Summary
Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para isolar pequenas vesículas extracelulares (EVs) de tecidos, incluindo amostras de cérebro e tumor. Este método oferece uma técnica reprodutível para extrair EVs do tecido sólido para mais análises a jusante.
Abstract
Circulantes e intersticiais pequenas membrana-limite extracelulares vesículas (EVs) representam alvos promissores para o desenvolvimento de ensaios de romance biomarcador de diagnóstico ou prognóstico e provavelmente servem como jogadores importantes na progressão de um vasto espectro de doenças. A pesquisa atual está focada na caracterização das vesículas secretada de várias células e tipos de tecido para melhor entendem o papel do EVs na patogênese das condições incluindo neurodegeneração, inflamação e câncer. No entanto, técnicas globalmente consistentes e reproduzíveis para isolar e purificar vesículas permanecem em andamento. Além disso, métodos para extração de EVs de tecido sólido ex vivo são raramente descritos. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para extrair pequenas EVs de interesse de tecidos inteiros frescos ou congelados, incluindo amostras de cérebro e tumor, para caracterização mais. Vamos demonstrar a capacidade de adaptação desse método para múltiplas análises a jusante, incluindo microscopia eletrônica e caracterização imunofenotípica das vesículas, bem como, a espectrometria de massa quantitativa de proteínas EV.
Introduction
Pequenas vesículas extracelulares (EVs) incluem CDDP-derivado exosomes e pequenas aumentada de membrana-galpão de amplo interesse biomédico. EVs pequenas são compostas por uma população heterogénea das vesículas de membrana-limite nm 50-250 contendo proteínas biologicamente activas, lípidos e ácidos nucleicos que coletivamente são acreditados para desempenhar um papel importante em uma infinidade de processos da doença. Fazer avançar a pesquisa implicou particularmente essas vesículas em neurodegenerativas e doenças de príon, processos infecciosos, condições auto-imunes ou inflamatórias e crescimento do tumor e metástases1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. crescendo rapidamente a investigação biomédica para a importância do EVs na patogênese da doença gerou interesse paralelo no desenvolvimento de métodos reprodutíveis e rigorosos para o isolamento e purificação dessas vesículas.
Um desafio histórico e atual na caracterização de EV tem sido a incapacidade de se separar totalmente pequenas subpopulações de EV. Este desafio é em grande parte devido à nossa compreensão limitada dos diferentes mecanismos moleculares que regem a biogênese de vesículas distintas. Sobreposição de tamanho, densidade e carga biológica entre subpopulações mais convolutes essas distinções. Parte desse desafio também tem sido a utilização de diferentes técnicas de enriquecimento, fornecendo inconsistência na análise a jusante das vesículas isoladas em laboratórios e minar o esforço global para iluminar categórica EV populações amplamente.
É interessante notar que a maioria dos EV caracterização foi realizada de coleção in vitro de cultura celular sobrenadante, com os mais recentes estudos in vivo, descrevendo técnicas para isolar vesículas de fluidos do corpo humanos ou animais, incluindo plasma, urina e saliva. Enquanto EVs estão presentes em grandes quantidades em circulação, é também reconhecer que essas vesículas desempenham um papel importante em eventos de comunicação célula a célula e estão presentes no interstício dos tecidos celulares. No contexto do câncer, EVs intersticiais podem ser particularmente importantes na modulação do microambiente do tumor para a célula cancerosa semeadura e crescimento metastático14,15. Consequentemente, há valor no desenvolvimento e otimização de técnicas para extrair vesículas de amostras sólidas. Estes métodos irão fornecer um meio para estudar diretamente órgão - ou tumor derivado de EVs colhidas amostras clínicas, incluindo pequenas biópsias e ressecções parciais ou totais do órgão.
Neste estudo e em um relatório anterior, publicado pelo nosso laboratório16, pretendemos abordar vários grandes preocupações atuais na metodologia de enriquecimento de EV: 1) para descrever uma técnica reprodutível para isolar e purificar EVs para os mais altos padrões atualmente aceitos no campo; 2) a tentativa de isolar pequenas subpopulações de EV altamente enriquecidas em CDDP-derivado exosomes; e 3) para fornecer um protocolo para a extração destas vesículas de espécimes de tecido sólido com a finalidade de caracterização mais.
Recentemente, Kowal e colegas descreveram um gradiente de densidade relativamente pequena escala iodixanol para separar e purificar EV subpopulações com maior eficácia do que a sacarose comparáveis de gradientes de densidade17. No estudo citado, EVs derivado de células dendríticas, capturados em uma fração de densidade relativamente leve, consistente com uma densidade de 1,1 g/mL, foram altamente enriquecidos em proteínas CDDP, acreditadas-se ser mais consistente com uma alta proporção de exosomes presentes neste fração. De acordo com os autores, estas proteínas "bona fide" exosomal incluíam gene de susceptibilidade de tumor 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 e várias annexin proteínas17. Mais tarde, adaptamos essa técnica para conseguir um método de dissociação de tecido descrito por Perez-Gonzalez et al18 e um protocolo de centrifugação diferencial subsequente para isolar todo derivado do cérebro EVs16. Nós também demonstrou a utilidade desse método em caracterizando EV proteomes combinando um protocolo sequencial para jusante quantitativa e comparativa espectrometria de massa de proteína vesicular, anteriormente descrita por nosso laboratório19. Este trabalho que paralelo do laboratório da colina, em que EVs foram enriquecidos do córtex frontal do cérebro de20.
Neste estudo, podemos elaborar sobre esta técnica e alargar a aplicação do protocolo recentemente publicado de nosso laboratório ao isolamento de EVs de tumores de pulmão sólido. A nosso conhecimento, este é o primeiro estudo para descrever um protocolo para enriquecer EVs de ex vivo espécimes de tumor. Dado o interesse generalizado em EVs como novos biomarcadores de diagnósticos e seu papel na tumorigênese, esse método provavelmente irá ser valioso para um número crescente de pesquisadores científicos. Do ponto de vista clínica, EVs intersticiais poderiam abrigar grande valor diagnóstico, particularmente em espécimes onde a avaliação histológica é limitada. Nossa esperança é que o método descrito aqui irá fornecer uma base para uma técnica reprodutível a colheita EVs de frescos ou congelados humanas ou animais cirúrgicos espécimes, pavimentando o caminho para o futuro trabalho descobrir os papéis importantes na patogênese da doença estes pequenos vesículas podem jogar.
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Protocol
Todo cérebro foram obtido com a aprovação do uso institucional do Animal e cuidados Comissão (IACUC) da Universidade do estado da Flórida. Um total de doze cérebro de rato (3 cérebros de cada grupo de idade: 2, 4, 6 e 8 meses) de um J C57BL/6 fundo foram usadas para a extração de EV, como descrito anteriormente,16. Amostras de tumor de pulmão foram generosamente doadas pelo Dr. Mandip Sachdeva sob aprovação da Flórida agrícola e mecânica IACUC Universidade. Tumores de pulmão foram derivados a linhagem de células de adenocarcinoma humano H1975 cultivada em imunodeficientes Balb/c nu/nu camundongos. Dados de duas repetições de tumor representativos são destacados neste estudo.
Nota: Uma visão esquemática do método de isolamento e purificação de vesículas é fornecida na Figura 1.
1. tecido dissociação e centrifugação diferencial
- Prepare-se 10 mL de tampão de dissociação (10 mg de papaína 5,5 mM L-cisteína µM 67 2-Mercaptoetanol; 1,1 mM EDTA) médio e Hibernate-E por aproximadamente 0,4-1,0 g de tecido. Observe que todas as soluções utilizadas para purificação e enriquecimento de EV devem ser diluídas em água ultrapura filtrada.
- Adicione o tecido inteiro fresco ou congelado para buffer de dissociação em um tubo cónico de 50 mL e incubar em água morna e uma banho a 37 ° C por 20 min. de tecido pode ser cortado em fragmentos menores antes de incubação se necessário.
- Após a incubação, adicione inibidores de protease e fosfatase para uma concentração final de 1 x para o buffer de dissociação que contém o tecido.
- Despeje a solução contendo o tecido em um ajuste frouxo homogenizacao homogenizador e dissociar suavemente o tecido através de aproximadamente 30 movimentos lentos por amostra. O número de traços pode ser ajustado com base na consistência do tecido.
- Tecido de transferência dissociado em buffer para um tubo cônico de 50 mL e centrifugar 500 x g por 5 min a 4 ° C para as células e fragmentos de tecido fibroso ou coesa restantes de Pelotas.
- Transferi o sobrenadante para um tubo cônico de 50ml limpo e centrifugar 2.000 x g por 10 min a 4 ° C, a pelota e descartar grandes restos celulares.
- Transferi novamente o sobrenadante para um tubo cônico de 50ml limpo e centrifugar 10.000 x g por 40 min a 4 ° C, a pelota indesejáveis vesículas maiores ou corpos apoptotic pequeno.
Nota: Este sedimento pode ser salvos para estudo adicional das vesículas maiores se desejado. - Decante o sobrenadante através de um filtro de 0,45 µm para um tubo de ultracentrifugação 12ml limpo.
Nota: Amostras de tecido densamente fibróticas podem não ser facilmente filtradas. Estas amostras podem ser filtradas através de um filtro de célula 40 µm, então passadas através de agulhas serialmente menores (18 G, 20 G, 22 G) antes da filtragem através do filtro de 0,45 µm. - Se a amostra a 100.000 x g durante 2 h a 4 ° C, a pelota pequenas EVs.
- Decante o sobrenadante e deixar os tubos de ultracentrifugação invertidos por 5-10 min, tocando frequentemente para remover o líquido residual nas laterais dos tubos. Líquido residual pode também ser aspirado usando uma pipeta de vácuo aspiração.
- Ressuspender o pellet EV em 1,5 mL de tampão de sacarose 0,25 M (10 mM Tris, pH 7,4). É importante garantir a completa re-suspensão da pelota nesta etapa. Para fazer isso, cobrir os tubos com parafilm antes num Vortex EVs em solução. Agitar os tubos se por 15-20 min à temperatura ambiente antes de uma mistura de vórtice final.
- Brevemente centrifuga os tubos a uma velocidade não mais do que 1.000, x g para recuperar a suspensão líquida na parte inferior do tubo.
- Prossiga para as etapas de purificação gradiente abaixo, ou se necessário, armazenar EV suspensão a 4 ° C durante a noite.
2. densidade gradiente purificação
- Adicione 1,5 mL de iodixanol 60% (solução em água) para o buffer de sacarose/Tris de 1,5 mL contendo EVs para criar uma solução final contendo iodixanol 30%. Pipetar acima e para baixo várias vezes para homogeneizar a solução. Ser cauteloso para evitar perder a solução na ponta da pipeta, como a concentração elevada de iodixanol é bastante viscosa.
- Transferi a solução de reserva de 30% iodixanol contendo EVs para o fundo de um tubo de ultracentrifugação 5,5 mL.
- Prepare pelo menos 1,5 mL das soluções de iodixanol 20% e 10% por amostra em água ultrapura a partir da solução estoque de iodixanol 60%.
- Medir 1,3 mL de iodixanol 20% e, cuidadosamente, camada sobre camada gradient inferior usando uma seringa e uma agulha de 18 G. Evite misturar as camadas na interface de densidade, manter o bisel da agulha em contacto com o interior do tubo de ultracentrifugação, logo acima do menisco e adicionar a solução gota a gota.
- 1,2 mL de solução 10% iodixanol acima da layer iodixanol 20% usando a mesma técnica acima da camada.
- Cuidadosamente, equilibrar e carregar os tubos de ultracentrifugação em baldes de rotor e centrifugar em um rotor de balanço-balde a 268.000 x g durante 50 min a 4 ° C. Defina as velocidades de aceleração e desaceleração do centrifugador para as taxas mínimas permitidas para evitar a interrupção das camadas densidade.
- Etiqueta de dez tubos de microcentrifuga de 1,5 mL para cada amostra a correspondem às frações 1 a 10 do gradiente de densidade. Fração 1 é designada como a fração de nível superior que será primeiro removida, enquanto a fração 10 é a fração de fundo última removida.
- Uma vez concluída a ultracentrifugação em gradiente, delicadamente, retirar os tubos do rotor baldes e coloque em um suporte estável. Uma banda visível das vesículas será muitas vezes vista na fração de interesse. Pipete 10 fracções seriais de 490 µ l da parte superior do gradiente para os tubos correspondentes. Haverá uma pequena quantidade de fluido restante na parte inferior do tubo que provavelmente contém proteínas contaminantes. Este exemplo pode ser descartado, ou mantido como fração 11, se desejado.
- Medir os índices de refracção de frações usando um refratômetro. Isso também pode ser realizada com um gradiente de controle se a conservação da amostra é necessária ser executado em paralelo. Pipetar 20-30 µ l de cada fração contendo iodixanol para a superfície de refratômetro e estimar a densidade, comparando os índices de refracção para densidades iodixanol conhecido. Observe que frações podem ser armazenadas durante a noite na solução contendo iodixanol se necessário antes de prosseguir para a próxima etapa de lavagem de ultracentrifugação.
- Transferi cada fração para um tubo de ultracentrifugação 12ml limpo. Adicione 5 mL de tampão fosfato salino (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2mm KH2PO4, pH 7,4) de 1x para o tubo e misture pipetando lentamente acima e para baixo.
Nota: PBS adicionado com as amostras deve ser isento de partículas, assegurada pela filtragem de PBS estéril através de um filtro de 0,22 µm e armazenar à temperatura ambiente para evitar a precipitação de sal. - Adicionar um adicional de 6 mL de 1X PBS na parte superior e outra vez misturar cuidadosamente.
- Se os tubos a 100.000 x g durante 2 h a 4 ° C para re-pequenas vesículas de Pelotas. Decante o sobrenadante e toque os tubos secos antes da lise das vesículas para análise de proteínas (etapa 3) ou re-suspensão de EVs para análise morfológica (passo 5).
3. Lise e Immunoblot confirmação das proteínas EV
Nota: Se a preservação das vesículas toda para caracterização morfológica ou actividade biológica é desejada, pesquisadores podem prosseguir diretamente para o passo 5. Em experimentos iniciais, ou antes da análise de espectrometria de massa, todas as frações recuperadas devem ser analisadas por immunoblot para confirmar fracções com proteínas de EV.
- Para lyse EVs para análise de proteínas, adicione 40 µ l de tampão de Lise forte (5% SDS, 10 mM de EDTA, pH de 120 mM Tris-HCl 6,8, 2,5% 2-Mercaptoetanol, ureia 8m) com a adição de inibidor de protease para EV pelota em tubo se.
Nota: Se as condições não-redução são desejadas para detecção do anticorpo de proteínas, substitua água ultrapura para 2-Mercaptoetanol no buffer de Lise forte. - Garantir a re-suspensão completa da pelota e lise de EVs no buffer colocando parafilm sobre a ultracentrifugação do tubo, num Vortex vigorosamente, então balançando por 20 min em temperatura ambiente antes de um vórtice final.
- Brevemente, centrifugar a 1.000 x g durante 30-60 s para recuperar o volume da amostra inteira. Transferi a amostra para um tubo novo de microcentrifuga de 1,5 mL e loja a-20 ° C a-80 ° C até o processamento adicional.
- Para preparar lysates purificada para análise de immunoblot, adicione 5 x Laemmli tampão de amostra (10% SDS, 250 mM Tris pH 6,8, 1 mg/mL de bromofenol, 0,5 M DTT, glicerol 50%, 5% 2-Mercaptoetanol) para as amostras para uma concentração final de 1 x.
Nota: Se as condições não-redução são desejadas, substitua a TDT e 2-Mercaptoetanol com água ultrapura. - Se todo tecido homogeneizado controles são desejadas, lyse o tecido no ureia contendo forte do lysis detalhados acima com inibidor de protease, centrifugar a 10.000 x g por 10 min descartar o restante da matriz extracelular, células de toda, ou restos celulares intacto. Adicione o homogeneizado de tecido para uma concentração final de 1 x 5 amortecedor da amostra x Laemmli.
- Ferva o amortecedor da amostra contendo amostras de EV ou tecido homogeneizado a 95 ° C por 5-10 min, em seguida, carregar o volume igual (do equivalente a 0,1-0,3 g de tecido material começar; 1-2 µ g da proteína purificada do EV) de frações de 1-10 em um gel de SDS-PAGE 10%. Carregar uma massa igual de homogeneizado de tecido. Maior volume de amostras pode ser necessária para a deteção por anticorpos menos sensíveis.
- Proceda com a eletroforese em gel e análise ocidental do borrão anteriormente detalhada21 para confirmar o EV proteínas nos lysates purificados e comparar a abundância relativa de EV em frações.
Nota: Uma vez EV proteína demonstrada reproducibly em frações consistentes, a lavagem de ultracentrifugação final descrita no passo 2.12 poderá ser limitada gradientes fracções de interesse.
4. quantificação de proteína EV
- Use um ensaio baseado em fluorescência de detergente e ureia-compatível com se sensível quantificação das proteínas EV é desejada para posterior análise (ver Tabela de materiais). Observe que alguns ensaios baseados em fluorescência são compatíveis com o azul de bromofenol presente na Laemmli sample buffer, facilitando a Lise direta da pelota de EV (em passo 2.12) nesse buffer se preferirem.
- Se for usado o kit de quantificação de proteína baseada em fluorescência acima mencionados, ponto 1 µ l de amostra ou padrão pelo menos duplicar o papel de filtro fornecido e continuar a quantificação da proteína de acordo com as instruções do fabricante.
5. Caracterização da morfologia de EV
- Para examinar toda vesículas após a centrifugação final Lave na etapa 2.12, completamente re-suspenda EV pelota em partícula livre 1X PBS. Loja EVs a 4 ° C, para não mais de uma semana até o processamento para evitar ciclos de congelamento e descongelamento.
Nota: É benéfico para anteriormente confirmaram frações consistentemente proteicos enriquecido EV por immunoblot análise para limitar as análises morfológicas de fracções de interesse. - Realize análise de rastreamento em toda EV amostras para determinar a concentração e tamanho das vesículas em preparações, como anteriormente detalhada22de nanopartículas.
- Caracterizar a morfologia EV e confirmar as medições de tamanho por microscopia electrónica de vesículas, se desejado. Grades EM podem ser preparados de suspensões de vesículas seguindo passo 5.123, ou alternativamente, podem ser processados como bloco preparações24 de pelotas 2.12 passo a seguir.
6. em-gel de purificação e digestão do Trypsin para análise de espectrometria de massa
- Se for desejada a caracterização de EV proteomes por espectrometria de massa, carrega massa igual (pelo menos 10 µ g de proteína) de frações contendo EVs em um gel de polyacrylamide pré-moldado para separar e purificar as proteínas. Geles de pré-moldado fornecidos pelo fabricante são preferidos para reduzir os níveis de potencial contaminar proteínas (por exemplo, a queratina) sendo introduzidas as amostras.
- Executar a amostra de pelo menos 0,5 polegadas para o gel de poliacrilamida para purificação de proteínas, em seguida, corrigir e mancha com corante Coomassie, conforme descrito em detalhe25.
- Corte as pistas em 1 mm3 cubos para a digestão de tripsina, como anteriormente detalhada19,26.
- Carrega 5 µ l de amostra digerida peptídeo em instrumento de LC-MS/MS para a separação na coluna analítica e posterior análise por espectrometria de massa de acordo com os parâmetros especificados em detalhe16.
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Representative Results
Uma visão esquemática da dissociação de tecido, centrifugação diferencial e gradiente purificação das vesículas é exibida na Figura 1. Morfológica e imunofenotípica confirmação da gradiente-purificado EVs é destacada na Figura 2. Um diagrama de densidades pode ser reproduzidos após ultracentrifugação do gradiente iodixanol 10-30% é mostrado, com duas populações distintas de vesículas migrando para cima a fração 2 (luz EVs) e fração 5 (EVs densas), dependente do tipo de tecido. Immunoblots representante de frações gradientes exibem o eficiente separação e purificação de pequenos tumor derivado EVs em fração 5. Digno de nota, amostras de tumor de pulmão apareceu enriquecidas em EVs densos comparados à luz EVs (em fração 2) previamente colhidos do tecido de cérebro inteiro, novamente destacado aqui. Como uma análise global do tecido do EVs surgem, será interessante determinar as densidades distintas de EVs produzidos pelos tecidos exclusivos. Análises de acompanhamento representante de nanopartículas e microscopia eletrônica das vesículas derivadas de tecido na fração predominante de vesículas contendo demonstram o enriquecimento e a preservação das vesículas toda consistentes com o tamanho conhecido e estrutura de EVs pequenos. Finalmente, a Figura 3 destaca a utilidade desse método para facilitar a caracterização de espectrometria de massa a jusante das proteínas de vesículas gradiente-purificado, demonstrando a detecção de muitas proteínas previamente identificados na pequenas EVs. Muitas destas proteínas identificadas são consistentes com aquelas enriquecido em pequenas EVs CDDP-derivado anteriormente propostos por Théry e Hill laboratórios17,20.
Figura 1 : Visão geral esquemática de vesículas isolamento e purificação de todo tecido. Seguir o tecido dissociação, etapas de centrifugação diferencial Pre-esclarecimento, filtração e ultracentrifugação, bruto EV pelotas pode ser resuspended no fundo de um gradiente de densidade iodixanol para separação de flutuação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Representante análise morfológica e imunofenotípica de tecido-derivado EVs. (A) calculado densidades de iodixanol gradiente ultracentrifugação seguintes, em média, experimentos independentes, destacando as frações que contêm EVs leves e densas. (B) representante immunoblots das vesículas derivadas de tecido demonstrando o isolamento de luz e predominantemente densa tumor EVs cerebral EVs. Isolados de vesículas estão esgotados de calnexin de proteína não-EV. H, homogeneizado de tecido. (C) nanopartículas análise (NTA) de rastreamento de representante gradiente-purificado tecido EVs. A menor partícula detectada nesta amostra foi 78 nm e aproximadamente 92% das vesículas detectadas foram 250 nm ou menores, consistente com um enriquecimento elevado de pequenos EVs. (D) imagens de microscopia de elétron representativo do cérebro tecidom-derivado EVs. Escala de barras = 200 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Resumo das proteínas de vesículas realçado detectado por espectrometria de massa de um representante amostra tecido derivado do EV. Após EV extração e purificação de gradiente, 10 µ g de proteína de EV na fração enriquecida foi carregado em um gel de poliacrilamida para eletroforese e digestão do trypsin em-gel. Neste tecido-derivado EV amostra representativa, um total de 918 proteínas foram identificadas pela análise de LC-MS/MS. Peptídeos foram identificados, analisados e encontrados para ser enriquecido em exosomal, dos lisossomos e proteínas de membrana plasmática, como descrito anteriormente,16. Aqui, vamos demonstrar a presença de pequeno EV ou proteínas exosomal em nossos preparativos que têm sido descritos por Théry e Hill laboratórios17,20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Gerou-se interesse muito científico com relação os papéis que pequenos EVs jogar o microambiente do tumor, bem como na função, maturação e desenvolvimento do órgão. Em geral, este estudo fornece um fluxo de trabalho otimizado para a extração de EVs intactas de todo o cérebro ou espécimes do tumor. Enquanto aqui estamos simplesmente demonstrar a aplicabilidade desta técnica para EVs derivado de tumor de pulmão, esse método poderia facilmente ser adaptado para trabalhar em outros tecidos sólidos, proporcionando oportunidades para vivo caracterização ex mais pequenas vesículas secretadas que são de amplo interesse biomédico. Enquanto está além do escopo deste estudo, comparação futura de EV conteúdo ao de origem expressão tecidual também será importante para estabelecer a utilidade das vesículas isoladas como biomarcadores de tecido e doença.
No estudo publicado anteriormente por nosso laboratório, nós demonstram claramente as vantagens do gradiente de densidade de flutuação-baseado em gradientes de sedimentação para a purificação das vesículas pequenas enriquecidas. Em essência, uma separação baseada em flutuabilidade melhora a purificação das vesículas, evitando a migração de contaminantes através de frações de interesse. Este princípio parece particularmente importante quando a partir de amostras complexas como todo tecido. Independentemente disso, Ressaltamos a importância dos estudos pré-analítico confirmação das vesículas isoladas descritos, incluindo exame de morfologia EV através de técnicas complementares como a microscopia eletrônica e análise, bem como de rastreamento de nanopartículas como análises bioquímicas, incluindo immunoblotting. Proteínas de EV em frações enriquecidas deve ser confirmada pelo menos três marcadores EV reconhecidos, incluindo uma proteína tetraspaninas, tal como recomendado pelo relatório de Informações mínimas para estudos de EVs (MISEV) publicado no diário de extracelular Vesículas,27. Um marcador de EV negativo deve ser demonstrado estar ausente ou altamente reduzido em frações de EV comparadas ao tecido homogenates. Todos os passos acima enunciados são cruciais para garantir a qualidade de purificação de pequenas vesículas. Além disso, cedo demonstração de consistência de laboratório - e usuário-específico em EV, contendo frações de densidade pode salvar tempo valioso e custos associados a processamento e análise de todas as frações seguindo o passo de ultracentrifugação gradiente de densidade.
É claro que vesículas de diversos tecidos podem flutuar para frações de densidade ligeiramente diferente, ou podem separar em predominantemente luz ou subpopulações densas. Estas diferenças têm sido vistas anteriormente no todo EVs derivado do cérebro em comparação com EVs colhidas das células dendríticas, cultivadas em cultura16,17e são ainda mais demonstrados neste estudo. Mostramos que os espécimes de tumor de pulmão podem abrigar predominantemente que densas EVs pequenos em comparação com o isqueiro EVs isolado do tecido cerebral. Estas diferenças, destacadas-se o método proposto neste estudo podem promover valiosas informações sobre a composição diferencial de EVs, incluindo tumor EVs que podem ser embalados com densa DNA vertentes28,29,30. Devido a essas diferenças na composição de EV, nós fortemente sublinham a importância desses experimentos técnico inicial. Futura aplicação desta técnica para o isolamento de EVs de espécimes diversos tumor será importante para determinar se a densas EVs são predominantemente secretada no interstício de outros tipos de tumor também.
Enquanto a purificação completa do EVs pequenas e o isolamento de subpopulações distintas vesículas permanece uma limitação atual através de laboratórios, este método fornece uma base para estudos adicionais caracterizar pequenas vesículas de uma diversidade de tecido ou tumor tipos e, portanto, pode facilitar uma melhor compreensão da diversidade de EV. Recente separação de partículas de EV por fracionamento de campo-fluxo fluxo assimétrica tem iluminado a possibilidade de carga distinta e funções de pequenas (60-80 nm) versus maior exosomes (90-120 nm) e ainda mais identificado um subconjunto de membrana não limite < 50 nm as partículas denominadas "exomeres"31,32. No entanto, a carga embalada nestas populações de vesículas exclusivo variados através das linhas de celular, destacando a heterogeneidade substancial das vesículas segregadas e a importância da in vitro ou ex vivo vesículas análise abrangente de apoio. Neste estudo, conseguimos enriquecer mais provável para ambas as classes de exosomes identificados. Uma proporção de pequenas aumentada com densidades semelhantes ao exosomes pode estar presente em isolados também. Embora não podemos excluir a possibilidade de exomeres em nossos isolados, vesículas de membrana-limite eram certamente mais abundantes nas fracções gradientes enriquecidas em proteínas de vesícula. Além do pequenos EVs, oncosomes grande (> 1.000 nm) tem sido de interesse recente de câncer biólogos33. Enquanto o protocolo descrito no presente estudo filtra vesículas superiores a 450 nm, exclusão desta etapa pode facilitar a análise destes EVs maiores descrito. Exame futuro de densidades associadas com várias subpopulações de vesículas será importante distinguir estas entidades além de seus tamanhos descritos.
Finalmente, embora nós apreciamos as limitações, incluindo o custo e o tempo associados com esta proposta técnica, também reconhecemos a necessidade de rigorosas métodos fundamentais para caracterizar o tecido EVs e para servir como uma comparação do produto final para constantemente em constante evolução e mais sofisticados métodos no futuro. Estas tecnologias avançadas esperançosamente se iluminarão mais rápidas e clinicamente compatível com técnicas para extrair EVs de espécimes médicas ou cirúrgicas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores Obrigado Dr. Richard Nowakowski e os recursos da Flórida estado Universidade laboratório Animal para fornecer e cuidando de animais utilizados para desenvolver este protocolo, respeitosamente. Agradecemos a Liu Xia, Dr. Rakesh Singh e o Florida estado Universidade translacional Science Laboratory para assistência com o trabalho de espectrometria de massa utilizado para caracterização de vesículas a jusante, bem como a facilidade de FSU biológica ciência Imaging Resource para o uso do microscópio eletrônico de transmissão neste estudo. Finalmente, agradecemos o Dr. Mandip Sachdeva (Florida A & M University) pela doação dos espécimes tumor utilizada no desenvolvimento deste método. Este estudo foi suportado por concessões do departamento de Florida de saúde Ed e Ethel Moore Alzheimer programa de pesquisa de doença atribuído a D.G.M. e J.M.O (6AZ11) e o National Cancer Institute dos National Institutes of Health, sob número de prêmio R01CA204621 atribuído a D.G.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm filter | VWR | 28145-505 | |
| 12 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| 5.5 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| anti-Alix antibody | Santa Cruz | sc-7129 | |
| anti-Calnexin antibody | Santa Cruz | sc-11397 | |
| anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| anti-CD81 antibody | Santa Cruz | sc-9158 | |
| anti-Flotillin 2 antibody | Santa Cruz | sc-25507 | |
| anti-HSC70 antibody | Santa Cruz | sc-7298 | |
| anti-Syntenin-1 antibody | Santa Cruz | sc-100336 | |
| anti-TSG101 antibody | Santa Cruz | sc-7964 | |
| EZQ protein quantification kit | ThermoFisher Scientific | R33200 | |
| FA-45-6-30 rotor | Eppendorf | 5820715006 | |
| FEI CM120 Electron Microscope | TSS Microscopy | ||
| goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) | Genetex | 27171 | |
| HALT phosphatase inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78420 | |
| HALT protease inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78438 | |
| Hibernate E medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| MLS-50 swinging-bucket rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
| NanoSight LM10 | Malvern | ||
| Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Optima XE-100 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Optiprep | Sigma | D1556 | 60% iodixanol in sterile water solution |
| Q Exactive HF Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | ||
| rabbit anti-goat IgG | Genetex | 26741 | |
| rabbit anti-mouse IgG | Genetex | 26728 | |
| Refracto 30PX (refractometer) | Mettler Toledo | 51324650 | |
| S-4-104 rotor | Eppendorf | 5820759003 | |
| SW 41 Ti swinging-bucket Rotor | Beckman Coulter | 333790 | |
| Tabletop 5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 |
References
- Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses. Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- Howitt, J., Hill, A. F. Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases. Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).
- Sardar Sinha, M., et al. Alzheimer's disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers. Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).
- Meckes, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).
- Meckes, D. G. Exosomal communication goes viral. Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).
- Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
- Zhang, X., et al. Exosomes in cancer: small particle, big player. Journal of Hematology Oncology. 8, 83 (2015).
- Janas, A. M., Sapoń, K., Janas, T., Stowell, M. H. Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).
- Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses. Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).
- Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
- Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
- Katsiougiannis, S. Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity. Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Hurwitz, S. N., et al. An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease. Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
- Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space. Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).
- Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).
- Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).
- Hurwitz, S. N., et al. CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.κB Signaling. Journal of Virology. 91 (5), (2017).
- Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).
- Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
- Meckes, D. G. Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).
- Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 6, 23978 (2016).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
- Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nature Communications. 2, 180 (2011).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
- Zijlstra, A., Di Vizio, D. Size matters in nanoscale communication. Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).
- Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. Oncosomes - large and small: what are they, where they came from. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).
