여기 우리가 제시 익스프레스, solubilize, 누 룩을 사용 하 여 SLC4 운송업 자 가족에 상 동으로 여러 진 핵 borate 전송기를 정화 하는 프로토콜. 우리는 또한 multimeric 어셈블리에 대 한 정화 homomeric 단백질을 평가 하기 위해 화학 가교 분석 결과 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 다른 도전 막 단백질에 대 한 적용할 수 있습니다.
단백질의 용액 캐리어 4 (SLC4) 가족 중 탄산염 운송업 불리고 archetypal 단백질 음이온 교환기 1 (AE1로 알려진 또한 밴드 3), 붉은 혈액 세포에 가장 풍부한 막 단백질을 포함. SLC4 가족은 식물과 곰 팡이 특징 borate 전송기와 동종 이다. 그것은 표현 하 고 정화 막 수송 단백질 구조 또는 기능에 대 한 적당 한 수량에 동질성을 중요 한 기술적인 도전 남아 있습니다. 여기 우리는 세제, 그리고 붕 산 염 운송업 자 homologs 미에서에서의 정화에 의해 Saccharomyces cerevisiae, 효 모 세포 막의 분리, 단백질의 가용 화 borate 전송기의 overexpression에 대 한 자세한 절차 설명 cerevisiae, 애기 thaliana, 그리고 Oryza sativa로 구나. 우리는 또한 cross-linking multimerization homomeric 전송기의 시험 하는 실험도 선발. 우리의 일반적인된 절차 모든 3 개의 단백질에 적용할 수 있는 고 효능에 대 한 최적화 되었습니다. 여기 개발 전략의 많은 다른 도전 막 단백질의 연구에 활용할 수 있습니다.
순화 된 막 단백질의 충분 한 수량을 얻기에 있는 어려움 수용 체, 이온 채널, 전송기의 구조 및 기능 연구의 추구에 중요 한 병목 현상에 남아 있다. 온건 하 게 높은 처리량 파이프라인 후속 생체 외에서 연구1,2,3,4 수 있도록 충분히 표현 하는 화면과 찾기 후보 막 단백질에 존재 하는 많은 프로토콜 . 일반적으로, 단백질은 N-또는 C-터미널 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그로 그리고 젤에 형광 또는 형광 탐지 크기 배제 크로마토그래피 (FSEC)5식 레벨 모니터링 됩니다. 이러한 접근 높은 표현 단백질, 중간 또는 낮은 단백질, 표현 또는 잘못 또는 전혀 표현 하는 단백질으로 막 단백질 후보자의 심사 가능 이 방법은 실험 설계는 최고를 표현 하는 어떤 단백질을 선택 하는 의도로 후보 유전자의 다 수를 조사 하는 경우에 잘 작동 합니다. 그러나, 어떤 경우에는 실험적인 접근 때 그 단백질의 식이 수준은 온건 하거나 낮은 범위에 도전적 일 수 있다 특정 막 단백질 공부에 입각 한입니다. 또한, 때로는 이러한 경우 식 수준은 늘릴 수 있습니다만 최소한 잘림, thermostabilizing 돌연변이, 또는 코 돈 최적화를 통해 구조를 변경 하 여. 그것은, 그러므로, 때로는 적당히 잘만 표현 하는 막 단백질에 대 한 막 단백질 표정과 정화 프로토콜을 최적화 하는 데 필요한.
전송기의 SLC4 가족 중 탄산염 운송업 자 음이온 교환기 1 (밴드 3 라고도 함), 적혈구6, 가장 풍부한 막 단백질 및 세포 호흡의 핵심 드라이버 포함 되어 있습니다. SLC4 가족은 식물에 중요 한 고 나트륨 결합 SLC4 전송기7,,89 뿐만 아니라 음이온 교환기 1 유사한 구조를 전시에 표시 되었습니다 borate 전송기와 동종 10. 여기 우리는 S. cerevisiae 정화 효 모와 식물에 있는 3 개의 다른 borate 전송기를 사용 하 여 최적화 된 단백질 표정과 정화 프로토콜을 보고 합니다. 우리는 우리가 수율 및 동질성에 담긴의 효율성을 최적화 했다 세부 주요 단계에 강조. 또한, 우리 글을 사용 하 여 순화 된 단백질-세제-지질 복합체의 맥락에서이 전송기의 multimeric 어셈블리를 모니터링 하는 화학 가교 분석 결과 보고 합니다. 가교 실험 정화 후 oligomeric 전송기의 multimeric 상태를 평가 하 여 체와 세제 적합성을 평가할 수 있습니다.
이 프로토콜에서는 원하는 전송 S. cerevisiae에 표현 위한 GAL1 발기인의 유도할 수 있는 통제 2 µ 파생 된 플라스 미드로 복제 되었습니다 가정 합니다. 이 절차에 대 한 DNA 전체 길이 야생-타입 borate 전송기 Saccharomyces cerevisiae Bor1 인코딩 사용 되었다 (ScBor1)11, 애기 thaliana Bor1 (AtBor1)12및 Oryza sativa Bor3 (OsBor3)13 . 각 구문에서 C terminus 10-그의-태그 추가 하 고 전송 10-그의-태그 경우 제거 수 있도록 사이 삽입 하는 트 롬 빈 분열 사이트 원하는. 프로토콜 또한 플라스 미드는 이미 DSY-5 식 변형 S. cerevisiae 의 완전 한 보충 선택적 미디어 (CSM)에 히스티딘 부족으로 변형 되어 가정 합니다.
여기 우리는 3 가지 진 핵 borate 전송기의 동질성을 정화 상세한 프로토콜을 공유 했습니다. 여기에 제시 된 프로토콜 향상 된 순도 수율 향상된에 S. cerevisiae1,14, 완전 한 막 단백질 그리고 우리의 최적화 결과의 표현에 대 한 다른 프로토콜에서 파생 됩니다. 여기에 최적화 된 매개 변수는 셀 문화 성장 볼륨 및 시간, 구슬-박동 세포 절차, 동안 세포 세포의 용 해 버퍼 구성 및 단백질 정화, 그램 막, 금속 이온 당 사용 된 세제의 친 화력 정화에 식별 볼륨 선호도 열 및 oligomeric 전송기의 multimeric 상태를 평가 하 여 체와 세제 적합성을 평가 하는 상호 분석 결과의 구현. 프로토콜은 식물과 곰 팡이 종에서 여러 SLC4 homologs에 대 한 성공적 이다. 완전 한 막 단백질의 정화에 대 한 모든 전략의 한계는 보편적인 막 단백질 정화 방법 작동 하도록 보장 하는 존재 이다. 우리의 프로토콜은 더 많은 가능성이 시퀀스 id 및 SLC4 전송기, 그리고 이렇게 SLC4, SLC23, 및 SLC26 가족의 일원을 구조에 가까운 단백질 약속 수에 대 한 성공 하려면 대상15가능 하다. 마찬가지로, 더 봤을 borate 전송기에서 먼 막 전송 될 수도 있습니다, 그리고 더 많은 가능성이 프로토콜 해야한다와 같은 다른 표현 시스템, 세제, 또는 다른 주요 매개 변수4변화 하 여.
프로토콜은 단백질 정화, 그 태그에에서 가장 일반적으로 사용 되 선호도 태그를 활용합니다. 초기 eluted 분수에 불순물의 존재에도 불구 하 고 니켈 선호도, 광범위 한 세척 및 후속 초 정화의 조합을 매우 순화 된 단백질에서 발생 합니다. 10-그의-태그 허용 더 엄격한 이미 씻어 따라서 세척에 의해 8-그의-또는 6-그의-태그 허용에서 제거 될 수 있다 보다 더 많은 배경 바인딩 단백질을 제거할 수 있습니다. 순수한 분수에 대 한 우리의 선택 피크 초 분수에 해당 하는 가장 높은 순수한 젤 분수의 보수적인 측면에 잘못. 풀링 및 더 많은 분수, 집중 약간 덜 순수 단백질의 트레이드 오프와 최종 단백질 수율을 증가 수 있습니다. 여기에 제시 된 방법을 사용 그의 태그를 잘라와 다른 것으로 교환 하는 전송 구성 된 정화 차이와 그것의 크리스탈 구조7의 결정에 지도 하는 수량에 AtBor1의 정화 크리스탈 회절7개선 한 세제
우리의 프로토콜 homologs와 solubilize 그들을 정화 하는 데 사용 하는 세제의 선택에 대 한 중요 한 고려 사항이 발생 합니다. DDM 때문에 상대적으로 온화 하 고, 종종 solubilizing, 성공 그리고 다양 한 막 단백질의 구조와 기능 연구에 사용 된 세제에 대 한 일반적인 첫 번째 선택 이다. 세제는 멤브레인에 대 한 불 쌍 한 선택 인지 결정할 때, 평가의 일반적인 방법은 이다 단백질 초 크로마에 단일 단 분산 피크 보다 무효 볼륨 또는 polydisperse 봉우리의 범위에 큰 피크를 제공 하는 여부는 단백질을 misfolded 또는 불안정을 나타냅니다. 더 미묘한 고려는 ScBor1의 우리의 정화에 의해 발생 합니다. 그것은 대량 및 유리한 모습과 구조 연구에 대 한 매력적인 대상 수 제안 하는 SEC 크로마에 단 분산에 정화. 그러나, 우리의 상호 분석 결과 정화 때 모노 머 다는 것을 보여준다. ScBor1 셀에 모노 머로 서 기본적으로 존재할 수 수 있지만 연구 나타냅니다 SLC4 전송기와 그들의 homologs 이합체7,8,,910될 것. 가교 시험의 우리의 개발 crystallizing 및 AtBor1의 구조를 해결 후 발생 했습니다. 그러나, 우리 수 있었다 상호 분석 결과, ScBor1 AtBor1에 비해 평가 귀중 한 시간과 연구 노력 후자는 궁극적으로 실패 했다에서 ScBor1 대신 AtBor1의 추구에 리디렉션 되었을 수 결정 화 및 회절 실험입니다. 따라서이 분석 결과 연구원 homologs 또는 구조 공부 때 단백질의 의심된 기본 형태를 유지 하는 조건 우선 순위를 지정 하기 위해 사용 하는 세제를 구분할 수 있습니다. 또한, 분석 결과 아미노산이 multimerization, multimerization 인터페이스와 단위체를 의무적으로 이어질 불안정 아미노를 함유한 산 성 대체를 찾기 위해 검색을 사용할 수 있습니다. 이러한 접근은 막 전송기16,,1718homomeric 어셈블리의 기능적 중요성을 사용 되었습니다.
우리의 방법의 일반적인 이점은 이다 효 모 다양 한 함수1의 많은 도전 막 단백질의 표현을 사용할 수 있도록 표시 되었습니다. 또한, 그것의 낮은 비용 및 성장 시간 조직 문화 또는 비싼 성장 매체를 필요로 하는 표현 전략을 사용 하 여 적은 수 많은 연구 노력에 대 한 접근을 촉진 합니다. 여기에 제시 된 절차는 상대적으로 저렴 하 고 접근 방법의 타당성을 강조는 1 주일에서 수행할 수 있습니다. 이러한 프로토콜의 구현 다른 도전 막 단백질의 구조 및 기능 연구를 가능 하 게 도울 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 데이비슨 대학에서 시작 기금에 의해 지원 되었다.
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES) | Acros | 172591000 | |
Äkta Pure 25 L FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
Amicon Ultra 15 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC905024 | for concentrating nickel column fractions |
Amicon Ultra 4 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC805024 | for concentrating S200 fractions |
Bacto Peptone | BD Diagnostics | 211677 | |
Bacto Yeast Extract | BD Diagnostics | 288620 | |
Glass Erlenmeyer flask, 2L | Sigma-Aldrich | CLS44442L | |
Benchtop centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
Bottle top filter | Nalgene | 595-4520 | the membrane is removed and used to filter glass beads |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
Complete supplement mixture without histidine | Sunrise Science | 1006-100 | |
D-Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
Ethanol, 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
Gel tank SDS-PAGE system | Bio-Rad | 1658004 | |
Glass bead-beating cell disruptor | BioSpec | 1107900 | |
Glass beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105 | |
Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | sent as an 8% solution under nitrogen |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
HiTrap IMAC FF column, 1 mL | GE Healthcare | 17-0921-02 | charged with nickel |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
Imidazole | Acros | 12202 | |
Instant Blue gel stain | Expedeon | ISB1L | |
JA-10 rotor | Beckman | 369687 | |
JA-14 rotor | Beckman | 339247 | |
Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Thermo Scientific | 3451 | |
Microcentrifuge, refrigerated | Fisher | 13-100-676 | |
Mini-Protean Tris-glycine gels, 4-20% | Bio-Rad | 456-1096 | |
Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | F155005 | used for loading lysate onto affinity column |
n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside (DDM) | Inalco | 1758-1350 | |
Nickel(II) Sulfate Hexahydrate | Sigma-Aldrich | 227676 | |
Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick | C24 | |
p423 GAL1 plasmid with borate transporter insert | available from authors | ||
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Acros | 215740050 | |
Polycarbonate ultracentrifuge tubes | Beckman | 355618 | |
Polypropylene bottles, 250mL | Beckman | 356011 | |
Polypropylene bottles, 500mL | Beckman | 355607 | |
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | Bio-Rad | 1610375 | |
S. cerevisiae expression strain DSY-5 | available from authors | ||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Spin column with 0.2 µm filter, 0.5mL | Millipore | UFC30GV0S | for filtering protein before injecting onto S200 column |
Sterile Falcon tubes, 15mL | Lab Depot | TLD431696 | |
Sterile Falcon tubes, 50mL | Lab Depot | TLD431698 | |
Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5175-01 | used for SEC purification |
Syringe filter, 5µm | Pall | 4650 | for filtering lysate before loading affinity column |
Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Type 70 Ti rotor | Beckman | 337922 | |
Ultracentrifuge | Beckman | L8-70M | |
YNB+Nitrogen without amino acids | Sunrise Science | 1501-500 |