Summary
ここでは、我々 は脳、腫瘍標本を含む全体の組織から小さな細胞小胞 (Ev) を分離するための詳しいプロトコルを提供します。このメソッドでは、さらに下流解析の固体ティッシュから EVs を抽出する再現性のある手法を提供しています。
Abstract
循環と格子間原子小さな膜結合型細胞小胞 (Ev) 新規診断や予後バイオ マーカーのアッセイの開発のための有望なターゲットを表し、可能性の広大なスペクトルの進行での重要なプレーヤーとして病気。現在の研究は複数の細胞から分泌される小胞のキャラクタリゼーションに焦点を当ててより良い組織の種類は神経変性、炎症、癌などの条件の病因に EVs の役割を理解します。しかし、グローバルに一貫した、再現性のあるテクニックを分離し、小胞を浄化は進行中のまま。また前のヴィヴォ固体ティッシュから EVs の抽出方法、やっとのことで説明します。ここでは、さらに特性評価のための脳、腫瘍標本を含む全体の新鮮なまたは冷凍の組織から関心の小型 Ev を抽出するための詳しいプロトコルを提供します。この電子顕微鏡および小胞の肺浸潤特性だけでなく、EV 蛋白質の量的な質量を含む複数のダウン ストリーム解析法の適応性を示します。
Introduction
小さな細胞小胞 (Ev) は、エンドソーム派生エクソソームと広範な生物医学的関心のある小さな膜小屋ミクロベシクルに含まれます。小型 Ev は、生物活性タンパク、脂質、および病気プロセスの多数の重要な役割を果たすと考えられている総称して核酸を含む 50 250 nm 膜結合型ベシクルの異種集団で構成されます。神経変性疾患とプリオン疾患、感染プロセス、自己免疫・炎症性条件と腫瘍の増殖や転移1,2,3にこれらの小胞を特に関与して研究を進めています。,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。 分離そしてこれらの小胞の浄化のための再現性・厳格な方法の開発に平行関心を生成している病因における EVs の意義に急速な生物医学研究。
EV の特性の歴史と現在の挑戦は、小型 EV のサブポピュレーションを完全に分離することができないことをされています。この課題は、異なる小胞の形成を支配する異なる分子メカニズムの私達の限られた理解の主因です。これらの区別を convolutes サイズ、密度、およびさらに集団間の生物学的製剤の貨物を重複します。このような課題の一部には広く濃縮技術を異なる所で隔離された小胞の下流における矛盾を提供する、カテゴリの EV 集団を照らすに世界的な努力を損なう使用もされました。
それは動物や人間の体液、血漿、尿を含む小胞を分離する技術を記述する生体内での最近の研究と in vitro における細胞培養上清、集から EV の特性の大半が実行されていることは注目に値する、と唾。一方、EVs が流通に大量に存在するこれらの小胞が細胞間コミュニケーション イベントで重要な役割を果たして、細胞組織の間質に存在をも認識します。癌の中では、間質性の EVs が癌細胞播種、転移性成長14,15がん微小環境を調節する際に特に重要な可能性があります。したがって、開発と最適化の固体組織標本から小胞を抽出する手法で価値があります。これらのメソッドは、直接研究器官に手段を提供するまたは腫瘍由来の EVs 小さな生検と部分的または完全臓器切除を含む、臨床検体から収穫されます。
この研究と当社研究所16刊以前のレポートでは、EV 濃縮方法論のいくつかの主要な現在の懸念に対処を目指して: 1) を分離し、現在最高の基準に EVs を浄化する再現性のある手法について説明するにはフィールドで受け入れ2) 小型 EV subpopulations エンドソーム派生エクソソーム; 高濃縮を分離しようとする・ 3) さらに評価の目的のための固体組織標本からこれらの小胞の抽出のためのプロトコルを提供します。
最近、Kowal と同僚は、分離し、匹敵するショ糖密度勾配17より大きい有効性によって EV subpopulations を浄化する比較的小規模な iodixanol の密度勾配を説明します。引用における密度 1.1 g/mL、一貫性のある比較的軽い密度分数でキャプチャされた樹状細胞由来 EVs 高エクソソームこの存在の割合が高いと最も一致する信じられるエンドソーム蛋白質で濃縮しました。割合です。作者によれば、これら「善意」exosomal 蛋白質はいくつかアネキシン タンパク質17、EHD4、ADAM10 CD81 腫瘍感受性遺伝子 101 (TSG101) syntenin 1 を含まれています。我々 はその後ペレス ・ ゴンザレスら18と全く脳由来 EVs16を分離する続く差動遠心分離のプロトコルで記述された組織解離法を成功するためにこの手法を適応しました。また、下流定量的および比較私たちの研究所の19に記載された小胞タンパク質の質量分析のための連続したプロトコルを組み合わせることによって EV プロテオームの特性でこのメソッドの有用性を示した。この仕事20脳の前頭葉から EVs が豊かな丘の研究室からあった。
本研究では、この手法に手の込んだ、EVs の固体腫瘍から分離に当研究室から最近公開されたプロトコルのアプリケーションを拡張します。私たちの知る限り、これは生体内の腫瘍の標本 ex から EVs を豊かにするためのプロトコルを記述する最初の研究です。このメソッドは、新規の診断バイオ マーカーとその腫瘍形成における役割として EVs で広範な関心を与え、科学研究者の数が増えている貴重なを可能性が高い証明します。臨床的観点から間質性 EVs は組織学的評価は限られた標本を中心に、素晴らしい診断的価値を抱くことが。私たちの希望は、ここで概説している方法は再現手法が新鮮なまたは冷凍動物または人間手術標本から、明らかに病気の発症に重要な役割これら小さな将来の仕事のための道を舗装 EVs を収穫するための基盤を提供小胞を再生可能性があります。
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Protocol
頭脳全体は、制度上の動物の使用およびフロリダの州立大学のケア委員会 (IACUC) から承認が得られました。12 マウス脳の合計 (各年齢別グループから 3 脳: 2、4、6、および 8 ヶ月) EV 抽出、上記16C57BL/6 J から背景が使用されました。肺の腫瘍の標本は、フロリダの農業および機械大学 IACUC の承認の下で博士 Mandip Sachdeva によって寛大に寄贈しました。肺腫瘍は、ひと癌細胞株 H1975 免疫不全 Balb/c nu/nu 裸マウスで栽培から派生しました。2 つの代表的な腫瘍複製からのデータは、本研究で強調表示されます。
注:小胞の分離精製法の概要は、図 1で提供されます。
1. 組織解離と差動遠心分離
- 休止状態 E 中約 0.4 1.0 あたり 10 mL の解離バッファー (パパインの 10 mg; 5.5 mM L システイン; 67 μ M 2-メルカプトエタノール; 1.1 mM EDTA) の準備組織の g。フィルター処理された純水 EV 濃縮と精製に使用されるすべてのソリューションを薄めるべきことに注意してください。
- 50 mL の円錐管にバッファーが解離に全く新鮮なまたは冷凍の組織を追加し、インキュベート暖かい水で 20 分組織の 37 ° C でバスがカットする孵化前に小さな断片に必要な場合。
- 次の孵化、組織を含む解離バッファーに最終的な 1 倍の濃度のプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を追加します。
- ルーズ フィット Dounce ホモジナイザーに組織を含む溶液を注ぐし、優しくサンプルあたり約 30 遅いストロークを使用して組織を切り離します。ストローク数は、組織の整合性に基づいて調整することがあります。
- 50 mL の円錐管とセルと残りの線維性または凝集の組織片をペレットへの 4 ° C で 5 分間 500 × gで遠心するバッファーの転送解離組織。
- きれいな 50 mL の円錐管、ペレットし、大細胞残骸を破棄する 4 ° C で 10 分間の 2,000 × gで遠心上清を転送します。
- きれいな 50 mL の円錐管、10,000 × gで遠心する望ましくない大きい小胞または小さなアポトーシス小体をペレットへの 4 ° C で 40 分に再び上澄みを転送します。
注:このペレットは、必要に応じてより大きい小胞の追加研究のため保存することができます。 - 0.45 μ m のフィルターを通してきれいな 12 mL 遠心チューブに上清をデカントします。
注:高密度線維化組織サンプルを簡単にフィルターされないことが。これらのサンプルを 40 μ m セル ストレーナー濾過し、0.45 μ m のフィルターを通してフィルタ リングする前に連続的に小さいサイズの針 (18 G、20 G、22 G) を通過できます。 - 超小型 Ev をペレットへの 4 ° C で 2 時間 100,000 × gのサンプル。
- 上清をデカントし、5-10 分、管の両側に残留液体を除去する頻繁にタップの逆遠心管を残します。残留液は、吸引真空ピペットを使用しても吸引することができます。
- 再 0.25 M ショ糖バッファー (10 mM トリス、pH 7.4) の 1.5 mL で EV ペレットを中断します。この手順ではペレットの懸濁液における日時を確認することが重要です。これを行うには、ソリューションにボルテックス Ev 前にパラフィルムでチューブをカバーします。最終的な渦ミックス前に室温で 15 〜 20 分の超遠心機チューブをロックします。
- 簡単に管の下で液体の懸濁液を回復する速度以上 1,000 x gでチューブを遠心分離機します。
- グラデーション浄化手順に進むか、必要な場合は、一晩 4 ° C で EV を懸濁液を格納します。
2. 密度勾配浄化
- 30 %iodixanol を含む最終的なソリューションを作成する Ev を含む 1.5 mL のショ糖/Tris バッファーに 60 %iodixanol (水の原液) 1.5 mL を追加します。ピペットを上下のソリューションを徹底的にミックスを数回。高 iodixanol の濃度は非常に粘性、ピペット チップのソリューションを失うことを避けるために慎重になります。
- 5.5 mL 遠心管の底に EVs を含む 30 %iodixanol の緩衝液を転送します。
- 60 %iodixanol のストック溶液から純水のサンプルあたりの 20%、10% の iodixanol ソリューションの少なくとも 1.5 mL を準備します。
- 1.3 mL 20 %iodixanol と慎重に注射器、18 G 針を使用して下部のグラデーションのレイヤーの上にレイヤーを測定します。密度界面層の混合を避けるため、半月板のすぐ上遠心チューブの内側との接触針の傾斜面を維持し、滴下ソリューションを追加します。
- 上記と同じテクニックを使用して 20 %iodixanol のレイヤーの上に 10 %iodixanol 溶液 1.2 mL をレイヤーします。
- 慎重にバランスし、ローター バケツと 4 ° C で 50 分間 268,000 x gでスイング バケツの回転子の遠心遠心チューブに読み込む密度層の破壊を回避できる最低料金に遠心分離機の加速と減速の速度を設定します。
- 密度勾配の端数 10 を 1 に対応する各サンプルの 10 1.5 mL 遠心チューブにラベルを付けます。分数 1 は、最初は削除され、10 の分数は最後に削除された最終留分中最上位の割合として指定されます。
- 勾配の遠心が完了すると、優しくローター バケツからチューブを取り外し、安定したホルダーに置きます。小胞の目に見えるバンドはしばしば関心の割合で見られます。対応する管にピペットのグラデーションの上から 490 μ L の 10 シリアル分数。可能性が高い汚染タンパク質を含まれている管の下部に残った液体の少量があります。このサンプルは、破棄、または必要な場合、分数 11 として保持できます。
- 糖度計を使用して分数の屈折を測定します。これは、サンプルの保全が必要な場合は、並列で実行制御グラデーションで実行できます。糖度計サーフェイス iodixanol を含む各画分の 20-30 μ L をピペットし、知られている iodixanol の密度に屈折を比較することによって密度を推定します。分数に格納できる一晩 iodixanol を含むソリューション次の遠心洗浄手順に進む前に必要な場合に注意してください。
- きれいな 12 mL 遠心チューブに各画分を転送します。上下にゆっくりとピペッティングによりチューブとミックスにリン酸緩衝食塩水 (PBS; 137 mM NaCl、KCl、2.7 mM 10 mM ナ2HPO4、2 mM KH2PO4、pH 7.4) x 1 の 5 mL を追加します。
注:サンプルに追加 PBS は、0.22 μ m のフィルターを通して滅菌 PBS をフィルタ リングし、塩の沈殿物を避けるために常温で保存することを確認パーティクル フリーする必要があります。 - トップに追加の 6 mL の 1x PBS を追加し、再度慎重に混ぜます。
- 超遠心機チューブ再ペレット小胞への 4 ° C で 2 時間 100,000 × gで。上清をデカントし、小胞タンパク質の解析 (ステップ 3) を溶解または形態学的解析 (ステップ 5) の EVs の再停止前に乾燥管をタップします。
3. 溶解とイムノブロット EV タンパク質の確認
注:全体小胞形態学的研究や生物学的活動のための保全が必要な場合、研究者はステップ 5 に直接進むことができます。最初の実験、または質量分析する前に、回復のすべての分数が分数の EV 蛋白質を確認するイムノブロットによって分析必要があります。
- タンパク質解析用 EVs を分離、遠心チューブに EV ペレットにプロテアーゼ阻害剤の添加で強力な換散バッファー (5 %sds、10 ミリメートルの EDTA、120 mM トリス塩酸 pH 6.8, 2.5 %2-メルカプトエタノール、8 M 尿素) の 40 μ L を追加します。
注:非還元条件蛋白質の抗体の検出の場合は、2-メルカプトエタノール強力な換散バッファー内の純水に置き換えてください。 - 遠心上パラフィルムを置くことによってペレットの懸濁液完了日時とバッファー内の EVs の換散を確保するチューブ、ボルテックス積極的に最終的な渦前に室温で 20 分間、ロッキングします。
- 簡単に 30-60 のサンプル全体ボリュームを回復するため 1,000 x gで遠心分離機します。さらに処理までサンプルを新しい 1.5 mL 遠心チューブ、-80 ° C に-20 ° C でストアに転送します。
- イムノブロット分析精製 lysates を準備するには、1 x の最終濃度のサンプルを 5 x Laemmli サンプル バッファー (10 %sds、250 mM Tris pH 6.8, 1 mg/mL ブロモフェノールの青、0.5 M の DTT、50% のグリセロール、5 %2-メルカプトエタノール) を追加します。
注:非還元条件が必要な場合は、純水で DTT や 2-メルカプトエタノールを置き換えます。 - 全体組織ホモジネートのコントロールが必要な溶解、尿素を含む強い組織プロテアーゼ阻害剤と上記の換散バッファーの詳細、残りの細胞外マトリックス、細胞全体を破棄する 10 分間 10,000 × gで遠心分離またはそのまま細胞の残骸。1 x の最終濃度の組織ホモジネートに 5 x Laemmli サンプル バッファーを追加します。
- 95 ° C、5-10 分で EV または組織ホモジネート サンプルを含むサンプル バッファーを沸騰し、等しいボリュームをロード (0.1 0.3 に相当から開始組織材料の g; EV の浄化された蛋白質の 1-2 μ g) 10 %sds ページのゲルに分数 1 10 の。組織ホモジネートの等しい質量をロードします。敏感抗体による検出のためのサンプルの大きいボリュームは必要かもしれない。
- 以前詳細21 EV タンパク質精製の lysates を確認し、分数で EV 個体を比較するとゲル電気泳動、ウエスタンブロット解析を続行します。
注:EV のタンパク質は、一貫性のある分数で再現性をもって実証されています、一度手順 2.12 で説明した最終的な遠心洗浄が関心のグラデーションの一部分に限られるかもしれない。
4. EV プロテインの定量
- EV 蛋白質の定量法がさらに分析が必要な場合、洗剤と尿素対応の蛍光アッセイを使用 (材料の表を参照してください)。いくつかの蛍光アッセイが好ましい場合、このバッファーに (手順 2.12) の EV ペレットの直接溶解を促進する塩化物イオン サンプル バッファーに存在ブロモフェノールの青と互換性があるに注意してください。
- 前述の蛍光を用いたタンパク質定量キットを使用すると、サンプルまたは標準の 1 μ L スポットが、少なくとも提供のフィルター紙の上を複製し、製造元の指示に従ってタンパク質定量を続けます。
5 EV 形態の特性
- 手順 2.12 の最終的なの遠心分離を洗浄後全体小胞を調べるも、徹底的に再停止 EV ペレット粒子無料 1x PBS で。もはや処理するまで一週間以上のための 4 ° C で凍結融解サイクルを避けるために EVs をストアします。
注:一貫して興味の一部分に形態学的解析を制限するイムノブロット解析による豊かな EV の蛋白質を含有する画分を確認している以前に有益です。 - ナノ粒子の濃度と以前詳細22として準備、小胞のサイズを決定するための全体の EV サンプルの分析を追跡を実行します。
- EV の形態を評価し、必要な場合小胞の電子顕微鏡によるサイズ測定を確認します。EM グリッドは次のステップ 5.123, 小胞懸濁液から調製することができます。 または代わりに次の手順 2.12 ペレットからブロック準備24として処理されます。
6. ゲルのトリプシンの消化力の精製と質量分析のため
- 質量分析法による EV プロテオームの解析が必要な場合は、別の蛋白質を浄化しプレキャスト ポリアクリルアミドゲルに EVs を含む分数の等しい質量 (蛋白質の少なくとも 10 μ g) をロードします。メーカー供給の既製ゲル サンプルに導入されているタンパク質 (ケラチンなど) の汚染の可能性のレベルを減らすことが推奨されます。
- ポリアクリルアミド ゲル蛋白質の浄化のために少なくとも 0.5 インチ サンプルを実行し、修正し、詳細25で前述した Coomassie 染料で染色します。
- トリプシンの消化力、以前詳細19,26として3キューブ 1 mm にレーンをカットします。
- 詳細16で指定されたパラメーターに従って質量分析法によるクロマトグラフィー-タンデム質量分析カラムとその後の分析の分離器に消化ペプチド試料の 5 μ L を読み込みます。
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Representative Results
組織解離、差動遠心分離および小胞のグラデーションの浄化の概要は、図 1に表示されます。グラデーション精製 EVs の形態学的及び肺浸潤の確認は、図 2でハイライトされます。再現可能な密度の 10-30 %iodixanol の勾配超遠心法を次の図が表示されます、上方に移行する 2 (光 Ev) の分数と割合 5 (密な Ev)、2 つの異なる小胞集団組織の種類によって異なります。グラデーションの分数の代表 immunoblots 展示効率的な分離と分数 5 の小型腫瘍由来 Ev の浄化。注記のうち、肺の腫瘍の標本の光全脳組織から収穫される以前 (一部 2) の Ev と比較して高密度の EVs で豊かな登場がここで強調表示再度。EVs のグローバル組織分析として出てくる、ユニークな組織によって生成される電気自動車の異なる密度を決定するために興味深いものになります。代表ナノ粒子追跡解析および優勢な小胞を含む画分由来の小胞の電子顕微鏡を示す濃縮と全体小胞知られているサイズと一貫性の維持と構造小型 Ev。最後に、図 3は、以前小型 Ev で識別される多くのタンパク質の検出を示すグラデーション精製小胞タンパク質の下流の質量特性を容易にこの手法の有用性を強調表示します。これらの識別された蛋白質の多くは、以前に提案した Théry とヒルの実験室17,20小型エンドソームから派生した Ev の濃縮と一致。
図 1: 小胞の分離・精製全体組織の概要。次の組織解離、前清算差動遠心分離手順、濾過、遠心、原油 EV ペレットは、浮上分離の iodixanol 密度勾配の下に再停止することができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 組織由来の EVs の代表的な形態と肺浸潤解析します。(A) 光と密な EVs を含有する画分を強調表示の独立した実験で平均 iodixanol 勾配次遠心の密度を計算します。(B) 代表 immunoblots 主に密度の高い腫瘍 EVs と光の分離を示す組織由来の小胞の EVs を脳します。小胞の分離株が非 EV タンパク質カルネキシンの枯渇します。H組織ホモジネート。(C) ナノ粒子代表グラデーション精製組織 EVs の分析 (NTA) を追跡します。このサンプルで検出された最小の粒子だった 78 nm、および検出された小胞の約 92% が 250 nm または小さい、小型 Ev の高濃縮と一貫性のあります。(脳組織から派生した EVs の D) 代表的な電子顕微鏡画像。スケール バー = 200 nm。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 組織由来 EV サンプル代表の質量分析法によって検出された強調表示された小胞タンパク質の概要。EV 抽出とグラデーションの精製、濃縮の割合で EV 蛋白質の 10 μ g はポリアクリルアミドゲルの電気泳動のゲルのトリプシンの消化力に読み込まれました。サンプルではこの代表的な組織から派生した EV、918 蛋白質の合計されたクロマトグラフィー-タンデム質量分析によって識別されます。ペプチドを識別、分析、前述16として exosomal、リソソーム、細胞膜で濃縮されることが判明します。ここでは、Théry とヒルの実験室17,20によって記述されている我々 の準備に小型 EV または exosomal 蛋白質の存在を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
小型 Ev における器官形成、成熟と機能だけでなく、腫瘍微小環境におけるの役割に関して多くの科学的関心が生成されました。全体的にみて、この研究では、脳全体または腫瘍の標本からそのまま EVs の抽出最適化されたワークフローを提供します。このメソッドが簡単に適応のある小さな分泌小胞の ex vivo 評価さらに機会を提供する他の固体組織の仕事のためかもしれないここで肺腫瘍由来 EVs に本手法の適用性を単に示す中、広範な医学の関心。ティッシュ式を元の EV コンテンツの今後の比較組織と疾患バイオ マーカーとして隔離された小胞の有用性を確立することが重要になります、この研究の範囲を超えている間。
私たちの研究室で、以前公開されて研究で明確に豊かな小さい小胞の浄化のための堆積勾配以上浮上を用いた密度勾配の利点を示します。本質的に、浮力ベースの分離は、利息の端数を汚染物質の移行を回避することによって小胞の精製を向上します。全体組織のような複雑なサンプルからの起動時、この原則が特に重要な表示されます。関係なく、我々 は電子顕微鏡とナノ粒子追跡分析、同様など補完的な技術により EV 形態の検討を含む、分離の小胞の事前分析確認研究の重要性を強調します。として生化学的解析法を含みます。EV 濃縮分数蛋白質確認すべき、少なくとも 3 つの認識された EV マーカーと細胞外のジャーナルで公開されて電気自動車の研究のための最小限の情報(MISEV) レポートの推奨どおり 1 つの tetraspanin タンパク質を含む小胞の27。否定的な EV マーカー、欠席する明示されなければならないまたは組織乳剤に比べて EV 分数で非常に減らされました。上記のすべての手順は、小さな小胞浄化の品質保証のため重要です。さらに、EV を含む密度分数の研究室およびユーザー固有の一貫性の初期デモは、貴重な時間と処理および次の密度勾配遠心ステップすべての画分の分析に関連するコストを節約できます。
多様な組織からの小胞がわずかに異なる密度分数に浮かぶかもしれないまたは主光または高密度の集団に分けることができます明白です。これらの違いは、EVs の脳由来樹状細胞文化16,17、栽培から収穫される EVs を比較し、本研究で示したさらに全体で以前見られています。肺の腫瘍の標本が主に脳組織から分離した軽い Ev と比較して高密度小型 Ev を抱くことができることを示す.本研究で提案する手法で強調表示されたこれらの違いは、高密度 DNA 鎖28,29,30と詰まるかもしれない腫瘍 EVs を含む電気自動車の差動構成に貴重な問い合わせを宣伝すること。強く EV 組成のこれらの違いのため、これらの初期の技術的な実験の重要性を強調します。多様な腫瘍の標本から EVs の分離にこの技術応用の将来展望は密な EVs は主に他の腫瘍型の間に分泌されるかどうかを決定することが重要になります。
このメソッドは、組織や腫瘍の多様性からの小さい小胞を特徴付けるためのさらなる研究のための基礎を提供します小型 Ev の完全な浄化および明瞭な小胞集団の隔離研究室の現在の制限のまま、タイプ、およびしたがって EV 多様性のより大きい理解を容易にすることがあります。非対称流れフィールド フロー ・ フラクショネーションによって EV 粒子の最近の分離が大きい (90-120 nm) エクソソーム対小 (60-80 nm) の機能と異なる貨物の可能性を点灯し、さらに非膜結合のサブセットを識別 < 50 nm粒子は、"exomeres"31,32建てください。ただし、これらのユニークな小胞集団でパッケージ化された貨物は細胞、分泌小胞の実質的な不均一性を強調表示し、包括的な体外または ex vivo 小胞分析の重要性のサポートの間で変化。本研究では最も可能性の高い識別エクソソームの両方のクラスに対して豊かに。エクソソームに似たような密度の小さい機構の解明の割合株同様に存在します。私たち分離株における exomeres の可能性を除外することはできません私たちが膜結合型小胞の小胞タンパク質の濃縮勾配の分数で確かに最も豊富です。小型 Ev、大規模な oncosomes に加えて (> 1,000 nm) 癌の生物学者の33の最近の関心されています。この研究が 450 より大きい小胞をフィルター、プロトコルで説明しながら nm、このステップの除外で説明これらの大きい EVs の検討を容易にするかもしれない。様々 な小胞集団に関連付けられた密度の将来検討は説明サイズに加えてこれらのエンティティを区別することが重要になります。
最後に、私たちは、この提案手法に関連付けられた時間とコストを含む制限を感謝も我々 も認める組織 EVs を特徴付ける、常に最終製品の比較としての厳密な基礎的な方法の必要性将来的に進化しより高度なメソッドです。これらの技術進歩がうまくいけば EVs を医療や外科手術標本から抽出するより迅速かつ臨床的に互換性のある技術を点灯します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、博士リチャード ・ スキーと提供し、丁重にこのプロトコルを開発するために使用する動物を気遣うフロリダ州大学研究室動物資源をありがとうございます。我々 は下流の小胞のキャラクタリゼーションと FSU 生物科学イメージング資源施設に使用される質量分析作業と夏 liu さん、博士 Rakesh シンと、フロリダ州立大学並進科学研究所支援のために感謝します。本研究では、透過型電子顕微鏡の使用。最後に、博士 Mandip Sachdeva (フロリダ A & M 大学) は、このメソッドの開発で使用される腫瘍の標本の寄付を感謝いたします。本研究は、授与賞数の下で健康の国民の協会の国立癌研究所と J.M.O (6AZ11) D.G.M. Ed 健康のフロリダ部とエセル ・ ムーア アルツハイマー病研究プログラムからの助成金によって支えられました。R01CA204621 D.G.M. に授与
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm filter | VWR | 28145-505 | |
| 12 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| 5.5 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| anti-Alix antibody | Santa Cruz | sc-7129 | |
| anti-Calnexin antibody | Santa Cruz | sc-11397 | |
| anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| anti-CD81 antibody | Santa Cruz | sc-9158 | |
| anti-Flotillin 2 antibody | Santa Cruz | sc-25507 | |
| anti-HSC70 antibody | Santa Cruz | sc-7298 | |
| anti-Syntenin-1 antibody | Santa Cruz | sc-100336 | |
| anti-TSG101 antibody | Santa Cruz | sc-7964 | |
| EZQ protein quantification kit | ThermoFisher Scientific | R33200 | |
| FA-45-6-30 rotor | Eppendorf | 5820715006 | |
| FEI CM120 Electron Microscope | TSS Microscopy | ||
| goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) | Genetex | 27171 | |
| HALT phosphatase inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78420 | |
| HALT protease inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78438 | |
| Hibernate E medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| MLS-50 swinging-bucket rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
| NanoSight LM10 | Malvern | ||
| Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Optima XE-100 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Optiprep | Sigma | D1556 | 60% iodixanol in sterile water solution |
| Q Exactive HF Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | ||
| rabbit anti-goat IgG | Genetex | 26741 | |
| rabbit anti-mouse IgG | Genetex | 26728 | |
| Refracto 30PX (refractometer) | Mettler Toledo | 51324650 | |
| S-4-104 rotor | Eppendorf | 5820759003 | |
| SW 41 Ti swinging-bucket Rotor | Beckman Coulter | 333790 | |
| Tabletop 5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 |
References
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