Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Een High-throughput Shigella-specifieke bactericide Assay

doi: 10.3791/59164 Published: February 27, 2019

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het meten van de Shigellacidal activiteit van antilichamen in het serum. Serum is vermengd met bacteriën en exogene aanvulling, geïncubeerd, en het reactiemengsel is verguld op agar platen. Levensvatbare bacteriën vormen kolonies die zijn geteld, met behulp van een geautomatiseerde kolonie enumerator, en gebruikt om te bepalen van de bactericide titer.

Abstract

Serum bactericide assays (SBAs) meet de functionele activiteit van antilichamen en hebben gebruikt voor vele decennia. Antilichaam doden activiteit meten SBAs direct door de evaluatie van het vermogen van antilichamen in serum om te binden aan bacteriën en activeren van de aanvulling. Deze aanvulling activering resulteert in de lysis en doden van de bacteriën doel. Deze testen zijn waardevol omdat ze buiten het kwantificeren van de productie van het antilichaam om te verhelderen van de biologische functies die deze antilichamen hebben, waardoor onderzoekers bestuderen de rol die antilichamen spelen kunnen bij het voorkomen van infectie. SBAs zijn gebruikt voor het bestuderen van de immuunrespons voor vele menselijke pathogenen, maar er is geen algemeen aanvaarde methode voor Shigella op dit moment. In het verleden geweest SBAs zeer arbeidsintensief, vereisen veel tijdrovende stappen nauwkeurig te kwantificeren overlevende bacteriën. Dit protocol beschrijft een eenvoudige, robuuste, en high-throughput dat maatregelen functionele antilichamen specifiek voor Shigella in serum in vitro assay. De hier beschreven methode biedt vele voordelen ten opzichte van traditionele SBAs, met inbegrip van het gebruik van bevroren bacteriële voorraden, 96 goed assay platen, een micro-cultuur systeem en geautomatiseerde kolonie-tellen. Al deze wijzigingen maken deze test minder arbeidsintensief en meer high-throughput. Dit protocol is eenvoudiger en sneller uit te voeren dan traditionele SBAs terwijl het nog steeds met behulp van eenvoudige technologieën en beschikbaar reagentia. Het protocol is met succes toegepast in meerdere onafhankelijke laboratoria en de bepaling is robuust en reproduceerbaar. De bepaling kan worden gebruikt ter beoordeling van immuunresponsen bij pre-klinische evenals klinische studies. Kwantificeren van shigellacidal antilichamen titers zowel vóór als na blootstelling van het antigeen (hetzij door immunisatie of infectie) voorziet in een breder begrip van hoe functionele antilichaam reacties worden gegenereerd en hun bijdrage aan de protectieve immuniteit. De ontwikkeling van dit gestandaardiseerd, goed gekarakteriseerd assay kan Shigella vaccin ontwerp sterk vergemakkelijken.

Introduction

Shigella serotypen, Shigella flexneri 2a, 3a S. flexneri en S. sonnei, tonen epidemiologische prevalentie wereldwijd. De diarree ziekte veroorzaakt door deze met militaire, reizigers van Shigella soorten effecten1, en is een belangrijke doodsoorzaak diarree bij kinderen onder de leeftijd van 5 in ontwikkelingslanden2. Er zijn momenteel geen licentie vaccins te beschermen tegen Shigella, er zijn echter meerdere kandidaat-vaccins in verschillende stadia van de ontwikkeling. Veel van deze vaccins en andere profylactische maatregelen die momenteel in ontwikkeling, gericht op antilichamen geproduceerd tegen Shigella lipopolysaccharide (LPS). LPS is een aantrekkelijke vaccin kandidaat omdat het een grote oppervlakte-antigeen en natuurlijke infectie met Shigella induceert LPS-specifieke antilichamen die in een serotype-specifieke wijze beschermend tegen herinfectie kunnen worden. Een succesvolle Shigella -vaccin zal waarschijnlijk moeten worden multi-valent en doelstelling 3-4 die Shigella serotypen om immuniteit tegen 70-80% van de wereldwijd circulerende stammen3,4, 5 , 6. dit vereist dat testen om te evalueren van Shigella vaccin kandidaten specifiek voor meerdere verschillende serotypen worden.

Huidige immunologische tests voor de beoordeling van kandidaten van vaccin concentreren op niveaus van antilichamen titers te kwantificeren, maar er zijn enkele goed gekarakteriseerd testen om te evalueren van functionele antilichamen. Het onderzoek van antilichaam functionele vermogen is belangrijk, omdat pathogen specifieke antilichamen verantwoordelijk zijn voor de bestrijding van infectie door middel van een aantal functionele mechanismen, met inbegrip van bindende oppervlakte antigenen van bacteriën, en het voorkomen van hechting op en infectie van epitheliale cellen, gericht op bacteriële cellen of opsonization en fagocytose en direct het doden van ziekteverwekkers door bindende en het initiëren van de complement cascade. De directe doden van bacteriën door antilichamen treedt op wanneer antilichamen aan oppervlakte componenten van de doel-bacteriën binden en initiëren van de complement cascade leidt tot het activeren van vele precursoren dat uiteindelijk resultaat in porie vorming in de bacteriële cel die lysis en bacteriële dood veroorzaakt. Deze directe doden van bacteriën door het circulerende antilichamen en aanvulling mogelijk een cruciale eerste lijn van verdediging tijdens de infectie.

Personen die natuurlijk besmet zijn hebben antilichamen met shigellacidal activiteit in hun sera. Shigella -specifieke antistoffen werden waargenomen met behulp van traditionele aanvulling-bemiddelde doden testen 7,8. Dit betekent dat er mogelijk een rol voor bactericide antilichamen in bescherming tegen Shigella. Traditionele bactericide testen zijn eenvoudig in de uitvoering ervan: serum is warmte-geïnactiveerd (te vernietigen de aanvulling van de endogene activiteit) en gemengd met de bacteriën van belang. Exogene aanvulling wordt toegevoegd aan dit mengsel bij een bepaalde concentratie. Het reactiemengsel is zodat voor bacteriële doden geïncubeerd en vervolgens verguld Controleer kolonie-vormende eenheden (CFUs). Zodra de CFUs worden meegeteld, een 50% doden index (KI) kan worden berekend en een SBA-titer bepaald. Hoewel deze procedure relatief eenvoudig, kunnen deze tests arbeidsintensief en tijdrovend om uit te voeren en de resultaten kunnen zeer variabel. Naast deze beperkingen, geen goed gekarakteriseerd functionele testen momenteel bestaan voor Shigella. Daarom hebben we met succes ontwikkeld en een eenvoudige, hoge-doorvoer assay voor het meten van Shigella bactericide activiteit voor drie van de meest klinisch relevante stammen9gekwalificeerd. Dit protocol beschrijft een SBA met wijzigingen die assay efficiëntie reproduceerbaarheid en. De eerste van deze wijzigingen is het gebruik van bevroren bacteriële voorraden. De productie van Eenpersoonsgebruik voorraden elimineert de noodzaak om verse bacteriën cultuur voor elke assay terwijl ook het verminderen van test-naar-assay variabiliteit. Een andere tijd en arbeid besparen voordeel van dit protocol is het gebruik van een 96-wells-plaat assay formaat. Dit zorgt voor seriële verdunning van monsters, zodat een aantal uiteenlopende concentraties kan worden getest.  Het staat ook voor het gebruik van meerkanaals pipetten voor monsters op vierkante petrischalen plating. Wanneer deze vierkante petrischalen worden gebruikt in combinatie met een cultuur-systeem dat micro-kolonies produceert, wordt het aantal agar platen nodig zijn voor de bepaling verminderd. Dit, zorgt in combinatie met vrij beschikbare software die de kolonie-tellen, oorspronkelijk ontwikkeld voor de pneumokokken multiplexed opsonophagocytic doden assay (MOPA)10, voor de snelle, geautomatiseerde en betrouwbare kolonie-opsomming. Al deze verbeteringen aanzienlijk verminderen hands-on assay tijd en het creëren van een hoge-doorvoer systeem waardoor meerdere platen tegelijk worden uitgevoerd.

Terwijl dit protocol is geoptimaliseerd voor drie van de meest klinisch relevante serotypes van Shigella, de SBA hier beschreven kan gemakkelijk worden toegepast op vele andere bacteriële pathogenen. Naast dit protocol het potentieel gebruik met andere bacteriën heeft dit protocol de potentie om uit te breiden buiten met behulp van alleen serum als grondstof, waaronder eventueel de analyse van antilichamen in andere relevante monster typen zoals mucosal monsters, met inbegrip van speeksel en fecale monsters. Het gebruik van deze test om te onderzoeken van immunologische reacties na vaccinatie kan breder inzicht geven in immuunrespons opgewekt door vaccinatie leidt tot het rationele ontwerp van vaccins en hulp in het begrip van hoe natuurlijke immuniteit ontwikkelt.

Protocol

Dit protocol volgt de richtsnoeren van de WRAIR menselijke certificaathouder Protection Board. Monsters gebruikt in deze studie zijn menselijk serummonsters verzameld als onderdeel van WRAIR protocolnummer 1328, met inachtneming van alle institutionele en federale verordeningen betreffende de bescherming van proefpersonen. Monsters waren-geïdentificeerde, en het gebruik van deze anonieme monsters werd geclassificeerd als niet-menselijke onderwerp onderzoek door de UAB IRB (protocolnummer N150115001).

1. Prepareer Assay reagentia

  1. Bereiden van 1% gelatine door 1 gram gelatine toe te voegen tot 100 mL water. Autoclaaf en winkel bij kamertemperatuur.
  2. Bereiden van 100 mg/mL stockoplossing van TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride) (1, 000 x) door toevoeging van 5 g van TTC aan 40 mL water. Wanneer de TTC volledig ontbonden is, stel het volume op 50 mL met water en een steriel filter met behulp van 0,2 µm filter. De oplossing bij 4 ° C bewaren en beschermen tegen licht.
    Opmerking: TTC afgescheurde de bacteriële kolonies en maakt ze veel makkelijker om te tellen. TTC oplossing heeft een lichte gele kleur. TTC oplossing ontwikkelt een rode kleur, negeren als vers bereiden.
  3. 10% natrium azide (NaN3) stockoplossing (100 x) voor te bereiden door 5 g NaN3 aan 40 mL water toe te voegen. Na volledige ontbinding, voeg water tot 50 mL. Bewaren bij kamertemperatuur.
    Let op: Natriumazide kan is een GIF en toxische indien gegeten of geabsorbeerd door de huid of ogen. Het kan reageren met lood en koperen sanitaire te vormen zeer explosieve metalen aziden. Inzake verwijdering van reagentia met natriumazide, spoelen met een groot volume van water te voorkomen azide opbouw of gooi in een zak van biohazard.
  4. LBA plaat (LB agarplaat) voor te bereiden door 35 g LB agar toe te voegen aan 1 liter water en autoclaaf. Voeg 25 mL toe aan elke vierkante petrischaal (120 x 120 mm2). Incubeer de platen bij RT voor 10-20 min om agar te stollen. Plaats platen terug in plastic zakken en bewaren bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
  5. Overlay Agar bereid door 7,5 gram agar toe te voegen aan 1000 mL water en autoclaaf. Incubeer in waterbad 56 ° C totdat het nodig is. Vlak voor gebruik, voeg 1 mL 100 mg/mL TTC en 10 mL 10% NaN3 en meng goed.
    Opmerking: Elke LBA plaat moet 25 mL Overlay agar. Topagar kan worden bereid tot een maand op voorhand en gesmolten in een microgolf of op een hete plaat zo nodig voor de bepaling. Zorg ervoor dat agar temperatuur ~ 55 ° C vóór toepassing aan LBA platen.
  6. Bereiden Assay Buffer door toevoeging van 5 mL van de 10 x Hanks evenwichtig zout oplossing (HBSS) met Ca2 +/Mg2 + en 5 mL van de 1% gelatine aan 40 mL water. Bewaren bij kamertemperatuur.

2. voorbereiding van de aanvulling en richten van bacteriën

  1. Baby konijn bereiden aanvulling (BRC)
    Opmerking: Gedetailleerde criteria voor aanvulling veel selectie kan hier worden gevonden: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
    1. Verkrijgen van bevroren BRC en ontdooien met stromend koud water. Fysiek Meng het BRC elke ~ 10-20 min tot volledig ontdooid. BRC niet onderworpen aan herhaalde bevriezen dooi cycli.
    2. Terwijl BRC is ontdooien, label 1,5 mL, 5mL en 15 mL centrifuge buizen. Plaats het label buizen op ijs vooraf afkoelen. Juiste volume van de hoeveelheid BRC de vooraf gekoelde centrifuge buizen (na vullen, onmiddellijk terug elke buis naar het ijs). Aliquots bij ≤-70 ° C bewaren in de vriezer.
      Opmerking: Ongeveer 1 m van de aanvulling is nodig voor elke bepaling plaat. Aanvulling aliquots zijn voor eenmalig gebruik en moeten aliquoted in volumes te assay lay-outs.
    3. Ontdooi een aliquoot gedeelte van het actieve BRC om te bereiden warmte-geïnactiveerd BRC. Een waterbad 56 ° C voor te bereiden. Nadat het BRC is volledig ontdooid, het overbrengen van het waterbad en incubeer gedurende 30 min.
    4. Na incubatie, warmte-geïnactiveerd BRC te verwijderen uit het waterbad en laat afkoelen op RT voor 10-15 min. Mix krachtig, en aliquoot ~ 150 µL 1,5 mL microcentrifuge buizen. Opslaan van aliquots bij ≤-10 ° C.
  2. Bereiden doel bacteriën voorraad
    Opmerking: De onderstaande procedure wordt gebruikt voor het bereiden van 48 aliquots van doel bacteriën materieel; Als er meer aliquots nodig zijn het protocol kan worden opgeschaald.
    1. Verwijderen de bacteriën master voorraad ampul uit de diepvries en schraap het bevroren bacteriële oppervlak om te verwijderen van een kleine hoeveelheid ijs uit de ampul op een bloed agarplaat. Onmiddellijk de master voorraad flacon terugkeren naar de vriezer.
    2. Strijk dit kleine hoeveelheid bacteriële voorraad op de bloed agarplaat en bedek met de deksel van de plaat. De plaat ondersteboven na een nacht bebroeden in 37 °C/5% CO2 incubator.
    3. ~ 10 geïsoleerde gladde kolonies overbrengen in een tube van 50 mL met 30 mL van de pond-Bouillon. Incubeer gedurende 3-5 uur bij 37 ° C met zacht schudden totdat de Bouillon cultuur een OD600 van ~0.6-0,7 heeft.
    4. Oogst de top 12,5 mL van de cultuur en de overdracht aan een verse 50 mL-buis. Centrifugeer de cultuur bij 15.000 x g gedurende 2 min met behulp van een tafelblad micro-centrifuge. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 25 mL 15% steriele glycerol-LB.
    5. Meng goed en afzien van 0,5 mL aliquots in steriele 1,5 mL micro centrifuge buizen (~ 48 buizen). Opslaan aliquots bij ≤-70 ° C in de vriezer.
    6. Bevestig de bacteriële identiteit met behulp van de agglutinatietest vóór gebruik.
  3. Bepaling van de optimale verdunningsfactor voor doel bacteriën voorraad
    Opmerking: Elke batch van het doel bacteriën voorraad moet worden getitreerd in assay voorwaarden kunt bepalen van de verdunning moet opleveren ~ 120 CFU/plek op LB platen.
    1. Krijg een microtiterplaat plaat (verdunning plaat) en voeg 135 µL van Assay Buffer goed 1A. Voeg 120 µL van Assay boter te putten 1B - 1H.
    2. Verwijderen van een flacon van bevroren doel bacteriën uit de vriezer en ontdooien bij kamertemperatuur. Toevoegen 15ul voor ontdooide bacteriële voorraad goed 1A zodat een 10-fold verdunning van de bacteriële voorraad.
    3. Overbrengen 30 µL van bacteriële oplossing uit goed 1A en 1B voor het uitvoeren van een 5-fold seriële verdunning. Blijven 5-fold seriële verdunningen 1H goed voor een totaal van 8 verdunningen (1:10; 1:50; 1:250; 1:1 250; 1:6 250; 1:31 250; 1:156 250; 1:781 250).
    4. Krijgen een ander microtiterplaat plaat (Assay plaat) en 20 µL van Assay Buffer al goed in de kolommen 1 en 2 in de Assay plaat toe te voegen.
    5. Pipetteer 10 µL van verdunde bacteriën uit elk putje in kolom 1 van de verdunning plaat in de overeenkomstige putjes in de kolommen 1 en 2 van de Assay-plaat. 10 µL van bacteriën wordt overgebracht van goed 1A van de verdunning plaat in goed 1A en 2A in de Assay plaat, enz.
    6. Ga verder met de test als beschreven in Serum bactericide Assay (SBA) hieronder voor het besturingselement een en Control B, stappen 3.6-3.12.
    7. Nadat de platen hebben zijn geïncubeerd op ijs, gebruiken een meerkanaalspipet met 8 Pipetteer tips spot 10 µL van de putten in kolom 1 op een bord LBA. Ook ter plaatse de putten uit kolom 2 op het bord LBA.
    8. Doorgaan met de bepaling zoals hieronder beschreven in stappen 3.14-4.6.
    9. Bepalen van de bacteriën verdunning die ~ 120 CFU/plek in Control B opbrengsten, deze verdunning wordt gebruikt in de test.

3. serum bactericide Assay (SBA)

Opmerking: De hieronder beschreven procedure is voor één assay plaat, maar het aantal Assay platen kan worden verhoogd.

  1. Warmte-inactivering testopnames door drachtige monsters in een waterbad van 56 ° C gedurende 30 minuten.
    Opmerking: Monsters moeten warmte-geïnactiveerd voorafgaand aan de test te trekken elke aanvulling van de endogene activiteit. Dit kan worden gedaan vóór de bepaling en geïnactiveerd monsters kunnen opnieuw bevroren of opgeslagen bij 4 ° C tot getest.
  2. Krijgen een Assay-plaat en 20 µL van Assay Buffer toevoegen aan kolommen 1 tot en met 12 van rijen A tot en met G. toevoegen 20 µL van Assay Buffer naar kolommen 1 en 2 van rij H, Zie tabel 1.
  3. Laden 30 µL van elk monster, in tweevoud, rij H van de Assay-plaat. Bijvoorbeeld, afzien van 30 µL van monster 1 in putten 3 H en 4 H, en afzien van 30 µL van monster 2 in putten 5 H en 6 H, etc.
  4. 3-voudig seriële verdunningen van monsters met een meerkanaalspipet uitvoeren
    1. Verwijderen van 10 µ van het monster uit putten 3H - 12H en overdracht aan overeenkomstige putjes in rij G en meng het monster goed door omhoog en omlaag pipetteren 8 - 10 keer.
    2. Vervolgens Verwijder 10 µ uit putten 3G - 12G en overdracht aan overeenkomstige putjes in rij F en meng goed.
    3. Blijven deze seriële verdunningen tot en met rij A. Na het mengen van de putten in rij A, verwijder en verwerp 10 µl van putten 3A-12A zodat alle putjes 20 µl bevatten.
      Opmerking: Omdat 20 µL van de serum wordt gebruikt in een totale assay volume van 80 µL, is er een 4-fold extra verdunning in de test. Deze verdunning moet rekening worden gehouden bij de berekening van een SBA-titer door de verdunning van het serum met 4 te vermenigvuldigen. Bijvoorbeeld, als een startende verdunning 1:2 wordt gebruikt, is de werkelijke verdunning wordt getest 1:8.
  5. Verwijder één flacon van bevroren Target bacteriën materieel en ontdooien bij kamertemperatuur. Verdun de bacteriën in 20 mL Assay Buffer volgens de vooraf bepaalde optimale verdunningsfactor (deze verdunningsfactor werd bepaald in punt 2.3). Voeg 10 µL van verdunde bacteriën aan elk putje van de plaat van de bepaling met behulp van een meerkanaalspipet.
  6. Verwijder één flacon van bevroren BRC en één flacon van warmte-geïnactiveerd BRC, ontdooien bij kamertemperatuur met stromend koud water bevroren of plaats op de rooster van een biologische veiligheid kabinet met het blazen van lucht te snel ontdooien.
  7. Bereid een 20%-oplossing van warmte-geïnactiveerd BRC. Mix 100 µL van warmte-geïnactiveerd BRC met 400 µL van Assay Buffer. Breng 50 µL van deze 20% warmte-geïnactiveerd BRC-oplossing in alle putjes in kolom 1 (besturingselement een wells).
    Opmerking: Warmte-geïnactiveerd BRC wordt gebruikt als een besturingselement niet-specifieke doden (NSK) volgen in de bepaling.
  8. Bereid een 20%-oplossing van inheemse BRC. Meng 1 mL inheemse BRC met 4 mL Assay Buffer. Voeg 50 µL van dit mengsel toe aan alle putjes in kolommen 2 tot en met 12 (Control B en test sample wells).
    Opmerking: De uiteindelijke concentratie van BRC in het reactiemengsel is 12,5%.
  9. Kort Assay plaat Meng door zachtjes schudden voor 10-15 s op een plaat shaker of meng door pipetteren naar boven en beneden de 8 keer met behulp van een meerkanaalspipet.
  10. Zet de plaat Assay in de microbiologische incubator 37 ° C gedurende 2 uur (zonder schudden).
  11. Droge 2 LBA platen door het verwijderen van deksels en platen te plaatsen onder ogen zien in biologische veiligheidskast voor 40-60 min.
  12. Wanneer de 2 h incubatie voltooid is, verplaatst de Assay plaat nat ijs en incubeer gedurende 10-20 min om te stoppen met de reactie.
  13. Met behulp van een pipet 12-kanaals, meng de putten in rij H, en ter plaatse plaat 10 µL van het reactiemengsel op de bodem van een LBA-plaat. Onmiddellijk kantelen van de plaat en laat de plekken om uit te voeren voor ~1.5-2 cm. Herhaal deze procedure voor rij G, F en E, spotten ze boven de vorige rij op de plaat LBA. Rij E, F, G en H zijn bevlekt op een LBA plaat, en rij A, B, C en D zijn bevlekt op een tweede plaat van de LBA op dezelfde manier (Zie Figuur 1).
  14. Incubeer de platen van de LBA bij kamertemperatuur totdat de oplossing in de LBA platen (10-15 min) is geadsorbeerd. Zet de deksels op de LBA-platen en plaats de LBA-platen in de microbiologische incubator ondersteboven aan na een nacht bebroeden (~ 16-18 h). Incubeer S. flexneri 2a en 3a bij 29 ° C en incubeer S. sonnei is bij 26 ° C.
    Opmerking: Deze temperaturen opbrengst kleinere "micro-kolonies" met maten geschikt voor nauwkeurige tellen door een kolonie teller9.
  15. Na een incubatieperiode van overnachting, voeg 25 mL Overlay Agar (bij ~ 55 ° C) met 100 µg/mL TTC en 0,1% NaN3 aan elke plaat LBA.
  16. Incubeer de platen van de LBA bij 37 ° C gedurende 2 uur dat de overlevende bacteriën te ontwikkelen van rode kleur, Zie afbeelding 1 hieronder.
  17. Platen met behulp van een digitale camera te fotograferen en overzetten van beelden naar een computer waarop de NIST geïntegreerde kolonie opsommen Software (NICE) is geïnstalleerd, Zie Figuur 2.
    Opmerking: MOOI kolonie-tellen software is kosteloos beschikbaar. Materialen overzicht voor meer informatie en installatie-instructies.

4. graaf bacteriële kolonies

  1. Open mooi Software en input Operator naam, Experiment informatie en alle assay notities in de lege velden. Zodra deze gegevens is ingevoerd klikt u op de knop gedaan .
  2. Gefotografeerde platen importeren door te klikken op de knop openen en selecteren van de juiste bestanden van de computer.
  3. De assay parameters aanpassen door het aantal rijen 4 en het aantal kolommen tot en met 12. Pas de instelling van de achtergrond naar-3 sigma en de resolutie te laag. Zie Figuur 2.
  4. De regio's van belang (ROIs) verplaatsen door klikken en slepen zodat elke ROI zich direct boven een monster plek. Ervoor zorgen dat alle bacteriële kolonies binnen de ROI met geen overlapping tussen de monsters. Zodra één plaat voltooid is, dubbelklikt u op de volgende plaat in de lijst van de afbeeldingen opgeslagen gegevens en pas de ROIs. Zie Figuur 2.
  5. Wanneer alle platen zijn gecorrigeerd, klikt u op de groene knop van de graaf , Zie Figuur 2 en figuur 3. Wanneer tellen is voltooid klikt u op de knop exporteren om de gegevens in.xls/.xlsx-indeling te exporteren. Een naam en sla het bestand.xls/.xlsx voor data-analyse.
  6. Ordenen gegevens geëxporteerd in een tabelindeling zodat graven zijn georganiseerd in een tabel vertegenwoordigen de bepaling van de 96-wells-plaat, Zie tabel 2.

5. berekening van de SBA Titer (KI) en niet-specifieke doden (NSK)

Opmerking: SBA titer of doden index (KI) wordt gedefinieerd als de reciproque waarde van de serumverdunning dat 50% van de doelgroep bacteriën doodt.

  1. Bereken de 50% doden index (KI) cutoff waarde door gemiddeld de CFU van actieve aanvulling controleputjes (Control-B) en te delen door 2. Berekent de gemiddelde CFU voor elke verdunning van elk monster dat werd uitgevoerd in twee exemplaren, Zie tabel 3.
  2. Omdat een serumverdunning zal zelden precies deze 50% KI waarde opleveren, het kan worden geïnterpoleerd van twee opeenvolgende serum verdunningen, die doodt minder dan 50% en die meer dan 50 doodt %, Zie Figuur 4. De formule voor de berekening van de geïnterpoleerde SBA KI wordt hieronder weergegeven:
    Equation
    Opmerking: De bactericide titer, of KI, kan ook worden automatisch berekend met Opsotiter software ontwikkeld door UAB. Op verzoek Opsotiter, contact opnemen met Dr. Moon Nahm of Mr. Rob Burton. Zie https://www.vaccine.uab.edu voor contact informatie.
  3. Het NSK-waarde berekenen door middel van 1 minus het gemiddelde van Control B gedeeld door het gemiddelde van controle A.

Representative Results

Een 96-wells-plaat lay-out in een typische assay gebruikt wordt in tabel 1. Deze indeling heeft de actieve aanvulling-controleputjes (Control-B), de warmte-geïnactiveerd aanvulling-controleputjes (besturingselement een), en vijf monsters in tweevoud. Monsters worden serieel 3 katernen verdund omhoog van de plaat boven rij H op rij een waardoor voor 8 verdunningen voor elk monster worden getest in een keer. Figuur 1 toont twee LBA platen na de overnachting incubatie en overlay toevoeging. Kleur ontwikkeling heeft plaatsgevonden en alle overlevende kolonies zijn zichtbaar in rood. Bacteriële doden wordt duidelijk gezien voor alle monsters getest in de eerste drie verdunningen (rijen F-H) en als monsters worden verdund verder omhoog de plaat, een afname van de bacteriële doden wordt gezien waar het serum is minder geconcentreerd. AARDIGE software interface te zien in Figuur 2. Micro-kolonie graven uit de aardige software te zien in Figuur 3, en deze punten zijn georganiseerd in tabel 2. De gemiddelde CFU tellen voor elke verdunning van elk monster wordt berekend en de waarde van een 50%-KI wordt berekend in tabel 3. Deze 50% KI waarde kan worden toegepast op de gemiddelde CFUs voor elke serumverdunning om te bepalen van de waarden die nodig zijn voor het berekenen van de SBA KI volgens de formule die is beschreven in Figuur 4. Het uiteindelijke resultaat van de test wordt weergegeven in tabel 4.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Besturingselement een Controle B Verdunning 8 Verdunning 8 Verdunning 8 Verdunning 8 Verdunning 8 Verdunning 8 Verdunning 8 Verdunning 8 Verdunning 8 Verdunning 8
B Besturingselement een Controle B Verdunning 7 Verdunning 7 Verdunning 7 Verdunning 7 Verdunning 7 Verdunning 7 Verdunning 7 Verdunning 7 Verdunning 7 Verdunning 7
C Besturingselement een Controle B Verdunning 6 Verdunning 6 Verdunning 6 Verdunning 6 Verdunning 6 Verdunning 6 Verdunning 6 Verdunning 6 Verdunning 6 Verdunning 6
D Besturingselement een Controle B Verdunning 5 Verdunning 5 Verdunning 5 Verdunning 5 Verdunning 5 Verdunning 5 Verdunning 5 Verdunning 5 Verdunning 5 Verdunning 5
E Besturingselement een Controle B Verdunning 4 Verdunning 4 Verdunning 4 Verdunning 4 Verdunning 4 Verdunning 4 Verdunning 4 Verdunning 4 Verdunning 4 Verdunning 4
F Besturingselement een Controle B Verdunning 3 Verdunning 3 Verdunning 3 Verdunning 3 Verdunning 3 Verdunning 3 Verdunning 3 Verdunning 3 Verdunning 3 Verdunning 3
G Besturingselement een Controle B Verdunning 2 Verdunning 2 Verdunning 2 Verdunning 2 Verdunning 2 Verdunning 2 Verdunning 2 Verdunning 2 Verdunning 2 Verdunning 2
H Besturingselement een Controle B Verdunning 1 Verdunning 1 Verdunning 1 Verdunning 1 Verdunning 1 Verdunning 1 Verdunning 1 Verdunning 1 Verdunning 1 Verdunning 1
Voorbeeld 1 Voorbeeld 2 Monster 3 Monster 4 Monster 5

Tabel 1: Assay plaat lay-out. De kolommen 1 en 2 bevatten de aanvulling-controleputjes. Besturingselement een ligt in kolom 1 en is de warmte-geïnactiveerd als aanvulling op de controle, met SBA buffer, bacteriën en warmte-geïnactiveerd aanvulling. Controle B bevindt zich in kolom 2 en is de actieve aanvulling van controle, met SBA buffer, bacteriën en aanvulling. Kolommen 3-12 bevatten serummonsters. Elk monster wordt uitgevoerd dubbele serieel verdunde 3 katernen van rij H rij A

Figure 1
Figuur 1: LBA platen na kleur ontwikkeling. Representatieve S. flexneri 3a bacteriële micro-kolonies hebben 's nachts uitgegroeid tot de juiste grootte. Topagar istoegevoegd en koloniën hebben ontwikkeld een rode kleur door vermindering van de TTC compound in topagar. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: software-interface van NIST van geïntegreerde kolonie Enumerator (NICE). Grafische weergave van de aardige software-interface. Regio's van belang (ROIs) gecentreerd over kolonies voor elke vlek vóór het tellen. Rechtstreeks vanuit het mooie venster kunnen gegevens worden geëxporteerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: LBA platen getelde in aardige Software. De foto van de kleurenafbeeldingen in aardige software worden geladen en kolonie vormende eenheden (CFUs) worden automatisch geteld. Dit beeld toont twee representatieve LBA platen met hun kolonie graaf informatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

185 167 145 151 122 134 119 142 124 115 113 123 1:17496 Verdunning 8
186 152 145 138 132 135 108 116 100 119 105 109 1:5832 Verdunning 7
179 160 145 135 109 120 54 55 71 75 79 89 1:1944 Verdunning 6
193 153 146 138 87 105 5 6 6 9 19 30 1:648 Verdunning 5
184 129 121 143 6 7 0 1 1 1 1 1 1:216 Verdunning 4
180 145 22 24 2 3 3 1 1 0 0 0 1:72 Verdunning 3
207 129 1 0 2 2 1 0 4 1 0 1 1:24 Verdunning 2
201 140 0 0 0 0 1 1 1 0 4 4 1:8 Verdunning 1
Besturingselement een Controle B Voorbeeld 1 Voorbeeld 2 Monster 3 Monster 4 Monster 5

Tabel 2: graven van bacteriële kolonies. CFU graven worden uit de aardige software naar excel-indeling uitgevoerd. Deze punten kunnen worden geregeld in een tabel waarin dat de bacterietelling geldt voor alle dubbele monsters en -controleputjes.

Besturingselement een Controle B 148 128 131 120 118 1:17496 Verdunning 8
189 147 142 134 112 110 107 1:5832 Verdunning 7
NSK (1-CtrB/CtrA): 22% 140 115 55 73 84 1:1944 Verdunning 6
50% KI (CtrB/2): 73 142 96 6 8 25 1:648 Verdunning 5
132 7 1 1 1 1:216 Verdunning 4
23 3 2 1 0 1:72 Verdunning 3
1 2 1 3 1 1:24 Verdunning 2
0 0 1 1 4 1:8 Verdunning 1
Voorbeeld 1 Voorbeeld 2 Monster 3 Monster 4 Monster 5

Tabel 3: berekening van 50% KI grenswaarde en dubbele monster gemiddelden. De grenswaarde van 50% KI werd berekend door het gemiddelde van alle Control B putjes en delen door 2. Gemiddelden van duplicaten werden berekend voor elke verdunning van elk monster dat werd uitgevoerd in tweevoud. NSK waarde wordt ook berekend.

Figure 4
Figuur 4: schematische van lineaire interpolatie. Het aantal overlevende bacteriën (y-as) bij elke verdunning van het serum getest (x-as) wordt uitgezet (zwarte diamanten), en afzonderlijke punten zijn verbonden door de stippellijn, dunne zwarte lijn. De solide en onderbroken horizontale lijnen geven aan 0% en 50% doden, respectievelijk. De verdunningen van het serum boven (verdunning 5) onder (verdunning 4) de 50% doden van de lijn zijn verbonden door een rode lijn en bactericide titer (KI) wordt aangegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

SBA KI
Voorbeeld 1 72
Voorbeeld 2 216
Monster 3 1994
Monster 4 1994
Monster 5 648

Tabel 4: SBA resultaten weergegeven: bactericide titer (KI). Definitieve SBA KI waarden zijn vastgesteld voor elk monster en worden getoond. Deze waarden worden berekend met behulp van de gemiddelde CFUs, de KI-grenswaarde van 50% en de lineaire interpolatie-formule.

Discussion

Het protocol beschreven hier toont een functionele immuun test om te beoordelen van de shigellacidal activiteit van antilichamen in het serum. In de bepaling voor dit protocol monoclonal antilichamen specifiek voor S. flexneri 3a aangetoond gebruikte9 werden samen met menselijke controlesera uit een vorige Shigella vaccin bestuderen11. De bron van serum getest in deze test kan variëren sterk van preklinische dierlijke monsters menselijke klinische monsters, en de activiteit van de shigellacidal van het serummonster zal worden beïnvloed door inentingen en vorderingen die het individu heeft doorgemaakt. Sommige Kruisallergie kan worden verwacht tussen nauw verwante serotypen, specifiek 2a S. flexneri en S. flexneri 3a doch weinig Kruisallergie in deze stammen in vergelijking met S. sonnei9heeft voorgedaan. De basis van de SBA richt zich op de activering van de complement cascade door antilichaam-antigeen-bindend. De behandeling van het BRC-reagens is daarom één van de vele kritische stappen betrokken bij de uitvoering van dit protocol. BRC werd geselecteerd voor gebruik in deze test vanwege de consistente prestaties en lage niveaus van NSK in andere bactericide testen12,13,14.  De activiteit van BRC is temperatuur gevoelig en moeten passende maatregelen worden genomen om ervoor te zorgen dat bevriezen dooi cycli zijn geminimaliseerd, dat het BRC is aliquoted in Eenpersoonsgebruik volumes, en dat de BRC aliquots snel, onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik in de bepaling zijn ontdooid. De consistentie van aanvulling activiteit zal gevolgen hebben voor de reproduceerbaarheid van deze test. Een andere belangrijke stap die van invloed zijn assay reproduceerbaarheid is de productie en de verdunning van bacteriële voorraden. Het is belangrijk dat voor het begin van de test de aangewezen verdunning van bacteriële voorraden wordt bepaald, als assay succes is afhankelijk van de constante productie van besturingselementen A en B hebben CFU telt gemiddeld ~ 120 kve per plek. Om locaties die aftelbare door de software zijn, is het ook noodzakelijk dat de techniek waarmee bacteriën van de plaat met succes is uitgevoerd. De afzetting van bacteriële oplossing en kantelen van de plaat, zodat vlekken ~ 2-3 uitvoeren cm is van cruciaal belang voor de productie van de kolonies van de juiste grootte en juiste verdeling voor nauwkeurige tellen door de aardige software. Beheersen van al deze stappen zullen ervoor zorgen dat accurate, consistente resultaten worden geproduceerd door dit protocol

Zelfs wanneer alle kritische stappen worden uitgevoerd kunnen daar goed nog wel gevallen waarin het is nodig te wijzigen of het oplossen van dit protocol. Wijzigingen van dit protocol om te evalueren van andere bacteriën kunnen vereisen een optimalisatie van de overnachting LBA plaat incubatietemperatuur, om ervoor te zorgen de vorming van micro-kolonies. Andere stammen van bacteriën of antilichaam wellicht andere bronnen, dan serum, optimalisatie van aanvulling concentratie. NSK waarden en KIs van controlesera moeten ook erop worden toegezien dat de bepaling op de juiste wijze werkt. NSK zou niet meer dan 70% stijgen. Het KI van besturingselement sera moeten niet variëren betekenen meer dan ± 2SD. Succesvol en consequent om resultaten te bereiken bij het gebruik van dit protocol, moeten het alle stappen zoals hier beschreven met speciale aandacht voor de kritische stappen hierboven beschreven.

Terwijl dit protocol een belangrijke behoefte in de onderzoekgemeenschap Shigella vult , is het niet zonder haar beperkingen. Dit protocol zal is gebaseerd op biologische materialen en, dus, altijd sommige variabiliteit die is moeilijk te controleren. Variaties in de aanvulling bedrijvigheid uit verschillende partijen en bronnen kunnen bijdragen aan de variabiliteit in testen. Om te verhelpen dit, is het belangrijk goed overweg met aanvulling en testen van nieuwe veel aanvulling voor activiteit alvorens een aankoop. Het kan ook nuttig zijn voor het maken van de zwembaden van aanvulling percelen met bekende activiteit te hebben een homogeen aanbod zijn. Dit protocol is eenvoudig door design en vereist geen gespecialiseerde apparatuur en de geautomatiseerde kolonie opsommen van software is vrij beschikbaar. Terwijl deze eenvoud een voordeel is, is waardoor dit protocol moet worden gebruikt in vrijwel elk laboratorium, het nog steeds vereist een overnachting incubatie. Recente tests zijn beschreven die hebben veel kortere incubatie-eis, maar vereisen gespecialiseerde, voorbereidende reagentia15. Een andere beperking van deze test is dat in zijn huidige vorm is het alleen geschikt voor een enkele bacteriesoorten in één keer onderzoeken. Op het gebied van Shigella is er een verlangen om te creëren van een multivalent vaccin, en immunologische testen dat ziekteverwekkers in een multiplex wijze kunnen beoordelen is van grote waarde. Deze test kan in de toekomst worden gewijzigd om te voldoen aan deze behoefte, maar in zijn huidige vorm, het is een single-plex assay.

Deze bepaling weliswaar enkele beperkingen, heeft op stilstaand vele voordelen ten opzichte van bestaande of alternatieve methoden. Deze voordelen zijn veel verbeteringen die een combinatie te maken van de uitvoering van deze methode veel minder arbeidsintensief en meer high-throughput dan traditionele SBAs. Het gebruik van bevroren bacteriële voorraden, een 96-wells-plaat assay formaat, de beplating op grotere vierkante petrischalen, de kleur van de kolonies voor fotograferen en automatische kolonie-tellen, waarmee bijdragen alle aan het verminderen van de materialen en de tijd die nodig is om dit assay. Deze test heeft ook voordelen ten opzichte van andere methoden van hoge-doorvoer omdat het niet nodig een gespecialiseerde reagentia of apparatuur. Het protocol beschreven kan worden uitgevoerd met eenvoudige reagentia en vrij beschikbare software, waardoor de toepassing ervan in de instellingen van een laboratorium.

Alle voordelen biedt van dit protocol ondersteunt het gebruik ervan in vele toekomstige onderzoeken. De bepaling is bij uitstek geschikt voor de behandeling van immuunresponsen na vaccinatie of natuurlijke infectie. Deze toepassing voorziet in de SBA worden een waardevol hulpmiddel in Shigella vaccinresearch en al gebruikt is om het vaccin immunogeniciteit in Shigella bio-conjugate vaccins waar het aangetoond het vermogen van deze vaccins te dat heeft evalueren de productie van functionele antilichamen16induceren. Dit protocol is uitgebreid getest door meerdere laboratoria en is aangetoond dat het produceren van betrouwbare, reproduceerbare resultaten9. Dit protocol produceert ook vergelijkbare resultaten wanneer de zelfde monsters worden getest met behulp van andere bactericide testen17. De consistentie van de gegevens die zijn gegenereerd door deze test, en de verenigbaarheid ervan met de andere oudere methoden maakt het een robuust hulpmiddel om bactericide activiteit in serummonsters nauwkeurig te beoordelen. De bepaling kan ook gemakkelijk worden aangepast aan het evalueren van extra monster typen. Terwijl serum direct beschikbaar in volwassen klinische proeven is, kan het moeilijk zijn om voldoende serum in proeven gericht op baby's en kleine kinderen; een van de uiteindelijke doelpopulaties voor Shigella vaccins. In deze proeven, volbloed routinematig verzameld op filterpapier en gedroogd. Er zijn sommige voorlopige succes met dit soort sample-formaat met behulp van de SBA geweest. Naast volbloed zijn mucosal monsters (zoals speeksel, fecale extracten en urine) ook een doelwit die relevant is in Shigella vaccinresearch. Momenteel dit protocol is geëvalueerd voor drie van de meest klinisch relevante serotypes van Shigella , maar het kan ook worden aangepast voor extra Shigella spp., alsmede andere bacteriële pathogenen. Toekomstige werkzaamheden zullen zich toespitsen op de productie van een multiplex assay met veel van dezelfde eigenschappen als de test beschreven door dit protocol. Een multiplexed assay zal scheppen voor evaluatie van meerdere Shigella serotypes tegelijkertijd verder behoud van monster volumes en handen op assay tijd. Ook is er werk aan de gang om deze test naar laboratoria over de hele wereld. Deze globale evaluaties zal genereren meer gegevens naar de kwalificatie van de bepaling op een grotere schaal onderzoek, terwijl tegelijkertijd de toenemende aantal microbiologie en immunologie laboratoria die toegang tot deze SBA hebben om bacteriën en serum monsters verzameld uit verschillende endemische locaties. De hier beschreven test is eenvoudig en high-throughput en heeft de mogelijkheid om het verbeteren van de immunologische beoordeling in de Shigella veld, evenals de bredere toepassingen tot beoordeling van andere bacteriële pathogenen.

Disclosures

R.W.K is een vaste medewerker van de Amerikaanse regering en als zodanig de standpunten in deze publicatie zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijk het officiële beleid of de positie van de afdeling van het leger, ministerie van defensie, noch de Amerikaanse regering.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van pad naar M.H.N. Deze studie werd uitgevoerd als een coöperatie onderzoeks- en ontwikkelingsovereenkomst tussen de Walter Reed Army Institute of Research en de Universiteit van Alabama in Birmingham.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gelatin Sigma G9391 Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture
TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride) Sigma T8877 ≥98.0% (HPLC)
Sodium azide (NaN3) Sigma S2002 ≥99.5%
Baby Rabbit Complement PelFreez 31061-3 3-4 week old
HBSS with Ca2+/Mg2+ Invitrogen 14065-56 Without Phenol Red
LB Agar (Lennox) Sigma L2897 Powder microbial growth medium
Bacto Agar BD 214010 Powdered, (C12H18O9)n
Glycerol Sigma G5516 For molecular biology, ≥99%
LB Broth (Lennox) Sigma L3022 Powder microbial growth medium
Square Petri Dish Sigma Z617679-240EA 120 mm x 120 mm
Assay Plate Costar 3799 96 well u-bottom plate with lid
NICE Software University of Alabama at Birmingham ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Riddle, M. S., Sanders, J. W., Putnam, S. D., Tribble, D. R. Incidence, etiology, and impact of diarrhea among long-term travelers (US military and similar populations): a systematic review. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 74, (5), 891-900 (2006).
  2. Tickell, K. D., et al. Identification and management of Shigella infection in children with diarrhoea: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5, (12), e1235-e1248 (2017).
  3. Livio, S., et al. Shigella isolates from the global enteric multicenter study inform vaccine development. Clinical Infectious Diseases. 59, (7), 933-941 (2014).
  4. Barry, E. M., et al. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 10, (4), 245-255 (2013).
  5. Noriega, F. R., et al. Strategy for cross-protection among Shigella flexneri serotypes. Infection and Immunity. 67, (2), 782-788 (1999).
  6. Levine, M. M., Kotloff, K. L., Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road. Nature Reviews Microbiology. 5, (7), 540-553 (2007).
  7. Sayem, M. A., et al. Differential host immune responses to epidemic and endemic strains of Shigella dysenteriae type I. Journal of Health Population and Nutrition. 29, (5), 429-437 (2011).
  8. Rahman, M. J., et al. Effects of zinc supplementation as adjunct therapy on the systemic immune responses in shigellosis. The American Journal of Clinical Nutrition. 81, (2), 495-502 (2005).
  9. Nahm, M. H., et al. interlaboratory evaluations, and application of a simple, high-throughput Shigella serum bactericidal assay. mSphere. 3, (3), (2018).
  10. Burton, R. L., Nahm, M. H. Development and validation of a fourfold multiplexed opsonization assay (MOPA4) for pneumococcal antibodies. Clinical and Vaccine Immunology. 13, (9), 1004-1009 (2006).
  11. Tribble, D., et al. Safety and immunogenicity of a Shigella flexneri 2a Invaplex 50 intranasal vaccine in adult volunteers. Vaccine. 28, (37), 6076-6085 (2010).
  12. Kim, H. W., Kim, K. H., Kim, J., Nahm, M. H. A high throughput serum bactericidal assay for antibodies to Haemophilus influenzae type b. BMC Infectious Diseases. 16, 473 (2016).
  13. Maslanka, S. E., et al. Standardization and a multilaboratory comparison of Neisseria meningitidis serogroup A and C serum bactericidal assays. The Multilaboratory Study Group. Clinical Diagnostic Laboratory Immunology. 4, (2), 156-167 (1997).
  14. Jang, M. S., Sahastrabuddhe, S., Yun, C. H., Han, S. H., Yang, J. S. Serum bactericidal assay for the evaluation of typhoid vaccine using a semi-automated colony-counting method. Microbial Pathogeneis. 97, 19-26 (2016).
  15. Necchi, F., Saul, A., Rondini, S. Development of a high-throughput method to evaluate serum bactericidal activity using bacterial ATP measurement as survival readout. PLoS One. 12, (2), e0172163 (2017).
  16. Riddle, M. S., et al. Safety and immunogenicity of a candidate bioconjugate vaccine against Shigella flexneri 2a administered to healthy adults: a single blind, randomized phase I study. Clinical and Vaccine Immunology. (2016).
  17. Shimanovich, A. A., et al. Functional and Antigen-Specific Serum Antibody Levels as Correlates of Protection against Shigellosis in a Controlled Human Challenge Study. Clinical and Vaccine Immunology. 24, (2), (2017).
Een High-throughput <em>Shigella</em>-specifieke bactericide Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weerts, H. P., Yu, J., Kaminski, R. W., Nahm, M. H. A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay. J. Vis. Exp. (144), e59164, doi:10.3791/59164 (2019).More

Weerts, H. P., Yu, J., Kaminski, R. W., Nahm, M. H. A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay. J. Vis. Exp. (144), e59164, doi:10.3791/59164 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter