Summary
Здесь мы предоставляем подробный протокол для изоляции малых внеклеточного везикулы (EVs) от всего тканей, в том числе мозга и опухоли образцов. Этот метод предлагает воспроизводимый метод для извлечения EVs из прочной ткани для дополнительного анализа, ниже по течению.
Abstract
Циркулирующего и интерстициальный малых мембраны прыгните внеклеточного пузырьков (EVs) представляют собой перспективные "мишени" для разработки новых диагностических и прогностических биомаркер анализов и скорее всего служат важными игроками в прогрессировании широкий спектр заболевания. Текущие исследования уделяется характеристике везикулы, выделяется из нескольких клеток и типы тканей для того, чтобы лучше понять роль EVs в патогенезе условий, включая нейродегенеративные, воспаление и рак. Однако глобально последовательную и воспроизводимые методы, чтобы изолировать и очистить везикулы остаются в прогресс. Кроме того едва описаны методы извлечения EVs из прочной ткани ex vivo . Здесь мы предоставляем подробный протокол для извлечения мелких EVs интереса от совершенно свежие или замороженные тканей, в том числе мозга и опухоли образцов, для дальнейшей характеризации. Мы продемонстрировать технологичность этого метода для несколько ниже по течению анализов, включая электронной микроскопии и иммунофенотипических характеристика везикулы, а также количественного масс-спектрометрии белков EV.
Introduction
Малые внеклеточного везикулы (EVs) включают в себя от англ производные exosomes и малых мембраны сарай микровезикулы, которые представляют широкий интерес биомедицинских. Небольшие EVs состоят из гетерогенных населения 50-250 Нм мембраны прыгните везикулы, содержащие биологически активные белки, липиды и нуклеиновых кислот, которые коллективно считается играть важную роль в множество процессов болезни. Продвижение исследований особенно причастны эти пузырьки в нейродегенеративных и прионы расстройств, инфекционные процессы, аутоиммунных или воспалительные условий и роста опухоли и метастазов1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. быстро растущих биомедицинских исследований в значении EVs в патогенезе заболевания параллельных интерес в развитии воспроизводимость и строгие методы для очистки этих пузырьков и изоляции.
Исторической и текущей задачей в EV характеристика была неспособность полностью отделить малых субпопуляций EV. Эта задача во многом из-за нашего ограниченного понимания различных молекулярных механизмов, регулирующих биогенеза отдельных пузырьков. Перекрывающиеся размер, плотность и биологические грузов между субпопуляциями далее convolutes эти различия. Частью этой задачи был также использование широко различные методы обогащения, предоставляя непоследовательность в течению анализе изолированных везикулы лаборатории и подрывает глобальные усилия для освещения категориальной EV населения.
Стоит отметить, что большинство EV характеристика была выполнена в пробирке коллекции клеточной культуры супернатанта, с более недавние исследования в естественных условиях, описывающих методы, чтобы изолировать везикулы из животных или человека жидкости организма, включая плазмы, мочи и слюна. В то время как EVs присутствуют в больших количествах в обращении, она также признала, что эти пузырьки играют важную роль в событиях в ячейке коммуникации и присутствуют в интерстиции клеточных тканей. В контексте рака интерстициальный EVs могут быть особенно важную роль в модуляции микроокружения опухоли раковых клеток посева и метастатический рост14,15. Следовательно есть значение в разработке и оптимизации методов для извлечения пузырьки из прочной ткани образцов. Эти методы будут предоставлять средства непосредственно изучать орган - или опухоль - производные EVs, добываемых из клинических образцов, включая небольшие биопсии и орган полной или частичной резекции.
В этом исследовании и в предыдущем докладе, опубликованном в нашей лаборатории16, мы стремимся решить несколько основных текущих проблем в EV обогащения методологии: 1) для описания воспроизводимый технику, чтобы изолировать и очищают EVs по самым высоким стандартам в настоящее время принятые в этой области; 2) для попытки изолировать малых субпопуляций EV, высоко обогащенный от англ производные exosomes; и 3) представить протокол для извлечения этих везикулы от твердых тканей образцов с целью дальнейшего характеристика.
Недавно Ковал и коллегами описал градиент плотности относительно небольших iodixanol для разделения и очистки EV субпопуляции более эффективно, чем сопоставимые сахарозы плотности градиенты17. В исследовании, цитируется в дендритных клеток, полученных EVs, захвачен в сравнительно малая плотность фракции, в соответствии с плотностью 1,1 г/мл, были высокообогащенного в белки от англ, считается наиболее последовательно с высокой долей exosomes в этом фракция. По мнению авторов эти «bona fide» exosomal белки включены опухоли восприимчивость ген 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 и несколько annexin белков17. Позже мы адаптировали эту технику для достижения успеха метода ткани диссоциации описал Перес Гонсалес et al18 и последующих дифференциального центрифугирования протокол изолировать весь мозг производные EVs16. Мы также продемонстрировали полезность этого метода в характеристике EV протеомов, объединяя последовательный протокол по течению количественное и сравнительного масс-спектрометрии везикулярного белка, ранее описанных в нашей лаборатории19. Эта работа параллельно, что от холма лаборатории, в которой EVs обогатились от лобной коры мозга20.
В этом исследовании мы подробно останавливаться на эту технику и расширить сферу применения протокола, недавно опубликовала от нашей лаборатории для изоляции EVs от опухоли легких твердых. Насколько нам известно это первое исследование, чтобы описать протокол обогатить EVs от ex vivo опухоли образцов. С учетом широкого интереса к EVs как Роман диагностических биомаркеров и их роль в tumorigenesis, этот метод скорее всего окажется ценным для растущего числа научных исследователей. С клинической точки зрения интерстициальный EVs могут гавани диагностики большое значение, особенно в образцах, где ограничена гистологических оценки. Мы надеемся, что метод конспектированный здесь обеспечит основу для воспроизводимых технику урожай EVs из свежих или замороженных животных или человека хирургической образцов, в почву для будущей работы раскрыть существенную роль в патогенезе заболеваний этих малых пузырьки могут играть.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Весь мозг были получены с согласия от правомерного использования животных и уход Комитет (IACUC) государственного университета Флориды. В общей сложности двенадцать мозг мыши (3 мозги из каждой возрастной группы: 2, 4, 6 и 8 месяцев) от C57BL/6 J фона использовались для извлечения EV, как описано выше16. Образцы опухоли легких были щедро подарены д-р Mandip Сачдева под номером официального утверждения Флорида сельскохозяйственных и механических IACUC университета. Опухоли легких были получены от линии клеток человеческого аденокарциномы H1975, выращенных в иммунодефицитных Balb/c ню/ню обнаженная мышей. Данные из двух представительных опухоли реплицирует, выделены в настоящем исследовании.
Примечание: Схематический обзор метода очистки и изоляции везикул приводится на рисунке 1.
1. ткань диссоциации и дифференциального центрифугирования
- Подготовка 10 мл буфера диссоциации (10 мг папаин; 5,5 мм L-цистеин; 67 мкм 2-меркаптоэтанол 1.1 мм ЭДТА) в среде Hibernate-E за примерно 0,4-1,0 г ткани. Обратите внимание, что все решения, используемые для очистки и обогащения EV следует разбавить в сверхчистого фильтрованной воды.
- Добавить все свежие или замороженные ткани диссоциации буфер в 50 мл Конические трубки и инкубировать в теплой воде Ванна при 37 ° C 20 мин ткани могут быть сокращены на более мелкие фрагменты до инкубации при необходимости.
- После инкубации добавьте ингибиторы протеазы и фосфатазы для окончательного 1 x концентрации диссоциации буфер, содержащий ткань.
- Залейте раствор, содержащий ткань в гомогенизатор Dounce свободную подходит и аккуратно отделить ткани, используя около 30 медленно штрихи на сэмпл. Количество ударов может быть скорректирована основе согласованности ткани.
- Передача в отрыве ткани в буфере в 50 мл Конические трубки и центрифуги на 500 x g 5 мин при 4 ° C для пеллет клетки и сплоченной или фиброзной ткани остатки.
- Передать супернатант чистой 50 мл Конические трубки и центрифуги на 2000 x g 10 мин при 4 ° C окатышей и отказаться от большой сотовой мусора.
- Передать супернатант снова чистой 50 мл Конические трубки и центрифуги на 10000 x g 40 мин при 4 ° C для пеллет нежелательных большие пузырьки или небольших apoptotic тела.
Примечание: Это гранулы могут быть сохранены для дополнительного изучения крупных пузырьков при желании. - Декант супернатант через фильтр 0,45 мкм в чистой 12 мл ultracentrifugation.
Примечание: Образцы плотно фиброзных тканей могут быть отфильтрованы не легко. Эти образцы можно фильтруют через стрейнер клеток 40 мкм, а затем прошли через поочередно небольшие иглы (18 G, 20 G, 22 G) до фильтрации через 0.45 мкм фильтром. - Ультрацентрифуги образца на 100,000 x g за 2 ч при 4 ° C до Пелле малых EVs.
- Декант супернатант и оставить ultracentrifugation трубы, Перевернутый для 5-10 мин, часто разговоров для удаления остатков жидкости по бокам трубы. Остаточная жидкость может также быть придыхательным с использованием аспирационных вакуумной пипетки.
- Вновь приостановите EV Пелле в 1,5 мл 0,25 М сахарозы буфера (10 мм трис, рН 7,4). Важно обеспечить полное ресуспендирования гранул в этом шаге. Чтобы сделать это, покрывают трубки с парафина до vortexing EVs в раствор. Рок ультрацентрифуга трубы для 15-20 минут при комнатной температуре до окончательного вихревой микс.
- Кратко центрифуга трубы на скорости не более чем 1000 x g восстановить жидкой суспензии в нижней части трубки.
- Перейти к градиента очистки шагов ниже, или при необходимости хранить EV подвеска на 4 ° C на ночь.
2. плотность градиента очистки
- Добавьте 1,5 мл 60% iodixanol (Стоковый раствор в воде) 1,5 мл сахарозы/трис буфер, содержащий EVs для создания окончательного решения, содержащий 30% iodixanol. Пипетка вверх и вниз несколько раз, чтобы тщательно перемешать раствор. Будьте осторожны, чтобы избежать потери раствора в наконечник пипетки, как концентрация высокой iodixanol довольно вязкой.
- Передача iodixanol 30% буферный раствор, содержащий EVs в нижней части трубки ultracentrifugation 5,5 мл.
- Подготовьте по крайней мере в 1,5 мл 20% и 10% iodixanol решений на сэмпл в ультрачистая вода из 60% iodixanol раствор.
- Мера 1.3 мл 20% iodixanol и тщательно слой поверх нижней градиентного слоя с помощью шприца и иглы 18 G. Чтобы избежать смешивания слоев на плотность интерфейс, держите скос иглы при контакте с внутренней трубки ultracentrifugation чуть выше мениска и добавить решение каплям.
- Слой 1,2 мл раствора 10% iodixanol поверх слоя 20% iodixanol, используя ту же технику, как указано выше.
- Тщательно сбалансировать и загрузить ultracentrifugation трубы в ротор ведра и центрифуги в свинг ведро ротора на 268.000 x g 50 мин при 4 ° C. Установите ускорение и замедление скорости центрифуги минимальные ставки, возможность избежать нарушения плотности слоёв.
- Метка 10 1,5 мл microcentrifuge трубы для каждого образца соответствовать фракций 1 до 10 градиент плотности. Фракция 1 обозначается как верхний фракция, которая будет сначала удалена, в то время как фракция 10 является нижней часть последнего удален.
- После завершения градиента ultracentrifugation, аккуратно удалить трубы из ведра ротора и место в стабильной держателя. Видимый диапазон везикулы часто можно увидеть в долю интереса. Пипетка десяти последовательных фракций 490 мкл от верхней части градиента в соответствующие трубы. Там будет небольшое количество жидкости, оставаясь в нижней части трубки, который вероятно содержит загрязняясь протеины. Этот пример можно отказаться, или при желании сохранить как часть 11.
- Измерьте преломления фракций с использованием рефрактометра. Это может также выполняться с градиентом управления параллельно при необходимости сохранения образцов. Пипетка 20-30 мкл каждой фракции, содержащие iodixanol на поверхность рефрактометр и оценить плотность, сравнивая преломления плотности известных iodixanol. Обратите внимание, что фракции могут храниться на ночь в iodixanol содержащих решение при необходимости перед переходом к следующему шагу мыть ultracentrifugation.
- Передавать каждую долю чистой 12 мл ultracentrifugation. Добавьте 5 мл 1 x фосфат амортизированное saline (PBS; 137 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 10 мм Na2HPO4, 2 мм х2PO4, рН 7,4) трубки и микс, закупорить медленно вверх и вниз.
Примечание: PBS, добавлены образцы должны быть свободной частицы, обеспечивается фильтрации через 0,22 мкм фильтром стерильные PBS и хранения при комнатной температуре, избегать соли осадков. - Добавьте дополнительные 6 мл ПБС в верхней и еще раз тщательно перемешать.
- Ультрацентрифуги трубы на 100,000 x g за 2 ч при 4 ° C до повторного Пелле небольшие пузырьки. Декант супернатант и коснитесь трубы сухой перед lysis пузырьки для анализа белка (шаг 3) или ре подвеска EVs для морфологической анализа (шаг 5).
3. распад и подтверждение Immunoblot EV белков
Примечание: Если сохранение всего везикулы морфологическая характеристика или биологической активности, исследователи могут перейти непосредственно к шагу 5. В первоначальных экспериментов, или перед анализом масс-спектрометрии восстановлены все фракции должны быть проанализированы, immunoblot для подтверждения фракций с EV белков.
- Чтобы лизировать EVs для анализа белка, добавьте 40 мкл буфера lysis сильных (5% SDS, 10 мм ЭДТА, 120 мм трис-HCl рН 6,8, 2,5% 2-меркаптоэтанол, мочевина 8 М) с добавлением ингибитора протеазы EV Пелле в ультрацентрифуга трубки.
Примечание: По желанию-уменьшение условия для обнаружения антител белков замените ультрачистая вода для 2-меркаптоэтанол сильный литического буфера. - Обеспечение полной ресуспендирования гранул и lysis EVs в буфере, поместив парафина ultracentrifugation трубки, vortexing энергично, затем качалки для 20 мин при комнатной температуре до окончательного вихря.
- Кратко центрифуги на 1000 x g за 30-60 s, чтобы восстановить объем всей выборки. Передать образец новой пробки microcentrifuge 1,5 мл и хранить при 20 ° C до-80 ° C до дальнейшей обработки.
- Для подготовки очищенного лизатов immunoblot анализа, добавьте буфер образца 5 x Laemmli (10% SDS, 250 мм трис рН 6,8, 1 мг/мл бромфеноловый синий, 0,5 М DTT, 50% глицерина, 5% 2-меркаптоэтанол) образцы для конечной концентрации 1 x.
Примечание: По желанию-сокращение условий DTT и замените 2-меркаптоэтанол ультрачистая вода. - Если огневки цельной ткани, элементы управления желательны, лизируют ткани в мочевины содержащих сильные буфера lysis подробно выше с ингибитором протеазы, затем центрифуги на 10000 x g за 10 мин отменить оставшиеся внеклеточного матрикса, всей клетки, или нетронутыми сотовой мусора. Добавьте 5 x Laemmli буфер образца ткани огневки для конечной концентрации 1 x.
- Отварить образца буфер, содержащий образцы огневки EV или ткани на 95 ° C за 5-10 мин, а затем загрузить равный объем (от эквивалент 0,1-0,3 г исходный материал ткани; 1-2 мкг очищенный протеин EV) фракций 1-10 в гель SDS-PAGE 10%. Загрузить равные массы ткани огневки. Больший объем пробы могут быть необходимы для обнаружения менее чувствительных антител.
- Как ранее подробные21 для подтверждения EV белков в очищенной лизатов и сравнить относительное изобилие EV в долях приступайте электрофорез геля и Западный анализ помаркой.
Примечание: Как только EV белка была продемонстрирована можно воспроизвести в соответствии фракций, окончательный ultracentrifugation мыть, описанные в шаге 2.12 может быть ограничена градиента фракций интерес.
4. EV белка количественная оценка
- Используйте моющее средство - и мочевина совместимые пробирного на основе флуоресценции чувствительных количественная оценка EV белков по желанию для дальнейшего анализа (см. Таблицу материалы). Обратите внимание, что некоторые анализы на основе флуоресценции совместимы с бромфеноловый синий, присутствующих в буфер Лэмли образца, содействия прямой lysis EV Пелле (в шаг 2.12) в этом буфере, если предпочтительный.
- Если используется комплект количественной оценки вышеупомянутых на основе флуоресценции белков, пятно 1 мкл пример или стандарта в по крайней мере дублировать на предоставленный фильтровальная бумага и продолжить белка количественной оценки согласно инструкциям производителя.
5. характеристика EV морфология
- Для изучения всего везикулы, после окончательного центрифугирования мыть в 2.12 шаг, тщательно вновь приостановите EV Пелле в свободной частицы ПБС. EVs хранить при 4 ° C не более чем за одну неделю до обработки избежать циклов замораживания оттаивания.
Примечание: Это полезно для ранее подтвердили дроби последовательно содержащие обогащенный белком EV immunoblot анализ ограничить морфологический анализ фракций интерес. - Выполнение отслеживания анализа всего EV образцов для определения концентрации и размер пузырьков в подготовке, как ранее подробные22наночастиц.
- Характеризуют EV морфологии и подтвердить размер измерения электронной микроскопии везикулы, при желании. ЕТ сетки могут быть получены из везикул суспензий после шаг 5.123, или в качестве альтернативы могут быть обработаны как блок подготовки24 из окатышей, следуя шаг 2.12.
6. в гель пищеварения трипсина и очистка для анализа масс-спектрометрии
- Если характеристика EV протеомов по масс-спектрометрии, загрузите равные массы (по крайней мере 10 мкг белка) фракций, содержащих EVs в сборных полиакриламидный гель для разделения и очистки белков. Поставляется производитель сборных гели предпочтительны для снижения уровня потенциальных загрязняющих белков (например, кератин) внедряется в образцы.
- Запуск образца по крайней мере 0,5 дюйма в полиакриламидный гель для очистки белков, затем исправить и пачкает краской Кумасси, как описано в деталях25.
- Нарежьте полосы 1 мм3 кубов для переваривания трипсином, как ранее подробные19,26.
- Загрузка 5 мкл переваривается пептид образца в LC-MS/MS инструмент для разделения на аналитической колонки и последующего анализа по масс-спектрометрии в зависимости от параметров, указанных в деталях16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схематический обзор ткани диссоциации, дифференциального центрифугирования и градиента очистки везикулы отображается на рисунке 1. Морфологическая и иммунофенотипических подтверждения градиент очищенная EVs выделяется на рисунке 2. Диаграмма воспроизводимые после ultracentrifugation 10-30% iodixanol градиента плотности показано, с двух популяций отдельных пузырьков, переход вверх к фракции 2 (свет EVs) и фракция 5 (плотной EVs), зависит от типа ткани. Представитель иммуноблотов градиент фракций демонстрируют эффективное разделение и очистка небольшой опухоли производные EVs в часть 5. Следует отметить образцы опухоли легких, появился обогащенный в плотных EVs, по сравнению с свет EVs (в часть 2) ранее найденным весь мозговой ткани, вновь подчеркнули здесь. Как анализ глобальных ткани EVs возникают, это будет интересно для определения различных плотностей EVs производства уникальных тканей. Представитель наночастиц отслеживания анализа и электронной микроскопии ткани производные везикулы в преобладающей везикул содержащие фракции продемонстрировать обогащения и сохранения всего везикулы в соответствии с известной размер и структура малые EVs. Наконец Рисунок 3 подчеркивает полезность этого метода в содействии характеристика течению масс-спектрометрии белков градиент очищенная везикул, демонстрируя обнаружение многих белков, ранее определенных в небольших EVs. Многие из этих определенных белков согласуются с теми обогащенный в небольших от англ производные EVs, ранее предложенный Théry и Хилл лаборатории17,20.
Рисунок 1 : Схематичный обзор везикул изоляция и очищение от всей ткани. После ткани диссоциации, шаги дифференциального центрифугирования предварительной очистки, фильтрации и ultracentrifugation, сырой EV гранулы могут высокомобильна в нижней части iodixanol градиент плотности для размещения отделения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Представитель морфологических и иммунофенотипических анализ тканей, полученных EVs. (A) расчет плотности градиента ниже ultracentrifugation iodixanol, усредненная за независимых экспериментов, подчеркнув фракций, содержащих легких и плотных EVs. (B) представитель иммуноблотов тканей производные везикулы, демонстрируя изоляции преимущественно плотная опухоль EVs и свет мозга EVs. Изоляты везикул истощены из-EV белка calnexin. H, ткани огневки. (C) наночастиц, отслеживание анализ (НТА) представитель градиент очищенная ткани EVs. Наименьший обнаруженных частиц в этом образце была 78 Нм и примерно 92% везикулы обнаружены были 250 Нм или меньше, в соответствии с высоким обогащения мелких EVs. (D) представитель электронной микроскопии изображений мозга ткани производные EVs. Масштаб баров = 200 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Резюме выделенной везикул белков определяется масс-спектрометрии представителя образец ткани производные EV. После извлечения EV и градиента очистки 10 мкг белка EV в обогащенных фракции был загружен в геле полиакриламида для электрофореза и пищеварение трипсина в гель. В этом репрезентативной выборки ткани, полученных на EV в общей сложности 918 белков были определены путем анализа LC-MS/MS. Пептиды были определены, проанализированы и нашли обогатиться в плазматической мембране белков и exosomal, лизосомных, как описано выше16. Здесь мы продемонстрировать наличие небольших EV или exosomal белков в наших препаратов, которые были описаны в Théry и Хилл лаборатории17,20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Гораздо научный интерес был создан относительно роли, которую малые EVs играть микроокружения опухоли, а также в орган развития, созревания и функции. В целом это исследование обеспечивает оптимизированный рабочий процесс для извлечения нетронутыми EVs от весь мозг или образцы опухоли. Хотя здесь мы просто продемонстрировать применимость этой техники к производным опухоли легких EVs, этот метод может быть легко адаптирована для работы на других твердых тканей, обеспечивая возможности для дальнейших ex vivo характеристики малых секретируемые пузырьки, которые биомедицинских широкий интерес. Хотя рамки этого исследования, будущего сравнения содержания EV, происходящих ткани выражение также будет важно установить Утилита изолированных везикулы как ткани и болезней биомаркеров.
В исследовании, ранее опубликованные в нашей лаборатории мы наглядно демонстрируют преимущества градиента на основе размещения плотность седиментации градиентов для очистки обогащенного мелких пузырьков. По существу на основе плавучести разделения улучшает очистки везикулы, избегая миграции загрязняющих веществ через фракций интерес. Этот принцип появляется особенно важно, когда начиная с сложных проб как цельной ткани. Несмотря на это мы подчеркиваем важность подтверждения предварительного аналитического исследования изолированных везикулы описал, включая изучение морфологии EV через дополнительные методы электронной микроскопии и наночастиц, отслеживания анализа, а также как биохимические анализы, включая immunoblotting. EV белков обогащенного фракций должны быть подтверждены по меньшей мере три признанных EV маркерами, включая одну tetraspanin белка, как рекомендовано в докладе Минимальной информации для исследования EVs (MISEV) опубликовал в журнале внеклеточного Везикулы27. Отрицательный EV маркера должна быть продемонстрирована отсутствует или весьма ограниченной в EV фракций по сравнению с ткани гомогенатах. Все шаги говорилось выше имеют решающее значение для обеспечения качества очистки небольших пузырьков. Кроме того начале демонстрации конкретных лабораторных и пользователем последовательности в EV-содержащих плотности фракций может сэкономить драгоценное время и затраты, связанные с обработкой и анализом всех фракций после шага градиентного ultracentrifugation плотность.
Ясно, что пузырьки из различных тканей может плавать немного различной плотности фракций, или может разделить преимущественно легкий или плотный субпопуляции. Эти различия были ранее видели в целом EVs мозга, полученных по сравнению с EVs, добываемых из дендритных клеток, выращиваемых в культуре16,17и подтверждается в настоящем исследовании. Мы покажем, что образцы опухоли легких могут гавани преимущественно густой малых EVs по сравнению с светлее EVs, изолированных от мозговой ткани. Эти различия, отмеченные метод, предложенный в этом исследовании может способствовать ценным расследование дифференцированный состав EVs, включая EVs опухоли, которые могут быть упакованы с плотной ДНК пряди28,29,30. Из-за этих различий в составе EV мы решительно подчеркиваем важность этих первоначальных технических экспериментов. Важно определить, являются ли плотной EVs преимущественно выделяется в интерстиции других типов опухолей, а также будет будущее применение этой техники к изоляции EVs от опухоли различных образцов.
Хотя полная очистка малых EVs и изоляции отдельных пузырьков субпопуляций остается ограничение тока через лаборатории, этот метод обеспечивает основу для дальнейших исследований характеризовать небольшие пузырьки из различных тканей или опухоль типы и поэтому может способствовать более глубокому пониманию разнообразия EV. Последние разделение частиц EV путем фракционирования поля потока асимметричного потока имеет освещенные функции малых (60-80 Нм) и возможности различных грузов по сравнению с более exosomes (90-120 Нм) и далее определила подмножество non мембраной граница < 50 Нм частицы называются «exomeres»31,32. Однако грузов, упакованных в популяциях этих уникальных везикул различных клеточных линий, отметив значительный неоднородность секретируемые везикулы и поддерживая важное значение всеобъемлющей в пробирке или ex vivo везикул анализа. В этом исследовании мы скорее обогатить для обоих классов определены exosomes. Доля малых микровезикулы с аналогичными плотностью до exosomes могут присутствовать в изоляты также. Хотя мы не можем исключать возможность exomeres в нашем изолятов, мембрана прыгните везикулы безусловно наиболее изобиловал градиента фракций, обогащенный белком пузырьки. В дополнение к небольшой EVs, большой oncosomes (> 1000 Нм) были недавно интерес для рака биологи33. В то время как протокол описанные в это исследование отфильтровывает везикулы больше чем 450 Нм, исключение этого шага может облегчить изучение этих больших EVs описал. Будущие обследования плотностей, связанные с различных субпопуляций везикул будет важно различать эти сущности в дополнение к их описанных размеров.
Наконец хотя мы ценим ограничения, включая стоимость и время, связанные с этой предлагаемой техники, мы также признаем необходимость строгого фундаментальные методы характеризуют ткани EVs и служить в качестве конечного продукта сравнение для постоянно развивается и более сложные методы в будущем. Надеюсь, эти продвижения технологий загорается более быстрое и клинически совместимые технологии для извлечения EVs из медицинских или хирургических образцов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят д-р Ричард Новаковский и Флорида государственного университета лабораторных животных ресурсов для предоставления и заботы о животных, используемых для разработки этого протокола, с уважением. Мы благодарим Лю ся, доктор Ракеш Сингх и Флорида государственного университета трансляционная научная лаборатория для помощи с работой масс-спектрометрии для вниз по течению везикул характеристик, а также БСС биологических наук Imaging ресурсов Фонда для Использование просвечивающий электронный микроскоп в этом исследовании. Наконец мы благодарим д-р Mandip Сачдева (Флорида A & M университет) за пожертвование в размере опухоли образцов, используемых в разработке этого метода. Это исследование было поддержано грантов от Флорида Департамента здравоохранения Эд и Этель Мур Альцгеймера болезнь исследовательской программы награждены D.G.M. и J.M.O (6AZ11) и национального института рака национальных институтов здоровья под номером премии Вручена D.G.M. R01CA204621
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm filter | VWR | 28145-505 | |
| 12 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| 5.5 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| anti-Alix antibody | Santa Cruz | sc-7129 | |
| anti-Calnexin antibody | Santa Cruz | sc-11397 | |
| anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| anti-CD81 antibody | Santa Cruz | sc-9158 | |
| anti-Flotillin 2 antibody | Santa Cruz | sc-25507 | |
| anti-HSC70 antibody | Santa Cruz | sc-7298 | |
| anti-Syntenin-1 antibody | Santa Cruz | sc-100336 | |
| anti-TSG101 antibody | Santa Cruz | sc-7964 | |
| EZQ protein quantification kit | ThermoFisher Scientific | R33200 | |
| FA-45-6-30 rotor | Eppendorf | 5820715006 | |
| FEI CM120 Electron Microscope | TSS Microscopy | ||
| goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) | Genetex | 27171 | |
| HALT phosphatase inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78420 | |
| HALT protease inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78438 | |
| Hibernate E medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| MLS-50 swinging-bucket rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
| NanoSight LM10 | Malvern | ||
| Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Optima XE-100 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Optiprep | Sigma | D1556 | 60% iodixanol in sterile water solution |
| Q Exactive HF Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | ||
| rabbit anti-goat IgG | Genetex | 26741 | |
| rabbit anti-mouse IgG | Genetex | 26728 | |
| Refracto 30PX (refractometer) | Mettler Toledo | 51324650 | |
| S-4-104 rotor | Eppendorf | 5820759003 | |
| SW 41 Ti swinging-bucket Rotor | Beckman Coulter | 333790 | |
| Tabletop 5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 |
References
- Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses. Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- Howitt, J., Hill, A. F. Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases. Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).
- Sardar Sinha, M., et al. Alzheimer's disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers. Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).
- Meckes, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).
- Meckes, D. G. Exosomal communication goes viral. Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).
- Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
- Zhang, X., et al. Exosomes in cancer: small particle, big player. Journal of Hematology Oncology. 8, 83 (2015).
- Janas, A. M., Sapoń, K., Janas, T., Stowell, M. H. Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).
- Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses. Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).
- Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
- Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
- Katsiougiannis, S. Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity. Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Hurwitz, S. N., et al. An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease. Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
- Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space. Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).
- Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).
- Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).
- Hurwitz, S. N., et al. CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.κB Signaling. Journal of Virology. 91 (5), (2017).
- Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).
- Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
- Meckes, D. G. Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).
- Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 6, 23978 (2016).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
- Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nature Communications. 2, 180 (2011).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
- Zijlstra, A., Di Vizio, D. Size matters in nanoscale communication. Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).
- Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. Oncosomes - large and small: what are they, where they came from. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).
