Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Biaksiale mekaniske beskrivelser af atrioventrikulær hjerteklapper

Published: April 9, 2019 doi: 10.3791/59170
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2
1Biomechanics and Biomaterials Design Laboratory (BBDL), School of Aerospace and Mechanical Engineering, The University of Oklahoma, 2Institute for Biomedical Engineering, Science and Technology (IBEST), The University of Oklahoma
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol omfatter beskrivelser af atrioventrikulær ventilen foldere med kraft-kontrollerede, deplacement-kontrolleret, og stress-afslapning biaksiale mekanisk testprocedurerne. Resultater opnået med denne protokol kan bruges til konstituerende modeludvikling til at simulere de mekaniske opførsel af fungerende ventiler under en finite element simulation ramme.

Abstract

Omfattende biaksiale mekaniske test af atrioventrikulær hjertet ventilen foldere kan udnyttes til at udlede optimale parametre, der bruges i konstitutiv modeller, som giver en matematisk repræsentation af den mekaniske funktion af disse strukturer. Dette præsenteres biaksiale mekaniske prøvningsprotokol omfatter (i) væv erhvervelse, (ii) udarbejdelse af væv enheder, (iii) biaksiale mekanisk testning og (iv) efterbehandling af de indsamlede data. Først, væv erhvervelse kræver at få svin eller får hjerter fra en lokale Food and Drug Administration-godkendt slagteri for senere dissektion at hente ventilen foldere. For det andet kræver væv forberedelse brug af væv modellen kuttere på indlægsseddel væv til at udtrække en klar zone til test. Tredje, biaksiale mekanisk testning af indlægsseddel modellen kræver brug af en kommerciel biaksiale mekaniske tester, som består af kraft-kontrollerede, deplacement-kontrolleret, og stress-afslapning test protokoller for at karakterisere indlægsseddel væv mekaniske egenskaber. Endelig, efterbehandling kræver brug af data billede korrelation teknik og kraft og forskydning aflæsninger at opsummere det væv mekaniske opførsel som svar på eksterne lastning. Generelt, viser resultater fra biaksiale test, at indlægssedlen væv giver en ikke-lineær, Anisotropisk mekanisk svar. Præsenteres biaksiale testproceduren er fordelagtig for andre metoder, da metoden præsenteres her giver mulighed for en mere omfattende karakterisering af ventilen indlægsseddel væv under ét samlet afprøvning ordning, i stedet for separate test protokoller på forskellige væv prøver. Den foreslåede testmetode har sine begrænsninger, idet shear stress er potentielt til stede i vævsprøve. Enhver potentiel shear formodes dog ubetydelig.

Introduction

Korrekt hjertefunktionen afhængig af passende mekaniske opførsel af hjertet ventilen foldere. I situationer hvor hjertet ventilen indlægsseddel mekanik er kompromitteret, opstår hjertet ventilen sygdom, som kan føre til andre hjerte-relaterede spørgsmål. Forståelse hjertet ventilen sygdom kræver en grundig forståelse af foldere ordentlig mekaniske opførsel til brug ved datamatisk modeller og terapeutisk udvikling, og som sådan en afprøvning ordning skal udvikles til at præcist hente det sunde foldere mekaniske egenskaber. I den tidligere litteratur, er denne mekaniske karakterisering gennemført ved hjælp af biaksiale mekaniske testprocedurer.

Biaksiale mekaniske prøvningsprocedurer for bløddele varierer hele litteraturen, med forskellige test rammer udnyttes til at hente forskellige egenskaber1,2,3,4, 5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. test metoder er blevet udvidet til afproevning af de mekaniske egenskaber af hjertet ventilen foldere. Generelt baseret biaksiale mekaniske test indebærer lastning hjertet ventilen væv med samtidige kræfter i de to vigtigste retninger, men hvordan denne test udføres varierer på biomekaniske egenskaber skal overholdes. Nogle af disse test protokoller omfatter (i) stamme-sats, (ii) krybe, (iii) stress-afslapning og (iv) kraft-kontrolleret afprøvning.

Først, stamme-hastighed test er blevet udnyttet til at bestemme den tidsafhængig opførsel af væv pjecer18,20. I denne test protokol, foldere er lastet til maksimal membran spændinger på forskellige halv-cyklus gange (dvs. 1, 0,5, 0,1 og 0,05 s) til at afgøre, om der er en betydelig forskel i peak strækning eller hysterese mellem loading tider. Disse test har dog vist en ubetydelig forskel i den observerede stretch med varierende belastning-priser. Andet i krybe test, er væv lastet til peak membran spændinger og afholdt på peak membran spændinger. Denne test giver en demonstration af hvordan det væv forskydning kryber for at opretholde peak membran spændinger. Men det har vist sig at krympning er ubetydelig for hjertet ventilen foldere under fysiologisk funktion3,20. Tredje i stress-afslapning test, vævet er lastet til peak membran spændinger og den tilknyttede forskydning holdes konstant i en længere periode af tid3,21,22. I denne type test, har væv stress en bemærkelsesværdig reduktion fra peak membran spændinger. Endelig i kraft-kontrollerede test, er væv cyklisk indlæst på forskellige nøgletal peak membran spændinger i hver retning17,23. Disse tests viser materialet anisotropy og ulineære stress-strain svar, og ved at indlæse vævet under forskellige nøgletal, potentielle fysiologisk deformationer kan blive bedre forstået. Disse nylige undersøgelser gjort det klart, at stress-afslapning og kraft-kontrollerede protokoller bevise mest gavnlige til at udføre en mekanisk karakterisering af hjertet ventilen foldere. Trods disse fremskridt i hjertet ventilen biomekaniske karakterisering, afprøvning er ikke udført under én samlet afprøvning ordning, og der er begrænset metoder til at undersøge kobling mellem retninger.

Formålet med denne metode er at fremme en fuld materielle karakterisering af hjertet ventilen foldere ved en samlet biaksiale mekanisk afprøvning ordning. En samlet afprøvning ordning betragtes som en hvor hver brochure er testet under alle test protokoller i én session. Dette er fordelagtigt, da væv egenskaber er i sagens natur variabel mellem foldere, så en fuld karakteristik for hver folder viser sig mere præcis som en deskriptor end udfører hver protokol uafhængigt på forskellige foldere. Ordningen test består af tre hovedelementer, nemlig en kraft-kontrollerede biaksiale prøvningsprotokol, (ii) en forskydning-kontrollerede biaksiale prøvningsprotokol og (iii) en biaksiale stress-afslapning prøvningsprotokol. Alle test ordninger udnytte en belastningsgraden af 4.42 N/min, og 10 lastning losning cykler at sikre stress-strain kurve replicability af de 10 cyklus (som findes i tidligere arbejde)23. Alle protokollerne er også bygget baseret på den antagelse, membran spændinger, som kræver, at tykkelsen er mindre end 10% af den effektive modellen længder.

Den kraft-kontrollerede protokol, der bruges i denne præsenteret metode består af 10 lastning og losning cyklusser med peak membran spændinger på 100 N/m og 75 N/m for mitralklap (MV) og trikuspidalklappen (TV), henholdsvis15,17. Fem lastning nøgletal betragtes i denne kraft-kontrollerede test protokol, nemlig 1:1, 0.75:1, 1:0.75, 0.5:1 og 1:0. 5. Disse fem lastning nøgletal vise sig nyttige til at beskrive understreger og stammer korrespondent til alle potentielle fysiologisk deformationer indlægsseddel in vivo.

Forskydning-kontrollerede protokollen præsenteret i denne metode består af to deformation scenarier, nemlig (i) begrænset enakset stretching og (ii) ren shear. I den begrænsede enakset stretching, er én retning af væv fordrevet til peak membran spænding mens om fastsættelse af anden retningen. I opsætningen ren shear er vævet strakt i én retning og velovervejet afkortes i anden retningen, så området af væv forbliver konstant under deformation. Hver af disse deplacement-kontrollerede testprocedurer er udført for hvert af to væv retninger (omkredsen og radial retning).

Stress afslapning-protokol, der bruges i metoden præsenteres opnås ved indlæsning af væv til peak membran spændinger i begge retninger og holde væv på de korrespondent forskydninger i 15 min. til at overvåge det væv stress afslapning adfærd. De detaljerede eksperimentelle procedurer er drøftet næste.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder beskrevet blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of Oklahoma. Alle animalske væv er anskaffet fra en afdeling af landbrug USDA godkendt slagteri (land kød Co., Edmond, OK).

1. Vævscentre erhvervelse og rengøring

  1. Hente den animalske hjerter på samme dag, som dyret er slagtet og gemme hjertet i en is brystet at sikre væv friskhed. Transportere hjerter til laboratorium plads.
  2. Ved ankomsten til laboratoriet, nedsænkes hjertet i en spand med fosfatbufferet saltvand (PBS) løsning til at skylle alle overskydende blod. Hent pincet, en dækkeserviet, en kirurgiske kniv, en spand af PBS løsning, blegemiddel og en plasticpose. Forberede dækkeserviet ved at lægge det på tælleren dissektion, giver mulighed for en lettere oprydning af blod-relaterede rod. Efter hjertet har været tilstrækkeligt skylles, sted midt på dækkeserviet (figur 1a).
  3. Brug en pincet, finde afsked linje mellem forkamre og ventriklen på hver side af hjertet. Bruge et barberblad, omhyggeligt gøre et snit langs denne afsked linje og afsløre hjerteklapperne og ventrikler (figur 1b). Gør indsnit langs hele ydre omkreds i hjertet, sådan at hjertets forkamre og alle hjertet materialet overlegen i forhold til hjertekamrene kan fjernes.
  4. Med pincet, træk forsigtigt ud alle observerede blodpropper i hjertekamrene (figur 1 c). Hvis der gøres et forsøg på at fjerne en blodprop, men det ikke flytte, sikre chordae tendineae eller brochurer har ikke været greb. Placer blodpropper i biohazard taske til bortskaffelse af affald.
  5. Når alle blodpropper er blevet fjernet fra hjertekamrene, skyl hjertet en sidste gang i en spand med PBS løsning. Placere den rene hjerte i posen og opbevares i en fryser.
  6. Ved hjælp af en opløsning af 10% blegemiddel og 90% anført vand, blandes blod med blegemiddelopløsning og rør konstant i ca 10 min. kigge efter en vellykket blegemiddel behandling, af den løsning, der skifter fra rødt til gul. Bortskaffe blegemiddel-behandlede blodet gennem dræning.
    Forsigtig: Blegemiddel er et giftigt stof og kan blive skadelig hvis indtaget.
    Bemærk: Protokollen kan pause her.

2. hjerte dissektion og undersøgelse af anatomi

  1. Hente de allerede rengjorte hjerte og gør det muligt at optø i et varmt vandbad. De nødvendige materialer til dissektion omfatter pincet, kirurgiske knive, dækkeservietter, PBS og små opbevaringsbeholdere. Efter hjertet er helt optøet, sætte det på en dækkeserviet til at absorbere enhver resterende blod.
  2. Hold hjertet for en top-down (superior) opfattelse at optimalt observere ventil strukturer. Begynder med MV på venstre side af hjertet, bruge pincet til at omhyggeligt manipulere foldere og identificere en commissure, eller afsked linje, mellem folderne.
  3. Gøre et snit langs commissure og skær forsigtigt gennem den ventrikulære væg, og sørg for ikke at beskadige foldere. Det kan være nødvendigt at klippe de chordal vedhæftede filer under denne proces fuldt åbne ventriklen. Når den fulde indsnit er lavet, skal du åbne ventrikel (figur 2a).
  4. Identificere MV anteriore og posteriore foldere og bruge en kirurgiske kniv til at afskære de chordal vedhæftede filer til de papillærmusklerne. Brug af pincet, strække foldere henslængt og foretage nedskæringer at adskille foldere fra annulus. Placer skåret foldere i en passende etiket container fyldt med PBS løsning og opbevar det i køleskab i ca. 4 ° C.
  5. Hold hjertet for en top-down Se og identificere TV på højre side af hjertet. Find Commissurer og gøre et snit gennem en af Commissurer og ventrikel væg (figur 2b).
  6. Identificere TV septal, posterior og anterior foldere, og udføre indlægsseddel udvinding som gjort i trin 2.4. Placere alle opnåede foldere i en mærket beholder fyldt med PBS løsning og opbevar beholderen i et køleskab på omkring 4 ° C.
    Bemærk: Protokollen kan pause her. Dog bør væv biomekaniske testning og efterfølgende histologi analyser ske senest 2 dage efter hjertet dissektion.

3. væv dissektion

  1. Hent en folder fra køleskabet, væv cutter for den angivne skæring størrelse, en kirurgisk pen, pincet, barberblade og et skære måtten.
  2. Brug af pincet, Tag prøven fra PBS løsning og læg den fladt på skære måtten med radial retning (R) justeret til Y-retning, og omkredsen retning (C) justeret i X-retning (figur 3a). Identificere den indlægsseddel centrale region som afsnittet test.
  3. Justere væv cutter, så den ønskede væv teste region er inden for grænserne af barberblade. Gøre en skåret horisontalt og vertikalt at danne et firkantet område af de ønskede dimensioner (figur 3b). Ved hjælp af den kirurgiske pen, mærke det væv radial retning (figur 3b).
  4. Bruger barberblad, trim chordal vedhæftede filer ved at strække chordae fra folderen med pincet og foretager en omhyggelig cut uden at forårsage nogen skade på indlægssedlen.
    Bemærk: Protokollen kan pause her. Hvis protokollen er sat på pause, gemme sektioneret vævet i en mærket beholder fyldt med PBS løsning, og opbevar beholderen køleskab på ca. 4 ° C (som forklaret i trin 2.6). Dog skal væv test ske senest 2 dage efter dissektion.

4. tykkelse måling og biaksiale tester setup

  1. Hente sektioneret væv modellen, digital skydelærer og en lille metal spatel. Ved hjælp af de digitale calipre, måle og registrere tykkelsen af metal spatel.
  2. Brug af pincet, læg væv modellen fladt på metal spatel. Ved hjælp af de digitale calipre, måle tykkelsen af spatel-væv par (figur 3 c) på tre forskellige indlægsseddel steder. Fratræk den spatel tykkelse fra hver måling og optage den gennemsnitlige tykkelse.
  3. Forberede et PBS bad ved 37 ° C, hvilket svarer til det væv fysiologiske tilstande.

5. Vævscentre montering og fiducial markør placering

  1. Hente pincet, væv modellen, monteringsbeslag, en fin spids værktøj, glasperler (med diametre på 300-500 µm) og superlim.
  2. Montere væv til biaksiale test systemet (figur 3de). Mens montering, sikre at den væv omkredsen og radial retning er afstemt med den maskine X - og Y-retninger.
  3. For fiducial markør placeringen, skal du placere glasperler i én lille Smørrebrød beholder og en lille pulje af super lim i en anden beholder. Brug værktøjet fine spids pels spidsen med en lille mængde af super lim og holde en individuel perle til spidsen af værktøjet.
  4. Omhyggeligt bruge værktøjet til at overføre perlen til et hjørne af den midterste tredjedel af de væv test region (figur 3f). Gentag dette trin, indtil en kvadratisk matrix af fire perler er dannet (figur 3 g).
    Bemærk: Det er afgørende, at overskydende lim undgås, og at de fiducial markører ikke holde sammen som senere digital billed korrelation (DIC) teknikker vil producere ubrugelig tracking resultater. Det er vigtigt, at den firkantede array skal være inden for dets midterste tredjedel i vævet test region.

6. forkonditionering trin og varighed timing

  1. For at beregne den passende membran spænding, få vævs effektive test kant længde og bruge følgende ligning.
    Equation 1(1)
    Bemærk: Her, T er membran spændingen i en enhed i kraft/længde, f er kraften, og L er modellens effektive test længde.
  2. Oprette en forkonditionering protokol, så vævet vil gennemgå 10 lastning/losning cyklusser på de styrker, der er forbundet med peak membran spænding i en belastningsgraden af 4.42 N/min, herunder en preload på 2,5% af den maksimale kraft (figur 4).
    1. Opret en ny vilkårlig test mappe for at midlertidigt gemmer forkonditionering data, fordi det ikke er nødvendigt for fremtidige beregninger. Etablere en belastningsgraden 4.42 N/min. til efterfølgende test.
    2. Oprette et nyt sæt test parametre og angive navnet på protokollen som Preconditioning0 (figur 4a). For X- og Y-axes, indstille kontroltilstand skal tvinge og kontrolfunktion skridt. Sæt den indlæse størrelsesorden som den kraft, der er forbundet med målrettet peak membran spænding (jf. trin 6.1) (figur 4b). Indstille preload størrelsesorden som 2,5% af den maksimale kraft til den første gentagelse kun (fig. 4 c). Sæt strække varighed og recovery varighed begge at være 25 s. sæt af antallet af gentagelser skal være 10 (figur 4e).
  3. Når det forkonditionering skridt er færdig, skal du notere det væv deformation i X - og Y-retninger. Udarbejde en protokol til at flytte modellen til den maksimale kraft, begyndende fra de registrerede størrelse.
    1. Hente et stopur til timing formål. Begynder den maksimale kraft ladning protokol og starte stopuret samtidig, når maskinen begynder aktivering (figur 5a). Stop stopuret, når aktivering stopper. Stop bliver indlysende gennem auditiv stikord.
    2. Optage den efter forkonditionering peak væv deformation sammen med tiden fra stopuret repræsenterer det væv optimal stretch tid (figur 5b).

7. biaksiale mekanisk testning

  1. Forberede en kraft-kontrollerede protokol på en belastningsgraden af 4.42 N/min.
    1. Åbne en ny test mappe og navngive testen. Indstil dataene til at gemme på en kendt placering til brug i senere beregninger, stress og belastning. Flytte modellen tilbage til den originale montering konfiguration.
    2. Oprette en protokol sæt med titlen FirstImage. Indstille x-aksen og y-aksen kontroltilstand at tvinge og kontrolfunktion til trin. Angiv den indlæse størrelsesorden til 0 mN. Indstille den strække varighed og recovery varighed hver til 1 sekund. Angive antallet af gentagelser til 1. Sæt den data udgang frekvens og billede output frekvens hver til 1 Hz.
    3. Konstruere en ny test sæt, opkaldt PreconditioningA. Etablere afprøvning parametre, således at væv vil gennemgå 10 gentagelser af cykliske lastning/losning til den målrettede kraft for den ønskede membran spænding præcis som var forberedt i trin 6.2. Bemærk, at nu, stretch tid og genoprette tid bør det tidspunkt registreret i trin 6.3.2. Ingen billeder, der er fanget i A test sæt, men data er fanget på 15 Hz.
    4. Konstruere en anden test sæt, navngivne PreconditioningB. Alle test parametre skal være identiske med dem som nævnt i det forrige trin, med undtagelse billedet output frekvens er indstillet til 15 Hz, og ingen preload er anvendt.
    5. Efter forkonditionering protokollen, oprette test protokoller så at vævet er lastet til peak membran spændinger i følgende omkredsen til radial lastning nøgletal på en belastningsgraden af 4.42 N/min: 1:1, 0.75:1, 1:0.75, 0.5:1 og 1:0.5 (figur 6 ). Hente data fra de to sidste cyklusser af hver lastning forholdet til efterfølgende databehandling og analyser er beskrevet i afsnit 10. Se tabel 1 for en detaljeret beskrivelse af protokollerne, der skal fastsættes.
  2. Forberede en forskydning-kontrollerede prøvningsprotokol på en belastningsgraden 4.42 N/min. som følger. (i) Biaxial strækker sig i X-retning og Y-retning til forskydninger forbundet med peak omkredsen og radial strækninger, henholdsvis (figur 7a). (ii) Pure shear langs X-retning — strækker sig i X-retning forbundet med peak omkredsen stræk og afkortning i Y-retning, samtidig med at den stiplede område konstant under deformation (figur 7b). (iii) begrænset enakset strækker sig langs X-retning (figur 7 c). (iv) Pure shear langs Y-retning (figur 7 d). (v) begrænset enakset strækker sig langs Y-retning (figur 7e).
    1. Mellem hvert af disse trin, konstruere en resten "livscyklus" 1 min, der holder væv ved den oprindelige monterede konfiguration. Hente data fra de to sidste cyklusser af hver lastning forholdet for databehandling og analyser (afsnit 9). Henvises til tabel 2 for en detaljeret beskrivelse af protokollerne, der skal fastsættes.
  3. Forberede en stress-afslapning protokol, så væv, der er indlæst i hver retning på en belastningsgraden af 4.42 N/min, at fordrivelser forbundet med peak membran spændinger (trin 7.2) og holdt på forskydningen i 15 min. (figur 8 og Figur 9). Efter 15 min, skal protokollen indstilles til gendanne væv til dens oprindelige montering konfiguration.
    Bemærk: Hvis væv rives, afbryde test omgående for at forebygge potentielle skader forårsaget af biaksiale test systemet.

8. væv fiksering til histologi analyse

  1. Afmontere vævet fra den biaksiale testsystem. Placer vævet ind i en container fyldt med 10% formalin, og derefter placere beholderen i en nedkølet miljø på ca 4 ° C. Fix væv for 24-48 timer, afhængigt af de væv tykkelse.
    Forsigtig: Formalin er et kendt carcinogen, og hvis indåndet, et overskud kan forårsage lungerne til at blive faste. Alt arbejde med formalin bør udføres i et stinkskab med tilstrækkelig ventilation.
  2. Når vævet er fastsat i formalin i 24-48 timer, overføre væv til en 80% ethanol løsning for senere histologi. Vævet opbevares i opløsning i et nedkølet miljø ved 4 ° C.
    Bemærk: Protokollen kan pause her. Når væv er fastsat, kan at enhederne analyseres på ethvert tidspunkt. Hvis protokollen er sat på pause, gemme vævet i en mærket beholder fyldt med 80% ethanol, og opbevar beholderen køleskab på ca. 4 ° C (som forklaret i trin 8.2).
  3. Forberede væv til kommercielle histologi analyse efter leverandørens anvisninger. Hvis visse indlægsseddel bestanddel, såsom kollagen, elastin, glycosaminoglycans, osv., er af undersøgelsens interesse, sikre, at passende histologi pletten er ansat.
    Bemærk: Histologi dias kan visualiseres ved hjælp af et mikroskop til at observere ønskede bestanddele (figur 10).
  4. Ved hjælp af billedbehandling program ImageJ, udføre farve deconvolution metoder til at bestemme procentdelen af hver farvede bestanddel i vævet. For flere detaljer om disse procedurer, henvises til Ruifrok og Johnston24.

9. biaksiale testdata post-processing procedurer

  1. Udføre sporing af DIC-baseret på de fire fiducial markører fra billeder taget under de biaksiale mekaniske test (Figur 11) til at bestemme tidsafhængig markør positioner.
    Equation 2(2)
    1. Hvis det ønskes at udføre analyser med hensyn til montering konfiguration, lad Xjeg er markør positioner i udeformerede tilstand i begyndelsen biaksiale testen. Hvis det ønskes at udføre analyser med hensyn til den post forkonditionering deformation, lad Xjeg er markør positioner i slutningen af forkonditionering protokollen.
      Bemærk: De efterfølgende foranstaltninger vil blive gennemført på samme måde, uanset den valgte variant.
      Bemærk: Her, X,jeg og x,jeg er udeformerede og deforme positioner af markører, henholdsvis, og d,jeg er forskydning vektoren for hver markør.
  2. Beregne deformation gradient (F) af de fiducial markører ved hjælp af en fire-node bilinear finite element2,23,25.
    Equation 3(3)
    Bemærk: Her, BxIog ByIer finite element figur funktion derivater i X - og Y-vejledningen til node jeg, henholdsvis, og u,jeg(t) og vjeg( t) er den tidsafhængig X - og Y-forskydninger, henholdsvis som tidligere bestemt i trin 9.1. Bemærk at X - og Y-koordinaterne er justeret til det væv omkredsen og radial retning.
  3. Beregne ret Cauchy-grøn deformation tensor (C) og grønne stamme tensor (E).
    Equation 4(4)
    Bemærk: Her, jeg er anden-ordens identitet tensor. Bestemme omkredsen og radial strækker sig ved at tage kvadratrødder med princippet værdier af C.
  4. Bestemme den første Piola-Kirchhoff (1.-PK) stress tensor (P).
    Equation 5(5)
    Bemærk: Her, t er modellens tykkelse, og T-C og TR er anvendt membran spændinger i omkredsen og radial retning, henholdsvis.
  5. Også, beregne andre stress tensoren, såsom Cauchy stress tensor (σ) og den anden Piola-Kirchoff (2.-PK) stress tensor (S).
    Equation 6(6)
    Bemærk: Her, J er Jacobimatricen af deformation gradient tensor F.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Stress-stretch data fra kraft-kontrollerede biaksiale mekaniske test afslører en ikke-lineær kurve med nogle lighed med en eksponentiel kurve (figur 12). Om svar i hver vigtigste retning er den materielle adfærd paa tvaers isotropic, med radial stretch større end omkredsen deformation. I nogle tilfælde kan den anisotropy retninger flip, med omkredsen retning udviser større overholdelse end den radialt. Denne vendt svar er observeret i TV oftere end i MV.

Forskydning-kontrollerede test følger stress-stretch data en ikke-lineær respons for den vigtigste retning under spænding (ren-shear, begrænsede enakset spænding [Figur 13]). Når vævet forkorter i den andre vigtigste retning, observeret en "negativ (trykstyrke) stress". I den begrænsede enakset spænding protokol, udstiller der også en stigende stress-stretch svar i den begrænsede retning, demonstrerer kobling af anvendt strækker sig i den andre vigtigste retning.

Fra stress-afslapning test, normaliseret membran spændinger-tid data følger en ikke-lineær rådnende kurve (Figur 14a, b). Både MV og TV indlægsseddel væv udviser en større stress reduktion i radial retning i forhold til det i omkredsen retning.

Repræsentative histologiske resultater af mitralklap forreste indlægsseddel (MVAL) og trikuspidalklappen forreste indlægsseddel (TVAL) væv ved hjælp af Masson's trichrome er præsenteret i figur 10. Den Masson trichrome plet viser typiske bestanddele fundet i atrioventrikulær hjerteklapper, såsom kollagen fibre (blå) og utætte hjerteklapper interstitielle celler (rød cytoplasma og sorte kerner). Andre pletter kan bruges til at visualisere bestanddele som elastin (Verhoeff-van Gieson plet) og glycosaminoglycans (Alcian blå plet).

Figure 1
Figur 1: eksperimenterende billeder af svin hjerter hentet fra et lokale slagteri. (en) A hele midt skylles af blod med PBS løsning. (b) en nedskæring er foretaget mellem forkamre og hjertekamre at afsløre begge mitral- og trikuspidalklapperne ventilerne. (c) blodpropper fjernes derefter fra hjertet før opbevaring. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: eksperimenterende billeder af åbnede svin hjertet afslører fem atrioventrikulær hjerte ventilen foldere og andre komponenter af ventil apparater. (en) mitralklap med dissektion af venstre midt langs commissure mellem to foldere, viser de forreste indlægsseddel (MVAL) og posterior folder (MVPL) og (b) trikuspidalklappen med en lignende dissektion på højre side af hjertet, afslører den forreste indlægsseddel (TVAL), posterior folder (TVPL) og septal folder (TVSL). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: eksperimenterende billeder skåret indlægsseddel forberedes til biaksiale mekaniske test. Hjertet ventilen indlægsseddel test kræver (en) bulk indlægsseddel sektioneret i (b) en 10 mm x 10 mm test region (radial retning bemærkes af kirurgisk pen markører). (c) indlægsseddel tykkelse måles. Enhederne er monteret til (d) den biaksiale test system af (e) piercing væv med metal tænder. Efter montering, er (f) fiducial markører limet på overfladen af væv før (g) neddykning i PBS løsning ved 37 ° C. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: eksempel protokol parametre til forkonditionering afprøvning af en mitralklap forreste indlægsseddel af en 7,5 mm x 7.5 mm test region. Forkonditionering protokollen er lavet af indstilling (en) protokollen navn, (b) af test kontroltilstand og kraft i x-aksen, (c) af preload betingelser, (d) y-aksen parametre skal være den samme som x-aksen, og (e. ) cyklus parametre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: eksempel protokol parametre til timingen skridt for en mitralklap forreste indlægsseddel af en 7,5 mm x 7.5 mm test region. Timingen skridt kræver (en) flytter vævet fra den post forkonditionering deformation til peak membran spænding (og tilsvarende peak deformation) mens du samtidig starter et stopur for at registrere den stretch tid. Når mål force er nået, registreres (b) den efter forkonditionering deformation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: skematisk af kraft-kontrollerede biaksiale test procedure for at afprøve mitral og tricuspid ventilen foldere. Den prøvningsprotokol består af en equibiaxial loading forkonditionering skridt for at udøve væv in vivo tilstand, efterfulgt af forskellige lastning nøgletal peak membran spændinger i hver væv retning (Tx:Ty): 1:1, 0.75:1, 1:0.75, 0.5:1 og 1:0. 5. Hver underafdeling af den kraft-kontrollerede prøvningsprotokol udføres for 10 lastning/losning cyklusser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: skematisk deplacement-kontrollerede biaksiale test procedure for at afprøve mitral og tricuspid ventilen foldere. Den prøvningsprotokol består af (en) biaksiale forskydninger forbundet med peak membran spændinger, (b) ren shear i X-retning, (c) begrænset enakset forskydning i X-retning (d) rene shear i den Y-retning, og (e) begrænset enakset forskydning i Y-retningen. Hver underafdeling af den forskydning-kontrollerede prøvningsprotokol udføres for 10 lastning/losning cyklusser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: eksempel stress-afslapning afprøvning parametre for en mitralklap forreste indlægsseddel med en effektiv test region 7.5 mm x 7.5 mm. Test sæt parametre for stress-afslapning testning for en mitralklap forreste indlægsseddel hvor målrettet fordrivelse er peak væv deformation specifikt for dette væv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: skematisk af 15 min stress-afslapning test procedure for at afprøve mitral og tricuspid ventilen foldere. Den prøvningsprotokol indebærer, holding biaksiale forskydninger tilknyttet peak membran spændinger i 15 min., hvorefter væv returneres til montering konfiguration. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10: eksempel histologiske fra den atrioventrikulær hjerteklapper forreste foldere. Repræsentative histologi billeder af (en) den forreste mitralklap folder og (b) trikuspidalklappen bageste indlægsseddel. Både farves med en Masson trichrome pletten: kollagen i blå, cytoplasma og keratin i rød og kerner i sort. Skalalinjen = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 11
Figur 11: repræsentative billeder illustrerer sporing af koordinaterne for fire fiducial markører under biaksiale mekaniske test ved hjælp af en data billede korrelation (DIC) teknik. (en) vævet montering konfiguration. (b) konfiguration efter forkonditionering trin. (c) den deforme konfiguration tilknyttet væv modellen under mekanisk belastning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 12
Figur 12: repræsentative data fra kraft-kontrollerede protokoller for mitralklap forreste indlægsseddel (MVAL). Repræsentative data viser materiale anisotropy og ulineære stamme svar af væv under biaksiale læsning ved varierende lastning nøgletal peak membran spændinger i hver væv retning (Tx:Ty): (et) 1:1, (b) 0.75:1, (c) 1:0.75, (d) 0.5:1 og (e) 1:0. 5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 13
Figur 13: repræsentative data fra de forskydning-kontrollerede protokoller for mitralklap forreste indlægsseddel (MVAL). Repræsentative data viser materiale anisotropy og ulineære stamme svar af væv under (en) biaksiale forskydninger forbundet med peak membran spændinger, (b) ren shear i X-retningen, (c) begrænset enakset forskydning i X-retning (d) rene shear i Y-retning, og (e) begrænset enakset forskydning i Y-retningen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 14
Figur 14: repræsentative data fra stress-afslapning protokoller for mitral- og trikuspidalklapperne ventil forreste foldere. Repræsentative data for (en) MVAL og (b) TVAL, illustrerer den eksponentielle stress reduktion over tid. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Sætnavnet X-aksen Y-aksen Stretch (s) Hold (s) Genskab (s) Resten (s) XPreload (mN) YPreload (mN) Reps Data (Hz) Billede (Hz)
FirstImage Trin 0,0 (mN) Trin 0,0 (mN) 1 0 1 0 0,0 (første) 0,0 (første) 1 1 1
PreconditioningA Trin F (mN) Trin F (mN) t 0 t 0 0.025*F (første) 0.025*F (første) 8 15 0
PreconditioningB Trin F (mN) Trin F (mN) t 0 t 0 Ingen Ingen 2 15 15
1:1A Trin F (mN) Trin F (mN) t 0 t 0 Ingen Ingen 10 15 0
1:1B Trin F (mN) Trin F (mN) t 0 t 0 Ingen Ingen 2 15 15
0.75:1A Skridt (0.75*F) (mN) Trin F (mN) t 0 t 0 Ingen Ingen 10 15 0
0.75:1B Skridt (0.75*F) (mN) Trin F (mN) t 0 t 0 Ingen Ingen 2 15 15
1:0.75A Trin F (mN) Skridt (0.75*F) (mN) t 0 t 0 Ingen Ingen 10 15 0
1:0.75B Trin F (mN) Skridt (0.75*F) (mN) t 0 t 0 Ingen Ingen 2 15 15
0.5:1A Skridt (0.5*F) (mN) Trin F (mN) t 0 t 0 Ingen Ingen 10 15 0
0.5:1B Skridt (0.5*F) (mN) Trin F (mN) t 0 t 0 Ingen Ingen 2 15 15
1:0.5A Trin F (mN) Skridt (0.5*F) (mN) t 0 t 0 Ingen Ingen 10 15 0
1:0.5B Trin F (mN) Skridt (0.5*F) (mN) t 0 t 0 Ingen Ingen 2 15 15

Tabel 1: fuld test parametre for alle protokoller i kraft-kontrolleret afprøvning ordning. Styrker (i millinewtons) er skrevet som F til at repræsentere den kraft, der er forbundet med målrettede peak membran spændinger. Stretch tid er skrevet som t til at repræsentere den stretch tid (i sekunder) specifikke væv bliver testet.

X-aksen Y-aksen Stretch (s) Hold (s) Genskab (s) Resten (s) XPreload (mN) YPreload (mN) Reps Data (Hz) Billede (Hz)
Trin 0,0 (mN) Trin 0,0 (mN) 1 0 1 0 0,0 (første) 0,0 (første) 1 1 1
Rampe dx (%) Rampe dy (%) t 0 t 0 0.025*F (første) 0.025*F (første) 10 15 0
Rampe dx (%) Rampe dy (%) t 0 t 0 Ingen Ingen 2 15 15
Rampe 0,0 (%) Rampe 0,0 (%) 0 0 0 60 Ingen Ingen 1 15 0
Rampe dx (%) Rampe 1 /dy (%) t 0 t 0 Ingen Ingen 10 15 0
Rampe dx (%) Rampe 1 /dy (%) t 0 t 0 Ingen Ingen 2 15 15
Rampe 0,0 (%) Rampe 0,0 (%) 0 0 0 60 Ingen Ingen 1 15 0
Rampe 1 /dx (%) Rampe dy (%) t 0 t 0 Ingen Ingen 10 15 0
Rampe 1 /dx (%) Rampe dy (%) t 0 t 0 Ingen Ingen 2 15 15
Rampe 0,0 (%) Rampe 0,0 (%) 0 0 0 60 Ingen Ingen 1 15 0
Rampe dx (%) Rampe 0,0 (%) t 0 t 0 Ingen Ingen 10 15 0
Rampe dx (%) Rampe 0,0 (%) t 0 t 0 Ingen Ingen 2 15 15
Rampe 0,0 (%) Rampe 0,0 (%) 0 0 0 60 Ingen Ingen 1 15 0
Rampe 0,0 (%) Rampe dy (%) t 0 t 0 Ingen Ingen 10 15 0
Rampe 0,0 (%) Rampe dy (%) t 0 t 0 Ingen Ingen 2 15 15

Tabel 2: fuld test parametre for alle protokoller af den forskydning-kontrolleret afprøvning ordning. Forskydninger (i procent) er skrevet som dx og dy til at repræsentere peak efter forkonditionering procentdel brudforlængelse i X - og Y-retninger, henholdsvis. Stretch tid er skrevet som t til at repræsentere den stretch tid (i sekunder) specifikke væv bliver testet. Forkortelser: PS = ren shear; CU = begrænset enakset.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske trin til denne biaksiale mekaniske test omfatter (i) den ordentlig orientering af indlægssedlen, (ii) en korrekt biaksiale tester setup for ubetydelig shear og (iii) en forsigtig application fiducial markører. Orientering af indlægssedlen er afgørende for opnået mekanisk karakterisering af indlægsseddel væv som materialet er anisotrope i naturen. Således, de radiale og omkredsen retninger skal være kendt for at ordentligt tilpasse væv prøver med den test X - og Y-retninger. Det er også vigtigt at biaksiale testeren er kalibreret korrekt, således at modellen er monteret til systemet med ubetydelig shear stress indført. Hvis en ikke ubetydelig mængde af shear er observeret, kan resultaterne være meget skæv i efterfølgende væv belastning og stress beregninger. Særlig opmærksomhed er nødvendig for anvendelsen af de fire fiducial markører for sikre, at ingen af markørerne holde sig til de andre at undgå forkerte beregninger af væv stammer. Med hensyn til væv stamme beregninger henvises interesserede læsere til procedurerne som beskrevet i tidligere undersøgelser2,23,25.

Nogle ændringer, der kunne gøres til de nuværende protokoller omfatter tilføjelse af stamme-sats og krybe test til forbindelse test. Disse tests giver mulighed for indblik i forskellige viskoelastiske egenskaber af aorta hjertet ventilen (AHV) folder, men det har vist i den tidligere litteratur, at stamme-sats og krybe er ubetydelig for hjertet ventilen indlægsseddel væv under fysiologisk fungerende betingelser.

Begrænsninger af denne metode omfatter potentialet for shear indførelse i tilfælde af ukorrekt planar tilpasning af modellen og stak fiducial markører, som ugyldige data, som ovennævnte. Andre begrænsninger af denne metode omfatter brug af tænderne for modellen montering, som modellen styres kun af fem punkter på hver kant i stedet for en fuld fastspænding til kontrol prøveeksemplar kanter. Brugen af tænderne over fastspænding metoder forårsager problemer med enakset testprotokoller sådan, at tænderne kan tillade, at små deformationer trods fordrivelse af tine-end knyttet til biaksiale test systemet bliver konstant. Dog kan denne deformation fra individuelle tine bevægelse formodes ubetydelig.

Denne metode er væsentlig i dens fordele i forhold til andre metoder fordi alle test protokoller (kraft-kontrollerede, deplacement-kontrolleret, og stress-afslapning) udføres i ét samlet væv prøvemateriale. Alternativer til den præsenterede metode kan kun udføre en prøvningsprotokol for hver væv, snarere end tre kombinerede test protokoller. Dette indebærer, at disse alternativer ikke kan være så præcis i deres beskrivelse af væv adfærd, som væv egenskaber kan afvige mærkbart mellem væv fra forskellige animalske emner.

Denne metode kan forlænges ved anvendelse til andre materialer udover atrioventrikulær hjertet ventilen foldere. Disse metoder kan for eksempel være nyttige i kendetegner andre bløde væv, eller polymerer/gummi-type materialer. Den medfølgende ordning ville give for fuld karakterisering af sådanne materialer, der er kompatibel med en biaksiale prøvningsanordningen, såfremt der er en passende opsætning, f.eks. et passende vejecelle kapacitet og modellen størrelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af American Heart Association videnskabsmand udvikling Grant 16SDG27760143. Forfatterne vil også gerne anerkende Mentored Research Fellowship fra University of Oklahoma Office of Undergraduate Research for at støtte både Colton Ross og Devin Laurence.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Formalin Solution, Neutral Bufffered Sigma-Aldrich HT501128-4L 
40X-2500X LED Lab Trinocular Compound Microscope AmScope SKU: T120C
BioTester - Biaxial Tester CellScale Biomaterials Testing 1.5N Load Cell Capacity
ImageJ National Institute of Health, Bethesda, MD Version 1.8.0_112
LabJoy CellScale Biomaterials Testing Version 10.66
MATLAB MathWorks Version 2018b
Phosphate-Buffered Saline n/a Recipe for 1L 1X PBS Solution: 8.0g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24g KH2PO4
Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) VWR International H3515541105024 Razord blades for tissue retrieval and preparation procedures

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. May-Newman, K., Yin, F. Biaxial mechanical behavior of excised porcine mitral valve leaflets. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 269 (4), H1319-H1327 (1995).
  2. Billiar, K., Sacks, M. A method to quantify the fiber kinematics of planar tissues under biaxial stretch. Journal of Biomechanics. 30 (7), 753-756 (1997).
  3. Grashow, J. S., Sacks, M. S., Liao, J., Yoganathan, A. P. Planar Biaxial Creep and Stress Relaxation of the Mitral Valve Anterior Leaflet. Annals of Biomedical Engineering. 34 (10), 1509-1518 (2006).
  4. Humphrey, J. D., Vawter, D. L., Vito, R. P. Quantification of strains in biaxially tested soft tissues. Journal of Biomechanics. 20 (1), 59-65 (1987).
  5. Sacks, M. A method for planar biaxial mechanical testing that includes in-plane shear. Journal of Biomechanical Engineering. 121 (5), 551-555 (1999).
  6. Sacks, M., Chuong, C. Biaxial mechanical properties of passive right ventricular free wall myocardium. Journal of Biomechanical Engineering. 115 (2), 202-205 (1993).
  7. Stella, J. A., Sacks, M. S. On the biaxial mechanical properties of the layers of the aortic valve leaflet. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (5), 757-766 (2007).
  8. Lanir, Y., Fung, Y. Two-dimensional mechanical properties of rabbit skin-II. Experimental results. Journal of Biomechanics. 7 (2), 171-182 (1974).
  9. Sun, W., Sacks, M. S., Sellaro, T. L., Slaughter, W. S., Scott, M. J. Biaxial mechanical response of bioprosthetic heart valve biomaterials to high in-plane shear. Journal of Biomechanical Engineering. 125 (3), 372-380 (2003).
  10. Sommer, G., Regitnig, P., Költringer, L., Holzapfel, G. A. Biaxial mechanical properties of intact and layer-dissected human carotid arteries at physiological and supraphysiological loadings. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (3), H898-H912 (2009).
  11. Tong, J., Cohnert, T., Regitnig, P., Holzapfel, G. A. Effects of age on the elastic properties of the intraluminal thrombus and the thrombus-covered wall in abdominal aortic aneurysms: biaxial extension behaviour and material modelling. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 (2), 207-219 (2011).
  12. Billiar, K. L., Sacks, M. S. Biaxial mechanical properties of the natural and glutaraldehyde treated aortic valve cusp-Part I: Experimental results. Transactions-American Society of Mechanical Engineers Journal of Biomechanical Engineering. 122 (1), 23-30 (2000).
  13. Jett, S., et al. Biaxial mechanical data of porcine atrioventricular valve leaflets. Data in Brief. 21, 358-363 (2018).
  14. Pham, T., Sun, W. Material properties of aged human mitral valve leaflets. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (8), 2692-2703 (2014).
  15. Pierlot, C. M., Moeller, A. D., Lee, J. M., Wells, S. M. Biaxial creep resistance and structural remodeling of the aortic and mitral valves in pregnancy. Annals of Biomedical Engineering. 43 (8), 1772-1785 (2015).
  16. Potter, S., et al. A Novel Small-Specimen Planar Biaxial Testing System With Full In-Plane Deformation Control. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (5), 051001 (2018).
  17. Khoiy, K. A., Amini, R. On the biaxial mechanical response of porcine tricuspid valve leaflets. Journal of Biomechanical Engineering. 138 (10), 104504 (2016).
  18. Grashow, J. S., Yoganathan, A. P., Sacks, M. S. Biaixal stress-stretch behavior of the mitral valve anterior leaflet at physiologic strain rates. Annals of Biomedical Engineering. 34 (2), 315-325 (2006).
  19. Huang, H. -Y. S., Lu, J. Biaxial mechanical properties of bovine jugular venous valve leaflet tissues. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. , 1-13 (2017).
  20. Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet. Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).
  21. Sacks, M. S., David Merryman, W., Schmidt, D. W. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
  22. Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. Heart valve function: a biomechanical perspective. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).
  23. Jett, S., et al. An investigation of the anisotropic mechanical properties and anatomical structure of porcine atrioventricular heart valves. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 87, 155-171 (2018).
  24. Ruifrok, A. C., Johnston, D. A. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 23 (4), 291-299 (2001).
  25. Sacks, M. S. Biaxial mechanical evaluation of planar biological materials. Journal of Elasticity. 61 (1), 199 (2000).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 146 biaksiale mekanisk testning mitralklap trikuspidalklappen væv biomekanik stress & stamme beregninger digital billed korrelation histologiske analyse stress afslapning
Biaksiale mekaniske beskrivelser af atrioventrikulær hjerteklapper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ross, C., Laurence, D., Wu, Y., Lee, … More

Ross, C., Laurence, D., Wu, Y., Lee, C. H. Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves. J. Vis. Exp. (146), e59170, doi:10.3791/59170 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter