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Medicine

Preparazione di Gushukang (GSK) Granuli per in vivo e in vitro

Published: May 9, 2019 doi: 10.3791/59171
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education, 4School of Rehabilitation Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

Summary

Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per la preparazione di una soluzione di lavoro di granuli di Gushukang per studi sugli animali e granulo GSK contenenti siero per esperimenti in vitro. Questo protocollo può essere applicato alle indagini farmacologiche di farmaci a base di erbe, nonché alle prescrizioni sia per esperimenti in vivo che in vitro.

Abstract

La medicina tradizionale cinese a base di erbe svolge un ruolo come metodo alternativo nel trattamento di molte malattie, come l'osteoporosi postmenopausale (POP). I granuli di Gushukang (GSK), una prescrizione commercializzata in Cina, hanno effetti ossei-protettivi nel trattamento del POP. Prima della somministrazione al corpo, una procedura di preparazione standard è comunemente necessaria, che mira a promuovere il rilascio di costituenti attivi da erbe crude e migliorare gli effetti farmacologici così come gli esiti terapeutici. Questo studio propone un protocollo dettagliato per l'utilizzo di granuli GSK in vivo e in analisi sperimentali in vitro. Gli autori forniscono innanzitutto un protocollo dettagliato per calcolare i dosaggi adatti agli animali dei granuli per l'indagine in vivo: pesatura, dissoluzione, stoccaggio e somministrazione. In secondo luogo, questo articolo descrive i protocolli per la scansione micro-CT e la misurazione dei parametri ossei. Sono stati valutati i protocolli per l'esecuzione della macchina micro-CT e la quantificazione dei parametri ossei. In terzo luogo, vengono preparati granuli GSK contenenti siero e il siero contenente farmaci viene estratto per l'osteoclastogenesi in vitro e l'osteoblastogenesi. I granuli GSK sono stati somministrati intragastricamente due volte al giorno ai ratti per tre giorni consecutivi. Il sangue è stato poi raccolto, centrifugo, inattivato e filtrato. Infine, il siero è stato diluito e utilizzato per eseguire l'osteoclastogenesi e l'osteoblastogenesi. Il protocollo qui descritto può essere considerato un riferimento per le indagini farmacologiche di farmaci a base di erbe, come i granuli.

Introduction

La medicina tradizionale cinese (TCM) è uno degli importanti approcci complementari e alternativi per il trattamento dell'osteoporosi1,2. Il decotto d'acqua è la forma di base e più comunemente utilizzata della formula3. Tuttavia, esistono anche inconvenienti: cattivo gusto, disagio per il trasporto, breve durata di conservazione e protocolli incoerenti, limitando gli usi così come gli effetti curativi. Per evitare gli svantaggi di cui sopra e per perseguire effetti migliori, granuli sono stati sviluppati e sono stati ampiamente utilizzati4. Anche se molti studi hanno esplorato i meccanismi farmacologici di uno o più componenti efficaci dai granuli5,6,7, i meccanismi esatti e i processi farmacologici sottostanti sono ancora difficile da identificare. Questo perché troppi componenti efficaci da un granulo possono contemporaneamente esercitare effetti simili o opposti4. Pertanto, lo sviluppo di un protocollo standard per preparare i granuli prima di consegnare al corpo non solo avrebbe un grande impatto sugli esiti terapeutici, ma è richiesto anche per i saggi in vivo e in vitro.

Inoltre, gli effetti curativi dei granuli in clinica sono difficili da confermare ed identificare esattamente utilizzando studi in vitro o ex vivo, il che crea una sfida perché i meccanismi farmacologici sono troppo complessi. Per risolvere questo problema, la preparazione del siero contenente farmaci è stata proposta per la prima volta da Tashino neglianni '80 8. Da allora in poi, numerosi ricercatori hanno applicato il siero contenente farmaci alla medicina a base di erbe, compresi i granuli9,10,11. Attualmente, la scelta del siero contenente di farmaci per le indagini in vitro è considerata come una strategia che imita da vicino le condizioni fisiologiche.

I granuli di Gushukang (GSK) sono stati sviluppati per trattare l'osteoporosi postmenopausale (POP) basata sulla pratica clinica alla luce della teoria della MTC. I granuli GSK prevengono la perdita ossea nei topi ovariati (OVX) in vivo, inibiscono il riorspo osseo osteoclasta e stimolano la formazione ossea osteoblastica4. Di conseguenza, Li et al.12 ha scoperto che i granuli GSK hanno effetti protettivi ossei nei topi OVX migliorando le attività del recettore del calcio per stimolare la formazione ossea. Per confermare gli effetti ossei-protettivi e gli effetti farmacologici dei granuli GSK, gli autori qui forniscono una procedura dettagliata per la preparazione di soluzioni di lavoro e siero contenente farmaci (granulo GSK). Inoltre, questo articolo descrive l'applicazione dei granuli GSK in un modello di topo osteoporotico indotta da OVX e nel siero contenente granulo GSK per l'osteoclastogenesi in vitro/osteoblastogenesi.

I granuli GSK sono composti da diverse erbe13,14 e possono essere completamente disciolti in salina facilmente. Pertanto, salina serve come veicolo. I topi a sham (Sham) e OVX sono stati somministrati lo stesso volume di salina dei topi somministrati al granulo. Le dosi equivalenti di granuli GSK per il topo sono state calcolate in base all'equazione Meeh-Rubner15. Questa equazione non solo ha il vantaggio di ottenere dosaggi sicuri, ma garantisce anche effetti farmacologici15. I tre dosaggi di granuli GSK sono stati generati come segue: (1) GSKL: OVX - granuli GSK a basso dosaggio, 2 g/kg/giorno. (2) GSKM: OVX - granuli GSK a media dose, 4 g/kg/giorno. (3) GSKH: OVX - granuli GSK ad alta dose, 8 g/kg/giorno. I topi dei gruppi GSKL, GSKM e GSKH sono stati somministrati intragastricamente i granuli GSK. Il carbonato di calcio di calcio (600 mg/compressa) con vitamina D3 (125 unità/compressa internazionale), ad esempio, in un prodotto maturo e commercializzato (ad esempio, Caltrate [CAL]) per il trattamento e la prevenzione dell'osteoporosi, è stato utilizzato come controllo positivo.

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Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite con l'approvazione di Institutional Animal Care and Use Committee della Shanghai University of TCM (S -Y201604005).

1. Preparazione e somministrazione della soluzione di lavoro GSK

  1. Calcolare le dosi equivalenti di granuli GSK per il mouse.
    1. Calcolare la superficie del corpo in base all'equazione Meeh-Rubner15: superficie del corpo - K x (peso corporeo2/3)/1000, dove i valori K sono 10.6 per umano e 9.1 per il mouse. Supponendo un peso corporeo umano di 70 kg, quindi superficie corporea umana (m2) - 10,6 x (70 2/3)/1000 x 1,8 m2. Supponendo un peso corporeo del mouse di 20 g (0,02 kg; ad esempio, 1 mese, femmina, C57/BL6), quindi la superficie del corpo del mouse (m2) - 9,1 x (0,022/3)/1000 - 0,0067 m2.
    2. In base alla superficie del corpo calcolata, calcolare il rapporto di trasformazione del corpo per l'uomo e il mouse. Umano: 70 kg/1,8 m2 x 39. Mouse: 0,02 kg/0,0067 m2 Granulo GSK 20 g/70 kg x 39/3 , 3,72 g/kg , 4 g/kg.
    3. Sulla base di un peso corporeo di 20 g per topo, calcolare il dosaggio equivalente per il mouse: 4 g/kg x 0,02 kg e 0,08 g.
    4. Calcolare tre dosi equivalenti di granuli GSK basati su 20 topi per gruppo e un intervento della durata di 3 mesi (90 giorni): (1) GSKL (OVX - granuli GSK a basso dosaggio [2 g/kg/giorno]): 0,04 g di topi al giorno x 20 mouse x 90 giorni x 72 g. (2) GSKM (OVX - medio dose GSK granules [4 g/g/g/4g/g/g/g/granules/4 g/g/g/4g/g/g/g/g/g/m./ giorno]): 0,08 g di mouse/giorno x 20 topi x 90 giorni : 144 g. (3) GSKH (OVX : granuli GSK ad alta dose [8 g/kg/giorno]): 0,12 g di mouse/giorno x 20 topi x 90 giorni
      NOTA: Preparare un ulteriore 20% di granuli GSK in pratica per compensare la perdita.
  2. Calcolare il volume del granulo GSK per mouse in base al peso corporeo15: ad esempio, il volume (V) - 0,24 mL/mouse/giorno.
    NOTA: Il volume per la somministrazione intragastrica per il mouse è di 0,12 mL/10 g.
  3. Pesare 10 giorni di tre dosi di granuli GSK. Pesare 8 g, 16 g, e 24 g di granuli GSK e servire come GSKL, GSKM, e GSKH, rispettivamente.
  4. Calcolare la dose equivalente di carbonato di calcio con vitamina D3 (CAL) per il topo in base all'equazione Meeh-Rubner15 come nei passaggi 1.1.1 e 1.1.2: dosaggio CAL : 2 compresse/70 kg x 39/3 - 0,372 compresse kg , 0,4 compresse/kg.
  5. Sulla base di un peso corporeo di 20 g per mouse (ad esempio, 1 mese, femmina, C57/BL6), calcolare il dosaggio equivalente di CAL per mouse: 0,4 compresse/kg x 0,02 kg x 0,008 compresse. Calcolare quindi la dose equivalente di CAL in base a 20 mouse per gruppo e un intervento della durata di 3 mesi (90 giorni): 0,008 compresse x 20 x 90 x 14,4 compresse. Pesa 10 giorni di CAL (1,6 compresse).
  6. Dissoluzione
    1. Mettere 8 g di granuli GSK in un tubo da 50 mL. Aggiungere 48 mL di salina e agitare il tubo per sciogliere completamente.
      NOTA: lo standard per la dissoluzione completa è l'assenza di sedimenti. La dissoluzione completa può essere ulteriormente confermata se un ago gavage può elaborare la soluzione di lavoro e poi espellerla senza intoppi.
    2. Ripetere il passaggio 1.5.1 con 16 g e 24 g di granuli GSK.
    3. Mettere 1,6 compresse (10 giorni) di CAL in un tubo da 50 mL. Aggiungere 48 mL di salina e agitare il tubo per sciogliere completamente.
      NOTA: Le soluzioni di lavoro possono essere conservate a -4 gradi centigradi e preparate ogni 10 giorni.
  7. Somministrazione intragastrica
    1. Afferrare la parte posteriore del mouse (1 mese, femmina, C57/BL6) con il mouse rivolto in avanti e assicurarsi che rimanga saldamente in quella posizione. Mantenere il mouse calmo per 2/3 min prima della somministrazione.
      NOTA: Assicurarsi che il ricercatore può vedere chiaramente la parte anteriore del mouse. Indossare guanti per prevenire i morsi di topo, in particolare per i nuovi ricercatori.
    2. Posizionare l'ago gavage (dimensioni: #12, 40 mm) nella soluzione di lavoro dei granuli GSK e disegnare 0,24 mL della soluzione di lavoro.
    3. Mettere l'ago gavage nel mouse attraverso un lato della bocca fino a quando l'ago gavage raggiunge lo stomaco.
      NOTA: Per confermare che l'ago gavage ha raggiunto lo stomaco: (1) L'ago di gavage incontra la sensazione di resistenza. Nel frattempo, il topo mostra l'azione di deglutizione prima che l'ago della gavage passi il restringimento fisico dell'esofago. (2) Iniettare circa 0,5 mL della soluzione di lavoro nel mouse e attendere 1 min. Se non c'è soluzione che escono dal mouse, questo significa che l'ago gavage ha raggiunto lo stomaco.
    4. Iniettare la soluzione di lavoro del granulo GSK (0,24 mL/mouse) nello stomaco e quindi estrarre l'ago di gavage. Riportare il topo nella sua gabbia.
    5. Ripetere il passaggio 1.6.4 con la soluzione CAL e inserire 0,24 mL della soluzione CAL per mouse.
      NOTA: il volume della soluzione CAL viene calcolato come nel passaggio 1.2.

2. Scansione micro-CT

  1. T ibia raccolta e preparazione
    1. Anestesizzare inmodo il topo con 300 mL/100 g di 80 mg/kg di ketamina il giorno successivo all'intervento di 90 giorni. Utilizzare un pizzico di ago delle dita dei dei pipi'per confermare se il mouse è completamente anetizzato. Nessuna risposta indica che l'anestesia di successo. Quindi uccidere il topo con lussazione cervicale.
    2. Fissare il mouse con le braccia e le gambe su schiuma con tacche.
    3. Tagliare la pelle con forbici (dimensioni: 8,5 cm) e pinzette (dimensioni: 10 cm) delle gambe dal proximal all'estremità dissalare e poi raccogliere le tibie.
    4. Mettere immediatamente le tibie nel 70% di alcool etilico e lavare per 3 volte.
  2. Avvolgere la tibia sinistra del mouse con schiuma di spugna e metterla in un tubo campione (35 mm di diametro, 140 mm di lunghezza).
    NOTA: L'asse lungo del campione deve essere insieme a quello del tubo campione. Assicurarsi che l'estremità prossimale dei punti tibia verso l'alto.
  3. Esecuzione della macchina di scansione micro-CT 80
    1. Avviare la macchina di scansione micro-CT 80 a temperatura ambiente.
    2. Impostare il tubo campione in micro-CT 80 e avviare la scansione trasversale con i seguenti parametri di scansione: dimensione in pixel 15,6 m, tensione del tubo 55 kV, corrente del tubo 72 A, tempo di integrazione 200 ms, risoluzione spaziale 15,6 m, risoluzione pixel 15,6 m e matrice dell'immagine 2048 x 2048.
      NOTA: l'osso cancellosi si distingue dall'osso corticale mediante la pre-scansione. L'area di scansione della tibia è definita come l'area ossea annullata da 5 mm sotto l'altopiano tibiale fino all'estremità distale.
  4. Quantificazione del parametro osseo
    1. Dopo aver completato la scansione trasversale, ottenere le immagini dei tibi di sinistra.
    2. Impostare la soglia di densità su 245-1000. Utilizzare il programma di valutazione micro-CT V6.6 per misurare i seguenti parametri ossei: densità minerale ossea (BMD), volume osseo su volume totale (BV/TV), numero osseo trabecolare (Tb.N), spessore osseo trabecolare (Tb.Th), nonché separazione ossea trasbecolare ( Tb.Sp).

3. Preparazione del siero del sangue per esperimenti in vitro

  1. calcolo
    1. Sulla base di un peso corporeo del ratto di 0,2 kg (1 mese, femmina, Sprague-Dawley), calcolare il dosaggio del granulo GSK: dosaggio umano/giorno x peso corporeo del peso umano x K/peso corporeo del ratto - 20 g/70 kg/giorno x 70 kg x K (K x 0,018) /0,2 kg - 2 g/kg/giorno.
      NOTA: K è il coefficiente di trasformazione farmacologica tra umano e tono15 (K - 0,018).
    2. Ripetere il passaggio 3.1.1 e calcolare i seguenti dosaggi.
      1. Calcolare il dosaggio di GSKL: 10 g/70 kg/giorno x 70 kg x K/0,2 kg x 1 g/kg/giorno.
      2. Calcolare il dosaggio di GSKM: 20 g/70 kg/giorno x 70 kg x K/0,2 kg - 2 g/kg/giorno.
      3. Calcolare il dosaggio di GSKL: 40 g/70 kg/giorno x 70 kg x K/0,2 kg : 4 g/kg/giorno.
      4. Calcolare il dosaggio di CAL: 2 compresse /70 kg/giorno x 70 kg x K/0,2 kg : 0,2 compresse/kg/giorno.
    3. Calcolare il dosaggio totale di granulo GSK e CAL.
      1. Calcolare il dosaggio totale per GSKL: 1 g/kg/giorno x 0,2 kg x 6 ratti x 3 giorni x 3,6 g.
      2. Calcolare il dosaggio totale per GSKM: 2 g/kg/giorno x 0,2 kg x 6 ratti x 3 giorni x 7,2 g.
      3. Calcolare il dosaggio totale per GSKH: 4 g/kg/giorno x 0,2 kg x 6 ratti x 3 giorni x 14,4 g.
      4. Calcolare il dosaggio del CAL: 0,2 compresse/kg/giorno x 0,2 kg x 6 ratti x 3 giorni , 0,72 compresse.
        NOTA: è necessario un totale di 10 mL di siero contenente granuli GSK per preparare un supporto di coltura di 100 mL (20% siero contenente granulo GSK). Ogni ratto (6 ratti/gruppo) dovrebbe fornire 1,5 mL di siero contenente granuli GSK dopo la centrifugazione.
    4. Calcolare il volume dei granuli GSK applicati per ratto in base al peso corporeo15: ad esempio, volume (V) - 2 mL/ratto/giorno.
      NOTA: Il volume per la somministrazione intragastrica per il ratto è di 0,1 mL/10 g.
  2. Pesare 3 giorni di tre dosi di granuli GSK. Pesare 3,6 g, 7,2 g, e 14,4 g di granuli GSK e servire rispettivamente come GSKL, GSKM e GSKH. Pesare 0,72 compresse per il gruppo CAL.
  3. Mettere 7,2 g di granuli GSK in un tubo da 50 mL. Aggiungere 36 mL di salina e agitare il tubo per sciogliere completamente. Ripetere questo con 3,6 g e 14,4 g di granuli GSK.
  4. Ripetere la sezione 1.6 per la somministrazione intragastrica con 2 mL di soluzione di lavoro GSK.
    NOTA: Amministrare lo stesso volume di salina (2 mL per ratto) per preparare il siero e funge da gruppo di controllo vuoto per i saggi in vitro.
  5. Preparazione del siero contenente GSK
    1. Anestesizzare inmodo i ratti con 300 mL/100 g di 80 mg/kg di ketamina 1 h dopo l'ultima somministrazione di granuli GSK. Utilizzare un pizzico di ago delle dita dei dei pipi' per confermare se il ratto è completamente anetizzato. Nessuna risposta indica che l'anestesia di successo.
    2. Esporre l'addome sul fondo del torace dei ratti utilizzando forbici operanti dopo aver inciso la pelle e il peritoneo.
      NOTA: Lo strumento chirurgico deve essere sterilizzato ad alte temperature e pressioni elevate prima dell'uso. L'area chirurgica deve essere sterilizzata con il 70% di etanolo durante la raccolta del sangue.
    3. Rimuovere il tessuto connettivo dell'aorta addominale con carta velina per esporre chiaramente il vaso.
    4. Estrarre sangue dall'aorta addominale utilizzando una siringa da 10 mL e 22 G. Quindi rimuovere l'ago e trasferire il sangue in un tubo sterile da 15 mL. Di solito, 6-8 mL di sangue possono essere ottenuti da un ratto.
      NOTA: Ogni ratto deve essere tenuto a vivere quando preleva sangue. Un indicatore è che l'aorta addominale pulsa quando il ratto è vivo. Il ratto è morto dopo l'estrazione del sangue.
    5. Mantenere il tubo in posizione verticale a temperatura ambiente per 30-60 min fino a quando il sangue è coagulato nel tubo. Quindi centribugiare il tubo a 500-600 g per 20 min. Trasferi tutti i supernatali (siero) da un gruppo (6 ratti) a un tubo sterile da 50 mL e agitati per mescolare.
    6. Inattivare il siero incubando in un bagno d'acqua a 56 gradi centigradi per 30 min. Filtrare il siero utilizzando un filtro di siringa idrofilo di dimensioni di 0,22 m.a.m. Conservare a -80 gradi centigradi per un utilizzo a lungo termine (meno di 1 anno).
      NOTA: Il siero filtrato può essere utilizzato per l'osteoclastogenesi in vitro e l'osteoblastogenesi.
  6. domanda
    1. Osteoclastogenesi in vitro
      1. Diluire i tre dosaggi del siero contenente GSK (GSKL, GSKM, GSKH) al rapporto di 1:4 con il mezzo minimo dell'aquila contenente L-glutamine, ribonucleosides e deoxyrinucleobosides.
        NOTA: Assicurarsi che la concentrazione finale di siero contenente GSK per l'osteoclastogenesi in vitro e l'osteoblastogenesi sia del 20%.
      2. Aggiungere il siero diluito contenente GSK (200 s/pozza) dal passo 3.6.1.1 ai macrofagi del midollo osseo (BMS) da 4/6 settimane vecchio C57BL/6 topi per l'osteoclastogenesi e stimolare i BMM con macrofro centro-stimolante fattore (M-CSF, 10 ng/mL) e il recettore per il ligando di fattore nucleare-B (RANKL, 100 ng/mL) come descritto in precedenza2.
    2. Osteoblastogenesi in vitro
      1. Ripetere il passaggio 3.6.1.1.
      2. Aggiungere il siero diluito contenente GSK (2 mL/bene) alle cellule staminali mesenchymale osseo (BMSC) dai topi C57BL/6 di 4-6 settimane per generare osteoblasto come descritto in precedenza16.

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Representative Results

I risultati della scansione micro-CT hanno indicato che i topi OVX hanno mostrato una perdita ossea significativa rispetto ai topi di controllo salino (Figura 1A). L'intervento (90 giorni) dei granuli GSK ha notevolmente aumentato il BMD, in particolare nel gruppo GSKM (Figura 1B). Sono stati quantificati i parametri della struttura ossea, come BMD, BV/TV, Tb.N e Tb.Th. I trattamenti di granuli GSK hanno portato a un aumento del BMD, della BV/TV, della Tb.Th e dell'Tb.Th, ma hanno ridotto la diminuzione della Tb.Sp (Figura 1C).

La colorazione TRAP (Tartat resistant acido fosfosasi) ha mostrato un aumento del numero di osteoclasti nei topi OVX rispetto ai topi di controllo (Figura 2A). I trattamenti di granulo GSK hanno diminuito gli osteoclasti positivi al TRAP rispetto al gruppo OVX. Questi risultati sono stati confermati calcolando il rapporto tra superficie ossea trap-positiva e superficie ossea trabecolare (OC/BS%) e il rapporto tra il numero osteoclasto e l'area ossea (OCs/mm2). Questi risultati quantitativi hanno mostrato una significativa diminuzione del numero di osteoclasti nei gruppi GSK rispetto al gruppo OVX (Figura 2B,C).

Il siero contenente granulo GSK è stato somministrato ai macrofagi del midollo osseo (BMM) dai topi C57BL/6 di 4-6 settimane per generare osteoclasti e il numero di osteoclasti è stato analizzato dalla colorazione TRAP. I risultati hanno mostrato che il siero contenente granuli GSK riduceva il numero di osteoclasti trap positivi nei gruppi GSK rispetto al gruppo di controllo (Figura 3A, B).

La colorazione alfoline fosfoculosi (ALP) ha mostrato che il siero medicato al granulo GSK esercitava effetti stimolatori sull'osteoblastogenesi con MSC da topi C57BL/6. La colorazione ALP ha mostrato che tutti e tre i gruppi di siero medicato al granulo GSK avevano aumentato l'attività di ALP (Figura 4A,B) rispetto al gruppo di controllo.

Figure 1
Figura 1: Il granulo GSK previene la perdita ossea nei topi indotti da OVX. (A) I topi sono stati trattati con granuli GSK per 3 mesi e sono stati raccolti tibi lasciati per eseguire l'analisi micro-CT. Sono state mostrate immagini rappresentative della ricostruzione tridimensionale (3D) dell'osso trabecolare delle tibie sinistra. La barra della scala -0,5 mm. (B) La densità minerale ossea (BMD) è stata misurata e quantificata. (C) Parametri ossei delle tibie sinistri, come il numero osseo trabecolare (Tb.N), il volume osseo rispetto al volume totale (BV/TV), lo spessore osseo trabecolare (Tb.Th) e la separazione ossea trabecolare (Tb.Sp), relativa alla struttura ossea trabecolare in tutti i gruppi sono stati mostrati. I gruppi GSKL, GSKM e GSKH sono stati confrontati con il controllo (Con; sham, saline) e con il gruppo OVX (n - 6,P < 0,05, rispetto al controllo; CAL: Calcium carbonato con vitamina D3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: i granuli GSK sopprimono il numero di osteoclasti nei topi OVX. (A) La colorazione TRAP è stata eseguita sulla vertebra lombare 3 (L3) dopo la raccolta dei topi trattati con GSK. I risultati di TRAP da controllo (sham , salina), OVX (OVX ) , CAL (OVX e Caltrate), GSKL (OVX - GSK a bassa dose GSK, 2 g/kg/giorno), GSKM (OVX - GSK a dose media, 4 g/kg/giorno) e GSKH (OVX - High dose GSK, 8 g/kg/giorno) sono stati misurati e analizzati. Barra di scala: 100 m (immagini in alto) o 50 m (immagini in basso). (B) Quantificazione della superficie ricoperta di osteoclasti sulla superficie ossea. (C) Numero Osteoclast. I valori sono stati espressi come media - errore standard della media (SEM). P < 0,05, OVX rispetto al controllo (Con); P < 0,05, i gruppi di CAL o GSKL/GSKM/GSKH rispetto al gruppo OVX. Tutti i saggi sono stati ripetuti con almeno 3 topi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Il granulo GSK medicato-siero riduce l'osteoclastogenesi dai macrofagi del midollo osseo (BMM). (A) Sono stati raccolti BMM provenienti da topi C57BL/6 (4-6 settimane) e coltivati con Sieri M-CSF (10 ng/mL) e RANKL (100 ng/mL) (controllo), M-CSF e RANKL più GSK o siero medicati CAL. L'osteoclastogenesi è stata valutata al giorno 4/6 dalla colorazione TRAP. Barra della scala: 100 m. (B) Il numero di osteoclasti è stato quantificato. P < 0,05, i gruppi di GSKL/GSKM/GSKH rispetto al controllo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Il siero medicato al granulo GSK favorisce l'osteoblastogenesi. (A) Le cellule staminali mesenchymale ossee (MSC) dei topi C57BL/6 (4-6 settimane fa) sono state isolate e trattate con siero GSK o CAL medicato. La colorazione ALP è stata eseguita al giorno 7 per valutare l'osteoblastogenesi. Barra della scala: 100 m. (B) Il numero di osteoblasti è stato quantificato. P < 0,05, i gruppi di CAL o GSKL/GSKM/GSKH rispetto al controllo. Tutti i saggi sono stati ripetuti con almeno 3 topi o 3 volte. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

I granuli degli agenti MTC sono diventati una delle scelte comuni per formulazioni o prescrizioni. Granuli GSK sono composti da diversi farmaci a base di erbe basati su esperienze cliniche o la teoria TCM, ed esercitano migliori effetti curativi con meno effetti collaterali4. Rispetto al decotto dell'acqua, i granuli hanno questi vantaggi: buon gusto, convenienza di consegna, stoccaggio a lungo termine, protocollo standard ed effetti curativi coerenti, nonché una maggiore produttività. Attualmente, i granuli sono una delle formazioni di farmacia più comunemente utilizzate in MTC. Tuttavia, i meccanismi sottostanti degli effetti farmacologici sono ancora raramente studiati. È necessario determinare i passaggi critici nella preparazione dei granuli per studiare i meccanismi farmacologici sottostanti.

Negli ultimi decenni, uno o più componenti efficaci rappresentativi da medicina a base di erbe sono stati di solito utilizzati per eseguire saggi molecolari ed esiti farmacologici a causa della loro chiarezza strutturale. Molte ricerche sono state eseguite per capire gli effetti curativi con componenti efficaci da erbe TCM5,6,7. Tuttavia, è ancora difficile imitare ciò che accadrà in un paziente a causa dell'ambiente complesso, con molti componenti efficaci che lavorano insieme. Per risolvere questo problema, le indagini con i granuli possono esplorare i processi farmacologici e sono una scelta nell'esecuzione di studi molecolari rispetto alle indagini con componenti efficaci.

La preparazione di soluzioni di lavoro per i granuli contiene quattro passaggi di base. Il primo passo è lo scioglimento. I granuli sono comunemente mescolati in salina dopo aver mescolato per completare la dissoluzione prima di ulteriori indagini. La quantità e la proprietà dei granuli influisce sul tempo e sulla stabilità dei granuli durante il processo di dissoluzione. La variazione nel tempo di dissoluzione e la stabilità dipende dalle erbe, a causa delle loro caratteristiche fisiche, chimiche e farmacologiche17. Agitazione corretta e temperatura più elevata di solito promuovono e garantiscono la completa dissoluzione dei granuli. Il passo successivo è la concentrazione. Il volume adeguato della somministrazione di gavage per gli animali è attentamente considerato ed è determinato dal volume della soluzione di lavoro. Le gavagazioni orali ad alte concentrazioni, come 10 mL/kg o più, possono portare a diversi problemi legati all'assorbimento. Lo shunting rapido della soluzione di lavoro dei granuli nel duodenum è un problema comune. Altri problemi, come la polmonite da aspirazione, a causa del reflusso passivo della soluzione di lavoro dei granuli nell'esofago, sono osservati anche18. La filtrazione è il terzo passo, che aiuta l'ago gavage a diminuire di volume e impedisce che venga intasato con granuli di erbe, così come aiuta la digestione dei granuli. Il quarto passaggio è l'archiviazione. L'immagazzinamento di soluzioni di lavoro di granuli a bassa temperatura (-20 gradi centigradi) garantisce risultati migliori.

L'approccio per calcolare la dose bioequivalente animale è importante per determinare gli effetti dei granuli nella pratica della MTC. Il peso corporeo (mg/kg) e le specie sono comunemente considerati. La superficie corporea (mg/m2) viene spesso utilizzata per eseguire il calcolo19 perché il tasso metabolico è correlato alle dimensioni del singolo animale. È buon senso considerare sia la superficie del corpo che il peso corporeo, e quindi è stata utilizzata l'equazione Meeh-Rubner, che è comune nelle indagini in vivo negli studi farmacologici19,20.

Diversi tipi di animali sono scelti per la preparazione di siero contenenti farmaci, come conigli, porcellini d'India, ratti e topi. Per le indagini in vivo, la stessa specie è preferita. I ratti sono stati selezionati perché non solo forniscono più siero rispetto ai topi, ma sono anche più vicini ai topi in termini di evoluzione rispetto ad altri animali. Si raccomanda anche la dose equivalente in vivo (ratto: 7 volte della dose equivalente) e l'uso clinico per i pazienti. Dieci volte la dose equivalente degli animali forniti dal siero non è comunemente applicata per le indagini in vivo perché le cellule o gli organi trattati possono portare a potenziali reazioni tossiche21. Metodi come l'iniezione, la somministrazione della pelle e l'inalazione sono le procedure di somministrazione comunemente utilizzate in conformità con le somministre in vivo. Nel presente studio è stata scelta la somministrazione orale mediante aghi gavage. La frequenza di somministrazione dei granuli varia da una a due volte al giorno, e il periodo di intervento è di 3-14 giorni. La raccolta finale di sangue viene di solito eseguita entro 2 h dopo l'ultima sommità22,23, quando la concentrazione di granuli nel sangue è relativamente stabile e al livello di picco secondo uno studio precedente24.

Siero contenente farmaci per saggi in vitro prima dell'uso è ancora controverso. Alcuni ricercatori sostengono che può provocare reazioni impreviste o effetti collaterali, che influenzano i risultati a causa della presenza di numerosi componenti attivi nel siero, tra cui enzimi, ormoni, anticorpi, e complementi25. Tuttavia, alcuni ricercatori sostengono l'opinione opposta che i componenti attivi potrebbero anche essere rimossi dal processo di inattivazione26. Per raggiungere una via di mezzo, il siero in questo studio è stato disattivato prima dell'incubazione in un bagno d'acqua a 56 gradi centigradi per 30 min. Inoltre, è stato incluso un gruppo di siero vuoto, in cui viene utilizzato il siero di animali trattati con salina, per escludere potenziali effetti collaterali. Pertanto, il siero contenente farmaci può servire come potenziale metodo per studiare i meccanismi farmacologici o gli esiti terapeutici.

Rispetto a metodi simili, il protocollo qui ha i seguenti vantaggi: (1) Completeness. Entrambi i metodi in vitro e in vivo sono utilizzati contemporaneamente e possono reciprocamente sostenersi a vicenda in effetti farmacologici. (2) Idoneità. Solo topi e ratti sono inclusi perché sono strettamente correlati. (3) Ripetibilità. Sia i topi che i ratti sono facilmente acquistati a basso costo, e i metodi possono essere facilmente ripetuti. (4) Basso costo. Il modello di mouse osteoporotico indotto da OVX è comunemente usato e affidabile27,28 e può essere facilmente fatto o acquistato. Pertanto, i protocolli qui sono più adatti rispetto ad altri metodi per studiare gli effetti farmacologici della medicina a base di erbe, come i granuli.

Tuttavia, ci sono diverse limitazioni ai protocolli con i granuli GSK. In primo luogo, sono stati somministrati tre dosaggi, anche se i granuli non hanno mostrato alcuna tendenza significativa dipendente dalla dose per le indagini in vivo. La ragione può essere che i dosaggi per gli studi sugli animali non sono sensibili e il tempo di intervento non è sufficientemente lungo, che richiede ulteriori test. Successivamente, è necessario un periodo di intervento più lungo per le indagini parallele in vitro. Il siero contenente un farmaco, anche se inattivato, può causare effetti collaterali dopo un intervento prolungato. In terzo luogo, per l'amministrazione animale viene utilizzato un solo volume di soluzione di lavoro, che può essere modificato in studi futuri. Infine, le specie animali scelte per la preparazione del siero tossicocontenente e delle routine amministrative possono essere modificate e saranno testate in ulteriori studi.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (81804116, 81673991, 81770107, 81603643 e 81330085), il programma per il Team Innovativo, Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ), il programma per il Team Innovativo, Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ), il programma per il Team Innovativo, Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ), il programma per il Team Innovativo, il Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ), il programma per il Team Innovativo, il Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ), il programma per il Team Innovativo, il Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ), il programma per il Team Innovativo, il Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ Team innovativo, Ministero dell'Educazione della Cina (Da IRT1270 a WYJ), Shanghai TCM Medical Center of Chronic Disease (2017-01010 a WYJ), Tripyears Action to Accelerate the Development of Traditional Chinese Medicine Plan (Y(2018-2020)-CCCX-3003 to WYJ), e progetti chiave per lo sviluppo della ricerca (2018YFC1704302).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-MEM Hyclone
laboratories		 SH30265.018 For cell culture
β-Glycerophosphate Sigma G5422 Osteoblastogenesis
Caltrate (CAL) Wyeth L96625 Animal interventation
C57BL/6 mice SLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		 Random Ainimal preparation
Dexamethsome Sigma D4902
Dimethyl sulfoxide Sigma D2438 Cell frozen
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) Sangon Biotech 60-00-4 Samples treatmnet
Fetal bovine serum Gibco FL-24562 For cell culture
Gushukang granules kangcheng companyin china Z20003255 Herbal prescription
Light microscope Olympus BX50 Olympus BX50 Images for osteoclastogenesis
L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate Sigma A8960-5G Osteoblastogenesis
Microscope Leica DMI300B Osteocast and osteoblast imagine
M-CSF Peprotech AF-300-25-10 Osteoclastogenesis
Μicro-CT Scanco
Medical AG		 μCT80 radiograph microtomograph Bone Structural analsysis
RANKL Peprotech 11682-HNCHF Osteoclastogenesis
Sprague Dawley SLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		 Random Blood serum collection
Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit Sigma-Aldrich 387A-1KT TRAP staining

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References

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Preparazione di Gushukang (GSK) Granuli per in vivo e in vitro
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Zhao, Y., Wang, Q., Liu, S., Wang, Y., Shu, B., Zhao, D. Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments. J. Vis. Exp. (147), e59171, doi:10.3791/59171 (2019).

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