Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Utvinning av extracellulära blåsor från hela vävnad

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/59143
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Florida State University College of Medicine

Summary

Här, tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att isolera små extracellulära blåsor (EVs) från hela vävnader, inklusive hjärnan och tumör exemplar. Denna metod erbjuder en reproducerbar teknik för att extrahera EVs från solid vävnad för ytterligare nedströms analyser.

Abstract

Cirkulerande och interstitiell små membran-bundna extracellulära blåsor (EVs) representerar lovande mål för utvecklingen av nya diagnostiska eller prognostiska biomarkörer analyser, och sannolikt fungera som viktiga aktörer i utvecklingen av ett brett spektrum av sjukdomar. Nuvarande forskning är inriktad på karakterisering av vesikler utsöndras från flera cell och vävnadstyper för att bättre förstå EVs roll i patogenesen av villkor inklusive neurodegeneration, inflammation och cancer. Globalt konsekvent och reproducerbart tekniker att isolera och rena blåsor är dock fortfarande pågår. Dessutom beskrivs metoder för utvinning av EVs från solid vävnad ex vivo knappt. Här, tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att extrahera små EVs sevärdheter från hela färska eller frysta vävnader, inklusive hjärnan och tumör prover, för ytterligare karakterisering. Vi visar denna metod för flera efterföljande analyser, inklusive elektronmikroskopi och immunophenotypic karakterisering av blåsor, samt kvantitativa masspektrometri av EV proteiner anpassningsförmåga.

Introduction

Lilla extracellulära vesicles (EVs) inkluderar endosomal-härledda exosomes och små membran-shed-microvesicles som är av bred biomedicinsk intresse. Liten EVs består av en heterogen population av 50-250 nm membran-bundna blåsor som innehåller biologiskt aktiva proteiner, lipider och nukleinsyror som kollektivt tros spela en viktig roll i en mängd olika sjukdomsprocesser. Främja forskning har särskilt inblandad dessa blåsor i neurodegenerativa och prion sjukdomar, smittsamma processer, autoimmuna eller inflammatoriska sjukdomar, och tumörtillväxt och metastas1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. snabbt växande biomedicinsk forskning om EVs betydelse i sjukdomspatogenes har genererat parallella intresse att utveckla reproducerbara och rigorösa metoder för isolering och rening av dessa blåsor.

En historisk och aktuell utmaning EV karakterisering har varit oförmågan att helt separera små EV subpopulations. Denna utmaning är till stor del på grund av vår begränsade förståelse av de olika molekylära mekanismer som styr biogenes av distinkta blåsor. Överlappande storlek, täthet och biologiska Last mellan subpopulationer ytterligare convolutes dessa distinktioner. En del av denna utmaning har också användningen av allmänt olika anrikning tekniker, ge inkonsekvens i efterföljande analys av enstaka blåsor över laboratorier och undergräver den globala ansträngningen att belysa kategoriska EV populationer.

Det är värt att notera att majoriteten av EV karakterisering har utförts från in vitro-samling av cellkultur supernatant, med nyare in vivo-studier som beskriver tekniker för att isolera blåsor från djurs eller människors kroppsvätskor, inklusive plasma, urin , och saliv. EVs finns i stora mängder i omlopp, erkänt det också att dessa blåsor spelar viktiga roller i cell-till-cell kommunikationshändelser och förekommer i interstitium av cellulära vävnader. I samband med cancer, kan interstitiell volontärerna vara särskilt viktigt i modulerande den tumör närmiljön för cancercell sådd och metastaserande tillväxt14,15. Följaktligen finns det värde i utveckling och optimering av metoder för att extrahera blåsor från solid vävnadsprover. Dessa metoder kommer att tillhandahålla ett sätt att direkt studera orgel - eller tumör - derived EVs skördas från kliniska prover, inklusive små biopsier och partiell eller fullständig orgel resektioner.

I denna studie, och i en tidigare rapport utgiven av vårt laboratorium16, vi strävar efter att ta flera stora aktuella problem i EV anrikning metodik: 1) att beskriva en reproducerbar teknik för att isolera och rena EVs till högsta standard för närvarande accepterat i fältet. (2) för att försöka isolera små EV subpopulations höganrikat i endosomal-derived exosomes; och 3) att ge ett protokoll för utvinning av dessa blåsor från solid vävnadsprover i syfte att ytterligare karakterisering.

Nyligen, Kowal och kollegor beskrivit en relativt småskalig iodixanol täthetlutning för att separera och rena EV subpopulationer med större effekt än jämförbara sackaros densitet övertoningar17. I den citerade studien var dendritiska cell-derived EVs fångas i en relativt ljus densitet bråkdel, konsekvent med en densitet 1,1 g/ml, höganrikat i endosomal proteiner tros vara mest förenligt med en hög andel av exosomes i detta fraktion. Enligt författarna ingår dessa ”bona fide” exosomal proteiner tumör känslighet genen 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 och flera annexin proteiner17. Vi anpassat senare denna teknik för att lyckas en metod av vävnad dissociation beskrivs av Perez-Gonzalez et al18 och ett efterföljande differentiell centrifugering protokoll att isolera hela brain-derived EVs16. Vi har också visat nyttan av denna metod i kännetecknar EV proteom genom att kombinera en sekventiell protokoll för nedströms kvantitativa och jämförande masspektrometri av vesikulär protein, tidigare beskrivits av vårt laboratorium19. Detta arbete parallellt som från Hill laboratoriet, där EVs berikades från främre hjärnbarken hjärnor20.

I denna studie vi utveckla denna teknik och utvidga tillämpningen av det protokoll som nyligen publicerade från vårt laboratorium på isoleringen av EVs från solid lungtumörer. Till vår kunskap är detta den första studien att beskriva ett protokoll för att berika EVs från ex vivo tumör prover. Ges det utbredda intresset för EVs som nya diagnostiska biomarkörer och deras roll i tumourigenesis, denna metod kommer sannolikt visa sig värdefullt att ett växande antal forskare. Ur ett kliniskt perspektiv, kunde interstitiell volontärerna hysa stort diagnostiskt värde, särskilt i exemplar där histologisk utvärdering är begränsad. Vår förhoppning är att den metod som anges här kommer att ge en grund för en reproducerbar teknik att skörda EVs från färska eller frysta djurs eller människors kirurgiska prover, banar väg för framtida arbete att avslöja betydande roller i sjukdomspatogenes dessa små blåsor kan spela.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hela hjärnor erhölls med godkännande från institutionella djur användning och hand kommittén (IACUC) av den Florida State University. Sammanlagt tolv mus hjärnor (3 hjärnor från varje åldersgrupp: 2, 4, 6 och 8 månader) från en C57BL/6 J bakgrund användes för EV utvinning, som tidigare beskrivits16. Lung tumör prover var generöst skänkts av Dr Mandip Sachdeva under godkännande av Florida jordbruks och mekaniska universitet IACUC. Lungtumörer härleddes från den mänskliga adenocarcinom cellinje H1975 odlas i nedsatt immunförsvar Balb/c nu/nu naken möss. Data från två representativa tumör replikat är markerade i denna studie.

Obs: En schematisk översikt av vesikler isolering rening-metoden finns i figur 1.

1. vävnad Dissociation och differentiell centrifugering

  1. Förbereda 10 mL av dissociation buffert (10 mg papain 5.5 mM L-cystein 67 µM 2-merkaptoetanol; 1,1 mM EDTA) i viloläge-E medium per cirka 0,4-1,0 g vävnad. Observera att alla lösningar som används för EV anrikning och rening ska spädas i ultrarena filtrerat vatten.
  2. Lägga hela färsk eller fryst vävnad till dissociation buffert i en 50 mL konisk tub och inkubera i en varmt vatten bad vid 37 ° C i 20 min. vävnad kan skäras i mindre fragment innan inkubering vid behov.
  3. Efter inkubering, lägga till proteas och fosfatas hämmare för en slutlig 1 x koncentration dissociation bufferten som innehåller vävnaden.
  4. Häll lösningen innehållande vävnaden i en loose-fit Dounce Homogenisatorer, och försiktigt separera vävnaden med cirka 30 långsamma drag per prov. Antal slag kan justeras baserat på vävnad konsistens.
  5. Överföring dissocierade vävnad i en buffert i en 50 mL konisk rör och centrifugera vid 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C till pellet cellerna och återstående fibrösa eller sammanhängande vävnad fragment.
  6. Överför supernatanten till en ren 50 mL koniska rör och centrifugera vid 2000 x g i 10 minuter vid 4 ° C till pellet och kasta stora cellulära skräp.
  7. Överför supernatanten igen till en ren 50 mL koniska rör och centrifugera vid 10 000 x g under 40 minuter vid 4 ° C till pellet oönskad större blåsor eller små apoptotiska kroppar.
    Obs: Denna pellet kan sparas för ytterligare en studie av större blåsor om så önskas.
  8. Dekantera supernatanten genom ett 0,45 µm filter i en ren 12 mL ultracentrifugering tub.
    Obs: Tätt fibrotiska vävnadsprover kan inte enkelt filtreras. Dessa prover kan filtreras genom en 40 µm cell SIL, sedan passerade seriellt mindre nålar (18 G, 20 G, 22 G) före filtrering genom 0.45 µm filter.
  9. Ultracentrifugen provet vid 100 000 x g under 2 timmar vid 4 ° C till pellet små EVs.
  10. Dekantera supernatanten och lämna ultracentrifugering rören inverterad för 5-10 min, ofta trycka för att ta bort kvarvarande vätskan på sidorna av rören. Kvarvarande vätska kan också vara aspirerade med hjälp av en utvärderingsenheten vakuum pipett.
  11. Återsuspendering EV pelleten i 1,5 mL 0,25 M sackaros buffert (10 mM Tris, pH 7,4). Det är viktigt att säkerställa full resuspension av pelleten i detta steg. Till gör så, täck rören med parafilm innan vortexa EVs till lösning. Rock ultracentrifugen rören för 15-20 min i rumstemperatur före en final vortex mix.
  12. Kort Centrifugera rören vid en hastighet inte mer än 1 000 x g till återvinna den flytande upphängningen på botten av röret.
  13. Gå vidare till gradient rening stegen nedan, eller om det behövs, lagra EV suspension vid 4 ° C över natten.

2. densiteten Gradient rening

  1. Tillsätt 1,5 mL 60% iodixanol (stamlösning i vatten) till 1,5 mL sackaros/Tris buffert innehållande EVs för att skapa en slutlig lösning som innehåller 30% iodixanol. Pipettera upp och ner flera gånger för att blanda lösningen väl. Vara försiktig att undvika att förlora lösning i pipettspetsen, eftersom hög iodixanol koncentrationen är ganska trögflytande.
  2. Överföra 30% iodixanol buffertlösningen innehållande EVs till botten av en 5,5 mL ultracentrifugering tub.
  3. Bered minst 1,5 mL 20% och 10% iodixanol lösningar per prov i ultrarent vatten från 60% iodixanol stamlösning.
  4. Mäta 1,3 mL 20% iodixanol och noggrant lager ovanpå gradient bottenlagret med hjälp av en spruta och en 18 G nål. Undvik att blanda lager på gränssnittet densitet, hålla fasningen av nålen kommer i kontakt med insidan av ultracentrifugering röret strax ovanför menisken och lägga till lösningen droppvis.
  5. Layer 1,2 mL 10% iodixanol lösning ovanpå 20% iodixanol lagret med samma teknik som ovan.
  6. Noggrant balansera och ladda ultracentrifugering rören till rotorn hinkar och Centrifugera i en swing-hink rotor vid 268,000 x g under 50 minuter vid 4 ° C. Ange den acceleration och retardation hastigheten av centrifugen minimisatserna tillåtet att undvika störningar av densitet lager.
  7. Etikett tio 1,5 mL mikrocentrifugrör för varje prov ska motsvara fraktioner 1 till 10 av täthetlutningen. Fraktion 1 betecknas som den översta fraktion som först försvinner, medan bråkdel 10 är botten bråket senast bort.
  8. När den lutning ultracentrifugering har avslutat, försiktigt ta bort rören från rotor hinkar och placera i en stabil hållare. Ett synligt band av blåsor kommer ofta ses i fraktionen av intresse. Pipettera tio seriell fraktioner av 490 µL från toppen av övertoningen i motsvarande rören. Det blir en liten mängd vätska kvar på botten av röret som sannolikt innehåller kontaminerande proteiner. Detta prov kan kasseras eller behållas som bråkdel 11 om så önskas.
  9. Mäta de refractive indexen av fraktioner med en refraktometer. Detta kan även utföras med kontroll lutning köras parallellt om provet bevarande är nödvändigt. Överför med pipett 20-30 µL av varje fraktion som innehåller iodixanol tryckytan refraktometer och beräkna tätheten genom att jämföra de refractive indexen till kända iodixanol tätheter. Observera att fraktioner kan lagras över natten i iodixanol-innehållande lösning om det behövs innan du fortsätter till nästa ultracentrifugering tvättningen.
  10. Överföra respektive fraktion till en ren 12 mL ultracentrifugering tub. Tillsätt 5 mL av 1 x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) till röret och blanda genom pipettering långsamt upp och ner.
    Obs: PBS tillsätts proverna bör partikel-fri, säkerställs genom filtrering steril fosfatbuffrad Koksaltlösning genom ett 0,22 µm filter och lagring vid rumstemperatur att undvika salt nederbörd.
  11. Lägg till ytterligare 6 mL 1 x PBS till toppen och igen blanda försiktigt.
  12. Ultracentrifugen rören vid 100 000 x g under 2 timmar vid 4 ° C till nytt pellet små blåsor. Dekantera supernatanten och tryck på rören torra innan lys av blåsor för proteinanalys (steg 3) eller resuspension av EVs för morphologic analys (steg 5).

3. Lys och Immunoblot bekräftelse av EV proteiner

Obs: Om bevarandet av hela blåsor för morphologic karakterisering eller biologisk aktivitet önskas, kan forskare gå vidare direkt till steg 5. I inledande experiment, eller innan masspektrometri analys, bör alla fraktioner återvinns analyseras av immunoblot bekräfta fraktioner med EV proteiner.

  1. För att lysera EVs för proteinanalys, lägga till 40 µL stark lyseringsbuffert (5% SDS, 10 mM EDTA, 120 mM Tris-HCl pH 6.8, 2,5% 2-merkaptoetanol, 8 M urea) med tillägg av proteashämmare EV pelleten i ultracentrifugen tube.
    Obs: Om icke-reducerande förhållanden önskas för påvisande av antikroppar av proteiner, ersätta ultrarent vatten för 2-merkaptoetanol i den starka lyseringsbuffert.
  2. Säkerställa komplett resuspension av pellets och lys av EVs i bufferten genom att placera parafilm över ultracentrifugering tube, vortexa kraftigt, sedan gunga i 20 min i rumstemperatur före en final virvel.
  3. Centrifugera kort 1 000 x g för 30-60 s återställa hela provvolymen. Överför provet till en ny 1,5 mL mikrocentrifug rör och förvaras vid-20 ° C till 80 ° C tills vidare bearbetning.
  4. För att förbereda renat lysates immunoblot analys, lägga till 5 x Laemmli prov buffert (10% SDS, 250 mM Tris pH 6.8, 1 mg/mL bromofenolblått, 0,5 M DTT, 50% glycerol, 5% 2-merkaptoetanol) proverna för en slutlig koncentration på 1 x.
    Obs: Om icke-reducerande förhållanden önskas, ersätta DTT och 2-merkaptoetanol med ultrarent vatten.
  5. Om hela vävnad Homogenatet kontroller föredras, lyse vävnaden i den karbamid som innehåller starka lyseringsbuffert detaljerad ovan med proteashämmare, sedan Centrifugera 10 000 x g i 10 min att kassera de återstående extracellulärmatrix, hela celler, eller intakt cellulära skräp. Lägga till 5 x Laemmli prov buffert vävnad Homogenatet för en slutlig koncentration på 1 x.
  6. Koka prov bufferten som innehåller EV eller vävnad Homogenatet prover vid 95 ° C i 5-10 min, sedan Ladda lika stor volym (från motsvarande 0.1-0.3 g av vävnad utgångsmaterial; 1-2 µg av renat EV protein) av fraktioner 1-10 till en 10% SDS-PAGE gel. Ladda lika massa vävnad Homogenatet. Större mängd prover kan behövas för upptäckt av mindre känsliga antikroppar.
  7. Fortsätt med gelelektrofores och Western blot analys som tidigare detaljerade21 att bekräfta EV proteiner i den renade lysates och jämför relativa EV överflöd i fraktioner.
    Obs: När EV protein har visat reproducibly konsekvent fraktioner, kan den slutliga ultracentrifugering tvätt som beskrivs i steg 2.12 begränsas till gradient fraktioner av intresse.

4. EV Protein kvantifiering

  1. Använd ett tvättmedel - och urea-kompatibel fluorescens-baserad analys om känsliga kvantifiering av EV proteiner önskas för vidare analys (se Tabell för material). Observera att vissa fluorescens-baserade analyser är förenliga med den bromophenol blå i Laemmli prov buffert, underlätta direkt lys av EV pelleten (i steg 2.12) i denna buffert om föredrog.
  2. Om ovannämnda fluorescens-baserade protein kvantifiering kit används, spot 1 µL prov eller standard i minst duplicera på det medföljande filterpappret och fortsätta protein kvantifiering enligt tillverkarens anvisningar.

5. karakterisering av EV morfologi

  1. För att undersöka hela blåsor efter den slutliga centrifugeringen tvätta i steg 2.12, grundligt återsuspendering EV pelleten i partikel-fri 1 x PBS. Lagra EVs vid 4 ° C längre än en vecka tills bearbetning för att undvika frysning-tining cykler.
    Obs: Det är fördelaktigt att har tidigare bekräftat fraktioner innehållande konsekvent berikad EV protein immunoblot analys att begränsa morfologiska analyser till bråkdelar av intresse.
  2. Utföra nanopartiklar spårning analys på hela EV prover att bestämma koncentrationen och storlek av blåsor i preparat, som tidigare detaljerade22.
  3. Karakterisera EV morfologi och bekräfta storlek mätningar genom elektronmikroskopi av blåsor, om så önskas. EM stödraster kan framställas från vesikler suspensioner efter steg 5.123, eller alternativt kan bearbetas som block preparat24 från pellets efter steg 2.12.

6. i-gel rening och Trypsin matsmältningen för masspektrometri analys

  1. Om karakterisering av EV proteom av masspektrometri önskas, Ladda lika (minst 10 µg av protein) massa bråk som innehåller EVs till en förtillverkade polyakrylamidgel att separera och rena proteiner. Tillverkaren levereras förtillverkade geler är att föredra att minska nivåerna av potential kontaminerande proteiner (t.ex. keratin) förs in i proverna.
  2. Kör provet minst 0,5 inches till Polyakrylamidgelen för protein rening, sedan fixa och fläckar med Coomassie färgämne, som tidigare beskrivits i detalj25.
  3. Skär köer i 1 mm3 kuber för trypsin matsmältningen, som tidigare detaljerade19,26.
  4. Ladda 5 µL av smält peptid provet till LC-MS/MS instrument för separation på analyskolonnen och efterföljande analys av masspektrometri enligt parametrar som anges i detalj16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En schematisk översikt av vävnad dissociation, differentiell centrifugering och gradient rening av blåsor visas i figur 1. Morphologic och immunophenotypic bekräftelse av toning-renat EVs är markerat i figur 2. Ett diagram av reproducerbara densiteter efter ultracentrifugering 10-30% iodixanol övertoningens visas, med två distinkta vesikler populationer flyttar uppåt till del 2 (ljus EVs) och del 5 (tät EVs), beroende av vävnadstyp. Representativ immunoblots av gradient fraktioner uppvisar effektiv separation och rening av liten tumör-derived EVs i del 5. Notera, lung tumör exemplar dök berikat i tät EVs jämfört med ljus EVs (i fraktion 2) tidigare skördas från hela hjärnvävnad, återigen markerat här. Som en global vävnadsanalys av EVs uppstå, det ska bli intressant att avgöra den distinkta täthet av EVs produceras av unika vävnader. Representant nanopartiklar spårning analyser och elektronmikroskopi av vävnad-derived blåsor i dominerande vesikler innehållande fraktionen demonstrera anrikning och bevarande av hela blåsor överensstämmer med kända storlek och struktur liten EVs. Slutligen, figur 3 belyser nyttan av denna metod för att underlätta efterföljande masspektrometri karakterisering av toning-renat vesikler proteiner, visar att upptäcka många proteiner som tidigare identifierats i små EVs. Många av dessa identifierade proteiner är förenligt med de anrikade med små endosomal-derived EVs tidigare föreslagit Théry och Hill labs17,20.

Figure 1
Figur 1 : Schematisk översikt av vesikler isolering och rening från hela vävnad. Efter vävnad dissociation, före röjningen differentiell centrifugering steg, filtrering och ultracentrifugering, rå EV pellets kan vara resuspended på botten av en iodixanol täthetlutning för floatation separation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Representativa morphologic och immunophenotypic analys av vävnad-derived EVs. (A) beräknade tätheter av iodixanol gradient följande ultracentrifugering, i genomsnitt över oberoende experiment, belysa fraktioner som innehåller ljus och tät EVs. (B) representant immunoblots av vävnad-derived blåsor visar isolering av huvudsakligen tät tumör EVs och ljus hjärnan EVs. Vesikler isolat är utfiskade av icke-EV protein calnexin. H, vävnad Homogenatet. (C) nanopartiklar spårning analys (NTA) av representant gradient-renat vävnad EVs. Den minsta upptäckta partikeln i detta prov var 78 nm och ungefär 92% av blåsor upptäckt var 250 nm eller mindre, är förenliga med en hög anrikning av små EVs. (D) representativa elektronmikroskopi bilder av hjärnans vävnad-derived EVs. Skala barer = 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Sammanfattning av markerade vesikler proteiner upptäcks av masspektrometri representant vävnad-derived EV provet. Efter EV extraktion och gradient rening, 10 µg av EV protein i berikade bråkdel lästes in i en polyakrylamidgel för elektrofores och i-gel trypsin matsmältningen. I denna vävnad-derived EV representativt identifierades totalt 918 proteiner av LC-MS/MS-analys. Peptider var identifieras, analyseras och befunnits vara berikad med exosomal, lysosomala, och plasmamembranet proteiner som tidigare beskrivits16. Här, visar vi förekomst av små EV eller exosomal proteiner i våra förberedelser som har beskrivits av Théry och Hill labs17,20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mycket vetenskapligt intresse har genererats med avseende på de roller som små EVs spela i den tumör närmiljön samt i orgel utveckling, mognad och funktion. Denna studie ger sammantaget ett optimerat arbetsflöde för utvinning av intakt EVs från hela hjärnan eller tumör prover. Även här har vi helt enkelt demonstrera tillämpligheten av denna teknik till lung tumör-derived EVs, kunde denna metod enkelt anpassas för arbete på andra fasta vävnader, vilket ger möjligheter för ytterligare ex vivo karaktärisering av små utsöndrade blåsor som är av brett biomedicinsk intresse. Även utanför ramen för denna studie, framtida jämförelse av EV innehåll som med ursprung vävnad uttryck kommer också att vara viktigt att upprätta verktyget av isolerade blåsor som vävnad och sjukdom biomarkörer.

I den studie som tidigare publicerats av vårt laboratorium, visar vi tydligt fördelarna med flyttankar-baserade täthetlutningen över sedimentering gradienter för rening av berikade små blåsor. I huvudsak förbättrar en flytkraft-baserade separation reningen av blåsor genom att undvika föroreningar migrationen genom fraktioner av intresse. Denna princip visas särskilt viktigt när start från komplexa prover som hela vävnad. Oavsett, betona vi vikten av pre analytiska bekräftelse studierna av isolerade blåsor beskrivs, inklusive undersökning av EV morfologi genom kompletterande tekniker såsom elektronmikroskopi och nanopartiklar spårning analys, samt som biokemiska analyser inklusive immunoblotting. EV proteiner anrikade fraktioner bör bekräftas med minst tre erkända EV markörer, inklusive ett tetraspanin protein, som rekommenderas av rapporten Minimal Information för studier av EVs (MISEV) publicerade i tidskriften av extracellulära Blåsor27. En negativ EV markör bör påvisas vara frånvarande eller mycket nedsatt EV fraktioner jämfört vävnad homogenates. Alla steg ovan är avgörande för kvalitetssäkring av små vesikler rening. Dessutom kan tidig demonstration av laboratorie - och användarspecifika konsekvens i EV-innehållande densitet fraktioner Spara värdefull tid och kostnaden i samband med bearbetning och analysera alla fraktioner efter steget täthet lutning ultracentrifugering.

Det är tydligt att blåsor från olika vävnader kan flyta till lite olika densitet fraktioner eller kan separera i övervägande ljus eller tät delpopulationer. Dessa skillnader har tidigare setts i hela hjärnan som härrör EVs jämfört med EVs skördas från dendritiska celler odlas i kultur16,17, och vidare demonstreras i denna studie. Vi visar att lung tumör prover kan hysa huvudsakligen täta små EVs jämfört med lättare EVs isolerade från hjärnvävnaden. Dessa skillnader framhävs av den metod som föreslås i denna studie kan främja värdefulla undersökningar av differentiell sammansättningen av EVs, inklusive tumör EVs som kan packas med tät DNA strands28,29,30. På grund av dessa skillnader i EV sammansättning kan understryka vi starkt betydelsen av dessa inledande tekniska experiment. Framtida tillämpning av denna teknik för att isoleringen av EVs från olika tumör prover kommer att vara viktigt att avgöra om tät EVs är huvudsakligen utsöndras i interstitium av andra tumortyper samt.

Medan komplett rening av små EVs och isolering av distinkta vesikler subpopulations förblir en strömbegränsning över laboratorier, ger denna metod en grund för fortsatta studier att karakterisera små blåsor från en mångfald av vävnad eller tumör typer, och kan därför underlätta en större förståelse för EV mångfald. Senaste separation av EV partiklar av asymmetriska flöden fält-flow fraktionering har upplyst möjligheten till skilda last och funktioner av små (60-80 nm) kontra större (90-120 nm) exosomes, och ytterligare identifierat en delmängd av icke-membran-bundna < 50 nm partiklar denominerade som ”exomeres”31,32. Dock varierat gods förpackat i dessa unika vesikler populationer över cellinjer, belysa den betydande heterogeniteten av utsöndrade blåsor, och stödja vikten av omfattande in vitro eller ex vivo vesikler analys. I denna studie berika vi troligen för båda klasserna av exosomes identifieras. En del av små microvesicles med liknande densitet till exosomes kan förekomma i isolat samt. Även om vi inte kan utesluta möjligheten av exomeres i vår isolat, var membran-bundna blåsor säkerligen mest rikligt förekommande i gradient fraktioner berikad i vesikler protein. Förutom små EVs, stora oncosomes (> 1000 nm) har varit av senaste intresse för cancer biologer33. Medan protokollet beskrivs i denna studie filtrerar bort blåsor som är större än 450 nm, uteslutande av detta steg kan underlätta undersökningen av dessa större EVs beskrivs. Framtida granskning av tätheter är associerad med olika vesikler subpopulations blir viktigt att skilja dessa enheter förutom deras beskrivs storlekar.

Slutligen, även om vi uppskattar de begränsningar inklusive kostnad och tid som är associerad med denna föreslagna teknik, vi också erkänna behovet av rigorösa grundläggande metoder för att karakterisera vävnad EVs och att fungera som en slutprodukt jämförelse för ständigt utvecklande och mer sofistikerade metoder i framtiden. Dessa advancing technologies kommer förhoppningsvis lysa mer snabba och kliniskt-kompatibla tekniker för att extrahera EVs från medicinska eller kirurgiska prover.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Dr Richard Nowakowski och Florida State University laboratorium djur resurser för att tillhandahålla och ta hand om de djur som används för att utveckla detta protokoll, respektfullt. Vi tackar Xia Liu, Dr. Rakesh Singh och Florida State University translationell vetenskap laboratoriet för hjälp med masspektrometri arbetet används för nedströms vesikler karakterisering, liksom FSU biologisk vetenskap Imaging Resource anläggningen för användningen av transmissionselektronmikroskop i denna studie. Slutligen, vi tackar Dr. Mandip Sachdeva (Florida A & M University) för donation av tumör exemplar används i utvecklingen av denna metod. Denna studie stöddes av bidrag från de Florida Department of Health Ed och Ethel Moore Alzheimers sjukdom Research Program tilldelas D.G.M. och J.M.O (6AZ11) och National Cancer Institute av det nationella Institutes of Health Award nummer R01CA204621 tilldelas D.G.M.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 µm filter VWR 28145-505
12 mL ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 331372
5.5 mL ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 344057
anti-Alix antibody Santa Cruz sc-7129
anti-Calnexin antibody Santa Cruz sc-11397
anti-CD63 antibody Abcam ab59479
anti-CD81 antibody Santa Cruz sc-9158
anti-Flotillin 2 antibody Santa Cruz sc-25507
anti-HSC70 antibody Santa Cruz sc-7298
anti-Syntenin-1 antibody Santa Cruz sc-100336
anti-TSG101 antibody Santa Cruz sc-7964
EZQ protein quantification kit ThermoFisher Scientific R33200
FA-45-6-30 rotor  Eppendorf 5820715006
FEI CM120 Electron Microscope TSS Microscopy
goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) Genetex 27171
HALT phosphatase inhibitor (100x solution) ThermoFisher Scientific 78420
HALT protease inhibitor (100x solution) ThermoFisher Scientific 78438
Hibernate E medium ThermoFisher Scientific A1247601
MLS-50 swinging-bucket rotor Beckman Coulter 367280
NanoSight LM10 Malvern
Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge  Beckman Coulter 393315
Optima XE-100 ultracentrifuge Beckman Coulter A94516
Optiprep Sigma D1556 60% iodixanol in sterile water solution
Q Exactive HF Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific
rabbit anti-goat IgG Genetex 26741
rabbit anti-mouse IgG Genetex 26728
Refracto 30PX (refractometer) Mettler Toledo 51324650
S-4-104 rotor Eppendorf 5820759003
SW 41 Ti swinging-bucket Rotor Beckman Coulter 333790
Tabletop 5804R centrifuge Eppendorf 22623508

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses. Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).
  2. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  3. Howitt, J., Hill, A. F. Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases. Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).
  4. Sardar Sinha, M., et al. Alzheimer's disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers. Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).
  5. Meckes, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).
  6. Meckes, D. G. Exosomal communication goes viral. Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).
  7. Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
  8. Zhang, X., et al. Exosomes in cancer: small particle, big player. Journal of Hematology Oncology. 8, 83 (2015).
  9. Janas, A. M., Sapoń, K., Janas, T., Stowell, M. H. Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).
  10. Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses. Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).
  11. Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  12. Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
  13. Katsiougiannis, S. Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity. Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).
  14. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
  15. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  16. Hurwitz, S. N., et al. An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease. Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).
  17. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
  18. Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space. Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).
  19. Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).
  20. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).
  21. Hurwitz, S. N., et al. CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.κB Signaling. Journal of Virology. 91 (5), (2017).
  22. Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).
  23. Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).
  24. Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
  25. Meckes, D. G. Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).
  26. Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 6, 23978 (2016).
  27. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
  28. Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
  29. Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nature Communications. 2, 180 (2011).
  30. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  31. Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
  32. Zijlstra, A., Di Vizio, D. Size matters in nanoscale communication. Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).
  33. Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. Oncosomes - large and small: what are they, where they came from. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).

Tags

Cancerforskning fråga 144 exosomes extracellulär vesikler vävnad hjärnan tumör masspektrometri täthetlutning ex vivo oncosomes biomarkörer
Utvinning av extracellulära blåsor från hela vävnad
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hurwitz, S. N., Olcese, J. M.,… More

Hurwitz, S. N., Olcese, J. M., Meckes Jr., D. G. Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue. J. Vis. Exp. (144), e59143, doi:10.3791/59143 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter