert vev i buffer til en 50 mL konisk rør og sentrifuge på 500 x g for 5 min på 4 ° C pellets celler og gjenværende fibrøs eller sammenhengende vev fragmenter.
  6. Overføre nedbryting til en ren 50 mL konisk rør og sentrifuge 2000 x g for 10 min på 4 ° C pellets og kaste store mobilnettet rusk.
  7. Overføre nedbryting igjen til en ren 50 mL konisk rør og sentrifuge 10.000 x g for 40 minutter til 4 ° C pellets uønskede større blemmer eller liten apoptotisk organer.
    Merk: Denne pellets kan lagres for ytterligere studier av større blemmer hvis ønskelig.
  8. Dekanter nedbryting gjennom et 0,45 µm filter i en ren 12 mL ultracentrifugation tube.
    Merk: Tett fibrotiske vevsprøver kan ikke filtreres lett. Disse prøvene kan bli filtrert gjennom en 40 µm celle sil, så gikk gjennom serielt mindre nåler (18 G, 20 G, 22 G) før du filtrerer gjennom 0,45 µm filteret.
  9. Ultracentrifuge prøven på 100.000 x g for 2t 4 ° c til pellets liten EVs.
  10. Dekanter nedbryting og la ultracentrifugation rør invertert for 5-10 min, trykke ofte for å fjerne gjenværende væske på sidene av rør. Gjenværende væske kan også være aspirated bruker en aspirating vakuum pipette.
  11. Nytt avbryte EV pellet 1,5 mL 0,25 M sukrose buffer (10 mM Tris, pH 7.4). Det er viktig å sikre full re-suspensjon av pellets i dette trinnet. Gjør dekke rør med parafilm før vortexing EVs løsning. Rock ultracentrifuge rør i 15-20 min ved romtemperatur før en endelig vortex blanding.
  12. Kort sentrifuge rør på en hastighet mer enn 1000 x g gjenopprette flytende suspensjon på bunnen av røret.
  13. Videre til gradient rensing trinnene nedenfor, eller eventuelt lagre EV suspensjon på 4 ° C over natten.

2. tetthet gradert rensing

  1. Legge til 1,5 mL 60% iodixanol (lager løsning i vann) 1.5 mL sukrose/Tris bufferen som inneholder EVs for å opprette en endelig løsning som inneholder 30% iodixanol. Pipetter opp og ned flere ganger for å blande løsning grundig. Være forsiktig å unngå å miste løsning i pipette spissen, høy iodixanol konsentrasjonen er ganske tregtflytende.
  2. Overføring 30% iodixanol buffer løsning som inneholder EVs til bunnen av en 5.5 mL ultracentrifugation tube.
  3. Forbered minst 1,5 mL av 20% og 10% iodixanol løsninger per prøve i ultrapure vann fra 60% iodixanol lager løsning.
  4. Måle 1.3 mL av 20% iodixanol og nøye lag på toppen av bunnen gradient laget med en sprøyte og en 18 G pinnen. Unngå å blande lagene på tetthet grensesnittet, holde skråkant nålen i kontakt med innsiden av ultracentrifugation røret like over meniscus og legge til løsningen dropwise.
  5. Lag 1,2 mL 10% iodixanol løsning på 20% iodixanol laget ved hjelp av samme teknikk som ovenfor.
  6. Nøye balanse og laste ultracentrifugation rør inn i rotoren bøtter og sentrifuger i en swing-bøtte rotor 268,000 x g for 50 min på 4 ° C. Angi akselerasjon og deselerasjon hastigheten på sentrifugen minimum priser kan unngå avbrudd av tetthet lag.
  7. Merke ti 1,5 mL microcentrifuge rør for hvert utvalg tilsvare fraksjoner 1 til 10 tetthet graderingen. Brøkdel 1 angis som den øverste brøken som først fjernes mens brøk 10 er nederst delen sist fjernet.
  8. Når den graderte ultracentrifugation er fullført, forsiktig fjerne rørene fra rotoren bøtter og plasser i en stabil holder. Et synlig band av blemmer vil ofte bli sett i fraksjonen av interesse. Pipetter ti føljetong fraksjoner av 490 µL fra toppen av graderingen i de tilsvarende rørene. Det vil være en liten mengde væske gjenværende nederst på røret som sannsynlig inneholder skadelige proteiner. Dette eksemplet kan forkastet eller beholdt som brøk 11 hvis ønskelig.
  9. Måle refractive indekser fraksjoner ved hjelp av en refractometer. Dette kan også utføres med en kontroll gradient kjøre parallelt hvis prøven bevaring er nødvendig. Pipetter 20-30 µL av hver fraksjon som inneholder iodixanol på refractometer overflaten og beregne tettheten ved å sammenligne refractive indeksene til kjente iodixanol tettheter. Vær oppmerksom på at fraksjoner kan lagres over natten i iodixanol inneholder løsningen om nødvendig før du fortsetter til neste ultracentrifugation vask trinn.
  10. Overføre hver fraksjon til et rent 12 mL ultracentrifugation rør. Legg til 5 mL 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) rør og blanding av pipettering langsomt opp og ned.
    Merk: PBS lagt til prøvene skal være partikkel-fri, sikret av filtrering sterilt PBS gjennom filtere 0.22 µm og lagring ved romtemperatur å unngå salt nedbør.
  11. Legge til en ytterligere 6 mL 1 x PBS øverst og bland igjen nøye.
  12. Ultracentrifuge rør på 100.000 x g for 2t 4 ° c til nytt pellets små blemmer. Dekanter nedbryting og trykk rør tørr før lysis av blemmer for protein analyse (trinn 3) eller re-suspensjon av EVs for morfologiske analyse (trinn 5).

3. lysis og Immunoblot bekreftelse av EV proteiner

Merk: Hvis bevaring av hele blemmer morfologiske karakteristikk eller biologisk aktivitet, kan forskere fortsette direkte til trinn 5. I initial eksperimenter eller før massespektrometri analyse, bør alle fraksjoner gjenopprettet analyseres av immunoblot å bekrefte brøker med EV proteiner.

  1. For å lyse EVs for protein analyse, legge til 40 µL av sterk lyseringsbuffer (5% SDS, 10 mM EDTA, 120 mM Tris-HCl pH 6.8, 2,5% 2-mercaptoethanol, 8 M urea) med tillegg av protease hemmer EV pellet i ultracentrifuge tube.
    Merk: Hvis ikke-reduserende forhold er ønsket antistoff deteksjon av proteiner, Erstatt ultrapure vann for 2-mercaptoethanol i sterk lyseringsbuffer.
  2. Sikre komplett re-suspensjon av pellets og lysis av EVs i bufferen ved å plassere parafilm over ultracentrifugation rør, vortexing kraftig, deretter rocking for 20 min ved romtemperatur før en endelig vortex.
  3. Kort sentrifuge 1000 x g for 30-60 s å gjenopprette hele prøven volumet. Overføre prøven til en ny 1,5 mL microcentrifuge rør og butikk på 20 ° C til-80 ° C før videre behandling.
  4. For å forberede renset lysates immunoblot analyse, legge til 5 x Laemmli prøven buffer (10% SDS, 250 mM Tris pH 6.8, 1 mg/mL bromophenol blå, 0,5 M DTT, 50% glyserol, 5% 2-mercaptoethanol) prøver for en siste konsentrasjon av 1 x.
    Merk: Hvis ikke-reduserende forhold er ønskelig, erstatte DTT og 2-mercaptoethanol med ultrapure vann.
  5. Hvis hele vev homogenate kontroller er ønskelig, lyse vevet i den urea-inneholder sterke lyseringsbuffer beskrevet ovenfor med protease inhibitor, deretter sentrifuge 10.000 x g i 10 min å forkaste den gjenværende ekstracellulær matrix, hele celler, eller intakt mobilnettet rusk. Legge til 5 x Laemmli prøven buffer vev homogenate for en siste konsentrasjon av 1 x.
  6. Kok eksempel bufferen som inneholder EV eller vev homogenate eksempler på 95 ° C i 5-10 minutter, deretter laste like volum (fra tilsvarende 0.1-0.3 g starter vev materiale, 1-2 µg renset EV protein) av fraksjoner 1-10 i en 10% SDS side gel. Laste lik masse vev homogenate. Større volum av prøver kanskje behøves for gjenkjenning av mindre sensitive antistoffer.
  7. Fortsett med gel gelelektroforese og Western blot analyse som tidligere detaljert21 å bekrefte EV proteiner i den renset lysates og sammenligne relative EV overflod i fraksjoner.
    Merk: Når EV protein har vist reproduserbar i konsekvent fraksjoner, kan siste ultracentrifugation vask beskrives i trinn 2.12 begrenses til gradient fraksjoner av interesse.

4. EV Protein kvantifisering

  1. Bruk et vaskemiddel - og urea-kompatibel fluorescens-baserte analysen hvis følsom kvantifisering av EV proteiner for videre analyse (se Tabell for materiale). Merk at noen fluorescens-baserte analyser er kompatibel med den bromophenol blå i Laemmli eksempel buffer, tilrettelegge direkte lysis av EV pellet (i trinn 2.12) i denne bufferen foretrekkes.
  2. Hvis nevnte fluorescens-basert protein kvantifisering kit, spot 1 µL av prøve eller standard i minst like på det angitte filter papiret, og fortsette protein kvantifisering i henhold til produsentens instruksjoner.

5. karakterisering av EV morfologi

  1. For å undersøke hele blemmer etter den siste sentrifugering vaske i trinn 2.12, grundig nytt avbryte EV pellet partikkel-gratis 1 x PBS. Lagre EVs på 4 ° C lenger enn en uke før behandling for å unngå fryse-Tin sykluser.
    Merk: Det er gunstig å ha tidligere bekreftet fraksjoner konsekvent inneholder beriket EV protein av immunoblot analyse begrense morfologiske analyser av interesse.
  2. Utføre hydrogenion sporing analyse på hele EV prøver å bestemme konsentrasjonen og størrelsen på blemmer i preparater, som tidligere detaljert22.
  3. Karakterisere EV morfologi og bekrefte størrelse målinger av elektronmikroskop av blemmer, om ønskelig. EM rutenett kan tilberedes fra vesicle suspensjoner følgende trinn 5.123, eller alternativt kan behandles som blokk forberedelser24 fra pellets følgende trinn 2.12.

6. i-gel rensing og Trypsin fordøyelsen for massespektrometri analyse

  1. Hvis karakteristikk av EV proteomes av massespektrometri, laste lik masse (minst 10 µg protein) av brøker som inneholder EVs i en sandsekk polyakrylamid gel å skille og rense proteiner. Leverandørleverte sandsekk gels er foretrukket å redusere konsentrasjonene av forurensende proteiner (f.eks keratin) blir introdusert i prøvene.
  2. Løpe prøven minst 0,5 tommer i polyakrylamid gel for protein rensing, og fikse og flekker med Coomassie fargestoff, som tidligere beskrevet i detalj25.
  3. Skjær banene i 1 mm3 kuber for trypsin fordøyelsen, som tidligere detaljert19,26.
  4. Laste 5 µL av fordøyd peptid prøve til LC--MS-/ MS instrument for separasjon på analytisk kolonne og påfølgende analyse av massespektrometri i henhold til parameterne som er angitt i detalj16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En skjematisk oversikt av vev dissosiasjon, differensial sentrifugering og gradient rensing av blemmer vises i figur 1. Morfologiske og immunophenotypic bekreftelse av forløpning-renset EVs utheves i figur 2. Et diagram av reproduserbar tettheter etter ultracentrifugation på 10-30% iodixanol graderingen vises, med to forskjellige vesicle bestander migrere oppover til del 2 (lett EVs) og del 5 (tett EVs), avhengig av vev type. Representant immunoblots av gradient fraksjoner utstilling effektiv separasjon og rensing av små svulst-avledet EVs i brøkdel 5. Av notatet, lunge svulst prøver dukket beriket i tett EVs sammenlignet med lys EVs (i brøkdel 2) tidligere høstet fra hele hjernevev, igjen uthevet her. Som en global vev analyse av EVs dukke, det vil være interessant å finne ut de forskjellige tettheter på EVs produsert av unike vev. Representant nanoparticle sporing analyser og elektronmikroskop av vev-avledet blemmer i dominerende vesicle inneholder fraksjonen vise berikelse og bevaring av hele blemmer forenlig med den kjente størrelsen og strukturen i liten EVs. Til slutt, Figur 3 høydepunkter nytten av denne metoden å tilrettelegge nedstrøms massespektrometri karakteristikk av forløpning-renset vesicle proteiner, demonstrere deteksjon av mange proteiner tidligere identifisert på liten EVs. Mange av disse identifiserte proteiner er konsistent beriket i små endosomal-avledet EVs tidligere foreslått av Théry og Hill labs17,20.

Figure 1
Figur 1 : Skjematisk oversikt over vesicle isolasjon og rensing fra hele vev. Etter vev dissosiasjon, pre clearing differensial sentrifugering trinn, filtrering og ultracentrifugation, råolje EV pellets kan være resuspended på bunnen av en iodixanol tetthet gradert for floatation separasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Representant morfologiske og immunophenotypic analyse av vev-avledet EVs. (A) beregnet tettheter av iodixanol gradient følgende ultracentrifugation, gjennomsnitt over uavhengige eksperimenter, utheving brøker med lys og tett EVs. (B) representant immunoblots av vev-avledet blemmer demonstrere isolering av hovedsakelig tett svulst EVs og lys hjernen EVs. Vesicle isolerer blir utarmet av ikke-EV protein calnexin. H, vev homogenate. (C) hydrogenion sporing analyse (NTA) av representant forløpning-renset vev EVs. Den minste oppdagede partikkelen i dette eksemplet var 78 nm og omtrent 92% av blemmer oppdaget var 250 nm eller mindre, samsvarer med en høy anriking av små EVs. (D) representant elektronmikroskop bilder av hjernen vev-avledet EVs. Skalere barer = 200 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Sammendrag av merkede vesicle proteiner oppdaget av massespektrometri av en representant vev-avledet EV eksempel. Etter EV utvinning og gradient rensing, 10 µg EV protein i beriket brøkdel ble lastet inn en polyakrylamid gel for gelelektroforese og i-gel trypsin fordøyelsen. I denne representativt vev-avledet EV utvalg, totalt 918 proteiner ble identifisert av LC--MS-/ MS analyse. Peptider ble identifisert, analysert og funnet å være beriket i exosomal, lysosomale, og plasma membran proteiner som beskrevet tidligere16. Her viser vi små EV eller exosomal proteiner i forberedelsene som er beskrevet av Théry og Hill labs17,20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mye vitenskapelig interesse er generert med hensyn til rollene liten EVs spiller i svulst microenvironment og orgel utvikling, modning og funksjon. Total, denne studien gir en optimalisert arbeidsflyt for utvinning av intakt EVs fra hele hjernen eller svulst prøver. Mens her viser vi bare anvendelse av denne teknikken til lunge svulst-avledet EVs, kan denne metoden lett tilpasses for arbeid på andre solid vev, gir muligheter for ytterligere ex vivo karakteristikk av små utskilles blemmer av bred biomedisinsk interesse. Mens du er utenfor omfanget av denne studien, vil fremtidige sammenligning EV innhold som stammer vev uttrykk også være viktig å etablere nytten av isolerte blemmer som vev og sykdom biomarkers.

I studien tidligere publisert av vårt laboratorium, viser vi klart fordelene med floatation-baserte tetthet graderingen over sedimentering gradients rensing av beriket små blemmer. I hovedsak forbedrer en oppdrift-baserte separasjon rensing av blemmer ved å unngå forurensning migrasjon gjennom fraksjoner av interesse. Dette prinsippet vises spesielt viktig når du starter fra komplekse eksempler som hele vev. Uansett, understreke vi viktigheten av pre analytisk bekreftelse studiene i isolerte blemmer beskrevet, inkludert undersøkelse av EV morfologi gjennom komplementære teknikker som elektronmikroskop og hydrogenion sporing analyse, samt som biokjemiske analyser inkludert immunoblotting. EV proteiner i beriket fraksjoner skal bekreftes med minst tre anerkjente EV markører, inkludert en tetraspanin protein, som anbefalt av rapporten, Minimal informasjon for studier av EVs (MISEV) publisert i tidsskriftet av ekstracellulære Blemmer27. En negativ EV markør bør være vist for å være fraværende eller svært redusert med EV brøker sammenlignet vev homogenates. Alle trinnene nevnt ovenfor er avgjørende for kvalitetssikring av små vesicle rensing. I tillegg kan tidlig demonstrasjon av laboratorie - og brukerspesifikke konsekvent EV inneholder tetthet fraksjoner spare verdifull tid og kostnader knyttet til bearbeiding og analyse alle fraksjoner etter tetthet gradert ultracentrifugation trinn.

Det er klart at blemmer fra ulike vev kan flyte litt forskjellig tetthet fraksjoner, eller kan skille i hovedsakelig lys eller tett subpopulasjoner. Disse forskjellene har tidligere vært helt hjerne-avledet EVs sammenlignet EVs høstet fra dendrittiske celler dyrket i kultur16,17, og er videre bevist i denne studien. Vi viser at lunge svulst prøver kan havn hovedsakelig tett liten EVs sammenlignet de lysere EVs isolert fra hjernevev. Disse forskjellene fremhevet av metoden foreslått i denne studien kan fremme verdifulle henvendelser i differensial sammensetningen av EVs, inkludert svulst EVs som kan pakkes med tett DNA tilnærmingene28,29,30. På grunn av disse forskjellene i EV komposisjon understreke vi sterkt betydningen av disse innledende teknisk eksperimenter. Fremtidig bruk av denne teknikken til isolering av EVs fra mangfoldig svulst prøver vil være viktig å finne ut om tett EVs er hovedsakelig utskilles i interstitium av andre svulst typene også.

Mens fullført rensing av små EVs og isolasjon av forskjellige vesicle subpopulasjoner fortsatt en gjeldende begrensning over laboratorier, gir denne metoden grunnlag for videre studier som karakteriserer små blemmer fra et mangfold av vev eller tumor typer, og kan derfor legge til rette en større forståelse av EV mangfold. Siste separasjon av EV partikler av asymmetrisk-flow feltet-flow fraksjoneres har opplyst muligheten for forskjellige Last og funksjoner av liten (60-80 nm) versus større (90-120 nm) exosomes, og videre identifisert et delsett av ikke-membran bundet < 50 nm partikler nominert som "exomeres"31,32. Imidlertid Last pakket i populasjonene unike vesicle variert over linjer, merke den betydelige heterogeniteten utskilles blemmer, og støtter betydningen av omfattende i vitro eller eks vivo vesicle analyse. I denne studien berike vi mest sannsynlig for begge klasser av exosomes identifisert. En andel av små microvesicles med lignende tettheter til exosomes kan finnes i isolerer også. Vi ikke kan utelukke muligheten for exomeres i våre isolerer, var membran-bundet blemmer absolutt mest rikelig i gradient fraksjoner beriket vesicle protein. I tillegg til små EVs, store oncosomes (> 1000 nm) har vært de siste interesse kreft biologer33. Mens protokollen beskrevet i denne studien filtrerer ut blemmer større enn 450 nm, utelukkelse av dette trinnet kan lette undersøkelse av disse større EVs beskrevet. Fremtidige undersøkelse av tettheter forbundet med ulike vesicle subpopulasjoner vil være viktig å skille disse enhetene i tillegg til beskrevet størrelsene.

Til slutt, selv om vi setter pris på begrensninger inkludert kostnadene og tiden knyttet til denne foreslåtte teknikken, vi også erkjenner behovet for strenge grunnleggende metoder å karakterisere vev EVs og å tjene som en sluttproduktet sammenligning for konstant utvikling og mer avanserte metoder i fremtiden. Disse teknologi vil forhåpentligvis lyse mer rask og klinisk-kompatible teknikker for å trekke ut EVs fra medisinsk eller kirurgisk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Richard Nowakowski og Florida State University laboratorium dyr ressurser gir og omsorg for dyr som brukes til å utvikle denne protokollen, ærbødig. Vi takker Xia Liu, Dr. Rakesh Singh og Florida State University translasjonsforskning Science laboratorium for hjelp med massespektrometri arbeidet brukes for nedstrøms vesicle karakterisering, samt FSU biologisk vitenskap tenkelig ressurs anlegg for bruken av elektronmikroskop overføring i denne studien. Til slutt, vi takker Dr. Mandip Sachdeva (Florida A & M University) for donasjon av svulst prøver brukes i utviklingen av denne metoden. Denne studien ble støttet av tilskudd fra Florida Department of Health Ed og Ethel Moore Alzheimers sykdom Research Program til D.G.M. og J.M.O (6AZ11) og National Cancer Institute av National Institutes of Health Award nummer R01CA204621 til D.G.M.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 µm filter VWR 28145-505
12 mL ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 331372
5.5 mL ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 344057
anti-Alix antibody Santa Cruz sc-7129
anti-Calnexin antibody Santa Cruz sc-11397
anti-CD63 antibody Abcam ab59479
anti-CD81 antibody Santa Cruz sc-9158
anti-Flotillin 2 antibody Santa Cruz sc-25507
anti-HSC70 antibody Santa Cruz sc-7298
anti-Syntenin-1 antibody Santa Cruz sc-100336
anti-TSG101 antibody Santa Cruz sc-7964
EZQ protein quantification kit ThermoFisher Scientific R33200
FA-45-6-30 rotor  Eppendorf 5820715006
FEI CM120 Electron Microscope TSS Microscopy
goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) Genetex 27171
HALT phosphatase inhibitor (100x solution) ThermoFisher Scientific 78420
HALT protease inhibitor (100x solution) ThermoFisher Scientific 78438
Hibernate E medium ThermoFisher Scientific A1247601
MLS-50 swinging-bucket rotor Beckman Coulter 367280
NanoSight LM10 Malvern
Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge  Beckman Coulter 393315
Optima XE-100 ultracentrifuge Beckman Coulter A94516
Optiprep Sigma D1556 60% iodixanol in sterile water solution
Q Exactive HF Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific
rabbit anti-goat IgG Genetex 26741
rabbit anti-mouse IgG Genetex 26728
Refracto 30PX (refractometer) Mettler Toledo 51324650
S-4-104 rotor Eppendorf 5820759003
SW 41 Ti swinging-bucket Rotor Beckman Coulter 333790
Tabletop 5804R centrifuge Eppendorf 22623508

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses. Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).
  2. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  3. Howitt, J., Hill, A. F. Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases. Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).
  4. Sardar Sinha, M., et al. Alzheimer's disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers. Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).
  5. Meckes, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).
  6. Meckes, D. G. Exosomal communication goes viral. Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).
  7. Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
  8. Zhang, X., et al. Exosomes in cancer: small particle, big player. Journal of Hematology Oncology. 8, 83 (2015).
  9. Janas, A. M., Sapoń, K., Janas, T., Stowell, M. H. Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).
  10. Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses. Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).
  11. Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  12. Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
  13. Katsiougiannis, S. Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity. Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).
  14. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
  15. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  16. Hurwitz, S. N., et al. An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease. Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).
  17. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
  18. Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space. Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).
  19. Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).
  20. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).
  21. Hurwitz, S. N., et al. CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.κB Signaling. Journal of Virology. 91 (5), (2017).
  22. Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).
  23. Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).
  24. Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
  25. Meckes, D. G. Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).
  26. Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 6, 23978 (2016).
  27. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
  28. Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
  29. Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nature Communications. 2, 180 (2011).
  30. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  31. Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
  32. Zijlstra, A., Di Vizio, D. Size matters in nanoscale communication. Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).
  33. Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. Oncosomes - large and small: what are they, where they came from. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).

Tags

Kreftforskning problemet 144 exosomes ekstracellulære vesicle vev hjernen svulst massespektrometri tetthet gradert ex vivo oncosomes biomarkers
Utvinning av ekstracellulære blemmer fra hele vev
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hurwitz, S. N., Olcese, J. M.,… More

Hurwitz, S. N., Olcese, J. M., Meckes Jr., D. G. Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue. J. Vis. Exp. (144), e59143, doi:10.3791/59143 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter