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Immunology and Infection

高スループット赤痢菌-特定の殺菌試験

doi: 10.3791/59164 Published: February 27, 2019

Summary

血清中の抗体のShigellacidal活性を測定するためのプロトコルをご紹介します。血清は細菌培養、外因性の補足物と混合され、寒天版で反応混合物をメッキします。細菌はカウント、自動コロニー列挙子を使用して、殺菌力価を決定するために使用のコロニーを形成します。

Abstract

血清殺菌アッセイ (SBAs) 抗体の機能活性を測定し、何十年も使用されています。Sba は直接細菌に結合し、補体をアクティブにする血清中の抗体能力を評価することにより抗体の殺傷活性を測定します。この補体の活性化は、換散と標的細菌の殺害の結果します。これらのアッセイは、彼らはこれらの抗体が抗体が感染の予防に果たす役割を研究する研究者で生体機能を解明するための抗体の生産の定量化を超えて行くために貴重です。Sba は、多くの人間の病原体の免疫応答の研究に使用されているが、現時点では赤痢菌の広く受け入れられた方法論はありません。歴史的には、Sba されている非常に労働集約的で存続の細菌を正確に定量化するための多くの時間のかかる手順を必要とします。このプロトコルを記述する単純な堅牢なと高スループット試金その対策機能の特異抗体赤痢菌体外血清中。ここで説明する方法は、冷凍細菌の在庫の使用を含む、伝統的な SBAs に比べて多くの利点を提供しています、96 もアッセイ プレート、マイクロ文化システム、および自動化されたコロニー カウントします。すべてのこれらの変更は手間がかからないとより高スループットこの試金を作る。このプロトコルは、簡単かつシンプルな技術と容易に入手できる試薬を使用しながら伝統的な SBAs より実行する高速です。プロトコルは、複数の独立した研究所で正常に適用されているし、アッセイは、堅牢で再現。アッセイは、前臨床試験と臨床研究で免疫応答を評価するために使用できます。機能的抗体応答の生成のより広範な理解と防御免疫への貢献により、抗原暴露 (予防接種や感染症のいずれか) の前後に両方 shigellacidal 抗体価を定量化します。この標準化の開発、よ特徴付けられたアッセイ大幅赤痢菌ワクチン設計を促進するかもしれない。

Introduction

赤痢菌の血清型、赤痢菌2 a、 s. 菌3 a、 s. 体グローバル疫学的有病率を示しています。これら赤痢菌種への影響、軍事方1、によって引き起こされる下痢性疾患で、発展途上国2で 5 の年齢の下で子供の下痢の死亡の主要な原因です。赤痢菌から守るために認可されたワクチンがない、しかし、開発のさまざまな段階で複数の候補者ワクチンがあります。これらのワクチンと現在開発中の他の予防措置の多くは赤痢菌リポ多糖 (LPS) に対する抗体に焦点を当てます。それは主要な表面抗原と赤痢菌の自然感染は、血清型固有の方法で再感染に対して保護することができます LPS 特異抗体を誘導するため、組合、魅力的なワクチン候補です。したがって、成功した赤痢菌ワクチンは、多原子価とターゲット 3-4 グローバル循環系統3,4,の 70-80% に対して免疫を誘導する赤痢菌の血清型にする必要があります。5,6。 これは赤痢菌ワクチン候補を評価するための試金は複数の異なる血清型のために特定できる必要があります。

抗体価のレベルを定量化に焦点を当てるワクチン候補を評価するための現在の免疫学的アッセイですが機能性抗体を評価するいくつかのよく特徴付けられるアッセイ。病原体特異抗体は細菌表面抗原への付着を防止するなどの機能のメカニズムの数を介して感染症との闘い、ため抗体機能の検討が重要ですし、上皮細胞、細菌細胞やオプソニン貪食能をターゲットと直接結合し、補体カスケードを開始する病原体を殺すの感染症。抗体による細菌の直接の殺害は、抗体標的細菌の表面のコンポーネントにバインドし、最終的に細菌の細孔形成の結果細胞を多く zymogens の活性化につながる補体カスケードを開始場合に発生します。換散および細菌の死を引き起こします。この直接の殺害細菌抗体および補体を循環させることにより伝染の間に防衛の重要な初期の行があります。

自然感染している人は、その血清中の shigellacidal 活動に抗体を持っています。7,8の試金の伝統的な補体を介した殺害を使用してこれらの赤痢菌 -特異抗体が検出されました。これは、殺菌抗体赤痢菌に対する保護のための役割があるかもしれないことを示します。従来の殺菌法は、その実行の簡単な: 血清は (内因性補体活性を破壊する) に熱不活化および興味の細菌と混合。外因性補体は、特定の濃度でこの混合物に追加されます。反応混合物は、細菌の殺害を可能にするために孵化し、コロニー形成単位 (CFUs) を確認するため、メッキです。CFUs がカウントされます 50% 殺害インデックス (氣) を計算できるし、SBA 価を測定します。この手順は比較的単純ですが、これらの試金は手間とを実行する時間がかかるすることができ、結果は非常に可変することができます。これらの制限に加えてよく特徴付けられて機能アッセイ現在存在しないため赤痢。したがって、我々 正常に開発し、臨床的に最も関連性の高い系統9の 3 つの赤痢菌殺菌活性を測定する簡単な高スループット アッセイを修飾します。このプロトコルでは、SBA アッセイ効率性と再現性を向上させるための変更について説明します。これらの変更の最初の冷凍の細菌の在庫の使用です。シングルユース株の生産には、アッセイの試金の変動も削減しながらそれぞれの試金のための新鮮なバクテリアを培養する必要があります。別の時間と労働 96 ウェル プレート アッセイ フォーマットの使用は、このプロトコルの利点を保存します。これで、サンプルのシリアル希釈濃度の範囲をテストすることができますに。 また、めっき試料平方ペトリ皿上のマルチ チャンネル ピペットの使用できます。マイクロ コロニーを作り出す文化システムと組み合わせてこれらの正方形のシャーレを使用する場合は、アッセイに必要な寒天版数が減少します。これは、もともと肺炎球菌の多重 opsonophagocytic 試金 (MOPA)10を殺し、自由に利用できるコロニー カウント ソフトウェアとの組み合わせで、自動化、迅速かつ信頼性の高いコロニー列挙体のことができます。これらの改善すべて大幅に減らす実践的な測定時間と同時に実行する複数の板を可能にする高スループット システムを作成します。

このプロトコルは、赤痢菌SBA はここで説明の最も臨床的に関連する血清型の 3 つで最適化されています中は、他の多くの細菌の病原体に簡単に適用できます。このプロトコルの他の細菌との潜在的な使用、に加えてこのプロトコル粘膜サンプルなど他の関連するサンプル タイプの抗体の解析を含めることができます、開始材料としてのみ血清を用いたを超えて拡大する可能性があります。唾と糞便を含みます。ワクチン接種後の免疫応答を調査するためこの試金の使用は、予防接種ワクチンの合理的な設計につながるによって生成された免疫応答により広範な洞察力を与える可能性があります、どのように自然免疫の理解の援助を開発します。

Protocol

このプロトコル WRAIR 被験者保護委員会のガイドラインに従います。本研究で使用されるサンプルは、被験者の保護を管理するすべての機関および連邦政府の規制に準拠して WRAIR プロトコル番号 1328 年の一部として収集された血清サンプルです。サンプルはデ識別され、これらの匿名のサンプルの使用は UAB IRB (プロトコル番号 N150115001) で非人間課題として分類されていた。

1. アッセイ用試薬

  1. 準備 1% ゼラチン ゼラチン 1 g を 100 mL の水に追加することによって。オートクレーブと室温で保管します。
  2. 2,3,5 - 塩化トリフェニルテトラゾリウム) 原液 100 mg/mL を準備 (1、000 x) TTC の 5 g を水 40 mL に追加することによって。TTC が完全に解散したときは、50 mL の水と滅菌フィルター 0.2 μ m フィルターを使用して、音量を調整します。4 ° C でソリューションを格納し、光から保護します。
    注:TTC は、細菌のコロニーを色づけしてカウントする簡単になります。TTC のソリューションには、わずかに黄色があります。TTC ソリューションは、赤い色を開発し、破棄、新鮮な準備してください。
  3. 10% アジ化ナトリウム (NaN3) ストック溶液 (100 倍) を準備するには、40 mL の水に 5 g ナン3を追加します。完全な分解の後に、50 mL に水を追加します。常温で保存します。
    注意:アジ化ナトリウムは、毒されており、摂取または目または皮膚から吸収された場合有害である可能性があります。それは鉛と銅配管爆発金属アザイドを形成する反応があります。アジ化ナトリウムを含む試薬の処分のアジ化物のビルドアップを防ぐまたはバイオハザード バッグで破棄する水の大きい容積をフラッシュします。
  4. LB 寒天培地の 35 グラムを 1 リットルの水のオートクレーブに追加することによって、LBA プレート (LB 寒天培地プレート) を準備します。25 mL を各角型シャーレ (120 x 120 mm2) に追加します。寒天を固めるように 10 〜 20 分のための RT でプレートを孵化させなさい。1 ヶ月のビニール袋、4 ° C で店に戻ってプレートを配置します。
  5. 寒天の 7.5 g を水 1,000 mL、オートクレーブに追加することで、オーバーレイの寒天を準備します。必要になるまで 56 ° C の水浴で孵化させなさい。使用前に 100 mg/mL と 10 mL の 1 mL を追加 10% ナン3とよく混ぜる。
    注:各 LBA プレートでは、25 mL の寒天培地のオーバーレイの必要があります。オーバーレイ寒天を覚悟の 1 カ月前に、アッセイのため必要に応じて電子レンジやホット プレートを溶かした。寒天培地の温度が LBA プレートへの適用前に 〜 55 ° C であることを確認します。
  6. 40 mL の水に 5 mL の 10 x ・ ハンクスのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) Ca2 +/Mg+2 1% のゼラチンの 5 mL を追加してアッセイのバッファーを準備します。常温で保存します。

2 の補数を準備し、細菌をターゲット

  1. 赤ちゃんウサギの補数 (BRC) を準備します。
    注:補完する多くの選択を見つけることがここで基準を説明: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
    1. 冷凍 BRC を取得し、冷たい水を実行して解凍します。物理的のミックス、BRC すべての 10 〜 20 分完全に解凍するまで。繰り返し凍結融解に BRC を与えないでください。
    2. BRC を解凍すると中、1.5 mL、5 mL、15 mL の遠沈管にラベルを付けます。場所は、あらかじめ冷たい氷の上の管をラベル付けします。予冷遠心分離チューブに分注適切なボリューム BRC (充填した後、すぐに各チューブに戻る氷)。≤-70 ° C で因数を冷凍庫に格納します。
      注:補体の約 1 m 各アッセイ プレートが必要です。補完する因数は一人用し、レイアウトを試金する適切なボリュームで避けようとする必要があります。
    3. BRC の熱不活化を準備するには、アクティブ BRC の 1 つの因数分解しなさい。56 ° C の水浴を準備します。BRC を完全に分解した後風呂の水にそれを移すし、30 分間インキュベートします。
    4. インキュベーション後、風呂の水から BRC の熱不活化を削除し、10-15 分ミックス積極的に RT で冷却して 1.5 mL 遠心チューブに分注 〜 150 μ L。≤ で因数を格納-10 ° C
  2. ターゲット細菌の在庫を準備します。
    注:以下の手順を使用して、ターゲット細菌株式の 48 の因数を準備するにはもっと因数が必要な場合、プロトコルをスケール アップすることができます。
    1. マスター ストック冷凍庫からバイアルし、血液寒天培地プレート上にバイアルから氷の少量を削除する冷凍細菌表面をこすり細菌を削除します。マスター ストック バイアルを冷凍庫にすぐに戻ります。
    2. 血液寒天培地プレートとプレートふた付けカバーに細菌の在庫のこの小さな因数を連勝します。逆さま一晩 37 °C/5% CO2インキュベーターでプレートをインキュベートします。
    3. 流体培養基 LB の 30 mL を含む 50 mL のチューブに 〜 10 隔離された滑らかなコロニーを転送します。培養液がある ~0.6 0.7 の外径 φ600まで穏やかな揺れで 37 ° C で 3-5 時間孵化させなさい。
    4. トップ文化と新鮮な 50 mL チューブへの転送の 12.5 mL を収穫します。テーブル トップ マイクロ遠心分離機を使用して 2 分間 15,000 × gで文化を遠心します。上澄みを廃棄し、再 15% 滅菌グリセリン ポンド 25 mL にペレットを中断します。
    5. よく混合し、0.5 ml を滅菌 1.5 mL マイクロ遠心チューブ (~ 48 管) に分配します。≤-70 ° C で因数を冷凍庫に格納します。
    6. 使用する前に凝集反応テストを使用して細菌の id を確認します。
  3. ターゲット細菌株の最適な希釈倍率の決定
    注:ターゲット細菌の在庫の各バッチは、アッセイ条件 〜 120 CFU/ポンドのプレート上のスポットを生成するために必要な希釈を決定するために滴定する必要があります。
    1. マイクロタイター プレート (希釈プレート) を取得し、1 a をよくアッセイバッファーの 135 μ L を追加します。井戸 1 b ・ 1 H アッセイ バターの 120 μ L を追加します。
    2. 冷凍庫から冷凍対象菌のバイアルを削除し、室温で解凍します。細菌の在庫の 10 倍希釈を行うため 1 a をうまく解凍の細菌の在庫の 15ul を追加します。
    3. よく 1b 割増シリアル希釈を実行するも 1 a から細菌のソリューションの 30 μ L を転送します。8 希薄 (1:10 1:50 1: 250; 1:1 250; 1:6 250; 1:31 250; 1:156 250; 1:781 250) の合計に 1 H はよく割増のシリアル希薄を続行します。
    4. 別のマイクロタイター プレート (アッセイ プレート) を取得し、アッセイ プレートの 1 と 2 列ですべてが順調にアッセイバッファーの 20 μ L を追加します。
    5. 希薄化後の細菌の 10 μ L を希釈板の 1 列目のウェルからアッセイ プレートの 1 と 2 の列に対応する井戸に移転します。細菌の 10 μ L は、よく 1 a および 2 a アッセイ プレート等に希釈板も 1 a から転送されます。
    6. コントロールとコントロール B 手順 3.6 3.12 の前述の血清殺菌アッセイ (SBA) の下のアッセイを続行します。
    7. プレートは、氷の上に培養されている後、は、LBA プレート上に 1 列目の井戸から 10 μ L をスポットに 8 のピペット チップでマルチ チャンネル ピペットを使用します。また、LBA プレート上に 2 列から井戸を見つけます。
    8. 3.14 4.6 の手順で以下のとおり分析を続行します。
    9. 〜 120 試金で使用される CFU/スポット コントロール B、この希釈で利回り細菌希釈を決定します。

3. 血清殺菌アッセイ (SBA)

注:以下の手順は、1 つのアッセイ プレートがアッセイ プレート数を増やすことができます。

  1. 熱不活化 30 分の 56 ° C の水浴でインキュベーターのサンプルでサンプルをテストします。
    注:テスト サンプルは、テストが、内因性補体活性を破棄する前に熱不活化する必要があります。これはアッセイの前に行うことができ、不活化サンプルを再凍結またはテストまで 4 ° C で保存することができます。
  2. アッセイ プレートを取得、列 1 の行 A g. 追加 20 μ L からアッセイバッファーの 1 と 2 の H の行の列に 12 ~ アッセイバッファーの 20 μ L を追加の表 1を参照してください。
  3. アッセイ プレートの H の行を重複して各テスト サンプルの 30 μ L をロードします。たとえば、3 H、4 H、井戸にサンプル 1 の 30 μ L を分注、5 H と 6 H の井戸等にサンプル 2 の 30 μ L を分注します。
  4. マルチ チャンネル ピペットを使用して試料の 3 倍のシリアル希薄を実行します。
    1. 行 G で 10 の井戸 3-12 H からサンプルの μ と対応する井戸への転送を削除し、上下にピペッティングでよくサンプルをミックス 8-10 回。
    2. F の行 10 の 3 G、12 G の井戸から μ と対応する井戸への転送を削除し、よく混ぜます。
    3. A. 行を通じてこれらのシリアル希薄を続けるA の行で井戸を混合した後削除し、20 μ l を含むすべての井戸井戸 3A-12 a から 10 μ l を破棄します。
      注:20 μ L の血清を 80 μ L の合計アッセイ ボリュームのため、試金の 4 倍追加希釈があります。この希釈は、4 血清の希釈を乗じて SBA 価の計算時にアカウントに撮影する必要があります。たとえば、1:2 の開始の希釈を使用すると、テストされている実際の希釈は 1:8 です。
  5. 冷凍室温で融解ターゲット細菌の 1 つのバイアルを削除します。(この希釈倍率はセクション2.3で決定された) 前もって決定された最適な希釈倍率によると 20 mL のアッセイ バッファー内の細菌を希釈します。マルチ チャンネル ピペットを使用してアッセイ プレートの各ウェルに希釈した細菌の 10 μ L を追加します。
  6. 熱不活化 BRC、冷たい水を実行して室温で融解凍結冷凍 BRC のバイアルとの 1 つのバイアルを削除または生物学的安全性の格子にすばやく解凍に空気を吹くとキャビネットを配置します。
  7. BRC の熱不活化の 20% 溶液を準備します。ミックス 100 μ L の熱不活化 BRC アッセイバッファーの 400 μ L で。列 1 (コントロール A 井戸) のすべての井戸にこの 20% の熱不活化 BRC 溶液 50 μ L を追加します。
    注:BRC の熱不活化は試金の非特異的殺害 (NSK) を監視するコントロールとして使用されます。
  8. ネイティブ BRC の 20% 溶液を準備します。アッセイバッファー 4 mL とネイティブ BRC の 1 mL を混ぜます。列 2 ~ 12 (コントロール B とテスト サンプル井戸) のすべての井戸にこの混合物の 50 μ L を追加します。
    注:反応混合物に BRC の最終濃度は 12.5% です。
  9. 簡単にミックス アッセイ プレート プレート シェーカーで 10-15 s の優しく揺することによってまたはマルチ チャンネル ピペットを使用して 8 回上下ピペッティングで混ぜます。
  10. (揺れ) なし 2 時間 37 ° C 微生物インキュベーターでアッセイ プレートを置きます。
  11. 蓋の取り外しプレートを配置することによって乾燥 2 LBA プレートは生物学的安全キャビネット 40-60 分間で立ち向かいます。
  12. 2 時間培養が完了したら、氷をウェットし、反作用を停止する 10-20 分間インキュベートするアッセイ プレートを移動します。
  13. 12 チャネル ピペッティング システムを使用して、行 H、LBA プレートの下部に反応混合物のスポット プレート 10 μ L の井戸をミックスします。すぐに板を傾けるし、~1.5-2 cm。 行 G、F、E、LBA プレートの前の行の上にそれらをスポッティングのこの手順を繰り返し実行するスポットを許可します。LBA プレートと行の A、B、C、および D は同様に 2 番目の LBA プレート発見が 1 つ上に行の E、F、G、および H が発見され、図 1を参照してください。
  14. ソリューションが LBA のプレート (10-15 分) に吸着するまで室温で LBA 版を孵化させなさい。LBA プレートの蓋を入れて、微生物のインキュベーターで一晩インキュベートする逆さまの LBA プレートを配置 (16 〜 18 h)。S. 菌2 a と 3 a 29 ° c の孵化し、孵化させなさいS. 体は 26 ° c.
    注:これらの温度は、小さい「マイクロ-植民地"コロニー カウンター9による正確なカウントに適した規模をもたらします。
  15. 一晩インキュベートした後 100 μ g/mL TTC と各 LBA のプレートに 0.1% ナン3を含む (〜 55 ° C) でオーバーレイ寒天の 25 mL を追加します。
  16. 下の図 1を参照してください、赤い色を開発する存続の細菌を許可するように 2 h の 37 ° C で LBA 版を孵化させなさい。
  17. デジタル カメラを使用してプレートを写真し NIST の統合されたコロニー列挙ソフトウェア (ニース) がインストールされているコンピューターにイメージを転送、図 2を参照してください。
    注:素敵なコロニー カウント ソフトウェアは無償でご利用いただけます。詳細およびインストール手順については、材料のリストを参照してください。

4. カウント細菌コロニー

  1. オープンの素敵なソフトウェアと入力オペレーター名実験については、空のフィールドにノートの試金します。このデータを入力した後、[ Done ] ボタンをクリックします。
  2. 撮影板をインポートするには、 [開く] ボタンをクリックして、コンピューターから適切なファイルを選択します。
  3. アッセイ パラメーターを調整するには、の数を 4 と 12の番号に設定できます。-3 シグマに背景設定と低解像度を調整します。図 2を参照してください。
  4. クリックしてドラッグして各 ROI が 1 つサンプル スポットの上に直接関心領域 (Roi) に移動します。すべての細菌のコロニーが重ならないのサンプルの間で投資収益率内部がようにします。1 つのプレートが完了すると、保存されているデータのイメージのリスト内の次の板をダブルクリックし、Roi を調整します。図 2を参照してください。
  5. すべてのプレートを調整すると、緑のカウントボタンをクリックして、図 2 と図 3を参照してください。カウントが終了は、.xls/.xlsx の形式でデータをエクスポートするのには [エクスポート] ボタンをクリックします。データ解析のための.xls/.xlsx ファイルに名前を付けて保存します。
  6. 数が 96 ウェル アッセイ プレートを表す表に編成できるように、表形式にエクスポートされたデータを整理、参照してください表 2.

5. 計算 SBA 価 (KI) と非特異的殺害 (NSK)

注:SBA 価または殺害インデックス (KI) は標的細菌の 50% を殺す血清希釈の逆数として定義されます。

  1. アクティブな補完コントロール井戸 (コントロール B) CFU を平均して 2 で割ることによってインデックス (KI) カットオフ値を殺す 50% を計算します。複製で実行した各サンプルの各希釈用平均 CFU を計算、表 3を参照してください。
  2. 血清希釈がこの 50 %ki 値正確を得られることはほとんどありませんので、それは 2 つシーケンシャル血清希釈液、50% 未満を殺すと、50% 以上を殺すから補間することができます、図 4を参照してください。補間された SBA 氣を計算する数式を次に示します。
    Equation
    注:殺菌力価や気には UAB によって開発された Opsotiter ソフトウェアを使用して自動的にも計算できます。要求 Opsotiter に博士月 Nahm または氏ロブ ・ バートンに問い合わせてください。連絡先については、https://www.vaccine.uab.edu を参照してください。
  3. コントロール B コントロール a. の平均で割った値の平均を引いた値 1 を撮影する NSK 値を算出します。

Representative Results

典型的な試金で使用される 96 ウェル プレート レイアウトは、「テーブル 1.このレイアウトは、重複してアクティブな補完コントロール井戸 (コントロール B)、補体の熱不活化制御井戸 (コントロール)、および 5 つのサンプルを持っています。サンプルは 3 倍希釈直列一度にテストする各サンプルの 8 の希薄のためできるように行行 H からプレートをアップします。図 1は、一晩培養とオーバーレイの付加の後で 2 つの LBA プレートを示しています。発色が行われると、すべての存続のコロニーが赤で表示されます。細菌の殺害 (F H 行) の最初の 3 つの希釈のテストすべてのサンプルが明らかに見られるし、プレートをさらにサンプルが希釈されて、血清はより少なく集中された細菌殺害の減少が見られます。素敵なソフトウェア インターフェイスは、図 2で見ることができます。図 3、素晴らしいソフトウェアからマイクロ コロニー カウントを見ることができる、これらの数は、表 2から編成されています。各サンプルの各希釈の平均 CFU の数が計算され、50 %ki 値は表 3で計算されます。この 50% の KI 値は、図 4に示した式によると SBA 氣を計算に必要な値を決定する各血清希釈用平均 CFUs に適用できます。アッセイの最終的な結果を表 4に示します。

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A コントロール A コントロール B 希釈 8 希釈 8 希釈 8 希釈 8 希釈 8 希釈 8 希釈 8 希釈 8 希釈 8 希釈 8
B コントロール A コントロール B 希釈 7 希釈 7 希釈 7 希釈 7 希釈 7 希釈 7 希釈 7 希釈 7 希釈 7 希釈 7
C コントロール A コントロール B 希釈 6 希釈 6 希釈 6 希釈 6 希釈 6 希釈 6 希釈 6 希釈 6 希釈 6 希釈 6
D コントロール A コントロール B 希釈 5 希釈 5 希釈 5 希釈 5 希釈 5 希釈 5 希釈 5 希釈 5 希釈 5 希釈 5
E コントロール A コントロール B 希釈 4 希釈 4 希釈 4 希釈 4 希釈 4 希釈 4 希釈 4 希釈 4 希釈 4 希釈 4
F コントロール A コントロール B 希釈 3 希釈 3 希釈 3 希釈 3 希釈 3 希釈 3 希釈 3 希釈 3 希釈 3 希釈 3
G コントロール A コントロール B 希釈 2 希釈 2 希釈 2 希釈 2 希釈 2 希釈 2 希釈 2 希釈 2 希釈 2 希釈 2
H コントロール A コントロール B 希釈 1 希釈 1 希釈 1 希釈 1 希釈 1 希釈 1 希釈 1 希釈 1 希釈 1 希釈 1
サンプル 1 サンプル 2 サンプル 3 サンプル 4 サンプル 5

表 1: アッセイ プレート レイアウト。列 1 および 2 は、補完コントロール井戸を含まれています。コントロールは 1 列に位置し、熱不活化は、SBA バッファー、細菌、および補体の熱不活化を含むコントロールを補完します。コントロール B 列 2 にある、アクティブな SBA バッファー、細菌、および補完を含むコントロールを補完します。3-12 の列には、血清サンプルが含まれています。各サンプルを実行するの重複して 3 倍希釈した H の行から行 A に

Figure 1
図 1: 発色後 LBA 板。代表的なs. 菌3 a 細菌マイクロ コロニー一晩適切なサイズに成長しています。オーバーレイ寒天が追加され、植民地は、オーバーレイ寒天の TTC 化合物の減少によって赤い色を開発しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: NIST の統合されたコロニー列挙子 (ニース) ソフトウェア インターフェイス。素敵なソフトウェア インターフェイスのグラフィカル表現。興味 (ROIs) の地域で各スポットのコロニーをカウントする前に中心です。素敵なウィンドウから直接データをエクスポートできます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: LBA プレートに数えられる素晴らしいソフトウェア。カラー写真画像が素晴らしいソフトウェアに読み込まれ、コロニー形成単位 (CFUs) が自動的にカウントされます。この画像は、コロニー カウント情報を 2 つの代表的な LBA プレートを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

185 167 145 151 122 134 119 142 124 115 113 123 1:17496 希釈 8
186 152 145 138 132 135 108 116 100 119 105 109 1:5832 希釈 7
179 160 145 135 109 120 54 55 71 75 79 89 1:1944 希釈 6
193 153 146 138 87 105 5 6 6 9 19 30 1:648 希釈 5
184 129 121 143 6 7 0 1 1 1 1 1 1:216 希釈 4
180 145 22 24 2 3 3 1 1 0 0 0 1: 72 希釈 3
207 129 1 0 2 2 1 0 4 1 0 1 1:24 希釈 2
201 140 0 0 0 0 1 1 1 0 4 4 1:8 希釈 1
コントロール A コントロール B サンプル 1 サンプル 2 サンプル 3 サンプル 4 サンプル 5

表 2: 細菌のコロニーのカウントします。CFU の数は、excel 形式に素晴らしいソフトウェアからエクスポートされます。これらのカウントは、細菌は、すべての重複したサンプルと制御井戸のカウントを示す表に手配できます。

コントロール A コントロール B 148 128 131 120 118 1:17496 希釈 8
189 147 142 134 112 110 107 1:5832 希釈 7
日本精工 (1-CtrB/CtrA): 22% 140 115 55 73 84 1:1944 希釈 6
50 %ki (CtrB/2): 73 142 96 6 8 25 1:648 希釈 5
132 7 1 1 1 1:216 希釈 4
23 3 2 1 0 1: 72 希釈 3
1 2 1 3 1 1:24 希釈 2
0 0 1 1 4 1:8 希釈 1
サンプル 1 サンプル 2 サンプル 3 サンプル 4 サンプル 5

テーブル 3: 50 %ki カットオフ値と重複するサンプル平均の計算。50 %ki のカットオフ値は、すべてのコントロール B 井戸の平均を取って、2 で割ることによって求めた。複製で実行した各サンプルの各希釈のため重複の平均値を求めた。NSK の値も計算されます。

Figure 4
図 4: 線形補間のスケマティック。テスト (x 軸) は血清の各希釈で存続の細菌 (y 軸) の数プロット (ブラック ダイヤモンド)、個々 の点が細い破線の黒い線によって接続されています。実線と破線の水平線を示す 0%、50%、それぞれを殺します。(希釈 5) 上記血清希釈液 (希釈 4) 下ラインを殺す 50% が赤い線で接続しているし、殺菌力価 (氣) が示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

SBA KI
サンプル 1 72
サンプル 2 216
サンプル 3 1994
サンプル 4 1994
サンプル 5 648

表 4: SBA 結果示す殺菌価 (KI).SBA KI の最終的な値はサンプルごとに決定されているし、が表示されます。これらの値は、平均 CFUs、50 %ki のカットオフ値と線形補間の数式を使用して計算されます。

Discussion

ここで説明されているプロトコルは、血清の抗体の shigellacidal 活性を評価するために機能的な免疫アッセイを示します。以前赤痢菌の血清コントロールと共に使用される9をされたs. 菌3 a のこのプロトコル モノクローナル抗体の実証試験では、ワクチンは11を研究します。この試金テスト血清のソースがひと臨床サンプル、前臨床動物サンプルから大きく可能性があり、血清サンプルの shigellacidal 活動は予防接種や個人が経験しているエクスポー ジャーによって影響されます。いくつかの交差反応性は密接に関連血清型、特にS. 菌2 a とs. 菌3 a の間行う必要がありますが、少し交差反応性は、 S. 体9と比較してこれらの系統で見られています。SBA の基礎は抗体抗原の結合によって補体カスケードの活性化に焦点を当てください。したがって、BRC 試薬の処理は、このプロトコルの実行に関係する多くの重要な手順の 1 つです。BRC は、その一貫したパフォーマンスと他殺菌アッセイ12,13,14NSK の低レベルのため、この試金で使用に選ばれました。 BRC の活動は温度に敏感、サイクルが少なく、BRC は単一の使用ボリュームに避けようと BRC 因数、アッセイに使用する前にすぐに、すぐに解凍、解凍を凍結することを確認する措置をとる必要があります。補体活性の一貫性は、このアッセイの再現性に影響します。測定の再現性に影響を与えるもう一つの重要なステップは、生産、細菌の在庫の希釈です。分析を開始する前に細菌の在庫の適切な希釈が決定されること、アッセイの成功としては、コントロール A と B を持つ一貫生産によって CFU の数平均スポットあたり 120 ~ の CFU が重要です。ソフトウェアによって可算のスポットを得るために板細菌に使用される手法を正常に実行することが不可欠です。付着細菌のソリューションとスポットが 2 〜 3 を実行するためにプレートの傾斜の cm は素敵なソフトウェアによる正確なカウントのいい大きさと正しい配布の植民地の生産にとって重要です。正確で一貫した結果がこのプロトコルによって生産されていることを確認、これらすべての手順をマスター

すべての重要なステップが実行されるときにもそこにもまだありますを変更またはこのプロトコルのトラブルシューティングを行う必要。他の細菌を評価するこのプロトコルの変更は、マイクロ コロニーの形成を確保するため、一晩 LBA プレート培養温度の最適化を必要があります。他の系統以外、血清、細菌または抗体の補体濃度の最適化を必要があります。NSK 値とコントロール血清のキシュを試金が適切に動作していることを確認する監視も必要があります。また、NSK ない以上 70% で上がるべきであります。血清に変わらないようにコントロールの氣よりも ± 2SD を意味します。このプロトコルを使用する場合は、成功し、一貫性のある結果を達成するためには、上記の重要な手順に特別な注意をここで説明したすべての手順を実行する必要があります。

このプロトコルは、赤痢菌の研究コミュニティの重要な必要性を塗りつぶし、それはありませんその制限なしです。このプロトコルは生体材料に依存し、したがって、常にコントロールすることは困難は、いくつかの変動。バリエーションとソースから補体活性のアッセイの変動に貢献するかもしれない。これを防ぐには、補数を適切に処理し、新しい多くの購入前に、の活動を補完をテストすることが重要です。また、均一な供給を持って知られている活動を補完する多くのプールを作成すると便利かもしれません。このプロトコルはシンプルでデザインとソフトウェアを列挙する自動化された植民地は自由に利用できる、特別な機器を必要としません。このシンプルさは利点が、あらゆる所で使用されるこのプロトコルを許可するまだ必要が一晩インキュベート。最近の試金は多くの短いインキュベーション要件が不要な準備、専用試薬15記載されています。この試金のもう一つの制限は現在の形態でのみの単一菌種を一度に調べることができます。赤痢菌の分野では、多価ワクチンを作成する欲望と大きな価値の多重方法で病原体を評価することが免疫学の試金があります。この試金はこの必要性を満たすために、将来的に変更可能性がありますが現在の形態でそれは単一プレックス アッセイ。

この試金には、いくつかの制限がありますが、まだ既存または代替の方法に比べて多くの利点を持ってください。これらの利点には、このメソッドの実行を大いにより少なく労働集約的な伝統的な SBAs よりもより高速化するために結合する多くの改善が含まれます。材料とこれを完了するために必要な時間を減らすを助けるすべて冷凍細菌の在庫の使用、96 ウェル プレート アッセイ フォーマット、大きい正方形ペトリ皿上のめっき、撮影と自動コロニー カウントは、植民地の着色試金。このアッセイは、他高スループット方法上の利点がありますの特殊な試薬や装置を必要としないので。基本的な試薬および自由に利用できるソフトウェア、実験室の設定での応用を可能にすると説明されたプロトコルを実行できます。

このプロトコルを提供する利点のすべては、多くの将来の調査でその使用をサポートしています。試金は予防接種か自然感染後の免疫応答の検討に最適です。このアプリケーションは、sba の赤痢菌ワクチン研究に貴重なツールをすることができます、すでに赤痢菌バイオ共役ワクチン ワクチンはこれらの能力を示しているそれでワクチンの免疫原性を評価するために使用されています機能性抗体16の生産を誘発します。このプロトコルは広く複数の研究所でテストされているし、信頼性が高く、再現性のある結果9を生成するが示されています。このプロトコルはまた他の殺菌法の17を使用して同一のサンプルをテストするときと同等の結果を生成します。この分析によって生成されるデータの整合性と他のより古い方法との互換性血清試料中の殺菌効果を正確に評価するための強力なツールになります。アッセイは、追加サンプルの型を評価するあることも簡単にできます。幼児や小さい子供に焦点を当てて試験で十分な血清を取得できないことが血清は成人の臨床試験ですぐに利用できるが、赤痢菌ワクチンの最終的な対象集団の一つ。これらの試験で全血は定期的にろ紙上で収集し、乾燥します。SBA を使用してサンプル形式のこのタイプのいくつかの予備的な成功があった。全血、ほか (唾液、糞便抽出物、尿など) の粘膜のサンプルにも赤痢菌ワクチン研究において関連するターゲットです。現在、このプロトコルは、赤痢菌の最も臨床的に関連する血清型の 3 つが評価されていますが、それは追加の赤痢菌属とその他の細菌性の病原体に適応することができます。今後の作業はこのプロトコルで記述されているアッセイと同じ特性の多くの多重アッセイの生産に焦点を当てます。多重アッセイは、複数の赤痢菌の血清型の評価のため同時にアッセイ時間サンプル ボリュームと手をさらに節約できます。また、世界中で研究所にこの試金を転送するために進行中の作業です。微生物学および免疫学研究所細菌と血清を評価するこの SBA にアクセス数を増やすと同時に、大規模な研究手段としてのアッセイを予選に向けてより多くのデータが生成されますこれらのグローバル評価サンプル風土の異なる場所から収集されます。ここで説明アッセイはシンプルで高スループットと他の細菌の病原体の評価をより広範なアプリケーションと同様に、赤痢菌フィールドで免疫学的評価を改善するために能力を持っています。

Disclosures

R.W.K は米国の政府の従業員とようこのパブリケーションでの意見表明はこれらの者と必ずしも正式な政策や軍、国防総省や米国政府の部門の位置を反映します。

Acknowledgments

この作品は、M.H.N. にパスからの助成金によって賄われていた本研究は、共同研究とウォルター リード陸軍研究所とアラバマ大学バーミンガム間の開発契約として実施されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gelatin Sigma G9391 Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture
TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride) Sigma T8877 ≥98.0% (HPLC)
Sodium azide (NaN3) Sigma S2002 ≥99.5%
Baby Rabbit Complement PelFreez 31061-3 3-4 week old
HBSS with Ca2+/Mg2+ Invitrogen 14065-56 Without Phenol Red
LB Agar (Lennox) Sigma L2897 Powder microbial growth medium
Bacto Agar BD 214010 Powdered, (C12H18O9)n
Glycerol Sigma G5516 For molecular biology, ≥99%
LB Broth (Lennox) Sigma L3022 Powder microbial growth medium
Square Petri Dish Sigma Z617679-240EA 120 mm x 120 mm
Assay Plate Costar 3799 96 well u-bottom plate with lid
NICE Software University of Alabama at Birmingham ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/

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References

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高スループット<em>赤痢菌</em>-特定の殺菌試験
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Weerts, H. P., Yu, J., Kaminski, R. W., Nahm, M. H. A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay. J. Vis. Exp. (144), e59164, doi:10.3791/59164 (2019).More

Weerts, H. P., Yu, J., Kaminski, R. W., Nahm, M. H. A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay. J. Vis. Exp. (144), e59164, doi:10.3791/59164 (2019).

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