Her presenterer vi en protokoll for å måle Shigellacidal aktivitet av antistoffer i serum. Serum er blandet med bakterier og eksogene supplement, ruges, og reaksjonsblandingen er belagt på agar plater. Levedyktig bakterier danne kolonier som telles, bruker en automatisert kolonien enumerator, og brukes til å bestemme den bakteriedrepende titer.
Serum bakteriedrepende analyser (SBAs) måler den funksjonelle aktiviteten av antistoffer og har vært brukt i mange tiår. Baseområdene måle direkte antistoff drapet aktivitet ved å vurdere muligheten av antistoffer i serum binde til bakterier og aktivere komplement. Denne komplementaktivering resulterer i lyse og drapet på målet bakterier. Disse analyser er verdifulle fordi de går utover kvantifisere antistoffproduksjon å belyse de biologiske funksjonene som disse antistoffene har, slik at forskere til å studere rollen som antistoffer kan spille i å hindre infeksjon. Baseområdene har blitt brukt til å studere immunreaksjoner for mange human patogener, men det er ikke allment akseptert metode for Shigella i dag. Historisk har SBAs vært svært arbeidskrevende, krever mange tidkrevende skritt å tallfeste nøyaktig overlevende bakterier. Denne protokollen beskriver en enkel, robust, og høy gjennomstrømming analysen tiltak funksjonelle antistoffer spesifikke for Shigella i serum i vitro. 96 analysen godt plater, mikro-kultur-systemet og automatisert koloni-telling metoden beskrevet her gir mange fordeler over tradisjonelle baseområdene, herunder bruk av frosne bakteriell aksjer. Alle disse endringene gjør denne analysen mindre arbeidskrevende og mer høy gjennomstrømming. Denne protokollen er enklere og raskere å utføre enn tradisjonelle SBAs mens de fortsatt bruker enkel teknologi og lett tilgjengelig reagenser. Protokollen er brukt med hell i flere uavhengige laboratorier og analysen er robust og reproduserbar. Analysen kan brukes til å vurdere immunreaksjoner i pre-klinisk samt kliniske studier. Kvantifisere shigellacidal antistoff titers både før og etter antigen eksponering (enten av immunisering eller infeksjon) gir en bredere forståelse av hvordan funksjonelle antistoff svar genereres og deres bidrag til beskyttende immunitet. Utviklingen av dette standardisert, godt karakterisert analysen kan forenkle Shigella vaksine design.
Shigella serotyper, Shigella flexneri 2a, S. flexneri 3a og S. sonnei, viser epidemiologisk prevalens globalt. Diaré sykdommen skyldes disse Shigella arter virkninger militære, reisende1, og er en ledende årsak til diaré dødsfall blant barn under 5 i utviklingsland2. Det finnes ingen lisensiert vaksiner for å beskytte mot Shigella, men det er flere kandidat vaksiner på ulike stadier av utviklingen. Mange av disse vaksiner og andre forebyggende tiltak er i utvikling, fokus på antistoffer produsert mot Shigella lipopolysakkarid (LPS). LPS er en attraktiv vaksine kandidat fordi det er en stor overflate antigen og naturlig infeksjon med Shigella induserer LPS-spesifikke antistoffer som kan være beskyttende mot re-infeksjon i en serotype-spesifikk måte. Derfor vil en vellykket Shigella vaksine trolig må være multi-valent og mål 3-4 Shigella serotyper for å indusere immunitet mot 70-80% av sirkulerende globalt stammer3,4, 5 , 6. Dette krever at analyser evaluere Shigella vaksine kandidater er spesifikke for flere forskjellige serotyper.
Gjeldende immunologiske analyser for å vurdere vaksine kandidater fokus på kvantifisering nivåer av antistoff titers, men det er noen godt karakterisert analyser evaluere funksjonelle antistoffer. Undersøkelse av antistoff funksjonsevne er viktig fordi patogen spesifikke antistoffer er ansvarlig for å bekjempe infeksjon gjennom en rekke funksjonelle mekanismer inkludert bindende bakterier overflaten antigener og hindre vedheft til og infeksjon av epitelceller, rettet mot bakterielle celler eller opsonization og fagocytose, og direkte drepe patogener ved bindende og starte supplement kaskade. Direkte drepe bakterier av antistoffer oppstår når antistoffer binde til overflaten komponenter av målet bakterier og starte supplement kaskade fører til aktivering av mange zymogener at til slutt resultatet i pore formasjon i bakterielle celle som forårsaker lyse og bakteriell død. Dette direkte dreper av bakterier av sirkulerende antistoffer og utfyller kan være en avgjørende tidlig forsvarslinje under infeksjon.
Personer som er naturlig infisert har antistoffer shigellacidal aktivitet i deres sera. Disse Shigella –spesifikke antistoffer ble oppdaget ved hjelp av tradisjonelle komplement-mediert drapet søk 7,8. Dette betyr at det kan være en rolle for bakteriedrepende antistoffer i beskyttelse mot Shigella. Tradisjonelle bakteriedrepende analyser er enkel i sin utførelse: serum er inaktivert (å ødelegge endogene supplement aktivitet) og blandet med bakterier rundt. Eksogene supplement legges til denne blandingen i en bestemt konsentrasjon. Reaksjonsblandingen er ruges som tillater for bakteriell drepe og deretter belagt for å bekrefte colony-forming enheter (CFUs). Når CFUs telles, en 50% drapet indeks (KI) kan beregnes og en SBA titer bestemt. Denne fremgangsmåten er relativt enkel, disse analyser kan være arbeidskrevende og tidkrevende å utføre og resultatene kan være svært variabel. I tillegg til disse begrensninger, ingen vel preget funksjonelle analyser finnes Shigella. Derfor har vi utviklet og kvalifisert en enkel, høy gjennomstrømming analysen måle Shigella bakteriedrepende aktivitet for tre av de mest klinisk relevante stammer9. Denne protokollen beskriver en SBA med endringer som forbedrer analysen effektivitet og reproduserbarhet. Først av disse endringene er bruken av frosne bakteriell aksjer. Produksjon av voksen aksjer eliminerer behovet for kultur frisk bakterier for hver analysen samtidig redusere analysen til analysen variasjon. En annen tid og arbeid lagring nytte av denne protokollen er bruken av en 96-brønns plate analysen format. Dette gir føljetong fortynning av prøver slik at en rekke konsentrasjoner kan testes. Det kan også bruk av flerkanals Pipetter for plating prøver på torget Petri retter. Når disse kvadrat Petri retter brukes i forbindelse med en kultur som produserer mikro-kolonier, reduseres antall agar plater som kreves for analysen. Dette, gir sammen med fritt tilgjengelig koloni-telling programvare, opprinnelig utviklet for pneumokokk multiplex opsonophagocytic drepe analysen (MOPA)10, rask, automatisk og pålitelig kolonien opplistingen. Alle disse forbedringene redusere hands-on analysen tid og å skape en høy gjennomstrømming system slik at flere plater kjøres samtidig.
Mens denne protokollen er optimalisert for tre av de mest klinisk relevante serotypene av Shigella, SBA beskrevet her kan lett brukes på mange andre bakterielle patogener. I tillegg til denne protokollen potensielle bruk med andre bakterier har denne protokollen potensial til å utvide utover bruker bare serum som starter materiale, som kan omfatte analyse av antistoffer i andre relevante eksempel typer som mucosal prøver, inkludert spytt og fecal prøver. Bruk av denne analysen undersøke immunologiske svar etter vaksinering kan gi større innsikt i immunreaksjoner generert av vaksinasjon fører til rasjonell utformingen av vaksiner, og hjelp i forståelsen av hvordan naturlig immunitet utvikler.
Protokollen beskrevet her viser en funksjonell immun analysen for å vurdere shigellacidal aktiviteten av antistoffer i serum. I analysen bevist for denne protokollen monoklonale antistoffer spesifikke for S. flexneri 3a ble brukt9 med menneskelige kontrollsera fra en tidligere Shigella vaksine studie11. Kilden av serum testet i denne analysen kan variere mye fra pre-klinisk dyr prøver til menneskelige kliniske prøver, og den shigellacidal aktiviteten serum prøven vil bli påvirket av immunizations og eksponeringer som enkelt har opplevd. Noen kryssreaktivitet kan forventes mellom nært beslektede serotyper, spesielt S. flexneri 2a og S. flexneri 3a men lite kryssreaktivitet har blitt sett i disse stammer i forhold til S. sonnei9. Grunnlag av SBA fokuserer på aktivering av komplement kaskade av antistoff-antigen bindende. Håndtering av BRC reagensen er derfor en av de mange kritiske trinnene involvert i gjennomføringen av denne protokollen. BRC ble valgt til bruk i denne analysen på grunn av sin konsistent ytelse og lave nivåer av NSK i andre bakteriedrepende analyser12,13,14. Aktiviteten av BRC er ømfintlig og hensiktsmessige tiltak må tas slik som fryse tine sykluser er minimert, at BRC er aliquoted i voksen volumer, og at BRC dele er tint raskt, umiddelbart før bruk i analysen. Konsistensen av komplement aktivitet påvirker reproduserbarhet av denne analysen. Et annet viktig skritt som analysen reproduserbarhet er produksjon og fortynning av bakteriell aksjer. Det er viktig at før analysen riktig fortynning av bakteriell aksjer bestemmes, som analysen suksess er avhengig av konsekvent produksjon av Kontroller A og B har CFU teller gjennomsnitt ~ 120 CFU per sted. For å få flekker som er countable av programvaren, er det også viktig at du platen bakterier er vellykket utførelse. Avsetning av bakteriell løsning og vippe av platen slik at flekker kjøre ~ 2-3 cm er avgjørende for å produsere kolonier av rett størrelse og riktig fordeling for nøyaktig telling av NICE. Mestre alle disse trinnene sikrer at nøyaktig, konsekvent resultater er produsert av denne protokollen
Selv når alle kritiske trinnene utføres kan vel det fortsatt være tilfeller der det er nødvendig å endre eller feilsøke denne protokollen. Endringer av denne protokollen til å vurdere andre bakterier kan kreve optimalisering av natten LBA plate inkubasjon temperatur, å sikre dannelsen av mikro-kolonier. Andre stammer av bakterier eller antistoff kilder, enn serum, krever optimalisering av komplement konsentrasjon. NSK verdier og KIs av kontrollsera bør også overvåkes for å sikre at analysen fungerer riktig. NSK bør ikke stige over 70%. KI kontroll sera ikke bør variere betyr mer enn ± 2SD. For å oppnå vellykket og konsekvent resultater når du bruker denne protokollen, vil det være nødvendig å utføre alle trinnene som beskrives her med spesiell oppmerksomhet på kritiske fremgangsmåten ovenfor.
Mens denne protokollen fyller et viktig behov i Shigella forskning samfunnet, er det ikke uten begrensninger. Denne protokollen er avhengig av biologisk materiale og, derfor vil alltid være noen variasjoner som er vanskelig å kontrollere. Variasjoner i supplement aktivitet fra forskjellige partier og kilder kan bidra til variasjon i analyser. For å løse dette, er det viktig å håndtere supplement hensiktsmessig og teste nye masse supplement for aktivitet før kjøpet. Det kan også være nyttig å opprette puljer masse supplement kjent aktivitet har en homogen forsyning. Denne protokollen er enkel standard og ikke krever noen spesialisert utstyr og automatisert kolonien opplisting programvaren er fritt tilgjengelig. Mens dette enkelhet er en fordel, krever slik at denne protokollen skal brukes i nesten alle laboratorium, det fortsatt en overnatting inkubasjon. Siste analyser har blitt beskrevet som har mye kortere inkubasjon krav, men krever spesialisert, forberedende reagenser15. En annen begrensning av denne analysen er at i sin nåværende form er det bare undersøke en enkelt bakterie-art samtidig. I feltet Shigella det er et ønske om å lage en multivalent vaksine, og immunologiske analyser som kan vurdere patogener i en multiplex måte er av stor verdi. Denne analysen kan bli endret i fremtiden for å møte dette behovet, men i sin nåværende form, det er en enkelt-plex analysen.
Mens denne analysen har noen begrensninger, har den fremdeles mange fordeler over eksisterende eller alternative metoder. Fordelene inkluderer mange forbedringer som kombinerer for å gjøre gjennomføringen av denne metoden mye mindre arbeidskrevende og mer høy gjennomstrømming enn tradisjonelle SBAs. Bruk av frosne bakteriell aksjer, en 96-brønns plate analysen format, plating på større kvadrat petri retter, fargeleggingen koloniene som tillater fotografere og automatisk koloni-telling, bidra alle til å redusere materialer og tid for å fullføre dette analysen. Denne analysen har også fordeler fremfor andre metoder for høy gjennomstrømming fordi den ikke krever noen spesialisert reagenser eller utstyr. Protokollen beskrevet kan utføres med grunnleggende reagenser og fritt tilgjengelig programvare, slik at dens anvendelse i enhver laboratorium setting.
Alle fordelene denne protokollen gir støtter bruken i mange fremtidige undersøkelser. Analysen er ideell for undersøkelse av immunreaksjoner etter vaksinasjon eller infeksjon naturlig. Dette programmet tillater SBA å være et verdifullt verktøy i Shigella vaksinen forskning og har allerede blitt brukt til å evaluere vaksine immunogenisitet i Shigella bio-konjugert vaksiner der det har demonstrert evne til disse vaksiner for å indusere produksjon av funksjonelle antistoffer16. Denne protokollen er blitt omfattende testet av flere laboratorier og har vist seg å produsere pålitelige, reproduserbare resultater9. Denne protokollen gir også sammenlignbare resultater når samme prøvene er testet med andre bakteriedrepende analyser17. Konsistens i data generert av denne analysen, og kompatibilitet med andre eldre metoder gjør det et kraftig verktøy for nøyaktig å vurdere bakteriedrepende aktivitet i serumprøver. Analysen kan enkelt tilpasses til å vurdere flere eksempler typer. Mens serum er lett tilgjengelig i voksen kliniske studier, kan det være vanskelig å få tilstrekkelig serum forsøk spedbarn og små barn; en av de endelige målet befolkningene Shigella vaksiner. I disse, fullblod rutinemessig samles inn på filter papir og tørket. Det har vært noen innledende suksess med denne prøven format ved hjelp av SBA. Fullblod er mucosal prøver (som spytt, fecal ekstrakter og urin) også et mål som er relevant i Shigella vaksinen forskning. Foreløpig denne protokollen er evaluert for tre av de mest klinisk relevante serotypene av Shigella , men det kan også tilpasses for ekstra Shigella spp. samt andre bakterielle patogener. Videre arbeidet vil fokusere på produksjon av en multiplex analysen med mange av de samme egenskapene som analysen beskrevet av denne protokollen. En multiplex analysen vil tillate evaluering av flere Shigella serotyper samtidig ytterligere bevare eksempel volumer og hendene på analysen tid. Det er også arbeidet i gang for å overføre denne analysen til laboratorier over hele verden. Disse globale evalueringene vil generere mer data mot kvalifisering analysen på større forskning skala, samtidig økende antall mikrobiologi og immunologi laboratorier som har tilgang til denne SBA evaluere bakterier og serum prøver samlet endemisk steder. Analysen beskrevet her er enkel og høy gjennomstrømming og muligheten til å forbedre immunologiske vurdering i Shigella feltet, samt bredere programmer til vurdering av andre bakterielle patogener.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av en bevilgning fra bane til M.H.N. Denne studien ble gjennomført som et Cooperative Research and Development avtale mellom Walter Reed hæren Institute for Research og University of Alabama i Birmingham.
Gelatin | Sigma | G9391 | Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture |
TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride) | Sigma | T8877 | ≥98.0% (HPLC) |
Sodium azide (NaN3) | Sigma | S2002 | ≥99.5% |
Baby Rabbit Complement | PelFreez | 31061-3 | 3-4 week old |
HBSS with Ca2+/Mg2+ | Invitrogen | 14065-56 | Without Phenol Red |
LB Agar (Lennox) | Sigma | L2897 | Powder microbial growth medium |
Bacto Agar | BD | 214010 | Powdered, (C12H18O9)n |
Glycerol | Sigma | G5516 | For molecular biology, ≥99% |
LB Broth (Lennox) | Sigma | L3022 | Powder microbial growth medium |
Square Petri Dish | Sigma | Z617679-240EA | 120 mm x 120 mm |
Assay Plate | Costar | 3799 | 96 well u-bottom plate with lid |
NICE Software | University of Alabama at Birmingham | ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/ |