Preparazione di Gushukang (GSK) Granuli per in vivo e in vitro
Summary
Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per la preparazione di una soluzione di lavoro di granuli di Gushukang per studi sugli animali e granulo GSK contenenti siero per esperimenti in vitro. Questo protocollo può essere applicato alle indagini farmacologiche di farmaci a base di erbe, nonché alle prescrizioni sia per esperimenti in vivo che in vitro.
Abstract
La medicina tradizionale cinese a base di erbe svolge un ruolo come metodo alternativo nel trattamento di molte malattie, come l’osteoporosi postmenopausale (POP). I granuli di Gushukang (GSK), una prescrizione commercializzata in Cina, hanno effetti ossei-protettivi nel trattamento del POP. Prima della somministrazione al corpo, una procedura di preparazione standard è comunemente necessaria, che mira a promuovere il rilascio di costituenti attivi da erbe crude e migliorare gli effetti farmacologici così come gli esiti terapeutici. Questo studio propone un protocollo dettagliato per l’utilizzo di granuli GSK in vivo e in analisi sperimentali in vitro. Gli autori forniscono innanzitutto un protocollo dettagliato per calcolare i dosaggi adatti agli animali dei granuli per l’indagine in vivo: pesatura, dissoluzione, stoccaggio e somministrazione. In secondo luogo, questo articolo descrive i protocolli per la scansione micro-CT e la misurazione dei parametri ossei. Sono stati valutati i protocolli per l’esecuzione della macchina micro-CT e la quantificazione dei parametri ossei. In terzo luogo, vengono preparati granuli GSK contenenti siero e il siero contenente farmaci viene estratto per l’osteoclastogenesi in vitro e l’osteoblastogenesi. I granuli GSK sono stati somministrati intragastricamente due volte al giorno ai ratti per tre giorni consecutivi. Il sangue è stato poi raccolto, centrifugo, inattivato e filtrato. Infine, il siero è stato diluito e utilizzato per eseguire l’osteoclastogenesi e l’osteoblastogenesi. Il protocollo qui descritto può essere considerato un riferimento per le indagini farmacologiche di farmaci a base di erbe, come i granuli.
Introduction
La medicina tradizionale cinese (TCM) è uno degli importanti approcci complementari e alternativi per il trattamento dell’osteoporosi1,2. Il decotto d’acqua è la forma di base e più comunemente utilizzata della formula3. Tuttavia, esistono anche inconvenienti: cattivo gusto, disagio per il trasporto, breve durata di conservazione e protocolli incoerenti, limitando gli usi così come gli effetti curativi. Per evitare gli svantaggi di cui sopra e per perseguire effetti migliori, granuli sono stati sviluppati e sono stati ampiamente utilizzati4. Anche se molti studi hanno esplorato i meccanismi farmacologici di uno o più componenti efficaci dai granuli5,6,7, i meccanismi esatti e i processi farmacologici sottostanti sono ancora difficile da identificare. Questo perché troppi componenti efficaci da un granulo possono contemporaneamente esercitare effetti simili o opposti4. Pertanto, lo sviluppo di un protocollo standard per preparare i granuli prima di consegnare al corpo non solo avrebbe un grande impatto sugli esiti terapeutici, ma è richiesto anche per i saggi in vivo e in vitro.
Inoltre, gli effetti curativi dei granuli in clinica sono difficili da confermare ed identificare esattamente utilizzando studi in vitro o ex vivo, il che crea una sfida perché i meccanismi farmacologici sono troppo complessi. Per risolvere questo problema, la preparazione del siero contenente farmaci è stata proposta per la prima volta da Tashino neglianni ’80 8. Da allora in poi, numerosi ricercatori hanno applicato il siero contenente farmaci alla medicina a base di erbe, compresi i granuli9,10,11. Attualmente, la scelta del siero contenente di farmaci per le indagini in vitro è considerata come una strategia che imita da vicino le condizioni fisiologiche.
I granuli di Gushukang (GSK) sono stati sviluppati per trattare l’osteoporosi postmenopausale (POP) basata sulla pratica clinica alla luce della teoria della MTC. I granuli GSK prevengono la perdita ossea nei topi ovariati (OVX) in vivo, inibiscono il riorspo osseo osteoclasta e stimolano la formazione ossea osteoblastica4. Di conseguenza, Li et al.12 ha scoperto che i granuli GSK hanno effetti protettivi ossei nei topi OVX migliorando le attività del recettore del calcio per stimolare la formazione ossea. Per confermare gli effetti ossei-protettivi e gli effetti farmacologici dei granuli GSK, gli autori qui forniscono una procedura dettagliata per la preparazione di soluzioni di lavoro e siero contenente farmaci (granulo GSK). Inoltre, questo articolo descrive l’applicazione dei granuli GSK in un modello di topo osteoporotico indotta da OVX e nel siero contenente granulo GSK per l’osteoclastogenesi in vitro/osteoblastogenesi.
I granuli GSK sono composti da diverse erbe13,14 e possono essere completamente disciolti in salina facilmente. Pertanto, salina serve come veicolo. I topi a sham (Sham) e OVX sono stati somministrati lo stesso volume di salina dei topi somministrati al granulo. Le dosi equivalenti di granuli GSK per il topo sono state calcolate in base all’equazione Meeh-Rubner15. Questa equazione non solo ha il vantaggio di ottenere dosaggi sicuri, ma garantisce anche effetti farmacologici15. I tre dosaggi di granuli GSK sono stati generati come segue: (1) GSKL: OVX – granuli GSK a basso dosaggio, 2 g/kg/giorno. (2) GSKM: OVX – granuli GSK a media dose, 4 g/kg/giorno. (3) GSKH: OVX – granuli GSK ad alta dose, 8 g/kg/giorno. I topi dei gruppi GSKL, GSKM e GSKH sono stati somministrati intragastricamente i granuli GSK. Il carbonato di calcio di calcio (600 mg/compressa) con vitamina D3 (125 unità/compressa internazionale), ad esempio, in un prodotto maturo e commercializzato (ad esempio, Caltrate [CAL]) per il trattamento e la prevenzione dell’osteoporosi, è stato utilizzato come controllo positivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
I granuli degli agenti MTC sono diventati una delle scelte comuni per formulazioni o prescrizioni. Granuli GSK sono composti da diversi farmaci a base di erbe basati su esperienze cliniche o la teoria TCM, ed esercitano migliori effetti curativi con meno effetti collaterali4. Rispetto al decotto dell’acqua, i granuli hanno questi vantaggi: buon gusto, convenienza di consegna, stoccaggio a lungo termine, protocollo standard ed effetti curativi coerenti, nonché una maggiore produttività. Attualmen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (81804116, 81673991, 81770107, 81603643 e 81330085), il programma per il Team Innovativo, Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ), il programma per il Team Innovativo, Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ), il programma per il Team Innovativo, Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ), il programma per il Team Innovativo, il Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ), il programma per il Team Innovativo, il Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ), il programma per il Team Innovativo, il Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ), il programma per il Team Innovativo, il Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ Team innovativo, Ministero dell’Educazione della Cina (Da IRT1270 a WYJ), Shanghai TCM Medical Center of Chronic Disease (2017-01010 a WYJ), Tripyears Action to Accelerate the Development of Traditional Chinese Medicine Plan (Y(2018-2020)-CCCX-3003 to WYJ), e progetti chiave per lo sviluppo della ricerca (2018YFC1704302).
Materials
| α-MEM | Hyclone laboratories |
SH30265.018 | For cell culture |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G5422 | Osteoblastogenesis |
| Caltrate (CAL) | Wyeth | L96625 | Animal interventation |
| C57BL/6 mice | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Ainimal preparation |
| Dexamethsome | Sigma | D4902 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2438 | Cell frozen |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Sangon Biotech | 60-00-4 | Samples treatmnet |
| Fetal bovine serum | Gibco | FL-24562 | For cell culture |
| Gushukang granules | kangcheng companyin china | Z20003255 | Herbal prescription |
| Light microscope | Olympus BX50 | Olympus BX50 | Images for osteoclastogenesis |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate | Sigma | A8960-5G | Osteoblastogenesis |
| Microscope | Leica | DMI300B | Osteocast and osteoblast imagine |
| M-CSF | Peprotech | AF-300-25-10 | Osteoclastogenesis |
| Μicro-CT | Scanco Medical AG |
μCT80 radiograph microtomograph | Bone Structural analsysis |
| RANKL | Peprotech | 11682-HNCHF | Osteoclastogenesis |
| Sprague Dawley | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Blood serum collection |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | TRAP staining |
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