Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

الفائق دوسنتاريا-مقايسة جراثيم معينة

doi: 10.3791/59164 Published: February 27, 2019

Summary

نقدم هنا بروتوكولا لقياس النشاط شيجيلاسيدال من الأجسام المضادة في المصل. مصل الدم يختلط بالبكتيريا وتكملة خارجية، المحتضنة، وهو مطلي بالخليط رد فعل على ألواح أجار. وتشكل البكتيريا قادرة على البقاء المستعمرات التي يتم حسابها باستخدام عداد الآلي مستعمرة، ويستخدم لتحديد عيار جراثيم.

Abstract

فحوصات جراثيم المصل (SBAs) قياس النشاط الوظيفي للأجسام المضادة، وقد استخدمت على مدى عقود عديدة. قياس SBAs مباشرة النشاط قتل جسم بتقييم قدرة الأجسام المضادة في مصل الدم ربط للبكتيريا وتنشيط تكملة. هذا التنشيط تكملة النتائج بتحلل وقتل البكتيريا المستهدفة. هذه الاختبارات قيمة نظراً لأنها تتجاوز التحديد الكمي لإنتاج الأجسام المضادة توضيح الوظائف البيولوجية أن هذه الأجسام المضادة لها، السماح للباحثين بدراسة الدور الذي قد تؤديه الأجسام المضادة في الوقاية من الإصابة. SBAs قد استخدمت لدراسة الاستجابات المناعية للعديد من مسببات الأمراض البشرية، ولكن هناك لا منهجية مقبولة على نطاق واسع دوسنتاريا في الوقت الحاضر. تاريخيا، قد تم SBAs جداً ذات العمالة الكثيفة، التي تتطلب الكثير من الخطوات تستغرق وقتاً طويلاً لدقة قياس البكتيريا الباقين على قيد الحياة. ويصف هذا البروتوكول بسيطة وقوية، والفائق الاعتداء أن الأجسام المضادة الفنية تدابير محددة دوسنتاريا في مصل الدم في المختبر. الأسلوب الموصوفة هنا يوفر مزايا عديدة أكثر SBAs التقليدية، بما في ذلك استخدام الأرصدة المجمدة البكتيرية، 96 الاعتداء أيضا لوحات والنظام الجزئي-الثقافة ومستعمرة-العد الآلي. جميع هذه التعديلات جعل هذا التحليل أقل كثيفة العمالة وأكثر الفائق. هذا البروتوكول أبسط وأسرع لأداء من SBAs التقليدية في حين لا تزال تستخدم تكنولوجيات بسيطة والكاشفات متاحة بسهولة. البروتوكول قد طبق بنجاح في مختبرات مستقلة متعددة والمقايسة قوي وقابل لإعادة الإنتاج. يمكن استخدامها في التحليل لتقييم الاستجابات المناعية في الدراسات ما قبل السريرية وكذلك السريرية. التحديد الكمي التتر جسم شيجيلاسيدال سواء قبل أو بعد التعرض للمستضد (أما عن طريق التحصين أو العدوى) يسمح لفهم أوسع لجسم الوظيفية كيف يتم إنشاء استجابات ومساهمتها في الحصانة الواقية. تطور هذا النظام الموحد، قد ييسر كثيرا والرزن جيدا يتميز تصميم لقاح دوسنتاريا .

Introduction

اللقاح دوسنتاريا و 2a فليكسنيري دوسنتاريا 3a فليكسنيري س. س. سوني، تبين انتشار الأوبئة على الصعيد العالمي. أمراض الإسهال الناجمة عن هذه دوسنتاريا أنواع الآثار العسكرية، المسافرين1، وهو سبب الرئيسي للوفاة الإسهال بين الأطفال دون سن الخامسة في البلدان النامية2. لا يوجد حاليا أي لقاح المرخصة لحماية ضد دوسنتاريا، بيد أن هناك اللقاحات المتعددة في مختلف مراحل التنمية. العديد من هذه اللقاحات، وتدابير وقائية أخرى حاليا في التنمية، والتركيز على الأجسام المضادة التي أنتجها ضد دوسنتاريا lipopolysaccharide (LPS). لبس مرشح لقاح جذابة لأنها سطح مستضد رئيسية والعدوى الطبيعية مع دوسنتاريا الحث على لبس حدة الأجسام المضادة التي يمكن أن تكون وقائية ضد إعادة العدوى بطريقة النمط المصلي المسيطر على حدة. ولذلك، سوف تحتاج لقاح دوسنتاريا ناجحة المحتمل بالينت متعددة والهدف 3-4 دوسنتاريا اللقاح للحث على الحصانة ضد 70-80% على الصعيد العالمي تعميم سلالات3،4، 5 , 6-وهذا يتطلب أن فحوصات لتقييم المرشحين لقاح دوسنتاريا تكون محددة للقاح مختلفة متعددة.

فحوصات مناعية الحالية لتقييم المرشحين لقاح التركيز على قياس مستويات الأجسام المضادة التتر، ولكن هناك فحوصات جيدة تتسم قليلة لتقييم الوظيفية الأجسام المضادة. دراسة القدرة الوظيفية جسم مهم لأن الممرض أجسام مضادة محددة المسؤولة عن مكافحة العدوى من خلال عدد من الآليات الوظيفية بما في ذلك ملزم البكتيريا المستضدات السطحية، ومنع التصاق إلى و عدوى خلايا الظهارية، واستهداف الخلايا البكتيرية أو أوبسونيزاتيون والبلعمه، وقتل مسببات الأمراض مباشرة ملزمة والشروع في سلسلة مكملة. قتل البكتيريا بالأجسام المضادة المباشرة يحدث عند الأجسام المضادة لربط المكونات السطحية من البكتيريا المستهدفة والشروع في تتالي تكملة مما يؤدي إلى تفعيل العديد من زيموجينس أن في نهاية المطاف نتيجة في تشكيل المسام في البكتيريا الخلية التي يسبب الوفاة تحلل والبكتيريا. قد يكون هذا القتل المباشر للبكتيريا بتعميم الأجسام المضادة وتكملة خط دفاع مبكرة حاسمة أثناء الإصابة.

الأفراد الذين يصابون بطبيعة الحال أن الأجسام المضادة مع النشاط شيجيلاسيدال بهم سيرا. تم الكشف عن هذه الأجسام محددة دوسنتاريا-قتل مكملاً بوساطة التقليدية باستخدام فحوصات 7،8. يشير هذا إلى أنه قد يكون هناك دور للأجسام المضادة جراثيم في الحماية ضد دوسنتاريا. فحوصات جراثيم التقليدية بسيطة في تنفيذها: المصل إبطال الحرارة (لتدمير النشاط مكملاً الذاتية) ومختلطة مع البكتيريا للفائدة. تكملة خارجية تضاف إلى هذا الخليط بتركيز معين. خليط رد فعل المحتضنة للسماح لقتل البكتيريا وثم مطلي بتأكيد الوحدات المكونة للمستعمرة (كفوس). حالما يتم عد كفوس، يمكن حساب مؤشر لقتل 50 ٪ (كي) وتحدد عيار الترتيبات الاحتياطية. في حين أن هذا الإجراء بسيط نسبيا، يمكن أن تكون هذه الاختبارات ذات العمالة الكثيفة وتستغرق وقتاً طويلاً لتنفيذ ويمكن أن تكون النتائج اختلافاً كبيرا. وبالإضافة إلى هذه القيود، لا الاختبارات الوظيفية تتسم أيضا موجودة حاليا ل دوسنتاريا. ولذلك، نحن بنجاح وضع والمؤهلين مقايسة بسيطة، الفائق لقياس نشاط جراثيم دوسنتاريا لثلاثة من السلالات ذات الصلة سريرياً أكثر9. ويصف هذا البروتوكول الترتيبات الاحتياطية مع التعديلات التي تعمل على تحسين كفاءة المقايسة وإمكانية تكرار نتائج. وأول هذه التعديلات هو استخدام الأرصدة المجمدة البكتيرية. إنتاج مخزون استخدام واحد يلغي الحاجة إلى ثقافة جديدة البكتيريا لفحص كل حين أيضا على الحد من تقلب المقايسة للمقايسة. آخر وقت والعمل توفير الاستفادة من هذا البروتوكول هو استخدام صيغة المقايسة لوحة 96-جيدا. هذا يسمح لتمييع المسلسل عينات من حيث أنه يمكن أن يكون اختبار مجموعة من التركيزات.  كما أنه يسمح لاستخدام الممصات متعددة القنوات لطلاء عينات مربعة بيتري الأطباق. عند هذه الأطباق بيتري مربعة تستخدم بالاقتران مع نظام ثقافة التي تنتج مستعمرات صغيرة، هو تخفيض عدد لوحات أجار المطلوبة للفحص. وهذا، بالاقتران مع البرمجيات المتاحة بحرية عد مستعمرة، وضعت أصلاً أوبسونوفاجوسيتيك متعدد المكوّرات الرئوية مما أسفر عن مصرع10من المقايسة (موبا)، يسمح للتعداد مستعمرة السريع والآلي، ويمكن الاعتماد عليها. كل هذه التحسينات تقلل وقت الفحص العملي، وخلق نظام الفائق للسماح بلوحات متعددة ليتم تشغيلها في وقت واحد.

في حين تم تحسين هذا البروتوكول لثلاثة من اللقاح ذات الصلة سريرياً أكثر من دوسنتاريا، وصف الترتيبات الاحتياطية هنا يمكن تطبيقها بسهولة على العديد من مسببات الأمراض البكتيرية الأخرى. بالإضافة إلى إمكانية استخدام هذا البروتوكول مع البكتيريا الأخرى، هذا البروتوكول لديه إمكانات للتوسع خارج استخدام مصل فقط كمادة بدء، التي يمكن أن تشمل تحليل الأجسام المضادة في أنواع العينة ذات الصلة الأخرى مثل عينات الأغشية المخاطية، بما في ذلك عينات البراز واللعاب. استخدام هذا الفحص للتحقيق في الاستجابات المناعية بعد التطعيم قد يعطي أوسع نطاقا من التبصر في الاستجابات المناعية المتولدة عن طريق التلقيح مما يؤدي إلى التصميم العقلاني للقاحات، والمساعدة في فهم الحصانة الطبيعية كيف يتطور.

Protocol

هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية "مجلس حماية رير البشرية" في هذا الموضوع. العينات المستخدمة في هذه الدراسة عينات مصل الدم البشري التي تم جمعها كجزء من بروتوكول رير رقم 1328، امتثالا لجميع الأنظمة المؤسسية والاتحادية تنظم حماية البشر. عينات تم إلغاء تحديدها، واستخدام هذه العينات المجهولة قد صنفت البحوث الموضوع غير البشرية بمجلس الهجرة واللاجئين UAB (البروتوكول رقم N150115001).

1. إعداد الكواشف الإنزيم

  1. إعداد 1% الجيلاتين بإضافة 1 غرام جيلاتين إلى 100 مل الماء. اﻷوتوكﻻف وتخزين في درجة حرارة الغرفة.
  2. إعداد 100 مغ/مل الحل مخزون عقاري (كلوريد 2,3,5-تريفينيلتيترازوليوم) (1، 000 x) بإضافة 5 غ عقاري إلى 40 مل من الماء. عندما تماما يذوب في عقاري، ضبط مستوى الصوت إلى 50 مل مع الماء وتصفية العقيمة باستخدام 0.2 ميكرون فلتر. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية وحماية من الضوء.
    ملاحظة: تلوين المستعمرات البكتيرية عقاري ويجعلها أسهل بكثير للاعتماد. وقد حل عقاري لون أصفر طفيف. إذا كان الحل عقاري يطور لون أحمر، تجاهل وإعداد جديدة.
  3. إعداد 10% أزيد الصوديوم (نان3) الأسهم الحل (100 x) بإضافة 5 ز نان3 إلى 40 مل من الماء. وبعد حل كامل، إضافة المياه إلى 50 مل. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
    تنبيه: أزيد الصوديوم هو سم، وقد تكون سامة إذا بلعها أو امتصاصه عن طريق الجلد أو العينين. قد تتفاعل مع الرصاص والنحاس السباكة لتشكيل أزيدات معدنية شديدة الانفجار. التخلص من المواد الكاشفة التي تحتوي على أزيد الصوديوم، تدفق مع كمية كبيرة من الماء لمنع تراكم أزيد أو تجاهل في حقيبة واقية.
  4. إعداد لوحة LBA (لوحة أجار رطل) بإضافة ز 35 من أجار رطل إلى 1 لتر من الماء والاوتوكلاف. إضافة 25 مل لكل طبق بيتري مربعة (120 x 120 مم2). احتضان لوحات على RT لمدة 10-20 دقيقة للسماح لاجار ترسيخ. وضع لوحات مرة أخرى في أكياس من البلاستيك ومخزن عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  5. إعداد "تراكب أجار" بإضافة ز 7.5 من أجار إلى 1,000 مل من الماء والاوتوكلاف. احتضان في حوض ماء 56 درجة مئوية إلى حين الحاجة. حق قبل الاستخدام، إضافة 1 مل من 100 مغ/مل عقاري ومل 10 10% نان3 ومزيج جيد.
    ملاحظة: وتحتاج كل لوحة LBA 25 مل من "تراكب أجار". يمكن إعداد تصل إلى شهر واحد مقدما أجار تراكب وذاب في ميكروويف أو على لوحة الساخن حسب الحاجة للمقايسة. التأكد من درجة حرارة أجار ~ 55 درجة مئوية قبل التطبيق إلى لوحات LBA.
  6. إعداد "المقايسة المخزن المؤقت" عن طريق إضافة 5 مل من متوازن الملح الحل (حبس ل 10 x هانكس) مع Ca2 +/Mg2 + و 5 مل من الجيلاتين 1% إلى 40 مل من الماء. تخزين في درجة حرارة الغرفة.

2-يعد مكملاً واستهداف البكتيريا

  1. إعداد الأرانب بيبي تكملة (BRC)
    ملاحظة: مفصلة معايير لاختيار تكملة الكثير ويمكن الاطلاع على هنا: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
    1. الحصول على BRC المجمدة وذوبان الجليد مع تشغيل المياه الباردة. مزيج جسديا BRC كل ~ 10-20 دقيقة حتى مذاب تماما. لا تعرض BRC لدورات ذوبان التجميد المتكررة.
    2. بينما هو ذوبان الجليد BRC، قم بتسمية أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل أو 5 مل أو 15 مل. المكان المسمى أنابيب على الجليد لتبريد مسبقاً. وحدة التخزين السليم اليكووت BRC للأنابيب قبل تبريد أجهزة الطرد المركزي (بعد الملء، العودة فورا كل أنبوبة للجليد). تخزين مختبرين في ≤-70 درجة مئوية في الثلاجة.
      ملاحظة: مسافة 1 متر لتكملة المسبق لكل لوح المقايسة. مختبرين مكملاً للاستخدام مرة واحدة ويجب أن تكون الكوتيد بكميات مناسبة الاعتداء تخطيطات.
    3. لإعداد إبطال الحرارة BRC، ذوبان الجليد قاسمة واحدة من BRC النشطة. تحضير حمام مائي 56 درجة مئوية. بعد تماما هو إذابة BRC، نقلها إلى حوض ماء واحتضان لمدة 30 دقيقة.
    4. بعد الحضانة، إزالة الحرارة إبطال BRC من حمام المياه والسماح لتبرد في الرايت عن 10-15 دقيقة المزيج بقوة، والكوة ~ 150 ميليلتر إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنابيب. تخزين مختبرين في ≤-10 درجة مئوية.
  2. إعداد الهدف الأسهم البكتيريا
    ملاحظة: يتم استخدام الإجراء أدناه لتحضير مختبرين 48 من الأسهم البكتيريا المستهدفة؛ إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من مختبرين يمكن الارتقاء بالبروتوكول.
    1. إزالة البكتيريا الأسهم الرئيسية فيال من الثلاجة وكشط سطح البكتيرية المجمدة لإزالة كمية صغيرة من الجليد من القنينة على طبق أجار الدم. العودة فورا القنينة المخزون الرئيسي للثلاجة.
    2. متتالية هذا قاسمة صغيرة من الأسهم البكتيرية على طبق أجار الدم وتغطية بغطاء لوحة. احتضان اللوحة رأسا على عقب بين عشية وضحاها في 37 °C/5% CO2 حاضنة.
    3. نقل ~ 10 مستعمرات السلس معزولة إلى أنبوب 50 مل تحتوي على 30 مل مرق رطل. احتضانها ح 3-5 في 37 درجة مئوية مع الهز لطيف حتى مرق الثقافة التطوير التنظيمي600 من ~0.6-0.7.
    4. حصاد أعلى 12.5 مل من الثقافة ونقلها إلى أنبوب 50 مل طازجة. الطرد المركزي في الثقافة في 15,000 س ز 2 دقيقة باستخدام جدول أعلى مايكرو--أجهزة الطرد مركزي. تجاهل المادة طافية وإعادة تعليق بيليه في 25 مل من 15% العقيمة والغليسيرول رطل.
    5. يخلط جيدا والاستغناء عن 0.5 مل مختبرين في أنابيب الطرد المركزي الصغرى معقم 1.5 مل (أنابيب ~ 48). تخزين مختبرين في ≤-70 درجة مئوية في الثلاجة.
    6. تأكيد هوية البكتيرية باستخدام اختبار تراص قبل الاستخدام.
  3. تحديد معامل تمييع الأمثل للمخزون البكتيريا المستهدفة
    ملاحظة: يجب أن تيتراتيد كل دفعة من الأسهم البكتيريا المستهدفة في ظروف الفحص لتحديد التخفيف اللازمة تسفر عن ~ 120 زيمبابوي/بقعة على لوحات رطل.
    1. الحصول على لوحة ميكروتيتير (تمييع لوحة) وإضافة ميليلتر 135 الإنزيم المخزن المؤقت شكل جيد 1A. إضافة 120 ميليلتر من الزبدة المقايسة لآبار 1B-1 ح.
    2. إزالة قنينة بكتيريا المستهدفة المجمدة من الثلاجة وذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. إضافة 15ul للأسهم البكتيرية المذابة جيدا 1A لجعل الوقت إضعاف المخزون البكتيرية.
    3. نقل 30 ميليلتر من حل البكتيرية من 1A جيدا إلى 1B جيدا لتنفيذ 5 إضعاف إضعاف مسلسل. مواصلة تخفيف المسلسل 5 إضعاف خير ح 1 بالنسبة لإجمالي تخفيف 8 (01:10 01:50 1: 250؛ 1:1 250؛ و 1:6 250؛ 1:31 250؛ 1:156 250; 1:781 250).
    4. الحصول على آخر microtiter لوحة (لوحة الفحص) وإضافة 20 ميليلتر "فحص المخزن المؤقت" لكل شيء جيد في العمودين 1 و 2 في "لوحة الفحص".
    5. نقل 10 ميليلتر من البكتيريا المخفف من كل بئر في العمود 1 من لوحة تمييع في الآبار المقابلة في العمودين 1 و 2 من "لوحة المقايسة". يتم تحويل 10 ميليلتر من البكتيريا من 1A جيدا لصفيحة تمييع في جيدا 1A و 2A في "لوحة المقايسة"، إلخ.
    6. تواصل مع المقايسة كما هو موضح في المصل جراثيم المقايسة (SBA) أدناه للتحكم والسيطرة ب، خطوات 3.6-3.12.
    7. بعد قد تم المحتضنة اللوحات على الجليد، استخدام ماصة متعددة القنوات مع 8 ماصة نصائح على الفور 10 ميليلتر من الآبار في العمود 1 على صفيحة LBA. أيضا، بقعة الآبار من العمود 2 على لوح LBA.
    8. تواصل مع المقايسة كما هو موضح أدناه في خطوات 3.14-4.6.
    9. تحديد إضعاف البكتيريا التي تعطي ~ 120 زيمبابوي/بقعة في "التحكم ب"، ستستخدم هذا التخفيف في المقايسة.

3-مصل جراثيم المقايسة (SBA)

ملاحظة: الإجراء الموضح أدناه للوح المقايسة واحد، ولكن يمكن زيادة عدد "لوحات المقايسة".

  1. إلغاء تنشيط الحرارة اختبار عينات من عينات تحضين في حمام مائي 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: يجب أن تكون عينات اختبار الحرارة غير نشط قبل الاختبار أن تلغي أي نشاط مكمل الذاتية. يمكن أن يتم ذلك قبل المقايسة ويمكن إعادة تجميد عينات المعطل أو تخزينها في 4 درجات مئوية حتى اختبار.
  2. الحصول على "صفيحة المقايسة" وإضافة 20 ميليلتر من "المخزن المؤقت للمقايسة" للأعمدة من 1 إلى 12 صفوف ألف إلى زاي إضافة 20 ميليلتر الإنزيم المخزن المؤقت إلى العمودين 1 و 2 من الصف ح، انظر الجدول 1.
  3. تحميل 30 ميليلتر من كل عينة الاختبار، في المكررة، إلى صف ح "صفيحة المقايسة". على سبيل المثال، الاستغناء عن 30 ميليلتر من نموذج 1 في آبار 3 ح و 4 ح، والاستغناء عن 30 ميليلتر من عينة 2 إلى الآبار ح 5 و 6 ح، إلخ.
  4. إجراء تخفيف المسلسل 3-fold لعينات الاختبار باستخدام ماصة الأقنية.
    1. إزالة 10 μ العينة من آبار ح 3-12 ح ونقل إلى الآبار المقابلة في صف ز وخلط العينة جيدا قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً 8-10 مرات.
    2. ثم إزالة 10 μ من آبار ز 3-12 ز ونقل إلى الآبار المقابلة في صف و ومزيج جيد.
    3. مواصلة تخفيف هذه المسلسل من خلال صف أ بعد خلط الآبار في الصف A، إزالة وتجاهل 10 ميليلتر من الآبار 3A-12A حيث تحتوي على جميع الآبار 20 ميليلتر.
      ملاحظة: لأنه يتم استخدام 20 ميليلتر من المصل في حجم إجمالي مقايسة 80 ميكروليتر، هناك إضعاف إضافية النوبات في المقايسة. تمييع هذا يجب أن تؤخذ في الاعتبار أثناء حساب عيار الترتيبات الاحتياطية واسطة ضرب تخفيف المصل 4. على سبيل المثال، إذا تم استخدام إضعاف بدءاً من 1:2، هو التخفيف الفعلي يجري اختبار 1:8.
  5. إزالة قنينة واحدة من تجميد "الأسهم البكتيريا المستهدفة"، وذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. تضعف البكتيريا في 20 مل من "المخزن المؤقت للمقايسة" وفقا لعامل إضعاف الأمثل سلفا (تم تحديد معامل تمييع هذا في القسم 2، 3). إضافة 10 ميليلتر من البكتيريا المخفف لكل بئر من لوحة الفحص باستخدام ماصة الأقنية.
  6. إزالة قنينة واحدة من BRC المجمدة وقنينة واحدة من إبطال الحرارة BRC، ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة مع تشغيل المياه الباردة المجمدة أو مكان في صر للسلامة البيولوجية مجلس الوزراء مع هبوب الهواء للذوبان بسرعة.
  7. إعداد حل 20% من إبطال الحرارة BRC. مزيج 100 ميليلتر من إبطال الحرارة BRC مع 400 ميليلتر من "المخزن المؤقت للمقايسة". إضافة 50 ميليلتر من هذا الحل BRC إبطال الحرارة 20% لجميع الآبار في العمود 1 (التحكم بابار).
    ملاحظة: BRC إبطال الحرارة كعنصر تحكم لرصد القتل غير محددة (NSK) في المقايسة.
  8. إعداد حل 20% من BRC الأصلية. مزيج من 1 مل BRC الأصلية مع 4 مل من "المخزن المؤقت للمقايسة". إضافة 50 ميليلتر من هذا الخليط لجميع الآبار في الأعمدة من 2 إلى 12 (ب مراقبة واختبار الآبار عينة).
    ملاحظة: تركيز BRC النهائي في الخليط رد فعل هو 12.5 في المائة.
  9. بإيجاز خلط "لوحة الفحص" التي تهز بلطف ل 10-15 s على شاكر لوحة أو مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 8 مرات باستخدام ماصة الأقنية.
  10. وضع "لوحة الفحص" في 37 درجة مئوية حاضنة الميكروبيولوجية ح 2 (بدون اهتزاز).
  11. مواجهة لوحات LBA 2 الجافة عن طريق إزالة الأغطية ووضع لوحات في السلامة البيولوجية على مجلس الوزراء لمدة 40-60 دقيقة.
  12. عند الانتهاء من حضانة ح 2، نقل "لوحة الفحص" الرطب الجليد واحتضان لمدة 10-20 دقيقة لوقف رد الفعل.
  13. استخدام ماصة 12-قناة، مزيج من الآبار في الصف ح، ولوحة بقعة 10 ميليلتر من خليط الرد على الجزء السفلي من صفيحة LBA. إمالة اللوحة على الفور والسماح للبقع خوض ~1.5-2 سم. كرر هذا الإجراء لصف ز وو ه، رصدهما أعلاه الصف السابق على لوحة LBA. صف ه، واو، وزاي وحاء رصدت على أحد رصدت لوحة LBA، والصف أ وب، وجيم ودال على صفيحة LBA ثانية بنفس الطريقة، انظر الشكل 1.
  14. احتضان لوحات LBA في درجة حرارة الغرفة حتى الحل هو تمتز إلى لوحات LBA (10-15 دقيقة). وضع الأغطية على لوحات LBA ووضع لوحات LBA في الحاضنة الميكروبيولوجية رأسا احتضان بين عشية وضحاها (~ 16-18 ح). احتضان فليكسنيري س. 2 ألف و 3 ألف في 29 درجة مئوية، واحتضان سوني س. في 26 درجة مئوية.
    ملاحظة: هذه درجات الحرارة العائد أصغر "مايكرو-المستعمرات" ذات أحجام مناسبة لعد دقيق ب عداد مستعمرة9.
  15. وبعد الحضانة بين عشية وضحاها، إضافة 25 مل من "تراكب أجار" (في ~ 55 درجة مئوية) التي تحتوي على 100 ميكروغرام/مل عقاري و 0.1% نان3 لكل لوح LBA.
  16. احتضان لوحات LBA في 37 درجة مئوية ح 2 للسماح بهذه البكتيريا الباقين على قيد الحياة لوضع اللون الأحمر، انظر الشكل 1 أدناه.
  17. تصوير اللوحات باستخدام كاميرا رقمية، ونقل الصور إلى كمبيوتر حيث تم تثبيت NIST تعداد مستعمرة البرامج المتكاملة (نيس)، انظر الشكل 2.
    ملاحظة: تتوفر برامج عد مستعمرة نيس في أي تهمة. انظر قائمة المواد للتفاصيل والحصول على إرشادات التثبيت.

4-عدد مستعمرات البكتيريا

  1. فتح برامج لطيفة وإدخال اسم المشغلومعلومات التجربة وأي الاعتداء الملاحظات إلى حقول فارغة. حالما يتم إدخال هذه البيانات انقر فوق الزر القيام به .
  2. استيراد لوحات وتصويرها بالنقر فوق الزر فتح وتحديد الملفات الصحيحة من الكمبيوتر.
  3. ضبط البارامترات المقايسة بتعيين عدد الصفوف إلى 4 وعدد الأعمدة إلى 12. قم بضبط الإعداد الخلفية إلى سيغما-3 و القرار إلى منخفض. انظر الشكل 2.
  4. نقل "المناطق ذات الأهمية" (رويس) بالنقر والسحب حيث يكون كل عائد الاستثمار مباشرة فوق بقعة عينة واحدة. التأكد من وجود جميع المستعمرات البكتيرية داخل العائد على الاستثمار مع عدم وجود تداخل بين العينات. بمجرد اكتمال لوحة واحدة، انقر نقراً مزدوجاً فوق لوحة التالي في قائمة الصور البيانات المخزنة وضبط رويس. انظر الشكل 2.
  5. عندما تم تعديل جميع لوحات، انقر فوق الزر الكونت الأخضر، انظر الشكل 2 والشكل 3. عند الانتهاء من فرز انقر فوق الزر تصدير لتصدير البيانات بتنسيق.xls/.xlsx. تسمية وحفظ الملف.xls/.xlsx لتحليل البيانات.
  6. ترتيب تصدير البيانات إلى تنسيق جدول حيث أن التهم منظمون في جدول يمثل لوحة المقايسة 96، حسنا، انظر الجدول 2-

5-حساب عيار سباعي (كي)، والقتل غير محددة (NSK)

ملاحظة: عيار سباعي، أو قتل الفهرس (كي) يعرف المعاملة بالمثل لتمييع المصل الذي يقتل 50% البكتيريا المستهدفة.

  1. حساب 50% مما أسفر عن مصرع استقطاع قيمة الفهرس (كي) بمتوسط زيمبابوي تكملة نشط مراقبة الآبار (التحكم ب) قسمة 2. حساب زيمبابوي متوسط لكل تمييع كل عينة التي تم تشغيلها في التكرارات، انظر الجدول 3.
  2. لأنه نادراً ما تسفر إضعاف مصل بالضبط هذه القيمة كي 50%، فإنه يمكن محرف من اثنين من تخفيف المصل متسلسلة، أحد أن يقتل أقل من 50% ويقتل أكثر من 50%، انظر الشكل 4. الصيغة لحساب كي سباعي محرف يظهر أدناه:
    Equation
    ملاحظة: عيار جراثيم، أو كي، يمكن أيضا حساب تلقائياً باستخدام البرمجيات أوبسوتيتير التي وضعها اتحاد المصارف العربية. "طلب أوبسوتيتير"، اتصل Nahm القمر الدكتور أو السيد روب بيرتون. راجع https://www.vaccine.uab.edu للحصول على معلومات جهة الاتصال.
  3. حساب قيمة NSK بأخذ 1 ناقص متوسط "ب التحكم" مقسوماً على متوسط التحكم أ

Representative Results

يظهر تخطيط لوحة 96-كذلك تستخدم في مقايسة نموذجية في الجدول 1- هذا التخطيط بابار مراقبة تكملة النشطة (التحكم ب) وآبار مراقبة تكملة إبطال الحرارة (التحكم) وخمس عينات مكررة. التسلسل هي تضعف عينات 3-fold أعلى اللوحة من "ح صف" صف السماح لتخفيف 8 لكل عينة لفحصها في وقت واحد. ويبين الشكل 1 عامين LBA لوحات بعد إضافة الاحتضان وتراكب بين عشية وضحاها. وقد حدث تطور اللون وجميع المستعمرات الباقين على قيد الحياة تظهر باللون الأحمر. قتل البكتيرية ينظر بشكل واضح لجميع عينات اختبار في تخفيف الثلاثة الأولى (الصفوف وح) وهي تضعف عينات أخرى حتى اللوحة، انخفاضا في قتل البكتيريا يعتبر المصل التي يتركز فيها أقل. واجهة البرنامج جميلة يتبين في الشكل 2. يمكن رؤية التهم الصغرى-مستعمرة من البرنامج الجميل في الشكل 3، وقد نظمت هذه التهم في الجدول 2. ويحسب متوسط عدد زيمبابوي لكل تمييع كل عينة ويتم حساب قيمة كي 50% في الجدول 3. يمكن تطبيق هذه القيمة كي 50% إلى كفوس متوسط لكل تخفيف المصل لتحديد القيم المطلوبة لحساب كي سباعي وفقا للصيغة المبينة في الشكل 4. النتيجة النهائية للمقايسة يرد في الجدول 4.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A التحكم A التحكم ب تخفيف 8 تخفيف 8 تخفيف 8 تخفيف 8 تخفيف 8 تخفيف 8 تخفيف 8 تخفيف 8 تخفيف 8 تخفيف 8
ب التحكم A التحكم ب تمييع 7 تمييع 7 تمييع 7 تمييع 7 تمييع 7 تمييع 7 تمييع 7 تمييع 7 تمييع 7 تمييع 7
ج التحكم A التحكم ب تمييع 6 تمييع 6 تمييع 6 تمييع 6 تمييع 6 تمييع 6 تمييع 6 تمييع 6 تمييع 6 تمييع 6
د التحكم A التحكم ب تمييع 5 تمييع 5 تمييع 5 تمييع 5 تمييع 5 تمييع 5 تمييع 5 تمييع 5 تمييع 5 تمييع 5
ه التحكم A التحكم ب تمييع 4 تمييع 4 تمييع 4 تمييع 4 تمييع 4 تمييع 4 تمييع 4 تمييع 4 تمييع 4 تمييع 4
و التحكم A التحكم ب تمييع 3 تمييع 3 تمييع 3 تمييع 3 تمييع 3 تمييع 3 تمييع 3 تمييع 3 تمييع 3 تمييع 3
ز التحكم A التحكم ب تمييع 2 تمييع 2 تمييع 2 تمييع 2 تمييع 2 تمييع 2 تمييع 2 تمييع 2 تمييع 2 تمييع 2
ح التحكم A التحكم ب تمييع 1 تمييع 1 تمييع 1 تمييع 1 تمييع 1 تمييع 1 تمييع 1 تمييع 1 تمييع 1 تمييع 1
عينة 1 عينة 2 نموذج 3 نموذج 4 نموذج 5

الجدول 1: تخطيط لوحة الإنزيم. العمودين 1 و 2 تحتوي على آبار مراقبة مكملة. التحكم الموجود في العمود 1 ويتم إلغاء تنشيطه الحرارة تكمل التحكم، الذي يحتوي على المخزن المؤقت للترتيبات الاحتياطية والبكتيريا وتكملة إبطال الحرارة. التحكم ب يقع في العمود 2 والنشط يكمل السيطرة، الذي يحتوي على المخزن المؤقت سباعي، والبكتيريا، وتكملة. تحتوي الأعمدة 3-12 على عينات المصل. كل عينة يتم تشغيل المكررة ومتسلسل المخفف 3-fold من صف ح للصف أ

Figure 1
رقم 1: لوحات LBA بعد وضع اللون. الممثل فليكسنيري س. 3a البكتيرية الدقيقة-المستعمرات قد نمت بين عشية وضحاها إلى الحجم المناسب. تم إضافة تراكب أجار والمستعمرات قد وضعتها لون أحمر للحد مجمع عقاري في أجار تراكب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: NIST العداد مستعمرة المتكاملة (نيس) واجهة البرنامج- تمثيل رسومي لواجهة البرنامج جميلة. المناطق ذات الاهتمام (رويس) تتركز على المستعمرات لكل بقعة قبل فرز الأصوات. يمكن تصدير بيانات مباشرة من نافذة لطيفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: LBA اللوحات البرمجيات لطيفة الأصوات التي تم فرزها في. يتم تحميل صور فوتوغرافية ملونة في برامج جميلة ومستعمرة تشكيل وحدات (كفوس) يتم حسابها تلقائياً. هذه الصورة يبين اثنين من لوحات LBA الممثل مع معلوماتهم العد مستعمرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

185 167 145 151 122 134 119 142 124 115 113 123 1:17496 تخفيف 8
186 152 145 138 132 135 108 116 100 119 105 109 1:5832 تمييع 7
179 160 145 135 109 120 54 55 71 75 79 89 1:1944 تمييع 6
193 153 146 138 87 105 5 6 6 9 19 30 1:648 تمييع 5
184 129 121 143 6 7 0 1 1 1 1 1 1:216 تمييع 4
180 145 22 24 2 3 3 1 1 0 0 0 1:72 تمييع 3
207 129 1 0 2 2 1 0 4 1 0 1 01:24 تمييع 2
201 140 0 0 0 0 1 1 1 0 4 4 1:8 تمييع 1
التحكم A التحكم ب عينة 1 عينة 2 نموذج 3 نموذج 4 نموذج 5

الجدول 2: عدد مستعمرات البكتيرية. يتم تصدير التهم زيمبابوي من البرنامج الجميل إلى excel في تنسيق. ويمكن ترتيب هذه التهم إلى جدول يبين البكتيرية التهم لجميع عينات مكررة ومراقبة الآبار.

التحكم A التحكم ب 148 128 131 120 118 1:17496 تخفيف 8
189 147 142 134 112 110 107 1:5832 تمييع 7
NSK (1-كترب/كترا): 22% 140 115 55 73 84 1:1944 تمييع 6
كي 50% (كترب/2): 73 142 96 6 8 25 1:648 تمييع 5
132 7 1 1 1 1:216 تمييع 4
23 3 2 1 0 1:72 تمييع 3
1 2 1 3 1 01:24 تمييع 2
0 0 1 1 4 1:8 تمييع 1
عينة 1 عينة 2 نموذج 3 نموذج 4 نموذج 5

الجدول 3: حساب القيمة استقطاع كي 50% ومتوسطات عينة مكررة. تم حساب قيمة استقطاع كي 50% بأخذ متوسط جميع "ب مراقبة" الآبار والقسمة على 2. حسبت المتوسطات للتكرارات لكل تمييع كل عينة التي تم تشغيلها في التكرارات. يتم أيضا حساب قيمة NSK.

Figure 4
الشكل 4: التخطيطي للاستيفاء الخطي. رسم العدد من البكتيريا الباقين على قيد الحياة (المحور الصادي) في إضعاف كل من المصل اختبار (س) (الماس الأسود)، ونقاط فردية ترتبط بخط أسود متقطع ورقيقة. خطوط أفقية صلبة ومتقطع تشير إلى 0% و 50% مما أسفر عن مصرع، على التوالي. تخفيف المصل أعلاه (5 إضعاف) وأدناه (4 إضعاف) 50% مما أسفر عن مصرع الخط متصلاً بخط أحمر، وهو مبين جراثيم عيار (كي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

كي سباعي
عينة 1 72
عينة 2 216
نموذج 3 1994
نموذج 4 1994
نموذج 5 648

الجدول 4: سباعي النتائج تظهر جراثيم عيار (كي)- ترد القيم النهائية كي سباعي وقد حددت لكل عينة. يتم حساب هذه القيم باستخدام كفوس متوسط، وقيمة استقطاع كي 50%، والصيغة الخطية الاستيفاء.

Discussion

البروتوكول هو موضح هنا يدل مقايسة المناعية وظيفية لتقييم النشاط شيجيلاسيدال من الأجسام المضادة في المصل. وفي التحليل أظهر لهذا البروتوكول [مونوكلونل] محددة ل 3a فليكسنيري س. كانت تستخدم9 جنبا إلى جنب مع مراقبة الأمصال البشرية من لقاح دوسنتاريا سابقة دراسة11. مصدر المصل اختبارها في هذا التحليل قد تختلف على نطاق واسع من العينات الحيوانية قبل الإكلينيكية للعينات السريرية البشرية، والنشاط شيجيلاسيدال من عينة المصل سوف يتأثر بعمليات التحصين والتعرض التي قد تعرضت للفرد. ويمكن توقع بعض ه بين اللقاح وثيق الصلة، على وجه التحديد 2 أ . س. فليكسنيري و 3a فليكسنيري س. ولكن القليل ه فقد رأينا في هذه السلالات بالمقارنة مع سوني س.9. الأساس للترتيبات الاحتياطية يركز على تفعيل تتالي مكملاً بجسم مضاد-مستضد ملزمة. ولذلك، معالجة الكاشف BRC واحدة من العديد من الخطوات الحاسمة التي تشارك في تنفيذ هذا البروتوكول. واختير BRC لاستخدامها في هذا التحليل بسبب الأداء المتسق ومستويات منخفضة من NSK في أخرى فحوصات جراثيم12،،من1314.  نشاط BRC درجة الحرارة حساسة ويجب اتخاذ التدابير المناسبة لضمان أن تجميد ذوبان دورات إلى أدنى حد، أن BRC الكوتيد إلى وحدات تخزين تستخدم مرة واحدة، وأن مختبرين BRC هي مذاب بسرعة، مباشرة قبل استخدامها في التحليل. اتساق النشاط مكملاً سيؤثر إمكانية تكرار نتائج لهذا التحليل. آخر الخطوة الحاسمة التي تؤثر في إمكانية تكرار نتائج الفحص هو إنتاج وتمييع الأرصدة البكتيرية. من المهم أن قبل البدء التحليل المناسب تمييع الأرصدة البكتيرية مصممة، كنجاح التحليل هو اعتماداً على إنتاج متسقة من عناصر التحكم بوجود تهم زيمبابوي في المتوسط زيمبابوي ~ 120 كل بقعة. من أجل الحصول على النقاط التي يتم العد بالبرنامج، من المحتم أيضا أن الأسلوب المتبع للبكتيريا لوحة يتم تنفيذها بنجاح. الترسب الحل البكتيرية وآماله لوحة حيث أن البقع تشغيل ~ 2-3 سم أمر حاسم لإنتاج المستعمرات لتوزيع حجم الحق والصحيح لعد دقيق بالبرنامج لطيفة. إتقان كل هذه الخطوات سوف تكفل إنتاج نتائج دقيقة ومتسقة بموجب هذا البروتوكول

حتى عندما يتم تنفيذ جميع الخطوات الحاسمة قد تكون هناك أيضا حالات حيث من الضروري تعديل أو استكشاف أخطاء هذا البروتوكول. قد تتطلب إدخال تعديلات على هذا البروتوكول لتقييم أخرى البكتيريا الأمثل بين عشية وضحاها LBA لوحة حضانة درجة الحرارة، لضمان تشكيل المستعمرات الصغيرة. سلالات أخرى من بكتيريا أو جسم مصادر، عدا المصل، قد تتطلب التحسين تكملة التركيز. ينبغي أيضا رصد القيم NSK وكيس من الأمصال مراقبة للتأكد من أن يعمل المقايسة على نحو ملائم. لا ينبغي أن ترتفع NSK ما يزيد على 70 في المائة. كي تحكم لا ينبغي أن تختلف سيرا يعني أكثر من ± 2SD. لتحقيق نتائج ناجحة ومتناسقة عند استخدام هذا البروتوكول، أنه يلزم القيام بجميع الخطوات كما هو موضح هنا، مع إيلاء اهتمام خاص للخطوات الأساسية المشار إليها أعلاه.

حين يملأ هذا البروتوكول ضرورة هامة في مجتمع البحوث دوسنتاريا ، ليس دون القيود. هذا البروتوكول يعتمد على المواد البيولوجية، وذلك، سيتم دوماً بعض التغيرات التي من الصعب التحكم. التغيرات في نشاط مكمل من الكثير مختلفة ومن مصادر قد تساهم في تقلب في فحوصات. للتخفيف من هذا، من المهم معالجة مكملة بشكل مناسب واختبار الجديدة الكثير من تكملة للنشاط قبل الشراء. ربما من المفيد أيضا إنشاء مجمعات لتكملة الكثير مع نشاط معروف لديها إمدادات متجانسة. هذا البروتوكول هو بسيط بالتصميم ولا يتطلب أية معدات متخصصة ومستعمرة الآلي تعداد البرامج متاحة بحرية. بينما هذه البساطة ميزة، يتيح هذا البروتوكول لاستخدامها في أي مختبر، وأنها لا تزال تتطلب حضانة بين عشية وضحاها. وقد وصف الاختبارات الأخيرة التي شرط الحضانة أقصر كثيرا، ولكن تتطلب الكواشف المتخصصة، التحضيرية15. قيد آخر من هذا التحليل في شكله الحالي أنه فقط قادرة على التحقيق من أنواع بكتيرية واحد في وقت واحد. في ميدان دوسنتاريا وهناك رغبة في إنشاء لقاح متعددي، وبعد فحوصات المناعية التي يمكن تقييم مسببات الأمراض على نحو متعدد ذات قيمة كبيرة. يمكن تعديل هذا التحليل في المستقبل لتلبية هذه الحاجة، ولكن في شكله الحالي، مقايسة واحد-من نوع plex.

بينما هذا التحليل على بعض القيود، أنها لا تزال العديد من المزايا أكثر الأساليب الموجودة أو بديلة. وتشمل هذه المزايا العديد من التحسينات التي تتضافر لجعل تنفيذ هذا الأسلوب أقل بكثير من العمالة الكثيفة والفائق أكثر مما SBAs التقليدية. استخدام الأرصدة المجمدة البكتيرية، شكل الإنزيم لوحة 96، حسنا، الطلاء على أطباق بيتري مربعا أكبر، تلون المستعمرات التي تسمح لتصوير والتلقائية العد مستعمرة، كلها عوامل تساعد على تقليل المواد والوقت اللازم لإتمام هذا المقايسة. هذا التحليل أيضا بمزايا أكثر من غيرها من الأساليب الفائق نظراً لأنها لا تتطلب أي الكواشف المتخصصة أو المعدات. يمكن تنفيذ البروتوكول وصف مع الكواشف الأساسية والبرمجيات متاحة بحرية، والسماح لتطبيقه في أي وضع المختبر.

جميع المزايا التي ينص هذا البروتوكول تدعم استخدامه في العديد من التحقيقات مستقبلا. المقايسة يعتبر مثاليا لدراسة الاستجابات المناعية بعد العدوى الطبيعية أو التطعيم. هذا التطبيق يسمح للترتيبات الاحتياطية لتكون أداة قيمة في بحوث اللقاحات دوسنتاريا وتم بالفعل استخدام تقييم الاستمناع اللقاح في اللقاحات الحيوية-المتقارن دوسنتاريا حيث قد برهن على قدرة هذه اللقاحات إلى الحث على إنتاج أجسام مضادة الوظيفية16. هذا البروتوكول قد تم اختبارها على نطاق واسع بمختبرات متعددة، وقد ثبت أن تنتج نتائج يمكن الاعتماد عليها، واستنساخه9. هذا البروتوكول كما تنتج نتائج مماثلة عندما يتم اختبار عينات نفس استخدام فحوصات جراثيم أخرى17. الاتساق في البيانات التي تولدها هذه المقايسة، وتوافقها مع غيرها من الأساليب القديمة يجعلها أداة قوية لتقييم دقة نشاط جراثيم في عينات مصل الدم. المقايسة بسهولة كما يمكن تكييفها لتقييم أنواع عينة إضافية. بينما المصل متاحة بسهولة في التجارب السريرية الكبار، يمكن أن يكون من الصعب الحصول على مصل كافية في المحاكمات التي تركز على الأطفال الرضع والأطفال الصغار؛ أحد السكان المستهدفين في نهاية المطاف للقاحات دوسنتاريا . في هذه المحاكمات، التي تم جمعها في ورقة تصفية الدم كله بشكل روتيني والمجففة. وقد أحرز بعض النجاح الأولية مع هذا النوع من نموذج تنسيق استخدام الترتيبات الاحتياطية. بالإضافة إلى الدم كله، عينات الأغشية المخاطية (مثل اللعاب ومقتطفات البراز والبول) هي أيضا هدفا ذات الصلة في بحوث اللقاحات دوسنتاريا . حاليا، وقد تم تقييم هذا البروتوكول لثلاثة من اللقاح ذات الصلة سريرياً أكثر من دوسنتاريا ولكن أيضا يمكن تكييفها ل spp. دوسنتاريا الإضافية، فضلا عن غيرها من مسببات الأمراض البكتيرية. الأعمال المقبلة ستركز على إنتاج مقايسة متعدد مع العديد من نفس خصائص الإنزيم الموصوفة بموجب هذا البروتوكول. سوف تسمح تحليل متعدد لتقييم متعددة دوسنتاريا اللقاح في وقت واحد، كذلك المحافظة على حجم العينة والأيدي في وقت الفحص. وهناك أيضا أعمال جارية لنقل هذا التحليل في المختبرات عبر أنحاء العالم. هذه التقييمات العالمية سوف تولد المزيد من البيانات نحو تأهيل مقايسة على نطاق بحث أكبر، بينما في الوقت نفسه زيادة عدد مختبرات علم الأحياء الدقيقة وعلم المناعة التي يمكنها الوصول إلى هذه الترتيبات الاحتياطية لتقييم البكتيريا والمصل عينات التي تم جمعها من مواقع مختلفة في المستوطنة. الفحص الموصوفة هنا بسيط والفائق ولديه القدرة على تحسين تقييم المناعية في الميدان دوسنتاريا ، فضلا عن تطبيقات أوسع لتقييم مسببات الأمراض البكتيرية الأخرى.

Disclosures

R.W.K موظف حكومة الولايات المتحدة، وعلى هذا النحو الآراء التي أعرب عنها في هذا المنشور آراء المؤلفين ولا تعكس بالضرورة السياسة الرسمية أو موقف الإدارة من الجيش، ووزارة الدفاع، ولا حكومة الولايات المتحدة.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل بمنحه من المسار إلى M.H.N. وأجريت هذه الدراسة كالبحوث التعاونية ووضع اتفاق بين معهد والتر ريد الجيش البحوث وجامعة ألاباما في برمنغهام.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gelatin Sigma G9391 Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture
TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride) Sigma T8877 ≥98.0% (HPLC)
Sodium azide (NaN3) Sigma S2002 ≥99.5%
Baby Rabbit Complement PelFreez 31061-3 3-4 week old
HBSS with Ca2+/Mg2+ Invitrogen 14065-56 Without Phenol Red
LB Agar (Lennox) Sigma L2897 Powder microbial growth medium
Bacto Agar BD 214010 Powdered, (C12H18O9)n
Glycerol Sigma G5516 For molecular biology, ≥99%
LB Broth (Lennox) Sigma L3022 Powder microbial growth medium
Square Petri Dish Sigma Z617679-240EA 120 mm x 120 mm
Assay Plate Costar 3799 96 well u-bottom plate with lid
NICE Software University of Alabama at Birmingham ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Riddle, M. S., Sanders, J. W., Putnam, S. D., Tribble, D. R. Incidence, etiology, and impact of diarrhea among long-term travelers (US military and similar populations): a systematic review. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 74, (5), 891-900 (2006).
  2. Tickell, K. D., et al. Identification and management of Shigella infection in children with diarrhoea: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5, (12), e1235-e1248 (2017).
  3. Livio, S., et al. Shigella isolates from the global enteric multicenter study inform vaccine development. Clinical Infectious Diseases. 59, (7), 933-941 (2014).
  4. Barry, E. M., et al. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 10, (4), 245-255 (2013).
  5. Noriega, F. R., et al. Strategy for cross-protection among Shigella flexneri serotypes. Infection and Immunity. 67, (2), 782-788 (1999).
  6. Levine, M. M., Kotloff, K. L., Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road. Nature Reviews Microbiology. 5, (7), 540-553 (2007).
  7. Sayem, M. A., et al. Differential host immune responses to epidemic and endemic strains of Shigella dysenteriae type I. Journal of Health Population and Nutrition. 29, (5), 429-437 (2011).
  8. Rahman, M. J., et al. Effects of zinc supplementation as adjunct therapy on the systemic immune responses in shigellosis. The American Journal of Clinical Nutrition. 81, (2), 495-502 (2005).
  9. Nahm, M. H., et al. interlaboratory evaluations, and application of a simple, high-throughput Shigella serum bactericidal assay. mSphere. 3, (3), (2018).
  10. Burton, R. L., Nahm, M. H. Development and validation of a fourfold multiplexed opsonization assay (MOPA4) for pneumococcal antibodies. Clinical and Vaccine Immunology. 13, (9), 1004-1009 (2006).
  11. Tribble, D., et al. Safety and immunogenicity of a Shigella flexneri 2a Invaplex 50 intranasal vaccine in adult volunteers. Vaccine. 28, (37), 6076-6085 (2010).
  12. Kim, H. W., Kim, K. H., Kim, J., Nahm, M. H. A high throughput serum bactericidal assay for antibodies to Haemophilus influenzae type b. BMC Infectious Diseases. 16, 473 (2016).
  13. Maslanka, S. E., et al. Standardization and a multilaboratory comparison of Neisseria meningitidis serogroup A and C serum bactericidal assays. The Multilaboratory Study Group. Clinical Diagnostic Laboratory Immunology. 4, (2), 156-167 (1997).
  14. Jang, M. S., Sahastrabuddhe, S., Yun, C. H., Han, S. H., Yang, J. S. Serum bactericidal assay for the evaluation of typhoid vaccine using a semi-automated colony-counting method. Microbial Pathogeneis. 97, 19-26 (2016).
  15. Necchi, F., Saul, A., Rondini, S. Development of a high-throughput method to evaluate serum bactericidal activity using bacterial ATP measurement as survival readout. PLoS One. 12, (2), e0172163 (2017).
  16. Riddle, M. S., et al. Safety and immunogenicity of a candidate bioconjugate vaccine against Shigella flexneri 2a administered to healthy adults: a single blind, randomized phase I study. Clinical and Vaccine Immunology. (2016).
  17. Shimanovich, A. A., et al. Functional and Antigen-Specific Serum Antibody Levels as Correlates of Protection against Shigellosis in a Controlled Human Challenge Study. Clinical and Vaccine Immunology. 24, (2), (2017).
الفائق <em>دوسنتاريا</em>-مقايسة جراثيم معينة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weerts, H. P., Yu, J., Kaminski, R. W., Nahm, M. H. A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay. J. Vis. Exp. (144), e59164, doi:10.3791/59164 (2019).More

Weerts, H. P., Yu, J., Kaminski, R. W., Nahm, M. H. A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay. J. Vis. Exp. (144), e59164, doi:10.3791/59164 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter