Summary
Presentamos un protocolo detallado para aislar pequeñas vesículas extracelulares (EVs) de tejidos todo, incluyendo a muestras de cerebro y del tumor. Este método ofrece una técnica reproducible para extraer EVs de tejido sólido para mayores análisis aguas abajo.
Abstract
Intersticiales y circulantes unida a la membrana extracelulares vesículas pequeñas (EVs) representan un objetivo prometedor para el desarrollo de ensayos de nuevos biomarcadores diagnóstico o pronóstico y probablemente servir como actores importantes en la progresión de un vasto espectro de enfermedades. La investigación actual se centra en la caracterización de las vesículas segregadas de múltiples células y tipos de tejidos con el fin de mejor comprender el papel de EVs en la patogenia de condiciones incluyendo neurodegeneración, inflamación y cáncer. Sin embargo, globalmente consistente y reproducibles técnicas para aislar y purificar las vesículas permanecen en progreso. Por otra parte, apenas se describen los métodos de extracción de EVs de tejidos sólidos ex vivo . Presentamos un protocolo detallado para extraer pequeños EVs de interés de tejidos entero frescos o congelados, incluyendo a muestras de cerebro y tumor, para mayor caracterización. Demostramos la capacidad de adaptación de este método para múltiples análisis aguas abajo, incluyendo microscopía electrónica y caracterización de immunophenotypic de vesículas, así como cuantitativo spectrometry total de proteínas de EV.
Introduction
Pequeñas vesículas extracelulares (EVs) incluyen exosomas derivados de endosomal y microvesículas de membrana-arrojan pequeñas que son de amplio interés biomédico. EVs pequeño están compuestos por una heterogénea población de vesículas de membrana-limite 50-250 nm que contiene las proteínas biológicamente activas, lípidos y ácidos nucleicos que colectivamente se cree que desempeñan un papel importante en multitud de procesos de la enfermedad. Avance de la investigación ha implicado especialmente estas vesículas en neurodegenerativas y trastornos del prión, procesos infecciosos, condiciones autoinmunes o inflamatorias y el crecimiento del tumor y metástasis1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Investigación Biomédica de rápido crecimiento en la importancia de los vehículos eléctricos en la patogénesis de la enfermedad ha generado un interés paralelo en el desarrollo de métodos reproducibles y riguroso para el aislamiento y purificación de estas vesículas.
Un desafío histórico y actual en EV caracterización ha sido la imposibilidad de separar totalmente pequeñas subpoblaciones de EV. Este reto es en gran parte debido a nuestra limitada comprensión de los diferentes mecanismos moleculares que rigen la biogénesis de diferentes vesículas. Superposición de tamaño, densidad y carga biológica entre subpoblaciones más convolutes estas distinciones. Parte de este reto ha sido también el uso de ampliamente diferentes técnicas de enriquecimiento, proporciona inconsistencia en posteriores análisis de vesículas aisladas en laboratorios y socavando los esfuerzos mundiales para iluminar poblaciones EV categóricas.
Cabe destacar que la mayoría de los EV caracterización se ha realizado de la colección in vitro de cultivo celular sobrenadante, con estudios in vivo más recientes que describen técnicas para aislar las vesículas de fluidos corporales de animales o humanos, incluyendo plasma, orina y la saliva. Mientras que EVs están presente en grandes cantidades en circulación, también reconoció que estas vesículas desempeñan papeles importantes en eventos de comunicación célula a célula y están presentes en el intersticio de los tejidos celulares. En el contexto de cáncer, EVs intersticiales pueden ser particularmente importantes en la modulación del microambiente tumoral para el cáncer siembra y crecimiento metastático14,15. Por lo tanto, es valor en el desarrollo y optimización de técnicas para extraer las vesículas de muestras de tejidos sólidos. Estos métodos proporcionarán un medio directamente estudiar órgano - o tumor derivado de EVs de muestras clínicas, incluyendo pequeñas biopsias y resecciones parcial o total del órgano.
En este estudio y en un informe anterior publicado por nuestro laboratorio16, apuntamos a las preocupaciones de varios principales actuales en la metodología del enriquecimiento de EV: 1) para describir una técnica reproducible para aislar y purificar EVs a los más altos estándares en la actualidad aceptado en el campo; 2) para intentar aislar pequeñas subpoblaciones EV altamente enriquecidas en exosomas derivados de endosomal; y 3) para proporcionar un protocolo para la extracción de estas vesículas de muestras de tejido sólido con el fin de más caracterización.
Recientemente, Kowal y colegas describieron un gradiente de densidad de iodixanol relativamente pequeños para separar y purificar EV subpoblaciones con mayor eficacia que el de gradientes de densidad de sacarosa comparable17. En el estudio citado, EVs derivados de células dendríticas capturadas en una fracción de densidad relativamente constante con una densidad de 1,1 g/mL, fueron altamente enriquecidos en proteínas endosomal creídas que es más consistente con una alta proporción de exosomas presente en este fracción. Según los autores, estas proteínas de "buena fe" exosomal incluyen el gen de susceptibilidad tumoral 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 y varias de las proteínas anexina17. Hemos adaptado más adelante esta técnica para tener éxito un método de la disociación del tejido descrito por Perez-Gonzalez et al18 y un protocolo posterior centrifugación diferencial para aislar todo derivado del cerebro EVs16. También hemos demostrado la utilidad de este método en la caracterización de proteomas EV combinando un protocolo secuencial descendente espectrometría cuantitativa y comparativa de proteína vesicular, descrita previamente por nuestro laboratorio19. Este trabajo en paralelo desde el laboratorio de Hill, en el cual se enriquecieron EVs de la corteza frontal del cerebro20.
En este estudio, elaborar sobre esta técnica y ampliar la aplicación del protocolo recientemente publicado de nuestro laboratorio para el aislamiento de EVs de tumores sólidos de pulmón. A nuestro conocimiento, éste es el primer estudio que describe un protocolo para enriquecer EVs de ex vivo especímenes de tumor. Dado el interés generalizado en EVs como nuevos biomarcadores diagnóstico y su papel en la tumorigénesis, este método probablemente resultará valioso para un número creciente de investigadores científicos. Desde una perspectiva clínica, EVs intersticiales podrían albergar gran valor diagnóstico, especialmente en muestras donde se limita la evaluación histologic. Nuestra esperanza es que el método descrito aquí proporcionará una base para una técnica reproducible cosecha EVs de frescos o congelados animales o humanos especímenes quirúrgicos, allanando el camino para el trabajo futuro a descubrir el importante papel en la patogénesis de la enfermedad estos pequeños las vesículas pueden jugar.
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Protocol
Cerebro entero se obtuvieron con la aprobación del uso Animal institucional y Comité de cuidado (IACUC) de la Universidad Estatal de Florida. Un total de doce cerebros de ratón (3 cerebros de cada grupo de edad: 2, 4, 6 y 8 meses) de un J C57BL/6 fondo fueron utilizados para la extracción de EV, como se describió anteriormente16. Especímenes de tumor de pulmón fueron generosamente donados por Dr. Mandip Sachdeva bajo aprobación de Florida agrícola y mecánica de la Universidad de IACUC. Tumores pulmonares se derivan de la línea celular de adenocarcinoma humano H1975 en ratones nude de inmunodeficientes Balb/c nu/nu. Datos de dos repeticiones de tumor representativas se destacan en este estudio.
Nota: Una descripción esquemática del método de aislamiento y purificación de vesícula se proporciona en la figura 1.
1. tejido disociación y centrifugación diferencial
- Preparar 10 mL de tampón de disociación (10 mg de papaína 5,5 mM de L-cisteína 67 μm 2-Mercaptoetanol; 1,1 mM EDTA) en medio de Hibernate-E por aproximadamente 0.4-1.0 g de tejido. Tenga en cuenta que todas las soluciones utilizadas para la purificación y enriquecimiento de EV deben ser diluidas en agua ultrapura de filtrado.
- Añadir tejido entero fresco o congelado a buffer de disociación en un tubo cónico de 50 mL e incubar en un agua caliente baño María a 37 ° C durante 20 min tejido se puede cortar en fragmentos más pequeños antes de la incubación si es necesario.
- Después de la incubación, añadir inhibidores de proteasa y fosfatasa para una concentración final de 1 x en el búfer de disociación que contiene el tejido.
- Vierta la solución que contiene el tejido en un homogeneizador de Dounce suelta de ajuste y disociar suavemente el tejido usando aproximadamente 30 movimientos lentos por muestra. El número de trazos puede ajustarse en base a la consistencia del tejido.
- Tejido de transferencia disociada en tampón a un tubo cónico de 50 mL y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 ° C para que sedimenten las células y los restantes fragmentos de tejido fibroso o cohesivo.
- Transferir el sobrenadante a un tubo cónico de 50 mL limpio y centrifugar a 2.000 x g por 10 min a 4 ° C de la pelotilla y desechar detritos celulares grandes.
- Transferir nuevamente el sobrenadante a un tubo cónico de 50 mL limpio y centrifugar a 10.000 x g durante 40 min a 4 ° C para que sedimenten las vesículas más grandes no deseadas o cuerpos apoptóticos pequeño.
Nota: Este pellet puede guardarse para un estudio adicional de vesículas más grandes si se desea. - Decantar el sobrenadante con filtro 0.45 μm en un tubo de 12 mL limpia ultracentrifugación.
Nota: Las muestras de tejido denso fibrótico pueden no fácilmente filtradas. Estas muestras pueden ser filtradas a través de un tamiz de célula 40 μm, luego pasa a través de agujas pequeñas en serie (18 G, 20 G, 22 G) antes de pasar el filtro de 0.45 μm. - Ultracentrífuga la muestra a 100.000 x g durante 2 h a 4 ° C para que sedimenten EVs pequeño.
- Decantar el sobrenadante y dejar los tubos de ultracentrifugación invertidos durante 5-10 min., aprovechando con frecuencia para eliminar el líquido residual en los lados de los tubos. Líquido residual se puede aspirar con una aspiración vacío pipeta.
- Vuelva a suspender los pellets de EV en 1,5 mL de tampón de sucrosa de 0.25 M (10 mM Tris, pH 7.4). Es importante asegurar la completa resuspensión de la pelotilla en este paso. Para ello, cubra los tubos con parafilm antes Vortex EVs en solución. Los tubos de la ultracentrífuga durante 15-20 min a temperatura ambiente antes de una mezcla final de vórtice de la roca.
- Brevemente centrifugar los tubos a una velocidad no mayor de 1.000 x g para recuperar la suspensión líquida en la parte inferior del tubo.
- Continúe con los pasos de purificación gradiente abajo, o si es necesario, almacenar EV suspensión a 4 ° C durante la noche.
2. purificación de gradiente de densidad
- Añadir 1,5 mL de iodixanol 60% (solución stock en agua) en el búfer de sacarosa/Tris de 1,5 mL conteniendo EVs para crear una solución final que contiene 30% iodixanol. Pipeta para arriba y abajo varias veces para homogeneizar la solución. Tenga cuidado para evitar perder la solución en la punta de la pipeta, como el iodixanol alta concentración es bastante viscosa.
- Transferir la solución de tampón 30% iodixanol con EVs para la parte inferior de un tubo de ultracentrifugación de 5,5 mL.
- Preparar por lo menos 1,5 mL de soluciones de iodixanol 20% y 10% por ejemplo en agua ultrapura de la 60% iodixanol solución.
- Miden 1,3 mL de 20% iodixanol y cuidadosamente capa sobre la capa de degradado de fondo usando una jeringa y una aguja de 18 G. Para evitar mezclar las capas en la interfaz de densidad, mantener el bisel de la aguja en contacto con el interior del tubo de ultracentrifugación justo por encima del menisco y añadir la solución gota a gota.
- Capa de 1,2 mL de solución 10% iodixanol encima de la capa de iodixanol 20% usando la misma técnica que el anterior.
- Cuidadosamente el balance y cargar los tubos de ultracentrifugación en cubos de rotor y centrífuga de un rotor de columpio-cubo a 268.000 x g por 50 min a 4 ° C. Establecer las velocidades de aceleración y deceleración de la centrífuga en los tipos mínimos permitidos para evitar la interrupción de las capas de densidad.
- Etiqueta de diez tubos de microcentrífuga de 1,5 mL para cada muestra que corresponden a fracciones de 1 a 10 de la gradiente de densidad. Fracción 1 se designa como la fracción superior que primero desaparecerá, mientras que la fracción 10 es la fracción de fondo último eliminada.
- Una vez terminada la ultracentrifugación en gradiente, suavemente Quite los tubos de los cubos de rotor y coloque en un soporte estable. A menudo se verá una visible banda de vesículas en la fracción de interés. Pipetear 10 fracciones seriales de 490 μl de la parte superior del gradiente en los tubos correspondientes. Habrá una pequeña cantidad de líquido restante en la parte inferior del tubo que contiene probablemente proteínas contaminantes. Esta muestra puede ser descarta, o conservada como fracción 11 si lo desea.
- Medir los índices de refracción de fracciones utilizando un refractómetro. Esto también puede realizarse con un gradiente de control ejecutar en paralelo si es necesario la conservación de la muestra. Pipetear 20-30 μl de cada fracción contiene iodixanol sobre la superficie del refractómetro y estimar la densidad mediante la comparación de los índices de refracción para densidades de iodixanol conocido. Tenga en cuenta que fracciones se pueden almacenar durante la noche en la solución que contiene iodixanol si es necesario antes de proceder a la siguiente etapa de lavado de ultracentrifugación.
- Transfiera cada fracción al tubo limpio 12 mL de ultracentrifugación. Añadir 5 mL de 1 x solución salina con tampón fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM de Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) para el tubo y mezclar mediante pipeteo lentamente arriba y abajo.
Nota: PBS ha añadido a las muestras debe estar libre de partículas, garantizada por filtrado de PBS estéril a través de un filtro de 0,22 μm y almacenar a temperatura ambiente para evitar la precipitación de sales. - Añadir un adicional 6 mL de 1 x PBS a la parte superior y otra vez la mezcla con cuidado.
- Ultracentrífuga los tubos a 100.000 x g durante 2 h a 4 ° C para volver a pellets pequeñas vesículas. Decantar el sobrenadante y toque los tubos secos antes de lisis de vesículas para análisis de proteínas (paso 3) o re-suspensión de los vehículos eléctricos para análisis morfológico (paso 5).
3. lisis y confirmación del Immunoblot de proteínas EV
Nota: Si se desea la preservación de todas vesículas para la caracterización morfológica o actividad biológica, los investigadores pueden proceder directamente al paso 5. En los experimentos iniciales, o antes de análisis de espectrometría de masas, deben analizarse todas aquellas fracciones recuperadas por el immunoblot para confirmar fracciones con proteínas de la EV.
- Para lyse EVs para análisis de proteínas, añadir 40 μl de tampón de lisis fuerte (5% SDS, 10 mM EDTA, 120 mM Tris-HCl pH 6.8, 2.5% 2-Mercaptoetanol, urea de 8 M) con la adición de inhibidor de la proteasa a pellet de EV en tubo de ultracentrífuga.
Nota: Si las condiciones no reductoras se desean para la detección de anticuerpos de proteínas, sustituir agua ultrapura para el 2-Mercaptoetanol en el buffer de lisis fuerte. - Asegurar la completa resuspensión del pellet y lisis de EVs en tampón colocando parafilm sobre la ultracentrifugación tubo Vortex vigorosamente, luego mecer por 20 min a temperatura ambiente antes de un vórtice final.
- Centrifugar brevemente a 1.000 x g durante 30-60 s para recuperar el volumen de la muestra entera. Transferir la muestra a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL y conservar a-20 ° C a-80 ° C hasta el procesamiento posterior.
- Preparación purificada lisados para el análisis de immunoblot, añadir 5 x Laemmli el tampón de muestra (10% SDS, 250 mM Tris pH 6.8, azul de bromofenol de 1 mg/mL 0,5 M TDT, glicerol 50%, 5% 2-Mercaptoetanol) para las muestras a una concentración final de 1 x.
Nota: Si se desean que las condiciones no reductoras, reemplace la TDT y 2-Mercaptoetanol con agua ultrapura. - Si todo tejido homogeneizado se desean que los controles, lisar el tejido en la urea que contiene fuerte tampón de lisis detallado arriba con inhibidor de la proteasa, luego centrifugar a 10.000 x g por 10 min, descartar el resto matriz extracelular, las células enteras, o detritos celulares intactas. Añadir 5 x Laemmli tampón para el homogeneizado de tejido para una concentración final de 1 x.
- Hervir el tampón de muestra que contiene muestras de homogeneizado de tejido o EV a 95 ° C durante 5-10 min., luego un volumen igual de la carga (desde el equivalente de 0,1 a 0,3 g de a partir de material tejido, 1-2 μg de la proteína purificada de EV) de fracciones 1-10 en un gel de SDS-PAGE 10%. Carga igual masa de tejido homogeneizado. Mayor volumen de muestras puede ser necesaria para la detección de anticuerpos menos sensibles.
- Proceda con el análisis de Western blot y electroforesis en gel de anteriormente detallada21 para confirmar las proteínas de la EV en los lisados purificadas y comparar la abundancia relativa de la EV en fracciones.
Nota: Una vez que la proteína EV ha demostrado reproducible en fracciones constantes, el lavado de ultracentrifugación final descrito en paso 2.12 puede limitarse a gradiente fracciones de interés.
4. EV cuantificación de proteína
- Utilizar un análisis basado en la fluorescencia compatibles con detergente y urea si sensible cuantificación de proteínas de EV es deseada para su posterior análisis (véase Tabla de materiales). Tenga en cuenta que algunos ensayos de fluorescencia son compatibles con el azul de bromofenol en Tampón Laemmli, facilitando la lisis directa de la pelotilla de EV (en paso 2.12) en este tampón si se prefiere.
- Si se utiliza el kit de cuantificación de dicha proteína de fluorescencia, punto 1 μl de muestra o estándar en por lo menos duplicar en el papel filtro siempre y seguir cuantificación de proteína según las instrucciones del fabricante.
5. Caracterización de la morfología de EV
- Para examinar todo vesículas después de la centrifugación final lavado en paso 2.12, cuidadosamente vuelva a suspender EV sedimento en partícula-libre 1 x PBS. Tienda de EVs a 4 ° C durante no más de una semana hasta el procesamiento para evitar ciclos de congelación-descongelación.
Nota: Es beneficioso que previamente han confirmado constantemente que contiene proteína EV enriquecida por el análisis de immunoblot para limitar el análisis morfológicos a fracciones de interés fracciones. - Realizar nanopartículas seguimiento análisis sobre todo muestras de EV para determinar la concentración y tamaño de las vesículas en preparaciones, como anteriormente detallada22.
- Caracterizar la morfología de EV y confirmar las mediciones de tamaño por microscopia electrónica de las vesículas, si lo desea. Rejillas de EM se pueden preparar de suspensiones de vesícula después paso 5.123, o alternativamente pueden procesarse como bloque preparados24 de pellets siguiendo paso 2.12.
6. en gel de purificación y digestión de la tripsina para el análisis de espectrometría de masas
- Si se desea caracterización de proteomas de EV por espectrometría de masa, carga igual masa (por lo menos 10 μg de proteína) de las fracciones que contienen EVs en un gel de poliacrilamida prefabricado para separar y purificar las proteínas. Geles premoldeados suministrado fabricante son las preferidas para reducir los niveles de proteínas (por ejemplo, queratina) en las muestras de contaminantes potenciales.
- Ejecutar la muestra por lo menos 0,5 pulgadas en el gel de poliacrilamida para la purificación de la proteína, luego fijar y tinción con Coomassie tinte, como se ha descrito en detalle25.
- Cortar los carriles en 1 mm3 cubos para la digestión de tripsina, como anteriormente detallada19,26.
- Carga 5 μl de la muestra de péptido digerido en instrumento de LC-MS/MS para la separación en la columna analítica y análisis posterior por espectrometría de masas según los parámetros especificados en detalle16.
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Representative Results
Un Resumen esquemático de la disociación del tejido, centrifugación diferencial y gradiente purificación de vesículas se muestra en la figura 1. La confirmación morfológica e immunophenotypic de EVs purificada de gradiente se destaca en la figura 2. Muestra un diagrama de densidades reproducibles después de ultracentrifugación de la gradiente de iodixanol 10-30%, con dos poblaciones distintas vesículas migran hacia arriba a fracción 2 (luz EVs) y fracción 5 (EVs densa), depende del tipo de tejido. Representante immunoblots de fracciones gradiente muestran la eficiente separación y purificación de pequeño tumor derivado EVs en fracción 5. De nota, especímenes de tumor de pulmón aparecidos enriquecidos en EVs densos comparados con luz de EVs (en fracción 2) previamente extraídas de tejido de todo el cerebro, otra vez puso de relieve aquí. Emergen como un análisis global del tejido de EVs, será interesante determinar las distintas densidades de vehículos eléctricos producidos por tejidos únicos. Representante nanopartículas seguimiento análisis y microscopia electrónica de las vesículas derivadas de tejido en la fracción que contiene la vesícula predominante demuestran el enriquecimiento y la conservación de las vesículas todo consistentes con el tamaño conocido y estructura de EVs pequeño. Por último, la figura 3 resalta la utilidad de este método para facilitar la caracterización de espectrometría de masas aguas abajo proteínas de vesículas purificadas de gradiente, demostrando la detección de muchas proteínas identificados previamente en EVs pequeño. Muchas de estas proteínas identificadas son consistentes con los enriquecidos en pequeño EVs endosomal derivado previamente propuestos por Théry y Cerro laboratorios17,20.
Figura 1 : Resumen esquemático de vesícula aislamiento y purificación de todo tejido. Después de tejido disociación, pasos de centrifugación diferencial claro previo, filtración y ultracentrifugación, crudo EV pellets pueden suspendidas en la parte inferior de un gradiente de densidad de iodixanol para separación de flotación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Representante análisis morfológico e immunophenotypic de EVs derivados de tejido. (A) calcular las densidades de ultracentrifugación siguiente gradiente iodixanol, promediadas en experimentos independientes, destacando las fracciones que contienen EVs ligeros y densos. (B) representante immunoblots de vesículas derivadas de tejido demostrando el aislamiento predominantemente densa del tumor de EVs y luz cerebro EVs. Aislamientos de vesícula están agotados de proteína no-EV calnexin. H, tejido homogeneizado. Nanopartículas (C) análisis (NTA) de seguimiento de vehículos eléctricos de tejido degradado purificada representante. La más pequeña partícula detectada en esta muestra fue de 78 nm y aproximadamente el 92% de las vesículas detectados fueron 250 nm o más pequeño, acorde con un alto enriquecimiento de pequeños vehículos eléctricos. (D) imágenes de microscopia electrónica representante de EVs derivadas de tejido cerebral. Barras de escala = 200 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Extracto de proteínas de la vesícula resaltado detectadas por espectrometría de masas de un representante muestra tejido derivado de la EV. EV extracción y purificación del gradiente, 10 μg de proteína de EV en fracción enriquecida fue cargado en un gel de poliacrilamida para la digestión de tripsina en gel y electroforesis. En esta muestra representativa de EV para derivados de tejido, se identificó un total de 918 proteínas por LC-MS/MS de análisis. Péptidos se identificado, analizados y encontrados para ser enriquecido en exosomal lysosomal y proteínas de membrana plasmática como se describió anteriormente16. Aquí, demostramos la presencia de proteínas exosomal o pequeño EV en los preparativos que se han descrito por el Théry y Cerro laboratorios17,20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Interés tanto científico se ha generado con respecto a los roles que EVS pequeño jugar en el microambiente del tumor, así como en función, maduración y desarrollo del órgano. En general, este estudio proporciona un flujo de trabajo optimizado para la extracción de EVs intactos de todo el cerebro o las muestras de tumor. Mientras que aquí simplemente se demuestra la aplicabilidad de esta técnica a pulmón tumor derivado de EVs, este método podría ser adaptado para el trabajo en otros tejidos sólidos, proporcionando oportunidades para mayor caracterización de vivo de ex de pequeñas vesículas segregadas de amplio interés biomédico. Mientras que más allá del alcance de este estudio, futura comparación de contenido de EV a la de origen expresión de tejido también será importante para establecer la utilidad de vesículas aisladas como biomarcadores de la enfermedad y tejido.
En el estudio previamente publicado por nuestro laboratorio, demuestran claramente las ventajas de la gradiente de densidad basada en la flotación sobre gradientes de sedimentación para la purificación del enriquecido pequeñas vesículas. En esencia, una separación basada en la flotación mejora la depuración de vesículas evitando la migración de contaminantes a través de las fracciones de interés. Este principio parece particularmente importante cuando a partir de muestras complejas como todo tejido. No obstante, subrayamos la importancia de los estudios de pre-analítica confirmación de vesículas aisladas descritas, incluyendo el examen de la morfología de EV a través de técnicas complementarias como la microscopia electrónica y nanopartículas seguimiento análisis, así como los análisis bioquímicos incluyendo immunoblotting. Proteínas de EV en fracciones enriquecidas deben confirmarse con al menos tres marcadores reconocidos de EV, incluyendo una proteína tetraspanina, tal como lo recomienda el informe de la Mínima información para estudios de EVs (MISEV) publicado en el diario del medio extracelular Las vesículas27. Un marcador negativo de EV debe demostrarse para ser ausente o muy reducida en fracciones de EV en comparación con homogenados de tejido. Todas las medidas indicadas son cruciales para el aseguramiento de la calidad de la purificación de vesícula pequeña. Además, demostración temprana de la consistencia de laboratorio-usuario-específicas y en fracciones de densidad que contienen EV puede ahorrar valioso tiempo y costo asociado con el procesamiento y análisis de todas aquellas fracciones tras el paso de la ultracentrifugación de gradiente de densidad.
Es claro que las vesículas de diversos tejidos pueden flotar a fracciones de distinta densidad, o pueden separarse en predominantemente ligera o densa subpoblaciones. Estas diferencias se han visto anteriormente en su totalidad EVs derivado del cerebro en comparación con EVs extraídas de las células dendríticas cultivadas en cultura16,17y además se demostraron en este estudio. Mostramos que los especímenes de tumor de pulmón pueden puerto predominantemente que densa EVs pequeño comparados con el EVs ligero aislado de tejido cerebral. Estas diferencias destacadas por el método propuesto en este estudio pueden promover valiosas investigaciones sobre la composición diferencial de los vehículos eléctricos, incluyendo EVs de tumor que pueden ser embalados con densa DNA filamentos28,29,30. Debido a estas diferencias en la composición de EV, fuertemente subrayamos la importancia de estos experimentos técnicos iniciales. Futura aplicación de esta técnica para el aislamiento de los vehículos eléctricos de los especímenes tumorales diversas será importante para determinar si EVs densos son predominantemente secretada en el intersticio de otros tipos de tumor, así.
Mientras que la completa purificación de los vehículos eléctricos pequeños y el aislamiento de subpoblaciones distintas vesícula sigue siendo una limitación de corriente a través de laboratorios, este método proporciona una base para futuros estudios caracterizar a pequeñas vesículas de una diversidad de tejido o tumor tipos y por lo tanto puede facilitar una mayor comprensión de la diversidad de EV. Reciente separación de partículas de EV por asimétrico flujo campo-fluye fraccionamiento ha iluminado la posibilidad de distinta carga y funciones de los pequeños (60-80 nm) versus mayor exosomas (90-120 nm) y además identificó un subconjunto de membrana no limitan < 50 nm partículas denominadas "exomeres"31,32. Sin embargo, en estas poblaciones de vesícula única carga varió a través de líneas de celulares, destacando la heterogeneidad sustancial de las vesículas de secreción y apoyar la importancia del análisis de vesícula vivo completa in vitro o ex. En este estudio, es muy probable que enriquecemos para ambas clases de exosomas identificado. Una proporción de pequeña microvesículas con densidades similares a exosomas puede estar presente en aislamientos así. Aunque no podemos excluir la posibilidad de exomeres en nuestros aislamientos, membrana-limite las vesículas eran ciertamente más abundantes en las fracciones gradiente enriquecidas en proteína de la vesícula. Además de pequeños EVs, oncosomes grandes (> 1.000 nm) han sido de reciente interés para biólogos de cáncer33. Mientras que el protocolo descrito en este estudio filtra las vesículas más de 450 nm, exclusión de este paso puede facilitar el examen de estos vehículos eléctricos más grandes descrito. Exámenes posteriores de densidades asociados a diversas subpoblaciones de vesícula será importante distinguir estas entidades además de los tamaños descritos.
Por último, aunque apreciamos las limitaciones incluyendo costo y tiempo asociados con esta propuesta técnica, también reconocemos la necesidad de rigurosos métodos fundamentales para caracterizar tejido EVs y servir como una comparación del producto final para constantemente evolución y más sofisticados métodos en el futuro. Esperemos que estas tecnologías de avance iluminarán más rápidas y clínicamente compatibles con técnicas para extraer EVs de muestras médicas o quirúrgicas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen el Dr. Richard Nowakowski y Florida estado Universidad laboratorio de los recursos para proveer y cuidar de los animales utilizados para desarrollar este protocolo, respetuosamente. Agradecemos a Liu Xia, Dr. Rakesh Singh y la Florida Universidad traslacional ciencia Laboratorio Estatal de asistencia con el trabajo de espectrometría de masas utilizado para la caracterización de aguas abajo de la vesícula, así como la posibilidad de recurso de la proyección de imagen de ciencia biológico CEI de el uso del microscopio electrónico de transmisión en este estudio. Finalmente, agradecemos a Dr. Mandip Sachdeva (Florida A & M University) para la donación de las muestras de tumor en el desarrollo de este método. Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Florida Departamento de la salud Ed Ethel Moore Alzheimer Enfermedad programa de investigación y concedió a D.G.M. y J.M.O (6AZ11) y el Instituto Nacional del cáncer de los institutos nacionales de salud premio con el número R01CA204621 otorgado a la D.G.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm filter | VWR | 28145-505 | |
| 12 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| 5.5 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| anti-Alix antibody | Santa Cruz | sc-7129 | |
| anti-Calnexin antibody | Santa Cruz | sc-11397 | |
| anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| anti-CD81 antibody | Santa Cruz | sc-9158 | |
| anti-Flotillin 2 antibody | Santa Cruz | sc-25507 | |
| anti-HSC70 antibody | Santa Cruz | sc-7298 | |
| anti-Syntenin-1 antibody | Santa Cruz | sc-100336 | |
| anti-TSG101 antibody | Santa Cruz | sc-7964 | |
| EZQ protein quantification kit | ThermoFisher Scientific | R33200 | |
| FA-45-6-30 rotor | Eppendorf | 5820715006 | |
| FEI CM120 Electron Microscope | TSS Microscopy | ||
| goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) | Genetex | 27171 | |
| HALT phosphatase inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78420 | |
| HALT protease inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78438 | |
| Hibernate E medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| MLS-50 swinging-bucket rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
| NanoSight LM10 | Malvern | ||
| Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Optima XE-100 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Optiprep | Sigma | D1556 | 60% iodixanol in sterile water solution |
| Q Exactive HF Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | ||
| rabbit anti-goat IgG | Genetex | 26741 | |
| rabbit anti-mouse IgG | Genetex | 26728 | |
| Refracto 30PX (refractometer) | Mettler Toledo | 51324650 | |
| S-4-104 rotor | Eppendorf | 5820759003 | |
| SW 41 Ti swinging-bucket Rotor | Beckman Coulter | 333790 | |
| Tabletop 5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 |
References
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