Summary
Detta protokoll innebär karakteriseringar av atrioventrikulärt ventilen flygblad med kraft-kontrollerade, deplacement kontrollerade och stress-avkoppling biaxiell mekaniska testförfaranden. Resultaten som förvärvats med detta protokoll kan användas för konstitutiv modellutveckling för att simulera den mekaniska beteenden av fungerande ventiler under en finita element simulering ram.
Abstract
Omfattande biaxiell mekaniska tester av atrioventrikulärt hjärtat ventilen broschyrer kan användas för att härleda optimala parametrar används i konstitutiva modeller, som ger en matematisk representation av den mekaniska funktionen av dessa strukturer. Här presenteras biaxiell mekanisk provning protokollet innebär (i) vävnad förvärv, (ii) utarbetande av vävnadsprover, (iii) biaxiell mekanisk provning och (iv) postprocessing förvärvade data. Först, vävnad förvärv kräver att erhålla svin eller får hjärtan från en lokal mat och Drug Administration godkänt slakteri för senare dissektion för att hämta ventilen broschyrer. Andra kräver vävnad förberedelse med vävnad preparatet fräsar på bipacksedeln vävnad för att extrahera en tydlig zon för testning. Tredje, biaxiell mekanisk provning av bipacksedel preparatet kräver användning av en kommersiell biaxiell mekaniska tester, som består av kraft-kontrollerade, deplacement-kontrollerade, och stress-avkoppling test protokoll för att karakterisera bipacksedel vävnadens mekaniska egenskaper. Slutligen kräver efterbehandling av data bild korrelation tekniker och kraft och deplacement avläsningar att sammanfatta vävnadens mekaniska beteenden som svar på externa lastning. Generellt visar resultaten från biaxiell testning att bipacksedeln vävnader ger en ickelinjär, Anisotrop mekaniska svar. Presenterade biaxiell testförfarandet är fördelaktigt att andra metoder eftersom metoden presenteras här möjliggör en mer omfattande karakterisering av ventilen bipacksedel vävnaden under ett enhetligt test system, i motsats till separat testprotokoll på olika vävnadsprover. Föreslagna testmetoden har sina begränsningar däri skjuvspänning är potentiellt närvarande i vävnadsprov. Några potentiella skjuvning förutsätts dock försumbar.
Introduction
Ordentlig hjärtfunktion är beroende av lämpliga mekaniska beteenden av hjärtat ventilen broschyrer. I situationer där hjärtat ventilen bipacksedel mekanik är äventyras, uppstår ventil hjärtsjukdom, vilket kan leda till andra hjärtrelaterade problem. Förstå ventil hjärtsjukdom kräver en grundlig förståelse av flygbladen ordentlig mekanisk beteenden för beräkningsmodeller och terapeutisk utveckling, och som sådan, ett test system måste utvecklas för att korrekt Hämta friska broschyrer mekaniska egenskaper. I tidigare litteratur genomförts denna mekaniska karakterisering med hjälp av biaxiell mekaniska testförfaranden.
Biaxial mekaniska testförfaranden för mjuka vävnader varierar i litteraturen, med olika tester ramar används för att hämta olika egenskaper1,2,3,4, 5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. testa metoder har förlängts för undersökningar av de mekaniska egenskaperna hos hjärtat ventilen broschyrer. I allmänhet baserat biaxiell mekanisk provning innebär lastning hjärtat ventil vävnaden med samtidiga styrkor i de två huvudsakliga riktningarna, men hur denna testning utförs varierar på biomekaniska egenskaper observeras. Några av dessa testprotokoll inkluderar (i) stam-rate, (ii) krypning, (iii) stress-avkoppling och (iv) kraft-kontrollerade tester.
Först, stam-rate testning har använts för att fastställa tidsberoende beteenden av vävnad broschyrer18,20. I detta test protokoll, broschyrer läses en högsta aluminiummembran spänningar på olika halv-cykeltider (dvs 1, 0.5, 0,1 och 0.05 s) att avgöra om det finns en betydande skillnad i maximal stretch eller hysteres mellan laddningstider. Dessa tester har dock visat en försumbar skillnad i den observerade stretch med varierande stam-priser. Andra i krypning testning, är vävnaden lastat till peak membran spänningen och hölls på topp membran spänning. Denna testning tillåter en demonstration av hur vävnadens deplacement kryper för att upprätthålla peak membran spänningen. Det har dock visat att krypning är obetydlig för hjärtat ventilen flygblad under fysiologiskt fungerande3,20. Tredje i stress-avkoppling testning, vävnaden är laddad till peak membran spänningen och associerade förskjutningen hålls konstant under en längre tid3,21,22. I denna typ av provning, har vävnad stress en anmärkningsvärd minskning från peak membran spänningen. Slutligen, i kraft-kontrollerade tester, vävnader läses cykliskt vid olika förhållanden av peak membran spänningen i varje riktning17,23. Dessa provningar visar materialets anisotropi och ickelinjära stress-påfrestningar svar och genom laddar vävnaden under olika nyckeltal, potentiella fysiologiska deformationer kan förstås bättre. Dessa undersökningar som nyligen gjorde det uppenbart att stress-avkoppling och kraft-kontrollerade protokoll bevisa mest fördelaktigt att utföra en mekanisk karakterisering av hjärtat ventilen broschyrer. Trots dessa framsteg i hjärtat ventil biomekaniska karakterisering, testning inte har utförts enligt en enhetlig testa systemet, och det finns begränsad metoder för att undersöka kopplingen mellan riktningar.
Syftet med denna metod är att underlätta en fullständig materialkarakterisering av hjärtat ventilen broschyrer genom en enhetlig biaxiell mekanisk provning systemet. En enhetlig provning systemet anses som en där varje bipacksedel är testad under alla testprotokoll i en session. Detta är fördelaktigt, som vävnad boenden är till sin natur variabelt mellan broschyrer, så en fullständig karakterisering för varje bipacksedel visar mer exakt som en deskriptor än utför varje protokoll självständigt på olika foldrar. Testa systemet består av tre huvuddelar, nämligen (i) en kraft-kontrollerade biaxiell testning, (ii) ett deplacement-kontrollerade biaxiell test protokoll, och (iii) en biaxiell stress-avkoppling testning protokollen. Alla test system utnyttja en fisktäthet 4,42 N/min, och 10 lastning cykler att säkerställa stress-påfrestningar kurvan replikerbarhet genom den 10: e cykel (som finns i tidigare arbete)23. Alla protokoll är också konstruerade utifrån membran spänning antagandet, som kräver att tjockleken är mindre än 10% av de effektiva preparatet längderna.
Kraft-kontrollerade protokollet som används i denna presenterade metoden består av 10 lastning och lossning cykler med peak membran spänningar av 100 N/m och 75 N/m för mitralisklaffstenos (MV) och trikuspidalklaffen (TV), respektive15,17. Fem lastning nyckeltal betraktas i detta kraft-kontrollerade test protokoll, nämligen 1:1, 0.75:1, 1:0.75, 0.5:1 och 1:0. 5. Dessa fem lastning nyckeltal Visa sig användbara i beskriver påfrestningar korrespondent till alla potentiella fysiologiska deformationer av bipacksedeln Invivo.
Deplacement-kontrollerade protokollet presenteras i denna metod består av två deformation scenarier, nämligen (i) begränsad enaxiella stretching och (ii) ren skjuvning. I den begränsade enaxiella stretching, är en riktning av vävnad fördrivna till peak membran spänningen fördriva tiden fästande den andra riktningen. I ren skjuvning setup, är vävnaden sträcks i en riktning och omdömesgillt förkortas i den andra riktningen, så området av vävnad förblir konstant under deformation. Var och en av dessa deplacement-kontrollerade testprocedurer utförs för varje av de två vävnad riktningarna (omkretsriktningen och radiella riktningar).
Den stress-avkoppling-protokoll som används i den presenterade metoden uppnås genom lastning vävnaden till peak membran spänningen i båda riktningarna och hålla vävnad på de korrespondent förskjutningarna för 15 min att övervaka vävnadens stress avkoppling beteende. De detaljerade experimentella förfarandena diskuteras nästa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder beskrivs godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) vid The University of Oklahoma. Alla animaliska vävnader förvärvades från ett enigt påstår avdelning av jordbruk USDA-godkända slakteri (land hem kött Co., Edmond, OK).
1. vävnad förvärv och rengöring
- Hämta djur hjärtan på samma dag som djuret slaktas och förvara hjärtan på en is bröstet för att säkerställa vävnad friskhet. Transportera hjärtan till laboratoriet utrymme.
- Vid ankomst till labbet, dränka hjärtat i en hink med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning att skölja bort överflödigt blod. Hämta en bordstablett, en kirurgisk kniv, tång, en hink med PBS lösning, blekmedel och en plastpåse. Förbereda bordstablett genom att lägga det på räknaren dissektion, vilket möjliggör en enklare rengöring av blod-relaterade röra. När hjärtat har varit tillräckligt sköljda, placera hjärtat på bordstablett (figur 1a).
- Med tången, lokalisera sära linjen mellan förmaken och ventrikeln på varje sida av hjärtat. Med ett rakblad, noggrant gör ett snitt längs denna sära linje och avslöja hjärtklaffarna och ventriklarna (figur 1b). Gör snitt längs hela yttre omkretsen av hjärtat, sådana att förmaken och allt mitt material överlägsen ventriklar kan tas.
- Med hjälp av tången, dra försiktigt ut eventuella observerade blodproppar i ventriklarna (figur 1 c). Om ett försök görs att ta bort en blodpropp, men det gör inte flytta, säkerställa den chordae tendineae eller broschyrer har inte varit tog. Placera blodproppar i biohazard påsen för avfallshantering.
- När alla blodproppar har tagits bort från ventriklarna, skölj hjärtat en sista gång i en hink med PBS lösning. Placera rena hjärtat i en plastpåse och förvara den i frysen.
- Med en lösning med 10% blekmedel och 90% indikeras vatten, blanda blodet med blekmedel lösning och uppståndelse kontinuerligt i ca 10 min. Leta efter en framgångsrik blekmedel behandling, av den lösning som övergår från röd till gul. Kassera blekmedel-behandlade blodet genom dränering.
FÖRSIKTIGHET: Blekmedel är ett giftigt ämne och kan vara skadligt vid förtäring.
Obs: Protokollet kan pausas här.
2. hjärta dissektion och undersökning av anatomi
- Hämta tidigare rengjorda hjärtat och låt den Tina i ett varmt vattenbad. Material behövs för dissektion inkluderar pincett, kirurgiska knivar, bordstabletter, PBS och små förvaringskärl. Efter hjärtat är helt tinade, satte den på en bordstablett att absorbera alla återstående blod.
- Håll hjärtat för en uppifrån (överlägsen) Visa att optimalt iaktta strukturerna som ventil. Börjar med MV på vänster sida av hjärtat, använda pincett att noggrant manipulera flygbladen och identifiera en commissure, eller parting line, mellan flygbladen.
- Gör ett snitt längs commissure och försiktigt skära genom ventrikulära väggen, se till att inte skada flygbladen. Det kan vara nödvändigt att sänka ackordinstrument bilagor under denna process helt öppna ventrikeln. När den fullständiga snitt, öppna ventrikeln (figur 2a).
- Identifiera MV främre och bakre flygbladen och använda en kirurgisk kniv för att bryta ackordinstrument bilagor till papillär musklerna. Med pincett, sträck flygbladen spända och göra nedskärningar till separata broschyrer från annulus. Placera de exciderad broschyrerna i en korrekt märkta behållare fylld med PBS lösning och förvara den i kylskåp vid cirka 4 ° C.
- Håll hjärtat för en top-down vy och identifiera TV på höger sida av hjärtat. Leta upp commissures och gör ett snitt genom en av commissures och ventrikulära väggen (figur 2b).
- Identifiera TV septal, bakre och främre flygbladen och utföra bipacksedel utvinning som gjort steg 2,4. Placera alla erhållna broschyrer i märkta behållare fylld med PBS lösning och förvara behållaren i kylskåp vid cirka 4 ° C.
Obs: Protokollet kan pausas här. Dock ska vävnad biomekanisk testning och efterföljande histologiska analyserna ske inom 2 dagar av hjärtat dissektion.
3. vävnad dissektion
- Hämta en broschyr från kylen, vävnad fräsen för den angivna snittningen storleken, en kirurgisk penna, pincett, rakblad och en skärmatta.
- Använda pincett, ta bort preparatet från PBS lösningen och lägga den platt på skärmatta med radiell riktning (R) anpassas till Y-riktningen och omkretsriktningen riktning (C) anpassas till X-riktning (figur 3a). Identifiera Bipacksedelns centrala regionen som avsnittet testning.
- Justera vävnad fräsen så att önskad vävnad testning regionen är inom gränserna för rakblad. Gör en skär horisontellt och vertikalt för att bilda en kvadrat region i önskade dimensioner (figur 3b). Med kirurgiska pennan etikett vävnadens radiell riktning (figur 3b).
- Använda rakbladet, trimma ackordinstrument bilagor genom stretching av chordae från bipacksedeln med tången och göra en noggrann cut utan att orsaka någon skada på bipacksedeln.
Obs: Protokollet kan pausas här. Om protokollet är pausad förvaras sektionerad vävnaden i märkta behållare fylld med PBS lösning och lagra behållaren i kylskåp vid cirka 4 ° C (som förklaras i steg 2,6). Dock ska vävnad provning ske inom 2 dagar av dissektion.
4. tjockleksmätning och biaxiell testare setup
- Hämta sektionerad vävnad preparatet, digital calipers Digitala skjutmått och en liten metall spatel. Använda de digitala bromsok, mät och anteckna tjockleken på den metall spateln.
- Med hjälp av tången, Lägg vävnad preparatet platt på den metall spateln. Använda de digitala bromsok, mäta tjockleken på paret spatel-vävnad (figur 3 c) på tre olika broschyr platser. Subtrahera spatelns tjocklek från varje mätning och spela in den genomsnittliga tjockleken.
- Förbereda ett PBS bad vid 37 ° C, vilket motsvarar den Tissues fysiologiska förhållanden.
5. vävnad montering och relaterat markör placering
- Hämta tång, vävnad preparatet, monteringsmaterial, en spetsig verktyg, glaspärlor (med diametrar av 300 – 500 µm) och superlim.
- Montera vävnaden de biaxiell testsystemet (figur 3de). Samtidigt montering, se till att vävnadens omkretsriktningen och radiella riktningar är i linje med maskinens X - och Y-riktning.
- För relaterat markör placering, placera glaspärlor i en liten öppen behållare och en liten pool av superlim i en annan behållare. Med verktyget spetsig, coat spetsen med en liten mängd superlim och sticka en enskild pärla till spetsen av verktyget.
- Försiktigt använda verktyget för att överföra pärla till ett hörn av den mellersta tredjedelen av vävnadens test region (figur 3f). Upprepa detta steg tills en kvadratisk matris av fyra pärlor är bildade (figur 3 g).
Obs: Det är avgörande att överflödigt lim undviks, och att relaterat markörerna inte håller ihop som senare digital bild korrelation (DIC) tekniker kommer att producera värdelösa spårning resultat. Det är viktigt att den kvadratiska matrisen måste vara inom den mittersta tredjedelen av vävnads testning regionen.
6. prekonditionering steg och varaktighet timing
- För att beräkna lämpliga membran spänningen, Hämta vävnadens effektiv testning kantalängd och använda följande ekvation.
(1)
Obs: Här T är membran spänningen i en enhet av kraft/längd, f är kraften, och L är preparatets effektiv testning längd. - Skapa ett prekonditionerande protokoll så att vävnaden kommer att genomgå 10 lastning och lossning cykler på de krafter som är associerad med peak membran spänning med en lastning hastighet på 4,42 N/min, inklusive en förspänning på 2,5% av den maximala kraften (figur 4).
- Skapa en ny godtycklig testning katalog för att tillfälligt lagra prekonditionerande data, eftersom det inte är nödvändigt för framtida beräkningar. Upprätta en fisktäthet 4,42 N/min för efterföljande testning.
- Skapa en ny uppsättning testa parametrar och ange namnet på protokollet som Preconditioning0 (figur 4a). För X- och y, ange kontrolläget vara kraft och kontrollfunktion vara steg. Ange den Ladda magnitud som den kraft som är associerad med riktade peak membran spänning (jfr steg 6.1) (figur 4b). Ställa in förspänning magnitud som 2,5% av den maximala kraften för den första repetitionen endast (figur 4 c). Ange den sträcka varaktighet och återhämtning varaktighet båda vara 25 s. Set det Antal repetitioner vara 10 (figur 4e).
- När steget prekonditionerande slutförs, anteckna vävnadens deformation i X - och Y-anvisningarna. Förbereda ett protokoll till flytta preparatet till den högsta kraft, som börjar från den inspelad storleken.
- Hämta ett stoppur för timing ändamål. Påbörja den högsta kraft som laddar protokollet och starta stoppuret samtidigt när maskinen börjar aktivering (figur 5a). Stoppa tidtagaruret när aktivering stannar. Stoppa blir uppenbart genom auditiva ledtrådar.
- Spela in efter prekonditionerande peak vävnad deformation tillsammans med tiden från stoppuret som representerar vävnadens optimala stretch tiden (Figur 5b).
(1)7. biaxial mekanisk provning
- Förbereda ett kraft-kontrollerade protokoll med en lastning hastighet på 4,42 N/min.
- Öppna en ny testning katalog och namnge testet. Ange uppgifterna som att spara till en känd plats för användning i senare påfrestningar beräkningar. Flytta provet tillbaka till den ursprungliga konfigurationen för montering.
- Skapa ett protokoll set med titeln FirstImage. Ange de x-axeln och y-axeln styrsätt till kraft och kontrollfunktion till steg. Ange den Ladda magnitud 0 mN. Inställt den sträcka varaktighet och återhämtning varaktighet varje 1 sekund. Ange antalet repetitioner till 1. Ange de data utgång frekvens och bild utfrekvensen varje till 1 Hz.
- Konstruera en ny testning uppsättning, som heter PreconditioningA. Fastställa parametrarna för testning så att vävnaden kommer att genomgå 10 upprepningar av cykliska lastning och lossning till riktad kraft för önskad membran spänningen exakt som utarbetades i steg 6,2. Observera att nu, den stretch och återvinna tid bör den tid som registrerades i steg 6.3.2. Inga bilder fångas i A test set, men data fångas på 15 Hz.
- Konstruera en annan test set, namngivna PreconditioningB. Alla tester parametrar bör vara identiska med dem som nämnts i föregående steg, med undantag det bild utfrekvensen är inställt på 15 Hzoch ingen förspänning tillämpas.
- Efter prekonditionerande protokollet, skapa testprotokoll så att vävnaden är laddad till peak membran spänningen i följande omkretsriktningen-till-radiella lastning nyckeltalen med en lastning hastighet på 4,42 N/min: 1:1, 0.75:1, 1:0.75, 0.5:1 och 1:0.5 (figur 6 ). Hämta data från de två sista cyklerna av varje lastning förhållandet för efterföljande databehandling och analyser som beskrivs i avsnitt 10. Se tabell 1 för en detaljerad beskrivning av de protokoll som skall fastställas.
- Förbereda ett deplacement-kontrollerade test protokoll med en lastning hastighet på 4,42 N/min enligt följande. (i) Biaxial stretching i X-riktning och Y-riktning till de förskjutningar som är associerad med peak omkretsriktningen och radiella sträckor, respektive (figur 7a). (ii) Pure skeva längs X-riktning — stretching i X-riktningen är associerad med peak omkretsriktningen stretch och förkortning i Y-riktning, samtidigt som området streckad konstant under deformation (figur 7b). (iii) begränsad enaxiella sträcker sig längs X-riktning (figur 7 c). (iv) Pure skeva längs Y-riktning (figur 7 d). (v) begränsad enaxiella sträcker sig längs Y-riktning (figur 7e).
- Mellan varje av dessa steg, konstruera en vila ”cykel” 1 min som håller vävnaden på monterade originalkonfigurationen. Hämta data från de två sista cyklerna av varje lastning förhållandet för databehandling och analys (avsnitt 9). Se tabell 2 för en detaljerad beskrivning av de protokoll som skall fastställas.
- Förbereda en stress-avkoppling-protokollet så att vävnaden är laddad i varje riktning, med en lastning hastighet på 4,42 N/min, till de förskjutningarna är associerad med peak membran spänningarna (steg 7,2) och höll på att deplacement för 15 min (figur 8 och Figur 9). Efter 15 min, bör protokollet anges att återställa vävnaden till sin ursprungliga konfiguration för montering.
Obs: När det gäller vävnad tårflöde, avbryta testet omedelbart för att förhindra eventuella skador orsakade av biaxiell testsystemet.
8. vävnad fixering för histologi analys
- Demontera vävnaden från biaxiell testa systemet. Placera vävnaden i en behållare fylld med 10% formalin och placera behållaren i en kyld miljö vid cirka 4 ° C. Fixa vävnaden för 24 – 48 timmar, beroende på vävnadens tjocklek.
FÖRSIKTIGHET: Formalin är cancerframkallande och, om andades, ett överskott kan orsaka lungor att bli fast. Allt arbete med formalin bör utföras i dragskåp med tillräcklig ventilation. - När vävnaden har fastställts i formalin för 24 – 48 h, överföra vävnad till en 80% etanol lösning för senare histologi. Vävnaden ska förvaras i lösning i en kyld miljö vid 4 ° C.
Obs: Protokollet kan pausas här. När vävnaderna är fasta, kan exemplaren analyseras när som helst. Om protokollet är pausad förvaras vävnaden i märkta behållare fylld med 80% etanol och lagra behållaren i kylskåp vid cirka 4 ° C (som förklaras i steg 8,2). - Förbereda vävnaden för kommersiella histologi analys enligt leverantörens anvisningar. Om vissa bipacksedel beståndsdel, såsom kollagen, elastin, glykosaminoglykaner, etc., är av studiens intresse, säkerställa att lämpliga histologi fläcken är anställd.
Obs: Histologi diabilder kan visualiseras med Mikroskop för att iaktta önskad beståndsdelar (figur 10). - Med hjälp av bildbehandling programmet ImageJ, utföra färg deconvolution metoder för att bestämma procentandelen av varje färgade beståndsdel i vävnaden. För mer information om dessa förfaranden, hänvisas till Ruifrok och Johnston24.
9. biaxial testdata efterbearbetning förfaranden
- Utföra DIC-baserad spårning på fyra relaterat markörer från bilder tagna under den biaxiell mekaniska testning (figur 11) att fastställa tidsberoende markör positioner.
(2)- Om det önskas att utföra analysen avseende montering konfigurationen, låt Xjag vara markör positioner i odeformerade staten i början av biaxiell testet. Om det önskas att utföra analysen avseende efter prekonditionerande deformation, låt Xjag vara namnets markör i slutet av protokollet prekonditionerande.
Obs: De efterföljande stegen kommer att genomföras på samma sätt, oavsett referenskonfigurationen valt.
Obs: Här Xjag och xjag är namnets odeformerade och deformerade av markörer, respektive, och djag är förskjutning vektorn av varje markör.
- Om det önskas att utföra analysen avseende montering konfigurationen, låt Xjag vara markör positioner i odeformerade staten i början av biaxiell testet. Om det önskas att utföra analysen avseende efter prekonditionerande deformation, låt Xjag vara namnets markör i slutet av protokollet prekonditionerande.
- Beräkna deformation gradient (F) relaterat markörer med en fyra noders Bilinjär finita element2,23,25.
(3)
Obs: Här BxI: s och ByIär finita element form funktion derivat i X - och Y-anvisningarna för noden jag, respektive, och ujag(t) och vjag( t) är den tidsberoende X - och Y-förskjutningar, respektive, som tidigare bestäms från steg 9,1. Observera att X - och Y-koordinaterna är justerade till vävnadens omkretsriktningen och radiella riktningar. - Beräkna rätt Cauchy – grön deformation tensor (C) och den gröna stam tensor (E).
(4)
Obs: Här, jag är andra ordningens identitet tensor. Fastställa de perifera och radiella sträcker sig genom att ta kvadratrötter av princip värden för C. - Avgöra den första Piola-Kirchhoff (1st-PK) stress tensor (P).
(5)
Obs: Här t är preparatets tjocklek och TC och TR är tillämpad membran spänningarna i omkretsriktningen och radiella riktning, respektive. - Dessutom beräkna andra stress tensorer, såsom den Cauchy stress tensor (σ) och den andra Piola-Kirchoff (2nd-PK) stress tensor (S).
(6)
Obs: Här J är Jacobimatris av den deformation gradient tensor F.
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stress-stretch data från kraft-kontrollerade biaxiell mekaniska tester avslöjar en ickelinjär kurva med vissa likheter med en exponentiell kurva (figur 12). Om svar i varje huvudsakliga riktning är materiella beteendet tvären isotropiskt, med den radiella stretch som är större än omkretsriktningen deformation. I vissa fall kan den anisotropi riktningar flip, med omkretsriktningen riktningen uppvisar större överensstämmelse än radiell riktning. Detta flippade svar observeras i TV oftare än i MV.
Deplacement-kontrollerade tester följer stress-stretch data en ickelinjär svar för huvudsakliga riktningen som genomgår spänning (ren-skjuvning, begränsad enaxligt spänning [figur 13]). När vävnaden förkortar i andra huvudsakliga riktning, observeras en ”negativ (tryckkraft) stress”. I protokollet begränsad enaxligt spänning, uppvisar det också en ökande stress-stretch svar i begränsad riktning, visar kopplingen av tillämpad stretching i andra huvudsakliga riktning.
Från stress-avkoppling testning, normaliserade membran spänning-tid data följer en ickelinjär ruttnande kurva (figur 14a, b). Både MV och TV bipacksedel vävnader uppvisar en större stress reduktion i radiell riktning jämfört med i omkretsriktningen riktning.
Representativa histologiska resultaten av mitralisklaffstenos främre bipacksedel (MVAL) och trikuspidalklaffen främre bipacksedel (TVAL) vävnader med Masson s trikrom presenteras i figur 10. De Masson trikrom fläcken visar typiska beståndsdelar i atrioventrikulärt hjärtklaffar, såsom kollagenfibrer (blå) och valvulär interstitiella celler (röda cytoplasman och svarta kärnor). Andra fläckar kan användas för att visualisera beståndsdelar såsom elastin (Verhoeff-van Gieson fläcken) och glykosaminoglykaner (Alcian blå fläck).
Figur 1: experimentella foton av svin hjärtan Hämtad från ett lokalt slakteri. (en) A hela hjärtat sköljs av blod med PBS lösning. (b) en snittet görs mellan förmak och kammare att avslöja både mitralis och tricuspid ventilerna. (c) blodproppar tas då bort från hjärtat före lagring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: experimentella foton av öppnade svin hjärtat avslöjar fem atrioventrikulärt hjärta ventilen flygblad och andra komponenter av ventil apparater. (en) mitralklaffen med dissektion av vänster hjärtat längs commissure mellan två broschyrer, visar den främre bipacksedel (MVAL) och bakre broschyr (MVPL) och (b) trikuspidalklaffen med en liknande dissektion på höger sida av hjärtat, avslöjar den främre bipacksedel (TVAL), bakre broschyr (TVPL) och septal bipacksedel (TVSL). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: experimentella foton exciderad bipacksedel förbereds för biaxiell mekanisk provning. Hjärtat ventilen bipacksedel testning kräver (en) bulk bipacksedeln sektioneras till (b), en 10 mm x 10 mm testning region (radiell riktning noterades av kirurgiska penna markörer). (c), bipacksedeln tjocklek mäts. Prover är monterade (d) den biaxiell testsystemet av (e) piercing av vävnaden med metall pinnarna. Efter montering limmas (f) relaterat markörer på ytan av vävnaden innan (g) nedsänkning i PBS lösning vid 37 ° C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: exempel protokollparametrar för prekonditionerande testning av en mitralisklaffstenos främre bipacksedel för en 7,5 x 7,5 mm testning regionen. Provprekonditionerande protokollet skapas testning styrsätt och kraft i x-axeln, (c) av förspänning villkor, (d), y-axeln parametrar vara densamma som i x-axeln, ange (en) protokollet namn, (b) och (e. ) cykel parametrar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: exempel protokollparametrar för timing steg för en mitralisklaffstenos främre bipacksedel för en 7,5 x 7,5 mm testning regionen. Det tidpunkten steget kräver (en) flyttar vävnaden från efter prekonditionerande deformation till peak membran spänning (och motsvarande peak deformation) medan du samtidigt startar ett stoppur för att registrera den stretch tid. När kraften som mål har uppnåtts, registreras (b) efter prekonditionerande deformation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Schematisk av kraft-kontrollerade biaxiell testförfarandet för testning mitral och trikuspidalklaffen broschyrer. Testning protokollet består av en equibiaxial lastning prekonditionering steg för att utöva vävnaden som dess Invivo tillstånd, följt av olika lastning nyckeltal av peak membran spänningen i varje vävnad riktning (Tx:Ty): 1:1, 0.75:1, 1:0.75, 0.5:1 och 1:0. 5. Varje underavsnitt av protokollet kraft-kontrollerade tester utförs för 10 lastning och lossning cykler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Schematisk av deplacement-kontrollerade biaxiell testförfarandet för testning mitral och trikuspidalklaffen broschyrer. Testning protokollet består av (en) biaxiell förskjutningar som är associerad med peak membran spänningarna, (b) ren skjuvning i X-riktning, (c) begränsad enaxiella förskjutning i X-riktning, (d) ren skjuvning i den Y-riktning, och (e) begränsad enaxiella förskjutning i Y-riktningen. Varje underavsnitt av protokollet deplacement-kontrollerade tester utförs för 10 lastning och lossning cykler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: exempel stress-avkoppling testning parametrar för en mitralisklaffstenos främre bipacksedel med en effektiv testning regionen i 7,5 x 7,5 mm. Testning ange parametrar för stress-avkoppling testning för en mitralisklaffstenos främre bipacksedel där riktade deplacement är peak vävnad deformation specifika för denna vävnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Schematisk av 15 min stress-avkoppling testförfarandet för testning mitral och trikuspidalklaffen broschyrer. Testning protokollet innebär holding biaxiell förskjutningar är associerad med peak membran spänningarna för 15 min, varefter vävnaden returneras till montering konfigurationen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: exempel histologiska data från atrioventrikulärt hjärtklaffarna främre broschyrer. Representativa histologi bilder av (en) mitralklaffen främre bipacksedel och (b), trikuspidalklaffen bakre bipacksedeln. Båda är färgade med en Masson trikrom fläcken: kollagen i blått, cytoplasman och keratin i rött och kärnor i svart. Skalstapeln = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 11: representativa bilder som illustrerar spårning av koordinaterna för fyra relaterat markörer under biaxiell mekanisk provning med hjälp av en data bild korrelation (DIC) teknik. (en) vävnaden montering konfiguration. (b) konfigurationen efter prekonditionerande steget. (c) den deformerade konfigurationen är associerad med vävnad preparatet under mekanisk belastning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 12: representativa uppgifter från de kraft-kontrollerade protokoll för mitralisklaffstenos främre bipacksedeln (MVAL). Representativa uppgifter visar den materiella anisotropi och ickelinjära stam svar av vävnader under biaxiell lastning vid varierande lastning nyckeltal peak membran spänning i varje vävnad riktning (Tx:Ty): (en) 1:1, (b) 0.75:1, (c) 1:0.75, (d) 0.5:1 och (e) 1:0. 5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 13: representativa uppgifter från deplacement-kontrollerade protokollen för mitralisklaffstenos främre bipacksedeln (MVAL). Representativa uppgifter visar den materiella anisotropi och ickelinjära stam svar av vävnader under (en) biaxiell förskjutningar som är associerad med peak membran spänningarna, (b) ren skjuvning i X-riktning, (c) begränsas enaxiella förskjutning i X-riktning, (d) ren skjuvning i Y-riktning, och (e) begränsat enaxiella förskjutning i Y-riktningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 14: representativa uppgifter från de stress-avkoppling protokoll för mitral och tricuspid ventil främre broschyrer. Representativa uppgifter för (en) MVAL och (b) den TVAL, illustrerar exponentiell stress minskning över tid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Ange namn | X-axeln | Y-axeln | Sträcka (s) | Tag (s) | Återställa (s) | Resten (s) | XPreload (mN) | YPreload (mN) | Reps | Data (Hz) | Bild (Hz) | |
| FirstImage | Steg 0,0 (mN) | Steg 0,0 (mN) | 1 | 0 | 1 | 0 | 0,0 (första) | 0,0 (första) | 1 | 1 | 1 | |
| PreconditioningA | Steg F (mN) | Steg F (mN) | t | 0 | t | 0 | 0.025*F (första) | 0.025*F (första) | 8 | 15 | 0 | |
| PreconditioningB | Steg F (mN) | Steg F (mN) | t | 0 | t | 0 | Ingen | Ingen | 2 | 15 | 15 | |
| 1:1A | Steg F (mN) | Steg F (mN) | t | 0 | t | 0 | Ingen | Ingen | 10 | 15 | 0 | |
| 1:1B | Steg F (mN) | Steg F (mN) | t | 0 | t | 0 | Ingen | Ingen | 2 | 15 | 15 | |
| 0.75:1A | Steg (0.75*F) (mN) | Steg F (mN) | t | 0 | t | 0 | Ingen | Ingen | 10 | 15 | 0 | |
| 0.75:1B | Steg (0.75*F) (mN) | Steg F (mN) | t | 0 | t | 0 | Ingen | Ingen | 2 | 15 | 15 | |
| 1:0.75A | Steg F (mN) | Steg (0.75*F) (mN) | t | 0 | t | 0 | Ingen | Ingen | 10 | 15 | 0 | |
| 1:0.75B | Steg F (mN) | Steg (0.75*F) (mN) | t | 0 | t | 0 | Ingen | Ingen | 2 | 15 | 15 | |
| 0.5:1A | Steg (0.5*F) (mN) | Steg F (mN) | t | 0 | t | 0 | Ingen | Ingen | 10 | 15 | 0 | |
| 0.5:1B | Steg (0.5*F) (mN) | Steg F (mN) | t | 0 | t | 0 | Ingen | Ingen | 2 | 15 | 15 | |
| 1:0.5A | Steg F (mN) | Steg (0.5*F) (mN) | t | 0 | t | 0 | Ingen | Ingen | 10 | 15 | 0 | |
| 1:0.5B | Steg F (mN) | Steg (0.5*F) (mN) | t | 0 | t | 0 | Ingen | Ingen | 2 | 15 | 15 | |
Tabell 1: Full testa parametrar för alla protokoll Stödordningens kraft-kontrollerade tester. Krafter (i millinewtons) skrivs som F att representera den kraft som är associerad med riktade peak membran spänningen. Stretch tid är skriven som t att representera stretch tiden (i sekunder) specifika i vävnad som testas.
| X-axeln | Y-axeln | Sträcka (s) | Tag (s) | Återställa (s) | Resten (s) | XPreload (mN) | YPreload (mN) | Reps | Data (Hz) | Bild (Hz) |
| Steg 0,0 (mN) | Steg 0,0 (mN) | 1 | 0 | 1 | 0 | 0,0 (första) | 0,0 (första) | 1 | 1 | 1 |
| Ramp dx (%) | Ramp dy (%) | t | 0 | t | 0 | 0.025*F (första) | 0.025*F (första) | 10 | 15 | 0 |
| Ramp dx (%) | Ramp dy (%) | t | 0 | t | 0 | Ingen | Ingen | 2 | 15 | 15 |
| Ramp 0,0 (%) | Ramp 0,0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | Ingen | Ingen | 1 | 15 | 0 |
| Ramp dx (%) | Ramp 1 /dy (%) | t | 0 | t | 0 | Ingen | Ingen | 10 | 15 | 0 |
| Ramp dx (%) | Ramp 1 /dy (%) | t | 0 | t | 0 | Ingen | Ingen | 2 | 15 | 15 |
| Ramp 0,0 (%) | Ramp 0,0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | Ingen | Ingen | 1 | 15 | 0 |
| Ramp 1 /dx (%) | Ramp dy (%) | t | 0 | t | 0 | Ingen | Ingen | 10 | 15 | 0 |
| Ramp 1 /dx (%) | Ramp dy (%) | t | 0 | t | 0 | Ingen | Ingen | 2 | 15 | 15 |
| Ramp 0,0 (%) | Ramp 0,0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | Ingen | Ingen | 1 | 15 | 0 |
| Ramp dx (%) | Ramp 0,0 (%) | t | 0 | t | 0 | Ingen | Ingen | 10 | 15 | 0 |
| Ramp dx (%) | Ramp 0,0 (%) | t | 0 | t | 0 | Ingen | Ingen | 2 | 15 | 15 |
| Ramp 0,0 (%) | Ramp 0,0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | Ingen | Ingen | 1 | 15 | 0 |
| Ramp 0,0 (%) | Ramp dy (%) | t | 0 | t | 0 | Ingen | Ingen | 10 | 15 | 0 |
| Ramp 0,0 (%) | Ramp dy (%) | t | 0 | t | 0 | Ingen | Ingen | 2 | 15 | 15 |
Tabell 2: Full testa parametrar för alla protokoll Stödordningens deplacement-kontrollerade tester. Förskjutningar (i procent) skrivs som dx och dy att representera toppen efter prekonditionering procentandel töjning i de X - och Y-riktningarna, respektive. Stretch tid är skriven som t att representera stretch tiden (i sekunder) specifika i vävnad som testas. Förkortningar: PS = ren skjuvning; CU = begränsad enaxiella.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg för detta biaxiell mekanisk provning inkluderar (i) rätt orientering av bipacksedeln, (ii) ordentlig biaxiell testare setup för försumbar skjuvning och (iii) en noggrann tillämpning av relaterat markörerna. Orientering på bipacksedeln är avgörande för den erhållna mekaniska karakteriseringen av bipacksedel vävnad som materialet är Anisotrop i naturen. De radiella och perifera riktningarna måste därför vara känd för att korrekt rikta vävnadsprover med testning X - och Y-anvisningarna. Det är också viktigt att biaxiell testaren är riktigt kalibrerad så att preparatet är monterad till systemet med försumbar skjuvspänningen infördes. Om en icke försumbar mängd skeva observeras, kan resultaten vara kraftigt sned i efterföljande vävnad stam och hållfasthetsberäkningar. Särskild uppmärksamhet krävs att tillämpningen av de fyra relaterat markörerna att säkerställa att ingen av markörerna hålla sig till de andra att undvika felaktiga beräkningar av vävnad stammar. När det gäller beräkningarna av vävnad stam hänvisas intresserade läsare till förfarandena som beskrivs i föregående studier2,23,25.
Vissa ändringar som kan göras till de nuvarande protokoll omfatta tillägger stam-rate och krypa tester för att testa ramen. Dessa tester tillåter inblick i olika viskoelastiska egenskaperna aorta hjärtat ventil (AHV) bipacksedel, men det har visat i tidigare litteratur att stam-rate och krypning är obetydlig för hjärtat ventilen bipacksedel vävnader under fysiologiskt fungerande villkor.
Begränsningar av denna metod inkluderar potentialen för skjuvning introduktion i fall av felaktig planar anpassning av preparatet och fastnat relaterat markörer som ogiltigförklarar data som ovan nämnda. Andra begränsningar av denna metod är användningen av pinnarna för preparatet montering, som preparatet styrs endast av fem punkter på varje kant, i stället för en full fastspänning kontroll preparatet kanter. Användning av fingrarna över fastspänning metoder orsakar problem med enaxiella testprotokoll så att pinnarna får tillåta små deformationer trots förskjutningen av tine-slutet ansluten till biaxiell testa systemet konstanta. Denna deformation från enskilda tine rörelse kan dock förutsättas försumbar.
Denna metod är betydande i dess fördelar jämfört med andra metoder eftersom alla testprotokoll (kraft-kontrollerade, deplacement kontrollerade och stress-avkoppling) utförs i ett enhetligt vävnad exemplar. Alternativ till metoden som presenteras kan endast utföra ett test protokoll för varje vävnad, snarare än tre kombinerade testprotokoll. Detta innebär att dessa alternativ inte kanske är så exakt i sin beskrivning av vävnad beteenden, eftersom vävnad egenskaper kan avsevärt varierar mellan vävnader från olika animaliska ämnen.
Denna metod kan förlängas genom ansökan till andra material förutom atrioventrikulärt hjärtat ventilen broschyrer. Exempelvis kan dessa metoder vara användbar i kännetecknar andra mjuka vävnader, eller polymerer/gummi-material. Den medföljande skulle i stödordningen för fullständig karakterisering av något sådant material som är kompatibel med en biaxiell provanordningen, förutsatt att det finns en lämplig installation, som en belastning-cell lämplig kapacitet och preparatstorleken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av den amerikanska hjärtat Association vetenskapsman utveckling Grant 16SDG27760143. Författarna vill också erkänna den Mentor Research Fellowship från University of Oklahoma's Office of Undergraduate Research för att stödja både Colton Ross och Devin Laurence.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formalin Solution, Neutral Bufffered | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| 40X-2500X LED Lab Trinocular Compound Microscope | AmScope | SKU: T120C | |
| BioTester - Biaxial Tester | CellScale Biomaterials Testing | 1.5N Load Cell Capacity | |
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD | Version 1.8.0_112 | |
| LabJoy | CellScale Biomaterials Testing | Version 10.66 | |
| MATLAB | MathWorks | Version 2018b | |
| Phosphate-Buffered Saline | n/a | Recipe for 1L 1X PBS Solution: 8.0g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24g KH2PO4 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) | VWR International | H3515541105024 | Razord blades for tissue retrieval and preparation procedures |
References
- May-Newman, K., Yin, F. Biaxial mechanical behavior of excised porcine mitral valve leaflets. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 269 (4), H1319-H1327 (1995).
- Billiar, K., Sacks, M. A method to quantify the fiber kinematics of planar tissues under biaxial stretch. Journal of Biomechanics. 30 (7), 753-756 (1997).
- Grashow, J. S., Sacks, M. S., Liao, J., Yoganathan, A. P. Planar Biaxial Creep and Stress Relaxation of the Mitral Valve Anterior Leaflet. Annals of Biomedical Engineering. 34 (10), 1509-1518 (2006).
- Humphrey, J. D., Vawter, D. L., Vito, R. P. Quantification of strains in biaxially tested soft tissues. Journal of Biomechanics. 20 (1), 59-65 (1987).
- Sacks, M. A method for planar biaxial mechanical testing that includes in-plane shear. Journal of Biomechanical Engineering. 121 (5), 551-555 (1999).
- Sacks, M., Chuong, C. Biaxial mechanical properties of passive right ventricular free wall myocardium. Journal of Biomechanical Engineering. 115 (2), 202-205 (1993).
- Stella, J. A., Sacks, M. S. On the biaxial mechanical properties of the layers of the aortic valve leaflet. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (5), 757-766 (2007).
- Lanir, Y., Fung, Y. Two-dimensional mechanical properties of rabbit skin-II. Experimental results. Journal of Biomechanics. 7 (2), 171-182 (1974).
- Sun, W., Sacks, M. S., Sellaro, T. L., Slaughter, W. S., Scott, M. J. Biaxial mechanical response of bioprosthetic heart valve biomaterials to high in-plane shear. Journal of Biomechanical Engineering. 125 (3), 372-380 (2003).
- Sommer, G., Regitnig, P., Költringer, L., Holzapfel, G. A. Biaxial mechanical properties of intact and layer-dissected human carotid arteries at physiological and supraphysiological loadings. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (3), H898-H912 (2009).
- Tong, J., Cohnert, T., Regitnig, P., Holzapfel, G. A. Effects of age on the elastic properties of the intraluminal thrombus and the thrombus-covered wall in abdominal aortic aneurysms: biaxial extension behaviour and material modelling. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 (2), 207-219 (2011).
- Billiar, K. L., Sacks, M. S. Biaxial mechanical properties of the natural and glutaraldehyde treated aortic valve cusp-Part I: Experimental results. Transactions-American Society of Mechanical Engineers Journal of Biomechanical Engineering. 122 (1), 23-30 (2000).
- Jett, S., et al. Biaxial mechanical data of porcine atrioventricular valve leaflets. Data in Brief. 21, 358-363 (2018).
- Pham, T., Sun, W. Material properties of aged human mitral valve leaflets. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (8), 2692-2703 (2014).
- Pierlot, C. M., Moeller, A. D., Lee, J. M., Wells, S. M. Biaxial creep resistance and structural remodeling of the aortic and mitral valves in pregnancy. Annals of Biomedical Engineering. 43 (8), 1772-1785 (2015).
- Potter, S., et al. A Novel Small-Specimen Planar Biaxial Testing System With Full In-Plane Deformation Control. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (5), 051001 (2018).
- Khoiy, K. A., Amini, R. On the biaxial mechanical response of porcine tricuspid valve leaflets. Journal of Biomechanical Engineering. 138 (10), 104504 (2016).
- Grashow, J. S., Yoganathan, A. P., Sacks, M. S. Biaixal stress-stretch behavior of the mitral valve anterior leaflet at physiologic strain rates. Annals of Biomedical Engineering. 34 (2), 315-325 (2006).
- Huang, H. -Y. S., Lu, J. Biaxial mechanical properties of bovine jugular venous valve leaflet tissues. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. , 1-13 (2017).
- Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet. Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).
- Sacks, M. S., David Merryman, W., Schmidt, D. W. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. Heart valve function: a biomechanical perspective. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).
- Jett, S., et al. An investigation of the anisotropic mechanical properties and anatomical structure of porcine atrioventricular heart valves. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 87, 155-171 (2018).
- Ruifrok, A. C., Johnston, D. A. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 23 (4), 291-299 (2001).
- Sacks, M. S. Biaxial mechanical evaluation of planar biological materials. Journal of Elasticity. 61 (1), 199 (2000).
