Summary
Her præsenterer vi en protokol til at måle Shigellacidal aktiviteten af antistoffer i serum. Serum er blandet med bakterier og eksogen supplement, rugede, og reaktionsblandingen er belagt på agar plader. Levedygtige bakterier danner kolonier, som tælles, ved hjælp af en automatiseret koloni optæller, og bruges til at bestemme den baktericide titer.
Abstract
Serum bakteriedræbende assays (SBAs) måle den funktionelle aktivitet af antistoffer og har været anvendt i mange årtier. SBAs måle direkte antistof drab aktivitet ved at vurdere muligheden for antistoffer i serum til at binde sig til bakterier og aktivere komplement. Denne komplement aktivering resulterer i lysering af og drab af målbakterierne. Disse undersøgelser er værdifulde, fordi de går ud over kvantificere antistof produktion for at belyse de biologiske funktioner, som disse antistoffer har, giver forskerne til at studere den rolle, som antistoffer kan spille i forebyggelse af infektion. SBAs har været brugt til at studere immunrespons for mange menneskelige patogener, men der er ikke bredt accepteret metode for Shigella på nuværende tidspunkt. Historisk set, har SBAs været meget arbejdskrævende, der kræver mange tidskrævende trin til nøjagtigt kvantificere overlevende bakterier. Denne protokol beskriver en enkel, robust, og høj overførselshastighed assay at foranstaltninger funktionelle antistoffer specifikke for Shigella i serum in vitro. Metoden beskrevet her tilbyder mange fordele frem for traditionelle SBAs, herunder brugen af frosne bakteriel lagrene, 96 assay godt plader, en mikro-kultur system og automatiseret koloni-optælling. Alle disse ændringer gør dette assay mindre arbejdskrævende og mere høj overførselshastighed. Denne protokol er enklere og hurtigere at udføre end traditionelle SBAs mens du stadig bruger enkle teknologier og let tilgængelige reagenser. Protokollen har været anvendt med succes i flere uafhængige laboratorier og analysen er robust og reproducerbar. Analysen kan bruges til at vurdere immunrespons i prækliniske samt kliniske undersøgelser. Kvantificere shigellacidal antistof titers både før og efter antigen eksponering (enten ved vaccination eller infektion) giver mulighed for en bredere forståelse af hvordan funktionelle antistof svar er genereret og deres bidrag til beskyttende immunitet. Udviklingen af det standardiserede, godt karakteriseret assay kan høj grad lette Shigella vaccine design.
Introduction
Shigella serotyper, Shigella flexneri 2a, S. flexneri 3a og S. sonnei, påvise epidemiologiske forekomst globalt. Diarré sygdom forårsaget af disse Shigella arter virkninger militære, rejsende1, og er en førende årsag til diarré dødsfald blandt børn under 5 i udviklingslandene2. Der er i øjeblikket ingen licens vacciner beskytter mod Shigella, men der er flere kandidat vacciner på forskellige udviklingsstadier. Mange af disse vacciner og andre forebyggende foranstaltninger i øjeblikket i udvikling, fokusere på antistoffer produceres af Shigella LPS (LPS). LP'ER er en attraktiv vaccine kandidat, fordi det er en større overflade antigen og naturlig infektion med Shigella inducerer LPS-specifikke antistoffer, der kan være beskyttende mod ny infektion i en serotype-specifikke måde. Derfor, en vellykket Shigella vaccine vil sandsynligvis nødt til at være multi-Valente og mål 3-4 Shigella serotyperne for at fremkalde immunitet mod 70-80% af globalt cirkulerende stammer3,4, 5 , 6. det kræver at assays til at evaluere Shigella vaccine kandidater være specifik for flere forskellige serotyper.
Nuværende immunologiske assays til evaluering vaccine kandidater fokusere på kvantificere niveauer af antistof titers, men der er par godt karakteriseret assays til at evaluere funktionelle antistoffer. Undersøgelse af antistof funktionsevne er vigtigt fordi patogen specifikke antistoffer er ansvarlige for bekæmpelse af infektion gennem en række funktionelle mekanismer, herunder bindende bakterier overflade antigener, og at forhindre adhæsion til og infektion af epitelceller, målretning bakterieceller eller opsonization og fagocytose, og direkte dræbe patogener af bindende og indlede supplement cascade. Den direkte drab af bakterier af antistoffer opstår når antistoffer binder sig til overfladen komponenter af målbakterierne og indlede supplement cascade fører til aktivering af mange zymogens at i sidste ende resultere i pore dannelse i bakterielle celle forårsager lysis og bakteriel død. Denne direkte drab af bakterier af cirkulerende antistoffer og supplement kan være en afgørende tidlig linje i forsvaret under infektion.
Personer, der er naturligt inficeret have antistoffer med shigellacidal aktivitet i deres sera. Disse Shigella -specifikke antistoffer blev fundet ved hjælp af traditionelle komplement-medieret drab-undersøgelser, 7,8. Dette indikerer, at der kan være en rolle for bakteriedræbende antistoffer i beskyttelse mod Shigella. Traditionelle bakteriedræbende assays er enkle i deres udførelse: serum er varme-inaktiverede (at ødelægge endogene supplement aktivitet) og blandet med bakterier af interesse. Eksogene supplement er tilføjet til denne blanding på en bestemt koncentration. Reaktionsblandingen er udruget for at give mulighed for bakteriel drab og derefter belagt for at bekræfte kolonidannende enheder (CFUs). Når CFUs tælles, en 50% dræbe indeks (KI) kan beregnes og en SBA titer bestemt. Mens denne procedure er forholdsvis enkel, disse assays kan være arbejdskrævende og tidskrævende at udføre og resultaterne kan være meget varierende. Ud over disse begrænsninger, ingen godt karakteriseret funktionelle assays i øjeblikket eksisterer Shigella. Derfor har vi med succes udviklet og kvalificeret en enkel, høj overførselshastighed assay at måle Shigella bakteriedræbende aktivitet for tre af de mest klinisk relevante stammer9. Denne protokol beskriver en SBA med ændringer, der forbedrer assay effektivitet og reproducerbarhed. Først af disse ændringer er brugen af frosne bakteriel bestande. Produktionen af engangsbrug bestande eliminerer behovet for kultur frisk bakterier for hvert assay samtidig reducere analysen til assay variation. En anden tid og arbejdskraft gemme fordel af denne protokol er brugen af en 96-brønd plade assay format. Dette giver mulighed for seriel fortynding af prøver, således at en række koncentrationer kan testes. Det giver også mulighed for brug af multikanals pipetter til plating prøver på firkantet petriskåle. Når disse firkantede petriskåle bruges sammen med en kultur-system, der producerer mikro-kolonier, reduceres antallet af agar plader kræves for analysen. Dette, i kombination med frit tilgængelige koloni-optælling software, oprindeligt udviklet til den pneumokok multiplex opsonophagocytic drab assay (MOPA)10, giver mulighed for hurtig, automatiseret og pålidelige koloni-optællingen. Alle disse forbedringer reducere hands-on assay tid og skabe en høj overførselshastighed system giver mulighed for flere plader skal køres på en gang.
Mens denne protokol er blevet optimeret til tre af de mest klinisk relevante serotyper af Shigella, SBA beskrevet her kan nemt anvendes til mange andre bakterielle patogener. Ud over denne protokol potentielle anvendelse med andre bakterier har denne protokol potentiale til at ekspandere ud ved hjælp af kun serum som råvare, som kunne omfatte en analyse af antistoffer i andre relevante prøve typer såsom slimhinde prøver, herunder spyt og fækal prøver. Brugen af denne analyse at undersøge immunologiske reaktioner efter vaccination kan give bredere indsigt i immunrespons genereret af vaccination fører til den rationelt design af vacciner, og støtten i forståelse af hvordan naturlige immunitet udvikler.
Protocol
Denne protokol følger retningslinjerne i det WRAIR menneske Protection Board. Prøver, der indgår i denne undersøgelse er menneskelige serumprøver indsamlet som en del af WRAIR protokolnummer 1328, under overholdelse af alle institutionelle og føderale regler for beskyttelse af forsøgspersoner. Prøverne blev de identificerede, og brugen af disse anonyme prøver blev klassificeret som ikke-menneskelige subjekt forskning af UAB IRB (protokolnummer N150115001).
1. Forbered analysereagenserne
- Forberede 1% gelatine ved at tilføje 1 g af gelatine i 100 mL vand. Autoklave, og opbevares ved stuetemperatur.
- Forberede 100 mg/mL TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chlorid) stamopløsning (1, 000 x) ved at tilføje 5 g af TTC 40 mL vand. Når TTC er fuldt opløst, justere lydstyrken til 50 mL med vand og sterile filter ved hjælp af 0,2 µm filter. Gemme løsning ved 4 ° C og beskytte mod lys.
Bemærk: TTC farvelægger de bakteriel kolonier og gør dem meget lettere at tælle. TTC løsning har en svag gul farve. Hvis TTC løsning udvikler en rød farve, kassér og forberede frisk. - Forbered 10% natrium indeholder (NaN3) stamopløsning (100 x) ved at tilføje 5 g NaN3 til 40 mL vand. Efter fuldstændig opløsning, skal du tilføje vand til 50 mL. Opbevares ved stuetemperatur.
Forsigtighed: Natriumazid er en gift og kan være giftigt, hvis indtaget eller optages gennem huden eller øjnene. Det kan reagere med bly og kobber VVS til at danne højeksplosive metalazider. Om bortskaffelse af reagenser indeholdende natriumazid, flugter med en stor mængde vand for at undgå azidophobning eller kassere i en biohazard taske. - Forbered LBA plade (LB agar plade) ved at tilføje 35 g af LB agar til 1 L vand og autoklave. Tilsættes 25 mL til hver firkant petriskål (120 x 120 mm2). Inkuber plader på RT for 10-20 min at tillade agar størkne. Placer plader tilbage ind i plastikposer og opbevares ved 4 ° C i op til 1 måned.
- Forbered Overlay Agar ved at tilføje 7,5 g agar til 1000 mL med vand og autoklave. Inkuber i 56 ° C vandbad indtil det skal bruges. Lige før brug, tilsættes 1 mL 100 mg/mL TTC og 10 mL 10% NaN3 og bland godt.
Bemærk: Hver LBA plade behov 25 mL af Overlay Agar. Overlay Agar kan rede op til en måned i forvejen og smeltet i mikrobølgeovn eller på en varmeplade, som er nødvendig for analysen. Sikre at agar temperaturen er ~ 55 ° C før anvendelse til LBA plader. - Forbered analysebuffer ved at tilføje 5 mL af 10 x Hanks's Balanced Salt løsning (HBSS) med Ca2 +/Mg2 + og 5 mL af 1% gelatine til 40 mL vand. Opbevares ved stuetemperatur.
2. klargør supplement og målrette bakterier
-
Forberede baby kanin supplement (BRC)
Bemærk: Detaljerede kriterier for supplement masse udvalg kan findes her: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf- Få frosne BRC og tø med rindende koldt vand. Fysisk blande BRC hver ~ 10-20 min. indtil helt optøet. Udsæt ikke BRC for gentagne fryse tø cykler.
- Mens BRC optøning, etiket 1,5 mL, 5mL eller 15 mL centrifugeglas. Sted mærket rør på is pre-afkøle. Ordentlig rumfanget af BRC til de pre afkølede centrifugeglas (efter påfyldningen, straks returnere hver tube til isen). Gemme delprøver på ≤-70 ° C i fryseren.
Bemærk: Ca 1 m af supplement er nødvendig for hvert assay plade. Supplement delprøver er til engangsbrug og skal være aliquoted i bind afpasset assay layouts. - For at forberede varme-inaktiverede BRC, tø en alikvot af aktive BRC. Forberede en 56 ° C vandbad. Efter BRC er helt optøet, overføre det til et vandbad og Inkuber i 30 min.
- Efter inkubering fjerner varme-inaktiverede BRC fra vandbadet og afkøles på RT for 10-15 min. Bland kraftigt, og alikvot ~ 150 µL til 1,5 mL microcentrifuge rør. Gemme delprøver på ≤-10 ° C.
-
Forberede mål bakterier lager
Bemærk: Nedenstående fremgangsmåde bruges til at forberede 48 delprøver af target bakterier materiel; Hvis flere delprøver er nødvendige for protokollen kan skaleres.- Fjerne bakterier master stock vial fra fryseren og Skrab den frosne bakterielle overflade for at fjerne en lille mængde af is fra hætteglas på en blod agar plade. Straks returnere den master stock hætteglas til fryseren.
- Streak denne lille alikvot af bakteriel bestand på blod agar plade og cover med plade låg. Inkuber pladen hovedet natten over i 37 °C/5% CO2 inkubator.
- Overføre ~ 10 isolerede glat kolonier til en 50 mL tube indeholder 30 mL af LB bouillon. Inkuber i 3-5 timer ved 37 ° C med blid ryster indtil kultur bouillon har en OD600 af ~0.6-0,7.
- Høste top 12,5 mL kultur og overførsel til en frisk 50 mL tube. Der centrifugeres kultur på 15.000 x g i 2 min. ved hjælp af en bordplade mikro-centrifuge. Supernatanten og genopslæmmes pellet i 25 mL af 15% steril glycerol-LB.
- Bland godt og dispensere 0,5 mL alikvoter til sterile 1,5 mL micro centrifugeglas (~ 48 rør). Gemme delprøver på ≤-70 ° C i fryseren.
- Bekræfte det bakterielle identitet ved hjælp af agglutinationstest før brug.
-
Bestemmelse af optimal fortyndingsfaktoren for target bakterier lager
Bemærk: Hver batch af target bakterier lager skal titreres i assay betingelser at fastlægge fortynding nødvendigt at give ~ 120 CFU/spot på LB plader.- Få en mikrotiter plade (fortynding plade) og tilføje 135 µL af analysebuffer til godt 1A. Tilføje 120 µL Assay smør til brønde 1B - 1H.
- Fjerne et hætteglas med frosne målbakterierne fra fryseren og tø op ved stuetemperatur. Tilføj 15ul af optøede bakteriel stock godt 1A for at gøre en 10-fold fortynding af bakteriel bestanden.
- Overføre 30 µL af bakteriel løsning fra godt 1A til godt 1B til at udføre en 5-fold seriel fortynding. Fortsætte 5-fold serielle fortyndinger godt 1 time i alt 8 fortyndinger (1:10; 1:50; 1:250; 1:1 250; 1:6 250; 1:31 250; 1:156 250; 1:781 250).
- Få en anden mikrotiter plade (Assay plade) og tilføje 20 µL af analysebuffer til alt godt i kolonne 1 og 2 i Assay plade.
- Overføre 10 µL fortyndede bakterier fra hver brønd i kolonne 1 i fortynding pladen ind i de tilsvarende brønde i kolonne 1 og 2 af analysen plade. 10 µL af bakterier overføres fra godt 1A af fortynding plade til godt 1A og 2A i Assay plade, osv.
- Fortsat med analyse som beskrevet i Serum bakteriedræbende Assay (SBA) nedenfor for kontrolelementer og Control B, trin 3.6-3.12.
- Når pladerne har været inkuberet på is, skal du bruge en multikanalpipette med 8 pipette tips til spot 10 µL fra brønde i kolonne 1 på en LBA tallerken. Også, spot wells fra kolonne 2 på LBA pladen.
- Fortsætte analysen som beskrevet nedenfor i trin 3,14-4.6.
- Bestemme de bakterier fortynding, der giver ~ 120 CFU/spot i kontrol B, denne fortynding vil blive brugt i analysen.
3. serum bakteriedræbende Assay (SBA)
Bemærk: Nedenstående fremgangsmåde er for en assay plade, men antallet af Assay plader kan øges.
- Varme-inaktivere teste prøver af kvægbruget prøver i vandbad på 56 ° C i 30 min.
Bemærk: Analyseprøverne må være varme-inaktiverede forud for testen at ophæve enhver endogene supplement aktivitet. Dette kan ske forud for analysen og inaktiveret prøver kan re frosset eller opbevares ved 4 ° C indtil testet. - Få en Assay plade og tilføje 20 µL af analysebuffer til kolonner 1 gennem 12 rækker A gennem G. tilføje 20 µL af analysebuffer til kolonne 1 og 2 i række H, se tabel 1.
- Indlæse 30 µL af hver prøve, i to eksemplarer, at træk H af Assay plade. For eksempel, dispensere 30 µL af prøven 1 i wells 3 H og 4 H, og dispensere 30 µL af prøven 2 i brønde 5 H og 6 H, osv.
-
Udføre 3-fold serielle fortyndinger af klargjorte prøver ved hjælp af en multikanalpipette.
- Fjern 10 µ i eksemplet fra brønde 3H - 12H og overførsel til tilsvarende brønde i række G og proeven blandes godt af pipettering op og ned 8 - 10 gange.
- Derefter fjerne 10 µ fra brønde 3G - 12G og overførsel til tilsvarende brønde i række F og bland godt.
- Fortsætte disse serielle fortyndinger gennem rækken A. Efter blanding brønde i række A, Fjern og kassér 10 µl fra brønde 3A-12A, således at alle brønde indeholder 20 µl.
Bemærk: 20 µL serum bruges i en samlet analyse volumen af 80 µL, er der en 4-fold yderligere fortynding i analysen. Denne fortynding skal tages i betragtning under beregning af en SBA titer ved at multiplicere fortyndingen af serum med 4. For eksempel, benyttes en start fortynding på 1:2, er de faktiske fortynding bliver testet 1:8.
- Fjerne et hætteglas med frosne Target bakterier lager og tø ved stuetemperatur. Fortynd bakterier i 20 mL af analysebuffer efter forudbestemte optimal fortyndingsfaktoren (denne fortyndingsfaktoren var bestemt i afsnit 2.3). Tilsæt 10 µL fortyndede bakterier til hver brønd af assay plade ved hjælp af en multikanalpipette.
- Fjerne et hætteglas med frosne BRC og et hætteglas med frosne varme-inaktiverede BRC, tø ved stuetemperatur med rindende koldt vand eller anbringe på risten i en biologisk sikkerhed kabinet med blæser luft til at tø hurtigt.
- Forberede en 20% opløsning af varme-inaktiverede BRC. Mix 100 µL af varme-inaktiverede BRC med 400 µL af analysebuffer. Tilføje 50 µL af denne 20% varme-inaktiverede BRC løsning til alle brønde i kolonne 1 (kontrolelementer wells).
Bemærk: Varme-inaktiverede BRC bruges som en kontrol til at overvåge ikke-specifikke drab (NSK) i analysen. - Forberede en 20% opløsning af indfødte BRC. 1 mL af indfødte BRC blandes med 4 mL af analysebuffer. Tilføje 50 µL af denne blanding til alle brønde i kolonne 2 til 12 (kontrol B og test stikprøven wells).
Bemærk: Den endelige koncentration af BRC i reaktionsblandingen er 12,5%. - Kort blandes Assay pladen ved at ryste forsigtigt for 10-15 s på en plade shaker eller mix af pipettering op og ned 8 gange ved hjælp af en multikanalpipette.
- Sætte Assay pladen i 37 ° C mikrobiologiske inkubator for 2 h (uden rysten).
- Tør 2 LBA plader ved at fjerne låg og placere plader opad i biologiske sikkerhed kabinet i 40-60 min.
- Når 2 h inkubation er komplet, flytte Assay plade til våd is og inkuberes i 10-20 min at stoppe reaktionen.
- Ved hjælp af en 12-kanals pipette, bland brønde i række H og spot plade 10 µL af reaktionsblandingen på bunden af en LBA plade. Straks VIP pladen og tillade steder at køre for ~1.5-2 cm. Gentag denne procedure for række G, F og E, spotte dem over den foregående række på LBA plade. Række E, F, G og H er spottet på et LBA plade, og række A, B, C og D er spottet på en anden LBA tallerken på samme måde, se figur 1.
- Inkuber LBA plader ved stuetemperatur, indtil løsningen er adsorberet på LBA plader (10-15 min). Sætte låg på LBA plader og placere LBA plader i den mikrobiologiske inkubator hovedet til inkuberes natten over (~ 16-18 h). Inkuber S. flexneri 2a og 3a på 29 ° C, og der inkuberes S. sonnei er på 26 ° C.
Bemærk: Disse temperaturer giver mindre "mikro-kolonier" med størrelser passende til præcis optælling af en koloni counter9. - Efter natten inkubation, tilsættes 25 mL af Overlay Agar (ved ~ 55 ° C) indeholdende 100 µg/mL TTC og 0,1% NaN3 hvert LBA pladen.
- Inkuber LBA plader ved 37 ° C i 2 timer til at tillade de overlevende bakterier til at udvikle rød farve, se figur 1 nedenfor.
- Fotografere plader ved hjælp af et digitalt kamera og overføre billeder til en computer, hvor NISTS integrerede koloni Enumerating Software (NICE) er blevet installeret, se figur 2.
Bemærk: FLOT koloni-optælling software er tilgængelig uden beregning. Se Materialer liste for nærmere oplysninger og installationsinstruktioner.
4. Grev bakteriel kolonier
- Åben NICE Software og input Operatør navn, eksperiment oplysninger og nogen assay noter i de tomme felter. Når disse data er indtastet skal du klikke på knappen færdig .
- Importere fotograferede plader ved at klikke på knappen Åbn og vælge de korrekte filer fra computeren.
- Justere assay parametre ved at angive antallet af rækker til 4 og antallet af kolonner til 12. Juster indstillingen baggrund til-3 sigma og opløsning til lav. Se figur 2.
- Flytte regioner af interesse (ROIs) ved at klikke og trække så at hver ROI er direkte over én prøve stedet. Sikre, at alle bakteriel kolonier er inde på Investeringsafkast med ingen overlapning mellem prøver. Når en plade er færdig, dobbeltklik på den næste plade i listen gemte data billeder og justere ROIs. Se figur 2.
- Når alle pladerne er blevet justeret, skal du klikke på knappen grønne Count , se figur 2 og figur 3. Klik på knappen Eksporter for at eksportere data i.xls/.xlsx format, når optællingen er færdig. Navngive og gemme filen.xls/.xlsx til dataanalyse.
- Arrangere eksporteres data i en tabelformat, så tæller er organiseret i en tabel, der repræsenterer 96-brønd assay pladen, se tabel 2.
5. Beregn SBA Titer (KI) og ikke-specifik drab (NSK)
Bemærk: SBA titer eller dræbe indeks (KI) er defineret som reciprokke af den serumfortynding, der dræber 50% af målbakterierne.
- Beregne den 50% dræbe indeks (KI) cutoff værdi af gennemsnit CFU af aktive supplement kontrolhullerne (kontrol B) og dividere med 2. Beregner den gennemsnitlige CFU for hver fortynding af hver prøve, der blev kørt i to eksemplarer, se tabel 3.
- Fordi en serumfortynding vil sjældent give præcis denne 50% KI værdi, det kan blive interpoleret fra to sekventielle serum fortyndinger, der dræber mindre end 50% og en, der dræber mere end 50%, se figur 4. Formlen for beregning af de interpolerede SBA KI er vist nedenfor:
Bemærk: Bakteriedræbende titer eller KI, kan også beregnes automatisk ved hjælp af Opsotiter software udviklet af UAB. At anmode om Opsotiter, kontakt Dr. Moon Nahm eller Mr. Rob Burton. Se https://www.vaccine.uab.edu for at finde kontaktoplysningerne. - Beregne NSK værdi ved at tage 1 minus gennemsnittet af kontrol B divideret med gennemsnittet af kontrol A.
Representative Results
En 96-brønd plade layout brugt i en typisk assay er vist i tabel 1. Dette layout har aktive supplement-kontrolhullerne (kontrol B), varme-inaktiverede supplement-kontrolhullerne (kontrolelementer) og fem prøver i to eksemplarer. Prøverne er seriefremstillede fortyndet 3-fold op plade fra række H til at række en giver mulighed for 8 fortyndinger af hver prøve skal testes på én gang. Figur 1 viser to LBA plader efter natten inkubation og overlay tilsætning. Farve udvikling har fundet sted og alle overlevende kolonier er synlige i rød. Bakteriel drab ses tydeligt for alle stikprøver, der undersøges i de første tre fortyndinger (rækker F-H) og som prøverne fortyndes yderligere op på pladen, et fald i bakteriel drab ses hvor serum er mindre koncentreret. NICE software interface kan ses i figur 2. Mikro-koloni tæller fra NICE software kan ses i figur 3, og disse tællinger har været organiseret i tabel 2. Den gennemsnitlige CFU tælle nemlig hver fortynding af hver prøve er beregnet og en 50% KI værdi er beregnet i tabel 3. Denne 50% KI værdi kan anvendes på de gennemsnit CFUs for hver serumfortynding til at bestemme de værdier, der er nødvendige for at beregne SBA KI efter formel beskrevet i figur 4. Det endelige resultat af analysen er vist i tabel 4.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | Kontrol A | Kontrol B | Fortynding 8 | Fortynding 8 | Fortynding 8 | Fortynding 8 | Fortynding 8 | Fortynding 8 | Fortynding 8 | Fortynding 8 | Fortynding 8 | Fortynding 8 |
| B | Kontrol A | Kontrol B | Fortynding 7 | Fortynding 7 | Fortynding 7 | Fortynding 7 | Fortynding 7 | Fortynding 7 | Fortynding 7 | Fortynding 7 | Fortynding 7 | Fortynding 7 |
| C | Kontrol A | Kontrol B | Fortynding 6 | Fortynding 6 | Fortynding 6 | Fortynding 6 | Fortynding 6 | Fortynding 6 | Fortynding 6 | Fortynding 6 | Fortynding 6 | Fortynding 6 |
| D | Kontrol A | Kontrol B | Fortynding 5 | Fortynding 5 | Fortynding 5 | Fortynding 5 | Fortynding 5 | Fortynding 5 | Fortynding 5 | Fortynding 5 | Fortynding 5 | Fortynding 5 |
| E | Kontrol A | Kontrol B | Fortynding 4 | Fortynding 4 | Fortynding 4 | Fortynding 4 | Fortynding 4 | Fortynding 4 | Fortynding 4 | Fortynding 4 | Fortynding 4 | Fortynding 4 |
| F | Kontrol A | Kontrol B | Fortynding 3 | Fortynding 3 | Fortynding 3 | Fortynding 3 | Fortynding 3 | Fortynding 3 | Fortynding 3 | Fortynding 3 | Fortynding 3 | Fortynding 3 |
| G | Kontrol A | Kontrol B | Fortynding 2 | Fortynding 2 | Fortynding 2 | Fortynding 2 | Fortynding 2 | Fortynding 2 | Fortynding 2 | Fortynding 2 | Fortynding 2 | Fortynding 2 |
| H | Kontrol A | Kontrol B | Fortynding 1 | Fortynding 1 | Fortynding 1 | Fortynding 1 | Fortynding 1 | Fortynding 1 | Fortynding 1 | Fortynding 1 | Fortynding 1 | Fortynding 1 |
| Prøve 1 | Prøve 2 | Prøve 3 | Prøve 4 | Prøve 5 | ||||||||
Tabel 1: Assay plade layout. Kolonne 1 og 2 indeholder supplement-kontrolhullerne. Kontrolelementer er placeret i kolonne 1 og er varme, inaktiverede supplere kontrol, der indeholder SBA buffer, bakterier og varme-inaktiverede supplement. B er beliggende i kolonne 2 og er aktivt supplere kontrol, der indeholder SBA buffer, bakterier og supplement. Kolonner 3-12 indeholder serumprøver. Hver prøve køres duplikerede og seriefremstillede fortyndet 3-fold fra række H til række A
Figur 1: LBA plader efter farveudviklingen. Repræsentative S. flexneri 3a bakteriel mikro-kolonierne er vokset natten til en passende størrelse. Overlay agar er blevet tilføjet og kolonier har udviklet en rød farve ved reduktion af TTC sammensatte i overlay agar. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: NISTS integrerede koloni optælleren (NICE) software interface. Grafisk repræsentation af NICE software interface. Regioner af interesse (ROIs) er centreret over kolonier af hver plet før optællingen. Data kan eksporteres direkte fra vinduet NICE. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: LBA plader optalte i NICE Software. Fotografi Farvebilleder er indlæst i NICE software og koloni danner enheder (CFUs) tælles automatisk. Dette billede viser to repræsentative LBA plader med deres koloni count oplysninger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| 185 | 167 | 145 | 151 | 122 | 134 | 119 | 142 | 124 | 115 | 113 | 123 | 1:17496 | Fortynding 8 |
| 186 | 152 | 145 | 138 | 132 | 135 | 108 | 116 | 100 | 119 | 105 | 109 | 1:5832 | Fortynding 7 |
| 179 | 160 | 145 | 135 | 109 | 120 | 54 | 55 | 71 | 75 | 79 | 89 | 1:1944 | Fortynding 6 |
| 193 | 153 | 146 | 138 | 87 | 105 | 5 | 6 | 6 | 9 | 19 | 30 | 1:648 | Fortynding 5 |
| 184 | 129 | 121 | 143 | 6 | 7 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1:216 | Fortynding 4 |
| 180 | 145 | 22 | 24 | 2 | 3 | 3 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 1: 72 | Fortynding 3 |
| 207 | 129 | 1 | 0 | 2 | 2 | 1 | 0 | 4 | 1 | 0 | 1 | 1:24 | Fortynding 2 |
| 201 | 140 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 1 | 0 | 4 | 4 | 1:8 | Fortynding 1 |
| Kontrol A | Kontrol B | Prøve 1 | Prøve 2 | Prøve 3 | Prøve 4 | Prøve 5 | |||||||
Tabel 2: tællinger af bakteriel kolonier. CFU tæller er eksporteret fra den hyggelig programmel hen til excel-format. Disse tæller kan arrangeres i en tabel, der viser bakterielle tæller for alle dobbelte prøver og kontrolhullerne.
| Kontrol A | Kontrol B | 148 | 128 | 131 | 120 | 118 | 1:17496 | Fortynding 8 |
| 189 | 147 | 142 | 134 | 112 | 110 | 107 | 1:5832 | Fortynding 7 |
| NSK (1-CtrB/CtrA): 22% | 140 | 115 | 55 | 73 | 84 | 1:1944 | Fortynding 6 | |
| 50% KI (CtrB/2): 73 | 142 | 96 | 6 | 8 | 25 | 1:648 | Fortynding 5 | |
| 132 | 7 | 1 | 1 | 1 | 1:216 | Fortynding 4 | ||
| 23 | 3 | 2 | 1 | 0 | 1: 72 | Fortynding 3 | ||
| 1 | 2 | 1 | 3 | 1 | 1:24 | Fortynding 2 | ||
| 0 | 0 | 1 | 1 | 4 | 1:8 | Fortynding 1 | ||
| Prøve 1 | Prøve 2 | Prøve 3 | Prøve 4 | Prøve 5 | ||||
Tabel 3: beregning af 50% KI cutoff værdi og dublerede udsnit gennemsnittene. 50% KI cutoff værdi blev beregnet ved at tage gennemsnittet af alle kontrol B brønde og dividere med 2. Gennemsnit af dubletter blev beregnet for hver fortynding af hver prøve, der blev kørt i to eksemplarer. NSK værdi beregnes ligeledes.
Figur 4: skematisk af lineær interpolation. Antallet af overlevende bakterier (y-aksen) på hver fortynding af serum testet (x-akse) er afbildet (sorte diamanter), og enkelte punkter er forbundet med den tynde, stiplede sorte linie. Solid og stiplede streger angiver 0% og 50% drab, henholdsvis. Serum fortyndinger ovenfor (fortynding 5) og under (fortynding 4) 50% dræbe linje er forbundet med en rød linje, og bakteriedræbende titer (KI) er angivet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| SBA KI | |
| Prøve 1 | 72 |
| Prøve 2 | 216 |
| Prøve 3 | 1994 |
| Prøve 4 | 1994 |
| Prøve 5 | 648 |
Tabel 4: SBA resultater viser bakteriedræbende titer (KI). Endelige SBA KI værdier er blevet fastlagt for hver enkelt prøve og er vist. Disse værdier beregnes ved hjælp af de gennemsnitlige CFUs, 50% KI skæringsværdien og formlen lineær interpolation.
Discussion
Protokollen beskrevet her viser en funktionel immun assay for at vurdere shigellacidal aktiviteten af antistoffer i serum. I analysen viste for denne protokol monoklonale antistoffer specifikke for S. flexneri 3a blev brugt9 sammen med kontrol menneskelige sera fra en tidligere Shigella studere vaccine11. Kilden til serum testet i dette assay kan varierer meget fra prækliniske animalske prøver til humane kliniske prøver, og shigellacidal aktivitet i serumprøven vil blive påvirket af vaccinationer og engagementer, at enkelt har oplevet. Nogle krydsreaktivitet kan forventes mellem nærtbeslægtede serotyper, især S. flexneri 2a og S. flexneri 3a men lille krydsreaktivitet er blevet set i disse stammer i forhold til S. sonnei9. Grundlag af SBA fokuserer på aktivering af komplement kaskade af antigen-antistof bindende. Derfor, håndtering af BRC reagens er en af de mange kritiske trin involveret i gennemførelsen af denne protokol. BRC blev udvalgt til brug i denne analyse på grund af sin ensartet ydelse og lave niveauer af NSK andre bakteriedræbende assays12,13,14. Aktiviteten af BRC er temperatur følsom og skal træffes passende foranstaltninger til at sikre, Frys thaw cycles er minimeret, at BRC er aliquoted til engangsbrug diskenheder, og at BRC delprøver er optøet hurtigt, umiddelbart før brug i analysen. Sammenhængen i supplement aktivitet vil påvirke reproducerbarhed af denne analyse. En anden afgørende skridt, der påvirker assay reproducerbarhed er produktion og fortynding af bakteriel bestande. Det er vigtigt, at før du begynder analysen den passende fortynding af bakteriel bestande bestemmes, som analysen succes er afhængig af den ensartet produktion af kontrol A og B har CFU tæller gennemsnit ~ 120 CFU pr. spot. For at få steder, der er tællelig af softwaren, er det også bydende nødvendigt, at teknik, der anvendes til plade bakterier er udført. Deposition af bakteriel løsning og vippe af pladen, således at steder køre ~ 2-3 cm er kritisk for at producere kolonier af den lige størrelse og korrekt fordeling til præcis optælling af den hyggelig programmel. Mastering alle disse trin sikrer, at nøjagtige og ensartede resultater er produceret af denne protokol
Selv når alle kritiske trin udføres kan godt der stadig være tilfælde hvor det er nødvendigt at ændre eller foretage fejlfinding af denne protokol. Ændringer af denne protokol til at evaluere andre bakterier kan kræve optimering af overnight LBA plade inkubation temperaturen, for dannelsen af mikro-kolonier. Andre stammer af bakterier eller antistof kilder, bortset fra serum, kan kræve optimering af supplement koncentration. NSK værdier og KIs af kontrol sera bør også overvåges for at sikre, at analysen arbejder korrekt. NSK bør ikke stige over 70%. KI kontrol sera ikke bør variere betyde mere end ± 2SD. For at opnå succesfulde og konsekvente resultater, når du bruger denne protokol, vil det være nødvendigt at udføre alle trinene som beskrevet her med særlig vægt på de kritiske trinene ovenfor.
Mens denne protokol udfylder en vigtig behov i forskerkredse Shigella , er det ikke uden sine begrænsninger. Denne protokol er baseret på biologiske materialer og vil derfor altid være nogle variation, der er svære at styre. Variationer i supplement aktivitet fra forskellige partier og kilder kan bidrage til variation i assays. For at afbøde dette, er det vigtigt at håndtere supplement korrekt og teste nye masser af supplement til aktivitet før køb. Det kan også være nyttigt at oprette emnepuljer supplement masser med kendt aktivitet at have en ensartet forsyning. Denne protokol er simpel af design og kræver ikke nogen specialiseret udstyr og automatiseret kolonien optælling af software er frit tilgængelig. Mens denne enkelthed er en fordel, kræver at lade denne protokol anvendes i stort set ethvert laboratorium, det stadig en natten inkubation. Seneste assays er blevet beskrevet, har meget kortere inkubation krav, men kræver specialiseret, forberedende reagenser15. En anden begrænsning i denne analyse er, at i sin nuværende form kun er i stand til at undersøge en enkelt bakteriearter på én gang. I feltet Shigella er der et ønske om at skabe en multivalent vaccine, og har immunologiske assays, der kan vurdere patogener i en multiplex måde er af stor værdi. Denne analyse kan ændres i fremtiden for at imødekomme dette behov, men i sin nuværende form, det er en single-plex assay.
Mens denne analyse har visse begrænsninger, har det stadig mange fordele frem for eksisterende eller alternative metoder. Disse fordele omfatter mange forbedringer, der kombineres for at gøre udførelsen af denne metode meget mindre arbejdskrævende og mere høj overførselshastighed end traditionelle SBAs. Brugen af frosne bakteriel lagrene, en 96-brønd plade assay format, plating på større firkantet petriskåle, farvning af kolonierne, der giver mulighed for at fotografere og automatisk koloni-optælling, bidrage alle til at reducere de materialer og tid til at fuldføre dette assay. Denne analyse har også fordele frem for andre metoder, høj overførselshastighed, fordi det ikke kræver nogen specialiserede reagenser eller udstyr. Protokollen beskrev kan udføres med grundlæggende reagenser og frit tilgængelig software, så for dens anvendelse i et laboratorium indstilling.
Alle de fordele, denne protokol giver støtter dets anvendelse i mange fremtidige undersøgelser. Analysen er særdeles velegnet til undersøgelse af immunrespons efter vaccination eller naturlig infektion. Dette program giver mulighed for SBA at være et værdifuldt redskab i Shigella vaccine forskning og er allerede blevet anvendt til at evaluere vaccine immunogenicitet i Shigella bio-konjugat vacciner hvor det har vist evne af disse vacciner til medføre produktion af funktionel antistoffer16. Denne protokol er blevet grundigt testet af flere laboratorier og har vist sig at producere pålidelige, reproducerbare resultater9. Denne protokol producerer også sammenlignelige resultater, når de samme prøver er testet ved hjælp af andre bakteriedræbende assays17. Sammenhængen i data genereret af denne analyse, og kompatibiliteten med andre ældre metoder gør det en robust værktøj til præcist vurdere bakteriedræbende aktivitet i serumprøver. Analysen kan også let tilpasses evaluere ekstra prøve typer. Mens serum er let tilgængelige i voksen kliniske forsøg, kan det være svært at få tilstrækkelig serum i forsøg med fokus på spædbørn og små børn; en af de endelige målpopulationer for Shigella vacciner. I disse forsøg, fuldblod rutinemæssigt indsamles på filtrerpapir og tørret. Der har været nogle indledende succes med denne type prøve format ved hjælp af SBA. Ud over fuldblod er slimhinde prøver (f.eks. spyt, fækal ekstrakter og urin) også et mål, der er relevante i Shigella vaccine forskning. I øjeblikket, denne protokol er blevet evalueret for tre af de mest klinisk relevante serotyper af Shigella , men det kan også tilpasses yderligere Shigella spp. samt andre bakterielle patogener. Fremtidige arbejde vil fokusere på produktionen af en multiplex assay med mange af de samme egenskaber som analysen beskrives af denne protokol. En multiplex assay vil give mulighed for evaluering af flere Shigella serotyper samtidigt, yderligere bevare prøve diskenheder og hænder på assay tid. Der er også arbejde undervejs at overføre dette assay til laboratorier over hele kloden. Disse globale evalueringer vil generere flere data mod kvalificerende assay forskning ligestillingsudviklingen, samtidig med at det stigende antal Mikrobiologi og Immunologi laboratorier, der har adgang til denne SBA at evaluere bakterier og serum prøver indsamlet fra forskellige endemiske steder. Analysen beskrevet her er enkel og høj overførselshastighed og har mulighed for at forbedre immunologiske vurdering i Shigella felt, samt bredere applikationer til vurdering af andre bakterielle patogener.
Disclosures
R.W.K er ansat af den amerikanske regering og som sådan synspunkterne i denne publikation er dem af forfatterne og afspejler ikke nødvendigvis de officielle politik eller position af Institut for hæren, Department of Defense, og heller ikke den amerikanske regering.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af et tilskud fra stien til M.H.N. Denne undersøgelse blev gennemført som et kooperativ forskning og udviklingsaftale mellem Walter Reed Army Institute of Research og University of Alabama i Birmingham.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride) | Sigma | T8877 | ≥98.0% (HPLC) |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma | S2002 | ≥99.5% |
| Baby Rabbit Complement | PelFreez | 31061-3 | 3-4 week old |
| HBSS with Ca2+/Mg2+ | Invitrogen | 14065-56 | Without Phenol Red |
| LB Agar (Lennox) | Sigma | L2897 | Powder microbial growth medium |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Powdered, (C12H18O9)n |
| Glycerol | Sigma | G5516 | For molecular biology, ≥99% |
| LB Broth (Lennox) | Sigma | L3022 | Powder microbial growth medium |
| Square Petri Dish | Sigma | Z617679-240EA | 120 mm x 120 mm |
| Assay Plate | Costar | 3799 | 96 well u-bottom plate with lid |
| NICE Software | University of Alabama at Birmingham | ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/ |
References
- Riddle, M. S., Sanders, J. W., Putnam, S. D., Tribble, D. R. Incidence, etiology, and impact of diarrhea among long-term travelers (US military and similar populations): a systematic review. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 74 (5), 891-900 (2006).
- Tickell, K. D., et al. Identification and management of Shigella infection in children with diarrhoea: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), e1235-e1248 (2017).
- Livio, S., et al. Shigella isolates from the global enteric multicenter study inform vaccine development. Clinical Infectious Diseases. 59 (7), 933-941 (2014).
- Barry, E. M., et al. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 10 (4), 245-255 (2013).
- Noriega, F. R., et al. Strategy for cross-protection among Shigella flexneri serotypes. Infection and Immunity. 67 (2), 782-788 (1999).
- Levine, M. M., Kotloff, K. L., Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road. Nature Reviews Microbiology. 5 (7), 540-553 (2007).
- Sayem, M. A., et al. Differential host immune responses to epidemic and endemic strains of Shigella dysenteriae type I. Journal of Health Population and Nutrition. 29 (5), 429-437 (2011).
- Rahman, M. J., et al. Effects of zinc supplementation as adjunct therapy on the systemic immune responses in shigellosis. The American Journal of Clinical Nutrition. 81 (2), 495-502 (2005).
- Nahm, M. H., et al. interlaboratory evaluations, and application of a simple, high-throughput Shigella serum bactericidal assay. mSphere. 3 (3), (2018).
- Burton, R. L., Nahm, M. H. Development and validation of a fourfold multiplexed opsonization assay (MOPA4) for pneumococcal antibodies. Clinical and Vaccine Immunology. 13 (9), 1004-1009 (2006).
- Tribble, D., et al. Safety and immunogenicity of a Shigella flexneri 2a Invaplex 50 intranasal vaccine in adult volunteers. Vaccine. 28 (37), 6076-6085 (2010).
- Kim, H. W., Kim, K. H., Kim, J., Nahm, M. H. A high throughput serum bactericidal assay for antibodies to Haemophilus influenzae type b. BMC Infectious Diseases. 16, 473 (2016).
- Maslanka, S. E., et al. Standardization and a multilaboratory comparison of Neisseria meningitidis serogroup A and C serum bactericidal assays. The Multilaboratory Study Group. Clinical Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (2), 156-167 (1997).
- Jang, M. S., Sahastrabuddhe, S., Yun, C. H., Han, S. H., Yang, J. S. Serum bactericidal assay for the evaluation of typhoid vaccine using a semi-automated colony-counting method. Microbial Pathogeneis. 97, 19-26 (2016).
- Necchi, F., Saul, A., Rondini, S. Development of a high-throughput method to evaluate serum bactericidal activity using bacterial ATP measurement as survival readout. PLoS One. 12 (2), e0172163 (2017).
- Riddle, M. S., et al. Safety and immunogenicity of a candidate bioconjugate vaccine against Shigella flexneri 2a administered to healthy adults: a single blind, randomized phase I study. Clinical and Vaccine Immunology. , (2016).
- Shimanovich, A. A., et al. Functional and Antigen-Specific Serum Antibody Levels as Correlates of Protection against Shigellosis in a Controlled Human Challenge Study. Clinical and Vaccine Immunology. 24 (2), (2017).
