Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

En høy gjennomstrømming Shigella-spesifikke bakteriedrepende analysen

doi: 10.3791/59164 Published: February 27, 2019

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å måle Shigellacidal aktivitet av antistoffer i serum. Serum er blandet med bakterier og eksogene supplement, ruges, og reaksjonsblandingen er belagt på agar plater. Levedyktig bakterier danne kolonier som telles, bruker en automatisert kolonien enumerator, og brukes til å bestemme den bakteriedrepende titer.

Abstract

Serum bakteriedrepende analyser (SBAs) måler den funksjonelle aktiviteten av antistoffer og har vært brukt i mange tiår. Baseområdene måle direkte antistoff drapet aktivitet ved å vurdere muligheten av antistoffer i serum binde til bakterier og aktivere komplement. Denne komplementaktivering resulterer i lyse og drapet på målet bakterier. Disse analyser er verdifulle fordi de går utover kvantifisere antistoffproduksjon å belyse de biologiske funksjonene som disse antistoffene har, slik at forskere til å studere rollen som antistoffer kan spille i å hindre infeksjon. Baseområdene har blitt brukt til å studere immunreaksjoner for mange human patogener, men det er ikke allment akseptert metode for Shigella i dag. Historisk har SBAs vært svært arbeidskrevende, krever mange tidkrevende skritt å tallfeste nøyaktig overlevende bakterier. Denne protokollen beskriver en enkel, robust, og høy gjennomstrømming analysen tiltak funksjonelle antistoffer spesifikke for Shigella i serum i vitro. 96 analysen godt plater, mikro-kultur-systemet og automatisert koloni-telling metoden beskrevet her gir mange fordeler over tradisjonelle baseområdene, herunder bruk av frosne bakteriell aksjer. Alle disse endringene gjør denne analysen mindre arbeidskrevende og mer høy gjennomstrømming. Denne protokollen er enklere og raskere å utføre enn tradisjonelle SBAs mens de fortsatt bruker enkel teknologi og lett tilgjengelig reagenser. Protokollen er brukt med hell i flere uavhengige laboratorier og analysen er robust og reproduserbar. Analysen kan brukes til å vurdere immunreaksjoner i pre-klinisk samt kliniske studier. Kvantifisere shigellacidal antistoff titers både før og etter antigen eksponering (enten av immunisering eller infeksjon) gir en bredere forståelse av hvordan funksjonelle antistoff svar genereres og deres bidrag til beskyttende immunitet. Utviklingen av dette standardisert, godt karakterisert analysen kan forenkle Shigella vaksine design.

Introduction

Shigella serotyper, Shigella flexneri 2a, S. flexneri 3a og S. sonnei, viser epidemiologisk prevalens globalt. Diaré sykdommen skyldes disse Shigella arter virkninger militære, reisende1, og er en ledende årsak til diaré dødsfall blant barn under 5 i utviklingsland2. Det finnes ingen lisensiert vaksiner for å beskytte mot Shigella, men det er flere kandidat vaksiner på ulike stadier av utviklingen. Mange av disse vaksiner og andre forebyggende tiltak er i utvikling, fokus på antistoffer produsert mot Shigella lipopolysakkarid (LPS). LPS er en attraktiv vaksine kandidat fordi det er en stor overflate antigen og naturlig infeksjon med Shigella induserer LPS-spesifikke antistoffer som kan være beskyttende mot re-infeksjon i en serotype-spesifikk måte. Derfor vil en vellykket Shigella vaksine trolig må være multi-valent og mål 3-4 Shigella serotyper for å indusere immunitet mot 70-80% av sirkulerende globalt stammer3,4, 5 , 6. Dette krever at analyser evaluere Shigella vaksine kandidater er spesifikke for flere forskjellige serotyper.

Gjeldende immunologiske analyser for å vurdere vaksine kandidater fokus på kvantifisering nivåer av antistoff titers, men det er noen godt karakterisert analyser evaluere funksjonelle antistoffer. Undersøkelse av antistoff funksjonsevne er viktig fordi patogen spesifikke antistoffer er ansvarlig for å bekjempe infeksjon gjennom en rekke funksjonelle mekanismer inkludert bindende bakterier overflaten antigener og hindre vedheft til og infeksjon av epitelceller, rettet mot bakterielle celler eller opsonization og fagocytose, og direkte drepe patogener ved bindende og starte supplement kaskade. Direkte drepe bakterier av antistoffer oppstår når antistoffer binde til overflaten komponenter av målet bakterier og starte supplement kaskade fører til aktivering av mange zymogener at til slutt resultatet i pore formasjon i bakterielle celle som forårsaker lyse og bakteriell død. Dette direkte dreper av bakterier av sirkulerende antistoffer og utfyller kan være en avgjørende tidlig forsvarslinje under infeksjon.

Personer som er naturlig infisert har antistoffer shigellacidal aktivitet i deres sera. Disse Shigella -spesifikke antistoffer ble oppdaget ved hjelp av tradisjonelle komplement-mediert drapet søk 7,8. Dette betyr at det kan være en rolle for bakteriedrepende antistoffer i beskyttelse mot Shigella. Tradisjonelle bakteriedrepende analyser er enkel i sin utførelse: serum er inaktivert (å ødelegge endogene supplement aktivitet) og blandet med bakterier rundt. Eksogene supplement legges til denne blandingen i en bestemt konsentrasjon. Reaksjonsblandingen er ruges som tillater for bakteriell drepe og deretter belagt for å bekrefte colony-forming enheter (CFUs). Når CFUs telles, en 50% drapet indeks (KI) kan beregnes og en SBA titer bestemt. Denne fremgangsmåten er relativt enkel, disse analyser kan være arbeidskrevende og tidkrevende å utføre og resultatene kan være svært variabel. I tillegg til disse begrensninger, ingen vel preget funksjonelle analyser finnes Shigella. Derfor har vi utviklet og kvalifisert en enkel, høy gjennomstrømming analysen måle Shigella bakteriedrepende aktivitet for tre av de mest klinisk relevante stammer9. Denne protokollen beskriver en SBA med endringer som forbedrer analysen effektivitet og reproduserbarhet. Først av disse endringene er bruken av frosne bakteriell aksjer. Produksjon av voksen aksjer eliminerer behovet for kultur frisk bakterier for hver analysen samtidig redusere analysen til analysen variasjon. En annen tid og arbeid lagring nytte av denne protokollen er bruken av en 96-brønns plate analysen format. Dette gir føljetong fortynning av prøver slik at en rekke konsentrasjoner kan testes.  Det kan også bruk av flerkanals Pipetter for plating prøver på torget Petri retter. Når disse kvadrat Petri retter brukes i forbindelse med en kultur som produserer mikro-kolonier, reduseres antall agar plater som kreves for analysen. Dette, gir sammen med fritt tilgjengelig koloni-telling programvare, opprinnelig utviklet for pneumokokk multiplex opsonophagocytic drepe analysen (MOPA)10, rask, automatisk og pålitelig kolonien opplistingen. Alle disse forbedringene redusere hands-on analysen tid og å skape en høy gjennomstrømming system slik at flere plater kjøres samtidig.

Mens denne protokollen er optimalisert for tre av de mest klinisk relevante serotypene av Shigella, SBA beskrevet her kan lett brukes på mange andre bakterielle patogener. I tillegg til denne protokollen potensielle bruk med andre bakterier har denne protokollen potensial til å utvide utover bruker bare serum som starter materiale, som kan omfatte analyse av antistoffer i andre relevante eksempel typer som mucosal prøver, inkludert spytt og fecal prøver. Bruk av denne analysen undersøke immunologiske svar etter vaksinering kan gi større innsikt i immunreaksjoner generert av vaksinasjon fører til rasjonell utformingen av vaksiner, og hjelp i forståelsen av hvordan naturlig immunitet utvikler.

Protocol

Denne protokollen følger retningslinjene for WRAIR menneskelige fagets Protection Board. Prøver som brukes i denne studien er koagulasjon samlet som en del av WRAIR Protokollnummer 1328, i samsvar med alle institusjonelle og bestemmelser om beskyttelse av mennesker. Prøvene var de identifiserte, og bruk av disse anonyme prøver ble klassifisert som ikke-menneskelige motiv forskning av UAB IRB (Protokollnummer N150115001).

1. klargjør analysen reagenser

  1. Forberede 1% Gelatin ved å legge 1 g av til 100 mL vann. Autoclave og lager ved romtemperatur.
  2. Forberede 100 mg/mL TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride) lagerløsning (1 000 x) ved å legge til 5 g av TTC 40 mL vann. Når TTC er fullstendig oppløst, justerer du volumet til 50 mL med vann og sterile filter med 0,2 µm filter. Lagre løsningen på 4 ° C, og beskytte mot lyset.
    Merk: TTC fargelegger bakteriell koloniene og gjør dem enklere å telle. TTC løsningen har en svak gul farge. Hvis TTC løsning utvikler en rød farge, forkaste og forberede frisk.
  3. Forberede 10% natrium azide (NaN3) lager løsning (100 x) ved å legge til 5 g NaN3 40 mL vann. Etter fullført oppløsningen, tilsett vann til 50 mL. Lagre ved romtemperatur.
    Forsiktig: Natriumazid er en gift og kan være giftig hvis inntatt eller absorberes gjennom huden eller øyne. Den kan reagere med bly og kobber rør til svært eksplosivt metal azides. På salg av reagenser som inneholder Natriumazid, skyll med et stort volum av vann for å hindre azide oppbygging og kaste i en biohazard bag.
  4. Forberede LBA plate (LB agar plate) ved å legge til 35 g av LB agar 1 L vann og autoclave. Legg til 25 mL i hver kvadrat Petriskål (120 x 120 mm2). Inkuber plater på RT i 10-20 min til å tillate agar å stivne. Plassere plater tilbake i plastposer og butikk på 4 ° C i opptil 1 måned.
  5. Forberede overlegg Agar ved å legge til 7.5 g agar 1000 mL vann og autoclave. Inkuber i 56 ° C vannbad inntil nødvendig. Rett før bruk, Legg 1 mL av 100 mg/mL TTC og 10 mL 10% NaN3 og bland godt.
    Merk: Hver LBA plate må 25 mL av overlegg Agar. Overlegg Agar kan være forberedt seg til én måned på forhånd og smeltet i mikrobølgeovn eller på en kokeplate behov for analysen. Kontroller at agar temperatur er ~ 55 ° C før programmet LBA plater.
  6. Forberede analysebuffer ved å legge 5 mL av 10 x Hanks balansert Salt løsning (HBSS) med Ca2 +/Mg2 + og 5 mL av 1% til 40 mL vann. Lagre ved romtemperatur.

2. Forbered supplement og bakterier

  1. Forberede baby kaninen supplement (BRC)
    Merk: Detaljerte kriterier for supplement mye utvalg kan bli funnet her: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
    1. Få frosne BRC og tine med rennende kaldt vann. Fysisk blande BRC alle ~ 10-20 min før helt tint. Ikke utsett BRC til gjentatte fryse tine sykluser.
    2. Mens BRC er tining, etiketten 1,5 mL og 5mL, 15 mL sentrifuge rør. Plasser merket rør på is pre avkjøles. Aliquot riktig volum BRC til pre-avkjølt sentrifuge rør (etter fylling, umiddelbart returnere hver rør på isen). Lagre dele på ≤-70 ° C i fryseren.
      Merk: Ca 1 m supplement er nødvendig for hver analysen plate. Supplement dele er for enkel bruk og skal aliquoted i volumer tilsvarer analysen oppsett.
    3. For å forberede inaktivert BRC, tine en aliquot av aktive BRC. Forberede en 56 ° C vannbad. Etter BRC er helt tint, overføre det til vannbad og ruge i 30 min.
    4. Etter inkubasjon fjerne inaktivert BRC fra vannbad og Avkjøl på RT i 10-15 min. blandingen kraftig, og aliquot ~ 150 µL til 1,5 mL microcentrifuge rør. Lagre dele på ≤-10 ° C.
  2. Forberede mål bakterier lager
    Merk: Prosedyren nedenfor brukes til å klargjøre 48 dele mål bakterier lager; Hvis det trengs mer dele protokollen kan besteget.
    1. Fjerne bakterier master medisinglass fra fryseren og skrape den frosne bakterielle overflaten for å fjerne litt is fra ampullen til en blod agar plate. Umiddelbart tilbake master lager ampullen til fryseren.
    2. Strek denne liten aliquot av bakteriell lager på blod agar plate og dekselet med plate lokket. Inkuber platen opp ned over natten i 37 °C/5% CO2 inkubator.
    3. Overføre ~ 10 isolerte glatt koloniene til en 50 mL tube inneholder 30 mL av LB kjøttkraft. Inkuber for 3-5 h på 37 ° C med mild risting til kultur suppen har et OD600 av ~0.6-0,7.
    4. Høste toppen 12.5 mL kultur og overføring til en frisk 50 mL tube. Sentrifuge kulturen på 15.000 x g i 2 minutter ved hjelp av en bordplaten mikro-sentrifuge. Forkast nedbryting og å avbryte pellet 25 mL av 15% sterilt glyserol-LB.
    5. Bland godt og dispensere 0,5 mL dele inn bakteriefri 1.5 mL mikro sentrifuge rørene (~ 48 rør). Lagre dele på ≤-70 ° C i fryseren.
    6. At bakteriell identitet ved hjelp av agglutinerende testen før bruk.
  3. Fastsettelse av optimal fortynningsfaktoren for målet bakterier lager
    Merk: Hvert sett med mål bakterier lager må være titreres i analysen betingelser til å bestemme fortynning nødvendig å gi ~ 120 CFU/plass på LB plater.
    1. Få en være ferdig innen plate (fortynning Plate) og legge til 135 µL av analysebuffer i vel 1A. Legge til 120 µL analysen smør til brønner 1B - 1H.
    2. Fjern ampuller av frosne målet bakterier fra fryseren og tine ved romtemperatur. Legg 15ul tinte bakteriell aksjer til godt 1A for å gjøre en 10 ganger fortynning av bakteriell aksjen.
    3. Overføring 30 µL av bakteriell løsning fra godt 1A til godt 1B å utføre en 5-fold føljetong fortynning. Fortsett 5-fold føljetong fortynninger godt 1t totalt 8 fortynninger (1:10, 1:50; 1:250; 1:1 250; 1:6 250; 1:31 250; 1:156 250, 1:781 250).
    4. Få en annen være ferdig innen plate (analysen Plate) og legge til 20 µL av analysebuffer i alt godt i kolonne 1 og 2 i analysen Plate.
    5. Overfør 10 µL av utvannet bakterier fra hver brønn i kolonne 1 fortynning platen til tilsvarende brønnene i kolonne 1 og 2 av analysen Plate. 10 µL av bakterier overføres fra godt 1A av fortynning platen godt 1A og 2A i analysen Plate, etc.
    6. Fortsett med analysen som beskrevet i Serum bakteriedrepende analysen (SBA) under en og kontroll B, skritt 3.6-3.12.
    7. Når platene har blitt ruget på is, kan du bruke en flerkanals pipette med 8 pipette-spisser oppdager 10 µL fra brønnene i kolonne 1 på en LBA-plate. Også spot brønner fra kolonne 2 på LBA platen.
    8. Fortsett med analysen som beskrevet nedenfor i trinn 3.14-4.6.
    9. Bestemme bakterier fortynning som gir ~ 120 CFU/plass i kontrollen B, dette fortynning vil bli brukt i analysen.

3. serum bakteriedrepende analysen (SBA)

Merk: Fremgangsmåten nedenfor gjelder en analysen plate, men antall analysen plater kan økes.

  1. Varme-Deaktiver test prøver av rugende eksemplar i et vannbad 56 ° C i 30 min.
    Merk: Test prøver må inaktivert før testen for å oppheve endogene supplement aktivitet. Dette kan gjøres før analysen og deaktivert prøver kan bli re frosset eller lagret på 4 ° C før testet.
  2. Få en analysen Plate og legge til 20 µL av analysebuffer i kolonne 1 til 12 rader A gjennom G. legge til 20 µL av analysebuffer til kolonne 1 og 2 rad H, se tabell 1.
  3. Laste inn 30 µL av hver prøve, i duplikat, H-raden i analysen platen. For eksempel dispensere 30 µL av prøve 1 i brønner 3 H og 4 H, og dispensere 30 µL av prøve 2 i brønner 5 H og 6 H, osv.
  4. Utføre 3-fold føljetong fortynninger av test prøver ved hjelp av en flerkanals pipette.
    1. Fjerne 10 µ av utvalget fra brønner 3H - 12H og overføring til tilsvarende brønner i rad G og bland prøven godt av pipettering opp og ned 8 - 10 ganger.
    2. Deretter fjerne 10 µ fra brønner 3G - 12G og overføring til tilsvarende brønner i rad F og bland godt.
    3. Fortsette disse føljetong fortynninger gjennom A. Etter miksing brønnene i rad A, fjerne og kast 10 µl fra brønner 3A-12A slik at alle brønnene inneholder 20 µl.
      Merk: 20 µL av serum brukes i et totalt analysen volum på 80 µL, er det en 4-fold ekstra fortynning i analysen. Dette fortynning må tas i betraktning under beregning av en SBA titer ved å multiplisere fortynning av serum med 4. For eksempel hvis en starter fortynning av 1:2 brukes, er den faktiske fortynning testes 1:8.
  5. Fjerne en flaske frosne målet bakterier lager og tine ved romtemperatur. Fortynne bakterier i 20 mL analysebuffer i henhold til den forhåndsbestemte optimal fortynningsfaktoren (denne fortynningsfaktoren ble bestemt i Seksjon 2.3). Legge til 10 µL av utvannet bakterier i hver brønn av analysen platen ved hjelp av en flerkanals pipette.
  6. Fjerne en flaske av frosne BRC og en flaske av frosne inaktivert BRC, tine ved romtemperatur med rennende kaldt vann eller plasser på risten en biologisk sikkerhet kabinett med blåse luft å tine raskt.
  7. Forberede en 20% løsning av inaktivert BRC. Mix 100 µL av inaktivert BRC med 400 µL av analysebuffer. Legge til 50 µL av 20% inaktivert BRC løsningen til alle brønner i kolonne 1 (en wells).
    Merk: Inaktivert BRC brukes som en kontroll til å overvåke uspesifisert drap (NSK) i analysen.
  8. Forberede en 20% løsning av innfødte BRC. Bland 1 mL av innfødte BRC med 4 mL analysebuffer. Legge til 50 µL av denne blandingen i alle brønnene i kolonner 2 til 12 (kontroll B og teste prøven wells).
    Merk: Siste konsentrasjonen av BRC i reaksjonsblandingen er 12,5%.
  9. Kort blande analysen Plate av risting forsiktig for 10-15 s på en plate shaker eller blanding av pipettering opp og ned 8 ganger med en flerkanals pipette.
  10. La analysen platen i 37 ° C mikrobiologisk inkubator for 2t (uten riste).
  11. Tørr 2 LBA-plater ved å fjerne dekslene og plassere plater med forsiden opp i biologiske sikkerhetskabinett kabinett for 40-60 minutter.
  12. Når den 2t inkubering er fullført, flytte analysen platen til våt is og ruge for 10-20 min å stoppe reaksjonen.
  13. Bruker en 12-kanals pipette, bland brønnene i rad H og spotplate 10 µL reaksjonsblandingen på bunnen av en LBA-plate. Umiddelbart vippe platen og la stedene å kjøre for ~1.5-2 cm. Gjenta denne fremgangsmåten for rad G F og E, fange dem over forrige rad på LBA tallerkenen. Se figur 1rad E, F, G og H er oppdaget på en LBA plate, og rad A, B, C og D er oppdaget på en annen LBA-plate på samme måte.
  14. Inkuber LBA platene ved romtemperatur før løsningen er adsorbert i LBA-platene (10-15 min). Sette lokkene på LBA plater og plassere LBA platene i mikrobiologisk inkubator opp-ned å ruge over natten (~ 16-18 h). Inkuber S. flexneri 2a og 3a på 29 ° C og Inkuber S. sonnei er 26 ° C.
    Merk: Disse temperaturene gir mindre "mikro-kolonier" med egnet for nøyaktig telling av en koloni counter9størrelser.
  15. Etter natten inkubasjon Legg 25 mL av overlegg Agar (på ~ 55 ° C) som inneholder 100 µg/mL TTC og 0,1% NaN3 hver LBA-plate.
  16. Inkuber LBA platene på 37 ° C for 2t tillate overlevende bakterier utvikle rød farge, se figur 1 nedenfor.
  17. Fotografere plater bruker et digitalt kamera og overføre bilder til en datamaskin der NIST integrert koloni Enumerating programvare (NICE) er installert, se figur 2.
    Merk: HYGGELIG koloni-telling programvare er tilgjengelig uten kostnad. Se Materialer liste for detaljer og installasjonsinstruksjoner.

4. antall bakteriell koloniene

  1. Åpne hyggelig programvare og inndata Nettverksoperatøren navn, eksperimentet informasjon og eventuelle analysen notater til de tomme feltene. Når disse opplysningene legges Klikk gjort .
  2. Importere fotografert plater ved å klikke Åpne -knappen og velge de riktige filene fra datamaskinen.
  3. Justere analysen parametere ved å angi antall rader til 4 og antall kolonner til 12. Justere innstillingen bakgrunnen til-3 sigma og oppløsning til lav. Se figur 2.
  4. Flytte områder av interesse (ROIs) ved å klikke og dra slik at hver avkastning er direkte over ett utvalg sted. Kontroller at alle bakteriell koloniene er inne Avkastningen uten overlapping mellom eksempler. Når en plate er fullført, dobbeltklikk neste platen i lagrede bilder listen og justere ROIs. Se figur 2.
  5. Når alle platene er justert, klikk den grønne Count -knappen, se figur 2 og figur 3. Når teller er ferdig klikk på Eksporter -knappen for å eksportere dataene i.xls/.xlsx format. Navn og lagre filen.xls/.xlsx for dataanalyse.
  6. Ordne eksporteres data i tabellformat slik at teller er organisert i en tabell som representerer 96-brønns analysen platen, se tabell 2.

5. beregne SBA Titer (KI) og ikke-spesifikk drap (NSK)

Merk: SBA titer eller drepe indeks (KI) er definert som resiproke av serum fortynning som dreper 50% av målet bakterier.

  1. Beregne 50% drepe indeks (KI) avkuttet verdi ved snitt CFU aktive supplement kontroll brønner (kontroll B) og dividere med 2. Beregne den gjennomsnittlige CFU for hver fortynning av hvert eksempel som ble kjørt i duplikat, se tabell 3.
  2. Fordi en serum fortynning vil sjelden gir nøyaktig denne 50% KI verdien, det kan være interpolert fra to sammenhengende serum fortynninger, en som dreper mindre enn 50% og som dreper mer enn 50%, se Figur 4. Formelen for å beregne interpolert SBA KI vises nedenfor:
    Equation
    Merk: Den bakteriedrepende titer, eller KI, kan også beregnes automatisk ved hjelp av Opsotiter programvare utviklet av UAB. Å be om Opsotiter, kan du kontakte Dr. Moon Nahm eller Mr. Rob Burton. Se https://www.vaccine.uab.edu for kontaktinformasjon.
  3. Beregne NSK verdien ved å ta 1 minus gjennomsnittet av kontroll B delt gjennomsnittet av kontroll A.

Representative Results

En 96-brønns plate-oppsettet som brukes i en typisk analysen vises i tabell 1. Dette oppsettet har aktive supplement kontroll brønnene (kontroll B), inaktivert supplement kontroll brønnene (kontroll A) og fem prøver i duplikat. Eksempler er serielt utvannet 3-fold opp platen fra rad H til rad en slik at 8 fortynninger av hvert utvalg kan testes samtidig. Figur 1 viser to LBA plater etter at natten inkubasjon og overlegg. Farge utvikling har skjedd og alle overlevende kolonier vises i rødt. Bakteriell drepe er tydelig for alle prøvene testet i de tre første fortynninger (rader F-H) og som prøver er utvannet videre opp platen, en nedgang i bakteriell drepe er sett der serum er mindre konsentrert. HYGGELIG programvaregrensesnitt kan sees på figur 2. Mikro-kolonien teller fra hyggelig programvare kan ses i Figur 3og disse teller har vært organisert i tabell 2. Gjennomsnittlig CFU teller hver fortynning av hvert utvalg beregnes og en 50% KI verdien beregnes i tabell 3. 50% KI verdien kan brukes på de gjennomsnittlige CFUs for hver serum fortynning å finne verdiene for å beregne SBA KI formelen beskrevet i Figur 4. Det endelige resultatet av analysen er vist i Tabell 4.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A En Kontroll B Fortynning 8 Fortynning 8 Fortynning 8 Fortynning 8 Fortynning 8 Fortynning 8 Fortynning 8 Fortynning 8 Fortynning 8 Fortynning 8
B En Kontroll B Fortynning 7 Fortynning 7 Fortynning 7 Fortynning 7 Fortynning 7 Fortynning 7 Fortynning 7 Fortynning 7 Fortynning 7 Fortynning 7
C En Kontroll B Fortynning 6 Fortynning 6 Fortynning 6 Fortynning 6 Fortynning 6 Fortynning 6 Fortynning 6 Fortynning 6 Fortynning 6 Fortynning 6
D En Kontroll B Fortynning 5 Fortynning 5 Fortynning 5 Fortynning 5 Fortynning 5 Fortynning 5 Fortynning 5 Fortynning 5 Fortynning 5 Fortynning 5
E En Kontroll B Fortynning 4 Fortynning 4 Fortynning 4 Fortynning 4 Fortynning 4 Fortynning 4 Fortynning 4 Fortynning 4 Fortynning 4 Fortynning 4
F En Kontroll B Fortynning 3 Fortynning 3 Fortynning 3 Fortynning 3 Fortynning 3 Fortynning 3 Fortynning 3 Fortynning 3 Fortynning 3 Fortynning 3
G En Kontroll B Fortynning 2 Fortynning 2 Fortynning 2 Fortynning 2 Fortynning 2 Fortynning 2 Fortynning 2 Fortynning 2 Fortynning 2 Fortynning 2
H En Kontroll B Fortynning 1 Fortynning 1 Fortynning 1 Fortynning 1 Fortynning 1 Fortynning 1 Fortynning 1 Fortynning 1 Fortynning 1 Fortynning 1
Eksempel 1 Eksempel 2 Eksempel 3 Eksempel 4 Eksempel 5

Tabell 1: analysen plate oppsett. Kolonne 1 og 2 inneholder supplement kontroll brønnene. En ligger i kolonne 1 og den inaktivert utfylle kontroll, inneholder SBA buffer, bakterier og inaktivert supplement. Kontroll B ligger i kolonne 2 og aktivt utfylle kontroll, inneholder SBA buffer, bakterier og supplement. Kolonner 3-12 inneholder serumprøver. Hvert utvalg kjøres to og serielt utvannet 3-fold fra rad H rad A

Figure 1
Figur 1: LBA plater etter farge utvikling. Representant S. flexneri 3a bakteriell mikro-koloniene har vokst over natten til riktig størrelse. Overlegg agar er lagt og koloniene har utviklet en rød farge av reduksjon av TTC sammensatte i overlegg agar. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: NIST integrert kolonien enumeratoren (NICE) programvaregrensesnitt. Grafisk fremstilling av hyggelig programvaregrensesnitt. Områder av interesse (ROIs) er sentrert over koloniene for hver spot før telling. Data kan eksporteres direkte fra vinduet hyggelig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: LBA plater telt i hyggelig programvare. Farge fotografi bildene lastes inn hyggelig programvare og kolonien danner enheter (CFUs) telles automatisk. Dette bildet viser to representant LBA plater med deres kolonien informasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

185 167 145 151 122 134 119 142 124 115 113 123 1:17496 Fortynning 8
186 152 145 138 132 135 108 116 100 119 105 109 1:5832 Fortynning 7
179 160 145 135 109 120 54 55 71 75 79 89 1:1944 Fortynning 6
193 153 146 138 87 105 5 6 6 9 19 30 1:648 Fortynning 5
184 129 121 143 6 7 0 1 1 1 1 1 1:216 Fortynning 4
180 145 22 24 2 3 3 1 1 0 0 0 1:72 Fortynning 3
207 129 1 0 2 2 1 0 4 1 0 1 1:24 Fortynning 2
201 140 0 0 0 0 1 1 1 0 4 4 1:8 Fortynning 1
En Kontroll B Eksempel 1 Eksempel 2 Eksempel 3 Eksempel 4 Eksempel 5

Tabell 2: teller for bakteriell koloniene. CFU teller eksporteres fra hyggelig programvare å overgå formatter. Disse teller kan ordnes i en tabell som viser bakterielle teller alle dupliserte prøver og kontroll brønner.

En Kontroll B 148 128 131 120 118 1:17496 Fortynning 8
189 147 142 134 112 110 107 1:5832 Fortynning 7
NSK (1-CtrB/CtrA): 22% 140 115 55 73 84 1:1944 Fortynning 6
50% KI (CtrB/2): 73 142 96 6 8 25 1:648 Fortynning 5
132 7 1 1 1 1:216 Fortynning 4
23 3 2 1 0 1:72 Fortynning 3
1 2 1 3 1 1:24 Fortynning 2
0 0 1 1 4 1:8 Fortynning 1
Eksempel 1 Eksempel 2 Eksempel 3 Eksempel 4 Eksempel 5

Tabell 3: beregning av 50% KI avkuttet verdi og like prøven gjennomsnitt. En 50% KI avkuttet verdi beregnet ved å ta gjennomsnittet av alle kontroll B brønner og dele 2. Gjennomsnitt av duplikater ble beregnet for hver fortynning av hvert eksempel som ble kjørt i duplikat. NSK verdien beregnes også.

Figure 4
Figur 4: skjematisk av Lineær interpolering. Antall gjenværende bakterier (y-aksen) på hver fortynning av serum testet (x-aksen) er tegnet (svarte diamanter), og enkelte punktene er forbundet med den tynne, stiplet svart linjen. Solid og stiplede vannrette linjene angir 0% og 50% drepe, henholdsvis. Serum fortynninger ovenfor (fortynning 5) nedenfor (fortynning 4) 50% drepe linje er forbundet med en rød linje og bakteriedrepende titer (KI) er angitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

SBA KI
Eksempel 1 72
Eksempel 2 216
Eksempel 3 1994
Eksempel 4 1994
Eksempel 5 648

Tabell 4: SBA resultater viser bakteriedrepende titer (KI). SBA KI sluttverdiene er funnet for hvert utvalg og vises. Disse verdiene beregnes på gjennomsnittlig CFUs, en 50% KI avkuttet verdi og Lineær interpolering formelen.

Discussion

Protokollen beskrevet her viser en funksjonell immun analysen for å vurdere shigellacidal aktiviteten av antistoffer i serum. I analysen bevist for denne protokollen monoklonale antistoffer spesifikke for S. flexneri 3a ble brukt9 med menneskelige kontrollsera fra en tidligere Shigella vaksine studie11. Kilden av serum testet i denne analysen kan variere mye fra pre-klinisk dyr prøver til menneskelige kliniske prøver, og den shigellacidal aktiviteten serum prøven vil bli påvirket av immunizations og eksponeringer som enkelt har opplevd. Noen kryssreaktivitet kan forventes mellom nært beslektede serotyper, spesielt S. flexneri 2a og S. flexneri 3a men lite kryssreaktivitet har blitt sett i disse stammer i forhold til S. sonnei9. Grunnlag av SBA fokuserer på aktivering av komplement kaskade av antistoff-antigen bindende. Håndtering av BRC reagensen er derfor en av de mange kritiske trinnene involvert i gjennomføringen av denne protokollen. BRC ble valgt til bruk i denne analysen på grunn av sin konsistent ytelse og lave nivåer av NSK i andre bakteriedrepende analyser12,13,14.  Aktiviteten av BRC er ømfintlig og hensiktsmessige tiltak må tas slik som fryse tine sykluser er minimert, at BRC er aliquoted i voksen volumer, og at BRC dele er tint raskt, umiddelbart før bruk i analysen. Konsistensen av komplement aktivitet påvirker reproduserbarhet av denne analysen. Et annet viktig skritt som analysen reproduserbarhet er produksjon og fortynning av bakteriell aksjer. Det er viktig at før analysen riktig fortynning av bakteriell aksjer bestemmes, som analysen suksess er avhengig av konsekvent produksjon av Kontroller A og B har CFU teller gjennomsnitt ~ 120 CFU per sted. For å få flekker som er countable av programvaren, er det også viktig at du platen bakterier er vellykket utførelse. Avsetning av bakteriell løsning og vippe av platen slik at flekker kjøre ~ 2-3 cm er avgjørende for å produsere kolonier av rett størrelse og riktig fordeling for nøyaktig telling av NICE. Mestre alle disse trinnene sikrer at nøyaktig, konsekvent resultater er produsert av denne protokollen

Selv når alle kritiske trinnene utføres kan vel det fortsatt være tilfeller der det er nødvendig å endre eller feilsøke denne protokollen. Endringer av denne protokollen til å vurdere andre bakterier kan kreve optimalisering av natten LBA plate inkubasjon temperatur, å sikre dannelsen av mikro-kolonier. Andre stammer av bakterier eller antistoff kilder, enn serum, krever optimalisering av komplement konsentrasjon. NSK verdier og KIs av kontrollsera bør også overvåkes for å sikre at analysen fungerer riktig. NSK bør ikke stige over 70%. KI kontroll sera ikke bør variere betyr mer enn ± 2SD. For å oppnå vellykket og konsekvent resultater når du bruker denne protokollen, vil det være nødvendig å utføre alle trinnene som beskrives her med spesiell oppmerksomhet på kritiske fremgangsmåten ovenfor.

Mens denne protokollen fyller et viktig behov i Shigella forskning samfunnet, er det ikke uten begrensninger. Denne protokollen er avhengig av biologisk materiale og, derfor vil alltid være noen variasjoner som er vanskelig å kontrollere. Variasjoner i supplement aktivitet fra forskjellige partier og kilder kan bidra til variasjon i analyser. For å løse dette, er det viktig å håndtere supplement hensiktsmessig og teste nye masse supplement for aktivitet før kjøpet. Det kan også være nyttig å opprette puljer masse supplement kjent aktivitet har en homogen forsyning. Denne protokollen er enkel standard og ikke krever noen spesialisert utstyr og automatisert kolonien opplisting programvaren er fritt tilgjengelig. Mens dette enkelhet er en fordel, krever slik at denne protokollen skal brukes i nesten alle laboratorium, det fortsatt en overnatting inkubasjon. Siste analyser har blitt beskrevet som har mye kortere inkubasjon krav, men krever spesialisert, forberedende reagenser15. En annen begrensning av denne analysen er at i sin nåværende form er det bare undersøke en enkelt bakterie-art samtidig. I feltet Shigella det er et ønske om å lage en multivalent vaksine, og immunologiske analyser som kan vurdere patogener i en multiplex måte er av stor verdi. Denne analysen kan bli endret i fremtiden for å møte dette behovet, men i sin nåværende form, det er en enkelt-plex analysen.

Mens denne analysen har noen begrensninger, har den fremdeles mange fordeler over eksisterende eller alternative metoder. Fordelene inkluderer mange forbedringer som kombinerer for å gjøre gjennomføringen av denne metoden mye mindre arbeidskrevende og mer høy gjennomstrømming enn tradisjonelle SBAs. Bruk av frosne bakteriell aksjer, en 96-brønns plate analysen format, plating på større kvadrat petri retter, fargeleggingen koloniene som tillater fotografere og automatisk koloni-telling, bidra alle til å redusere materialer og tid for å fullføre dette analysen. Denne analysen har også fordeler fremfor andre metoder for høy gjennomstrømming fordi den ikke krever noen spesialisert reagenser eller utstyr. Protokollen beskrevet kan utføres med grunnleggende reagenser og fritt tilgjengelig programvare, slik at dens anvendelse i enhver laboratorium setting.

Alle fordelene denne protokollen gir støtter bruken i mange fremtidige undersøkelser. Analysen er ideell for undersøkelse av immunreaksjoner etter vaksinasjon eller infeksjon naturlig. Dette programmet tillater SBA å være et verdifullt verktøy i Shigella vaksinen forskning og har allerede blitt brukt til å evaluere vaksine immunogenisitet i Shigella bio-konjugert vaksiner der det har demonstrert evne til disse vaksiner for å indusere produksjon av funksjonelle antistoffer16. Denne protokollen er blitt omfattende testet av flere laboratorier og har vist seg å produsere pålitelige, reproduserbare resultater9. Denne protokollen gir også sammenlignbare resultater når samme prøvene er testet med andre bakteriedrepende analyser17. Konsistens i data generert av denne analysen, og kompatibilitet med andre eldre metoder gjør det et kraftig verktøy for nøyaktig å vurdere bakteriedrepende aktivitet i serumprøver. Analysen kan enkelt tilpasses til å vurdere flere eksempler typer. Mens serum er lett tilgjengelig i voksen kliniske studier, kan det være vanskelig å få tilstrekkelig serum forsøk spedbarn og små barn; en av de endelige målet befolkningene Shigella vaksiner. I disse, fullblod rutinemessig samles inn på filter papir og tørket. Det har vært noen innledende suksess med denne prøven format ved hjelp av SBA. Fullblod er mucosal prøver (som spytt, fecal ekstrakter og urin) også et mål som er relevant i Shigella vaksinen forskning. Foreløpig denne protokollen er evaluert for tre av de mest klinisk relevante serotypene av Shigella , men det kan også tilpasses for ekstra Shigella spp. samt andre bakterielle patogener. Videre arbeidet vil fokusere på produksjon av en multiplex analysen med mange av de samme egenskapene som analysen beskrevet av denne protokollen. En multiplex analysen vil tillate evaluering av flere Shigella serotyper samtidig ytterligere bevare eksempel volumer og hendene på analysen tid. Det er også arbeidet i gang for å overføre denne analysen til laboratorier over hele verden. Disse globale evalueringene vil generere mer data mot kvalifisering analysen på større forskning skala, samtidig økende antall mikrobiologi og immunologi laboratorier som har tilgang til denne SBA evaluere bakterier og serum prøver samlet endemisk steder. Analysen beskrevet her er enkel og høy gjennomstrømming og muligheten til å forbedre immunologiske vurdering i Shigella feltet, samt bredere programmer til vurdering av andre bakterielle patogener.

Disclosures

R.W.K er ansatt av den amerikanske regjeringen og slik synspunktene i denne publikasjonen er de av forfatterne, og reflekterer ikke nødvendigvis den offisielle politikken eller posisjon i departementet av hæren, Department of Defense, eller den amerikanske regjeringen.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av en bevilgning fra bane til M.H.N. Denne studien ble gjennomført som et Cooperative Research and Development avtale mellom Walter Reed hæren Institute for Research og University of Alabama i Birmingham.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gelatin Sigma G9391 Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture
TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride) Sigma T8877 ≥98.0% (HPLC)
Sodium azide (NaN3) Sigma S2002 ≥99.5%
Baby Rabbit Complement PelFreez 31061-3 3-4 week old
HBSS with Ca2+/Mg2+ Invitrogen 14065-56 Without Phenol Red
LB Agar (Lennox) Sigma L2897 Powder microbial growth medium
Bacto Agar BD 214010 Powdered, (C12H18O9)n
Glycerol Sigma G5516 For molecular biology, ≥99%
LB Broth (Lennox) Sigma L3022 Powder microbial growth medium
Square Petri Dish Sigma Z617679-240EA 120 mm x 120 mm
Assay Plate Costar 3799 96 well u-bottom plate with lid
NICE Software University of Alabama at Birmingham ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Riddle, M. S., Sanders, J. W., Putnam, S. D., Tribble, D. R. Incidence, etiology, and impact of diarrhea among long-term travelers (US military and similar populations): a systematic review. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 74, (5), 891-900 (2006).
  2. Tickell, K. D., et al. Identification and management of Shigella infection in children with diarrhoea: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5, (12), e1235-e1248 (2017).
  3. Livio, S., et al. Shigella isolates from the global enteric multicenter study inform vaccine development. Clinical Infectious Diseases. 59, (7), 933-941 (2014).
  4. Barry, E. M., et al. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 10, (4), 245-255 (2013).
  5. Noriega, F. R., et al. Strategy for cross-protection among Shigella flexneri serotypes. Infection and Immunity. 67, (2), 782-788 (1999).
  6. Levine, M. M., Kotloff, K. L., Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road. Nature Reviews Microbiology. 5, (7), 540-553 (2007).
  7. Sayem, M. A., et al. Differential host immune responses to epidemic and endemic strains of Shigella dysenteriae type I. Journal of Health Population and Nutrition. 29, (5), 429-437 (2011).
  8. Rahman, M. J., et al. Effects of zinc supplementation as adjunct therapy on the systemic immune responses in shigellosis. The American Journal of Clinical Nutrition. 81, (2), 495-502 (2005).
  9. Nahm, M. H., et al. interlaboratory evaluations, and application of a simple, high-throughput Shigella serum bactericidal assay. mSphere. 3, (3), (2018).
  10. Burton, R. L., Nahm, M. H. Development and validation of a fourfold multiplexed opsonization assay (MOPA4) for pneumococcal antibodies. Clinical and Vaccine Immunology. 13, (9), 1004-1009 (2006).
  11. Tribble, D., et al. Safety and immunogenicity of a Shigella flexneri 2a Invaplex 50 intranasal vaccine in adult volunteers. Vaccine. 28, (37), 6076-6085 (2010).
  12. Kim, H. W., Kim, K. H., Kim, J., Nahm, M. H. A high throughput serum bactericidal assay for antibodies to Haemophilus influenzae type b. BMC Infectious Diseases. 16, 473 (2016).
  13. Maslanka, S. E., et al. Standardization and a multilaboratory comparison of Neisseria meningitidis serogroup A and C serum bactericidal assays. The Multilaboratory Study Group. Clinical Diagnostic Laboratory Immunology. 4, (2), 156-167 (1997).
  14. Jang, M. S., Sahastrabuddhe, S., Yun, C. H., Han, S. H., Yang, J. S. Serum bactericidal assay for the evaluation of typhoid vaccine using a semi-automated colony-counting method. Microbial Pathogeneis. 97, 19-26 (2016).
  15. Necchi, F., Saul, A., Rondini, S. Development of a high-throughput method to evaluate serum bactericidal activity using bacterial ATP measurement as survival readout. PLoS One. 12, (2), e0172163 (2017).
  16. Riddle, M. S., et al. Safety and immunogenicity of a candidate bioconjugate vaccine against Shigella flexneri 2a administered to healthy adults: a single blind, randomized phase I study. Clinical and Vaccine Immunology. (2016).
  17. Shimanovich, A. A., et al. Functional and Antigen-Specific Serum Antibody Levels as Correlates of Protection against Shigellosis in a Controlled Human Challenge Study. Clinical and Vaccine Immunology. 24, (2), (2017).
En høy gjennomstrømming <em>Shigella</em>-spesifikke bakteriedrepende analysen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weerts, H. P., Yu, J., Kaminski, R. W., Nahm, M. H. A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay. J. Vis. Exp. (144), e59164, doi:10.3791/59164 (2019).More

Weerts, H. P., Yu, J., Kaminski, R. W., Nahm, M. H. A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay. J. Vis. Exp. (144), e59164, doi:10.3791/59164 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter