Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kombinerede nukleotid og Protein ekstraktioner i Caenorhabditis elegans

Published: March 17, 2019 doi: 10.3791/59178
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Brown University

Summary

Vi præsenterer her, en protokol til isolering af RNA, DNA og protein fra den samme prøve, i et forsøg på at reducere variation, forbedre reproducerbarhed og lette fortolkninger.

Abstract

En enkelt biologisk prøve rummer et væld af oplysninger, og det er nu almindelig praksis at samtidig undersøge adskillige makromolekyler for at fange et fuldstændigt billede af de flere niveauer af molekylære forarbejdning og skifter mellem forskellige betingelser. Denne protokol præsenterer metoden isolering af DNA, RNA, og protein fra den samme prøve af fyrretræsnematoden Caenorhabditis elegans til at fjerne den variation, der er indført, når disse biomolekyler er isoleret fra replikater af ligeledes behandlet men i sidste ende forskellige prøver. Nukleinsyrer og proteiner er udvundet af fyrretræsnematoden med syre guanidinium kaliumthiocyanat-phenol-chloroform ekstraktion metode, med efterfølgende nedbør, vask og oploesning af hvert. Vi viser den succesfulde isolering af RNA, DNA og protein fra en enkelt prøve fra tre stammer af fyrretræsnematoden og HeLa celler, med bedre protein isolation resultater i voksne dyr. Derudover forbedrer guanidinium kaliumthiocyanat-phenol-chloroform-udvundet protein fra nematoder opløsningen af større proteiner, med forbedret påviselige mængder konstateret ved immunoblotting, i forhold til den traditionelle RIPA udvinding af protein.

Metoden præsenteres her er nyttigt at undersøge prøver ved hjælp af en multiomic tilgang, specielt til udforskning af proteomet og transkriptom. Teknikker, der samtidig vurderer multiomics er tiltalende, fordi molekylære signaling underliggende komplekse biologiske fænomener menes at opstå på supplerende niveauer; Det er imidlertid blevet mere og mere almindeligt at se, at ændringer i mRNA niveau ikke altid afspejler den samme ændrede Proteinniveau og at tidspunktet for indsamlingen er relevante i forbindelse med døgnrytmen forordninger. Denne metode fjerner enhver intersample variation, når boltpistoler forskellige indhold inden for den samme prøve (intrasample.)

Introduction

Multiomics, den analytiske tilgang, der bruger en kombination af omik, såsom genom, proteomet, transkriptom, epigenome, microbiome eller lipidome, er blevet stadig mere populære, når de behandler store datasæt for sygdom karakterisering1, 2. Montering beviser har vist, at begrænse tilgange til en enkelt "ome" indeholder ufuldstændige Molekylær analyse (revision af Rotroff og Motsinger-Reif1). Store datasæt er genereret, navnlig når du udfører skærme med høj overførselshastighed teknikker, men for at male et komplet billede eller til at identificere de mest relevante mål, multiomic tilgange er at foretrække. Med anvendelse af multiomics metoder, men er der hyppig observation af uoverensstemmelser mellem mRNA og protein niveauer3,4,5,6. Navnlig, er mRNA og protein bruges til side-by-side transkriptom og proteom analyser med RNA sekventering (RNAseq) og liquid chromatography-tandem massespektrometri (LC-MS/MS), henholdsvis, ofte fremstillet af tilsvarende behandlede prøver fra forskellige replikater, potentielt at indføre variation mellem de samme betingelser,3,4,5,6. Harvald et al. udførte et elegant C. elegans sult tidsforløb undersøgelse, som sammenlignede transkriptom og proteomet af wild-type (WT) orme som hlh-30 mutant orm, der mangler en vigtig transskription faktor i levetiden 7. Bemærk, RNA og protein blev høstet fra de samme betingelse replikater, altså ikke fra samme prøve. Deres resultater viser en lav korrelation mellem mRNA niveau og protein niveauer for hvert tidspunkt (r = 0.559 til 0.628). I virkeligheden, deres heatmap dannet fire klynger: klynge jeg havde et stort fald i mRNA niveauer men lidt eller intet fald i tilsvarende protein niveauer, klynge II havde lidt eller ingen stigning i mRNA niveau men en stigning i protein niveauer, klynge III havde en stigning i mRNA niveauer, men et fald i protein niveauer og klynge IV havde en stigning i mRNA niveauer, men kun en subtil ændring i protein niveauer4. Dette intersample variation kan derudover indføres i tilfælde hvor prøver af den samme betingelse ikke opkræves på nøjagtig samme tid. For eksempel, svinger mRNA og proteiner reguleret af døgnrytmen cyklus afhængigt af tidspunktet for dag8,9, eller, mere specifikt C. elegans eksponering for lys9; udtryk for disse døgnrytmen proteiner kan være forsinket op til 8 timer efter gen expression induktion10. Dog, forekomsten af denne observation betyder ikke nødvendigvis det er forkert; i virkeligheden, kan det vise sig for at være informativ. Protein og mRNA er i en konstant dynamisk tilstand mellem dannelse og nedbrydning. Derudover er proteiner ofte posttranslationally modificeret til at øge stabiliteten eller fremkalde deres nedbrydning11. For eksempel, kan deres status som ubiquitination føre til enten aktivering eller målretning til proteasom eller lysosomet for nedbrydning12. Derudover spiller noncoding RNA'er en vigtig rolle i reguleringen af genekspression på transkriptionel og posttranskriptionelle trin13. Spørgsmålet er således, hvordan man kan begrænse variablerne for at bekræfte, at de uoverensstemmelser, vi observerer i disse ødelægge undersøgelser er reelle.

Her, foreslår vi en metode, der fjerner variablen intersample af tillade analyser af forskellige makromolekyler fra samme prøve. Målet med denne protokol er at tilbyde en metode til at konsekvent isolere DNA, RNA og protein fra en enkelt prøve af C. elegans (også benævnt orme) i et forsøg på at reducere variation, forbedre reproducerbarhed og lette fortolkninger. Yderligere fordele ved at bruge den samme prøve omfatter besparelse på tid og ressourcer under prøvetagning, lette tværsnits analyse af værdifulde og begrænset prøver, herunder stammer, der er svære at dyrke og vedligeholde, og få indsigt i den differentieret regulering af makromolekyler baseret på intrasample variationer i mRNA og protein niveauer.

Denne metode er velegnet til vurdering af gene udtryk og protein niveauer fra en enkelt prøve af orme, giver mulighed for en mere omfattende evaluering af flere niveauer af molekylære behandling. Guanidinium kaliumthiocyanat-phenol-chloroform (GTCp) reagens14, et almindeligt anvendt kemikalie at isolere RNA, der bruges til udvinding af nukleinsyrer og proteiner fra orme, med efterfølgende nedbør, vask og oploesning af hvert. Denne protokol er en samling af forskellige protokoller15,16 med mindre ændringer, designet med fokus på C. elegans, men vi har også med succes isoleret RNA, proteiner, og DNA fra en pellet HeLa celler efter den samme fremgangsmåde. Men er ikke testet her, er denne protokol tilbøjelige til at arbejde på væv samt17,18.

Protocol

Bemærk: Hver makromolekyle nedbør trin udføres sekventielt, efterfulgt af vask gjort samtidigt; Det anbefales dog at fuldføre RNA isolering først da det er uløseligt ustabil.

1. prøvetagning

  1. Seed 1.000 orm æg pr. 10 cm plade med passende vækst betingelser19. Der inkuberes ved 20 ° C i 72 timer.
    Bemærk: Blegemiddel æg-bærende voksne for at indsamle æg som tidligere beskrevet19.
  2. Vaske pladen med omkring 5 mL af M9 buffer og indsamle 1.000 voksne orme ind i et rør.
    Bemærk: M9 buffer består af 35 mM natriumfosfat dibasiske, 102 mM natriumchlorid, 22 mM kalium fosfat monobasic og 1 mM magnesium sulfat i sterilt vand19.
  3. Centrifugeres orme ved 1.000 x g i 1 min, supernatanten fjernes, og overføre pelleted orme med 1 mL af M9 buffer til en 1,5 mL microcentrifuge tube.
  4. Centrifugeres igen ved 845 x g i 1 min og skille sig af med de fleste af supernatanten. Gemme pelleted ormene ved-80 ° C i mindst 4 h.
    Bemærk: Ved hjælp af en frossen pellet producerer et højere udbytte end en frisk pellet. En serie af fryse/tø cykler ved hjælp af flydende nitrogen eller 95% ethanol på tøris til knæk orm neglebånd anbefales hvis bruger en frisk pellet. Forlader en lille mængde af M9 på pellet vil hjælpe med at bryde neglebånd, når nedfrysningen.

2. nukleotid og Protein Isolation

  1. Fjern eventuelle supernatanten fra den optøede pellet og tilsættes 1 mL af kolde GTCp reagens. Bland godt af pipettering op og ned. Prøven anbringes i isbad i 10 min og bland det lejlighedsvis ved at dreje hovedet.
    Forsigtighed: Phenol er ætsende, neurotoksiske og meget giftigt og kan forårsage kemiske forbrændinger og blindhed.
    Bemærk: Vi brugte op til 5.000 voksne orme som udgangsmateriale rapporterede mængder; hvert bind er baseret på brugen af 1 mL af GTCp reagens. Når du bruger et større udsnit, kan det være nødvendigt at skalere op.
  2. Til løsning af orme og GTCp, tilføje 200 µL koldt chloroform. Hold røret mellem fingrene og rystes kraftigt for 15 s. forlade det ved stuetemperatur (RT) for 3 min.
    Forsigtighed: Chloroform er en giftig lokalirriterende, kan forårsage hud sår og andre skader, orgel-målrettet, og er et muligt karcinogen.
  3. Centrifugeres rør ved 13.500 x g i 15 min. ved 4 ° C.
    Bemærk: Tre lag er dannet efter denne spin: toppen, klar vandig fase, bunden, pink organisk fase, og de små, overskyet interfase, der indeholder lipider og DNA.
  4. Med en mikropipette, flytte den klare øverste lag (vandfasen) til en ny RNase-fri 1,5 mL microcentrifuge tube (tube A) at isolere RNA via alkohol nedbør (som beskrevet i trin 2,5) og flytte den lyserøde lag (organiske fase) fra de resterende pellet til en ny tube ( Tube B) og placere den på is.
    Bemærk: Den lyserøde organiske fase kan fryses ved-80 ° C indtil isolering af DNA og protein fra denne prøve. Større prøver vil producere en tyk hvid lag mellem den vandige og den organiske fase. Denne fraktion indeholder DNA. Hvis dette lag kan fjernes uden at forstyrre de øvrige faser, gøre det og sætte det i en separat tube (tube B2).
  5. Isolere RNA som følger.
    1. Fra klart vandfasen i rør A, udfældes RNA med 500 µL af 100% isopropanol. Der inkuberes i 10 min. ved RT. Derefter centrifugeres tube A på 13.500 x g i 10 min. ved 4 ° C.
      Bemærk: En lille hvid pellet af RNA skal være synlig i bunden af røret.
    2. Dekanteres størstedelen af supernatanten. Fjerne resten med en 1 mL sprøjte med en nål og supernatanten.
      Bemærk: Størrelsen af nålen er ikke vigtigt; dog vil en større nål gauge tilbyde mere kontrol for ikke at forstyrre pelleten. En mikropipette kan bruges, hvis nåle ikke er tilgængelige.
    3. Der tilsættes 1 mL af 75% ethanol til tube A for at vaske pelleten. Spin rør ved 5.300 x g i 5 min. ved 4 ° C.
    4. Fjern supernatanten fra pellet ved dekantering og bruge en 1 mL sprøjte med en nål, som beskrevet i trin 2.5.2, og kassér den.
    5. Lad pelleten lufttørre for 5-10 min, men lad ikke det overdry. Bruge 50 µL af RNase-fri vand til at rekonstruere pellet af RNA, før det bliver helt gennemsigtig.
      Bemærk: Dette er en passende start volumen for 1.000-3.000 orme, men det skal måske justeres afhængigt af hvor meget råvare blev brugt.
    6. Inkuber pellet ved 55-60 ° C i 10 min til at opløse den.
    7. Måling af koncentrationen og renheden bruger et spektrofotometer. Optage absorptioner på 260 nm for RNA koncentration og på 230 og 280 nm til at identificere eventuelle urenheder.
    8. Ren RNA for at fjerne eventuelle forureninger, såsom phenol rester eller DNA, enten med kolonne rensning eller med efterfølgende ethanol vasker og DNase behandling.
      Bemærk: På dette tidspunkt RNA er klar til at blive sendt til RNAseq analyse eller kan bruges til at gøre cDNA til brug for RT-qPCR (Se afsnit 3.1 for detaljer). RNA kan opbevares ved-80 ° C indtil videre anvendelse.
  6. Isolere DNA som følger.
    1. Fra den lyserøde organiske fase i rør B og prøven i tube B2, hvis nogen, udfældes DNA ved at tilføje 300 µL af 100% ethanol og mix af inversion. Forlade røret på RT for 2-3 min.
    2. Der centrifugeres rør B og B2 på 375 x g i 5 min. ved 4 ° C til pellet DNA.
    3. Flytte supernatanten fra rør B og B2 ved at hælde det i et nyt 2 mL tube (tube C) og forlade det på isen for efterfølgende protein isolation. Vask DNA pellet i rør B eller B2 med 1 mL af 0,1 M natriumcitrat i 10% ethanol for 30 min. centrifugeglas B og B2 på 375 x g i 5 min. ved 4 ° C.
      Bemærk: Natrium binder sig til DNA rygraden, at DNA bundfald lettere i natriumcitrat og ethanol, tillader urenheder fjernes ved lav hastighed centrifugering.
    4. Gentag trinnet vask, som beskrevet i trin 2.6.3. Resuspenderes i 1,5 mL 75% ethanol og forlade det på RT for 20 min, med lejlighedsvise blanding af upending.
    5. Centrifuge tube B og B2 på 375 x g i 5 min. ved 4 ° C.
    6. Supernatanten og lad det tørre i 5-10 min.
    7. Opløse pellet i 150 µL natriumhydroxidopløsning, 8 mM. Eventuelt justere til den ønskede pH med HEPES. Spin prøve på 375 x g i 5 min. ved 4 ° C.
    8. Med en mikropipette, flytte supernatanten (DNA) til en ny tube. Måle koncentrationen og bestemme den renhed, der bruger et spektrofotometer. Optage absorptioner på 260 nm for DNA koncentration og på 230 og 280 nm til at identificere eventuelle urenheder.
  7. Isolere protein som følger.
    1. For at faelde proteinet, tilføje op til 1,5 mL 100% isopropanol til pink supernatanten i tube C, mix af invertere flere gange, og der inkuberes ved RT i 10 min.
    2. Centrifugeres tube C ved 13.500 x g i 10 min. ved 4 ° C.
    3. Supernatanten og vaske pellet med 2 mL 0,3 M guanidin hydrochlorid i 95% ethanol i 20 min. på RT. centrifugeglasset C ved 5.300 x g i 5 min. ved 4 ° C.
    4. Gentag trinnet vask som beskrevet i trin 2.7.3 2 x.
    5. Flytte protein pellet til en ny 1,5 mL tube (tube C2) og tilføje op til 1,5 mL 95% ethanol. Vortex og lad det sidde på RT for 20 min.
    6. Centrifugeres tube C2 på 5.300 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten og lad pellet tørre i 10 min. ved RT. opløses pellet i 300 µL af 5% SDS ved 50 ° C til 60 min.
      Bemærk: En længere inkubationstiden kan være forpligtet til at fuldt opløses protein pellet. I fortiden, har været inkuberet pellet op til 6 h uden at ofre kvaliteten.
    7. Centrifugeres tube C2 ved 13.500 x g i 10 min. ved 17 ° C. Flytte supernatanten til en ny tube.
    8. Måle koncentrationen ved hjælp af en foretrukne protein kvantificering assay, der er kompatibel med vaskemiddel.
      Bemærk: Proteinet er klar til at blive brugt i SDS-PAGE og western blotting. Det kan opbevares ved-20 ° C til fremtidig brug. Andre teknikker, såsom LC-MS/MS, skal vaskemiddel være dialysebehandling.

3. evaluering af mRNA og Protein niveauer

  1. RT-qPCR
    1. Forbered cDNA ved reverse transkription med 1 ng af RNA, ved hjælp af følgende thermocycler-protokollen: priming (5 min ved 25 ° C), reverse transkription (20 min. ved 46 ° C), og RT inaktivering (1 min på 95 ° C).
    2. Gøre en stock plade af cDNA ved at tilføje 100 µL af 1: 100 fortyndinger af hver prøve, cDNA individuelle brønde på en 96-brønd plade. Omfatter passende kontrol, som ingen skabelon, der kun er beregnet til vand brønde og seriefremstillede fortyndede prøver fra 1:25 1: 400 (stammer med poolede cDNA fra alle prøverne analyseres) at give mulighed for en standardkurve at etablere primer effektivitet for hvert analyseret gen.
      Bemærk: Dette format kan bruges med 96-godt microdispenser, som giver mulighed for overførsel af alle prøver i en plade til en RT-qPCR plade og til afbødning af godt at nå pipettering variationer. Den passende master mix (fx SYBR + primere) kan tilføjes til hver godt derefter med en multikanalpipette. Samlet set reducerer denne fremgangsmåde fejl indført når hånd-pipettering hver prøve, hvorved yderligere variabilitet.
    3. Tilføje 3 µL cDNA fra stock pladen til wells af RT-qPCR plade.
    4. Gøre en master mix for hvert sæt primere, der omfatter 1 x supermix indeholdende et DNA-intercalating cyanine farvestof, 5 µM af frem og vende primere og vand op til 7 µL pr. prøve. Tilføje 7 µL passende brønde af en RT-qPCR plade og agitere let for at blande.
      Bemærk: Omfatte prøver for at måle husholdning gener til brug som reference til at normalisere resultater20.
    5. Køre pladen ved hjælp af en RT-qPCR-protokol, der er egnet til primere bliver brugt.
  2. Vestlige skamplet
    Bemærk: Se Lisbeth og Yang21for detaljerede oplysninger om western blotting.
    1. Forberede prøverne for SDS-PAGE ved at kombinere 20 µg protein med et lige saa stort volumen af 2 x Laemmli prøvebuffer og kog ved 95 ° C i 10 min.
    2. Indlæse prøver på en 4-15% Tris-glycin gel og køre dem på 150 V for 1 time, eller indtil farvestof foran når bunden af gelen.
    3. Overføre proteiner fra gel til en nitrocellulose membran på 25 V i 30 min. i en semidry overførsel apparater.
    4. Bekræfte den rette overførsel af farvning membranen med Ponceau S pletten.
    5. Grundigt vaske pletten fra membran med Tris-bufferet saltvand (TBS) med 0,01% Polysorbat 20 (TBS-T).
    6. Blok membran med 5% nonfat mælk i TBS-T i 1 time på RT.
    7. Inkuber membran i den primære antistof på den passende fortynding efter leverandørens anvisninger. Efterlad det på rocker ved 4 ° C natten over.
    8. Vaske membran 3 x, for 5 min hver, med TBS-T.
    9. Inkuber membran i den passende sekundær antistof på den passende fortynding efter leverandørens anvisninger. Efterlad det på Vippeknappen for 1 h på RT.
    10. Vaske membran 3 x, for 5 min hver, med TBS-T.
    11. Billede og kvantificere den vestlige skamplet, foretrukne metoder.

Representative Results

RNA, DNA og protein prøver blev analyseret, og repræsentative resultater ved hjælp af RNA og protein isolater præsenteres her. Derudover sammenligner vi protein prøven høstet ved hjælp af GTCp metoden til fælles RIPA lysis metode22. For vores eksperiment brugte vi fire uafhængige replikater af hver WT (N2) orme og to langlivede mutant orm, spise-2 og rsks-123,24.

RNA og DNA kvantitet og kvalitet

Koncentrationen af RNA når genopslemmes i 50 µL vand varierede fra 0,2 – 2 µg/µL, ved hjælp af omkring 3.000 voksne orme som råvare. Absorbans nøgletal, som angiver renhed, varierede fra 2.0 til 2,2 for A260/A280 og 1,9 til 2,5 for A260/A230 (tabel 1), der angiver den vellykket ekstraktion af RNA uden kontaminering med GTCp komponenter, såsom phenol eller guanidin hydrochlorid.

DNA-ekstraktion var vellykket, men kvaliteten var variabel. DNA koncentration når genopslemmes i 150 µL af NaOH varierede fra 0,04 til 1,1 µg/µL. Absorbansen nøgletal varierede fra 1,8 til 2.1 til A260/A280 og 0,9 til 1,6 til A260/A230 (tabel 1), der angiver den vellykket ekstraktion af DNA; men nogle af prøverne var forurenet med GTCp komponenter, ligesom phenol eller guanidin hydrochlorid. Hvis DNA isolation er nødvendigt, skal udvises forsigtighed, når adskiller det midterste lag fra GTCp faseadskillelse, og flere vasker kan være nødvendigt.

RT-qPCR valgte mål

RNA isolering fra fire uafhængige prøver af hver orm stamme var en succes og blev sendt til RNAseq analyse, med efterfølgende RT-qPCR udføres ved hjælp af en supermix indeholdende en cyanine farve. Mål analyseret af RT-qPCR blev udvalgt fra en stor RNAseq datasæt baseret på de mest varierende regulerede gener fælles i begge mutanter i forhold til WT orme. F07C4.1225, en homolog til menneskelige neuroligin 3, isoform b, var det valgte delte upregulated mål. Vi har også inkluderet et varierende reguleret gen mellem begge mutanter, mrp-126, for yderligere analyse, der var upregulated i spise-2 orme, men downregulated i rsks-1 orme. Udtrykket ændringer af mrp-1 blev bekræftet via RT-qPCR; dog blev F07C4.12 Opregulering i rsks-1 orme forudsagt af RNAseq analysen ikke set af RT-qPCR (figur 1).

Supplerende mål med antistoffer valideret for orme blev undersøgt så godt. Disse omfattede flere organelle markører karakteriseret i Hadwiger et al.27. En række af disse markører blev varierende udtrykt på mRNA niveau i de mutant orm. Som det ses i figur 1, var lmp-128 og dlg-129 upregulated i spise-2 orme; HSP-4 30, hsp-7030og lmp-1 var upregulated i rsks-1 orme; HSP-60 31 og pas-732 blev downregulated i spise-2 orme; HSP-60 og tac-133 blev downregulated i rsks-1 orme.

Samtidig vs RIPA protein forberedelse

For at bekræfte effektiviteten og kvaliteten af proteinet med metoden GTCp som beskrevet ovenfor, sammenlignet vi det med protein indsamlet ved hjælp af den mere traditionelle metode af RIPA lysis22. Ved hjælp af den samme mængde starter materiale, nemlig enten voksne kun (ca. 10.000 orme) eller en blandet population af voksne, larver og æg (omkring 130.000 orme), var den samlede mængde indsamlet med GTCp mindre, når genopslemmes i lige ende diskenheder (tabel 1 ); Men, udvinding fra en voksen-bare befolkning var mere vellykket end fra en blandet befolkning. Derudover var kvaliteten af proteinerne, der lignende, omend for GTCp udvundet protein viste en bedre opløsning på større proteiner ved lige belastning af total protein, som det fremgår af Coomassie farvning i figur 2. Faktisk, mål evalueres af vestlige skamplet i figur 3 viste lignende niveauer i de fleste tilfælde; de proteiner, der er større end 75 kDa viste imidlertid lavere niveauer i RIPA-udvundet proteinet i forhold til den GTCp-udvundet protein (figur 3A, højre vognbane; Figur 3B, gule bar).

Ekstraktion metode præsenteres her blev også vurderet i linjen pattedyr celle HeLa. For reference, mængden af protein udvundet med RIPA fra en kompakt pellet af seks millioner HeLa celler (en ~ 25 µL pellet) var sammenlignelig med udvundet fra en 130.000 blandet population af orme (en ~ 75 µL kompakt pellet), eller omkring halvdelen af hvad er udvundet fra 10.000 voksne orme (en ~ 100 µL gravity udlignede pellet), som det ses i tabel 1. Vi viser, at effektiviteten af protein udvinding (tabel 1) og opløsning af større proteiner (figur 2) var faldet i GTCp i forhold til RIPA-udvundet protein i HeLa celler, tyder på, denne teknik virker bedre i en voksen befolkning af orme. Den ufuldstændige oploesning af protein toerstoffet fra GTCp-udvundet HeLa protein kan være en begrænsning af denne metode i pattedyrsceller.

Immunoblotting mål analyseret af RT-qPCR

Næste, vi undersøgte protein niveauer af genet produkter testet af RT-qPCR til at bestemme, hvis mRNA niveau korreleret med protein niveauer. Som det ses i figur 3, de gennemsnitlige udtryk ændringer af protein korreleret med de gennemsnitlige mRNA udtryk ændres for mange mål; men nogle protein niveauer ikke afspejlede ændringer i mRNA niveau. Ofte mRNA i spise-2 orm var højere end i de andre stammer, men protein niveauer var enten de samme eller lavere end de andre stammer af samme mål. Den mest fremragende observation var de meget høje niveauer af dlg-1 mRNA i spise-2 orme, som ikke oversætte til mere protein; der var faktisk lavere dlg-1 protein niveauer i forhold til de andre stammer (figur 3).

Endelig viste niveauer i det GTCp-udvundet protein og RIPA-udvundet protein en slående forskel. RNA blev udtrukket på samme måde for begge; men eksemplet lignende men separat indsamlet af RIPA lysis viste markant reduceret protein niveauer, især for dem, der er større end 75 kDa (figur 3A, højre vognbane; Figur 3B, gule bar).

Intrasample sammenligning af mRNA og protein niveauer

Et af målene i denne protokol var at afgøre, om variationen vi så på mRNA og protein niveau var virkelige, eller hvis det kunne være en artefakt af intersample variation. I figur 4, var en delmængde af målene i forhold inden for de enkelte prøver. Hver individuel prøve er vist som den samme nuance og farve af dot med prøve 1 er den mørkeste skygge og prøve 4 som den lyseste nuance af grå (WT), blå (spise-2), eller røde (rsks-1). Inden for de fleste prøver var der en lav variabilitet mRNA niveau, med større variation på protein-niveau, en potentiel fejl af en semikvantitativ analyse af western blotting. Når man ser på placeringen af hvert af de farvede prikker mellem par mRNA og protein, svarede rækkefølgen af højeste til laveste ofte ikke; for eksempel i WT, hsp-60 mRNA ordre var prøve 4, 3, 2, 1, men protein niveauer blev 1, 2, 3, 4. Således forskelle mellem mRNA og protein niveauer inden for en bestemt, men metoden præsenteres tillader brugernes hen til fjerne tid af samling som en mulig kilde til den observerede forskel.

Table 1
Tabel 1: koncentrationer og absorption nøgletal. RNA og DNA koncentrationer og renhed nøgletal blev målt på et spektrofotometer. Protein koncentrationer blev bestemt ved hjælp af en kolorimetrisk protein kvantificering assay. Grå, blå og rød fremhæve prøver anvendes til RT-qPCR og vestlige skamplet. Gule angiver prøver bruges til at sammenligne GTCp med RIPA protein udvinding eller orm protein til HeLa protein. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Figure 1
Figur 1: genekspression af RT-qPCR. RT-qPCR analyse for mRNA opnået ved denne metode, bekræfter mål identificeres fra RNAseq data og af organelle markørgener. Fejllinjer udgør standard afvigelse; n = 4. Koncentrationen af mRNA blev defineret mod en standardkurve for hvert sæt af primere. Alle mRNA niveau var normaliseret til gennemsnittet af et sæt af seks husholdning gener anvendes som reference gener, som omfatter act-1, cdc-42, ama-1, Knud-23, pmp-3og cyn-1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: sammenligning af GTCp-versus RIPA-udvundet protein i orme og HeLa celler. Total protein fra wild-type (WT) orme eller HeLa celler høstet via GTCp eller RIPA lysis metode, adskilt af SDS-PAGE og farves med Coomassie blå. Hver bane indeholder 25 µg af total protein. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Protein niveauer i orme. (A) vestlige skamplet mål undersøgt af RT-qPCR og (B) densitometri analyse af signal intensitet. Hver bane indeholder 20 µg samlede GTCp-udvundet protein fra wild-type (WT), spise 2eller rsks-1 mutant orm. Billedet vist er en repræsentation af fire uafhængige gentagelser pr. orm stamme. Β-actin (nederst) blev brugt til kontrol for lig lastning for hvert mål; kun en repræsentativt sæt er vist. Højre vognbane indeholder 20 µg samlede RIPA-udvundet protein fra rsks-1 mutant orm. (B) tilsvarende signal intensiteter var kvantificeres ved hjælp af ImageJ. Fejllinjer udgør standard afvigelse; n = 4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Intrasample mRNA og protein niveau sammenligning. MRNA og protein niveauer fra enkeltprøver fra et undersæt af mål for hver stamme er justeret. Farven er repræsentant for tabel 1. Grå/sort er WT, blå er spise-2, og røde er rsks-1. mRNA og protein af samme mål er parret ved siden af hinanden og adskilt af nematodeprøveudtagning stamme. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Metoder til biomolekyle isolering, såsom DNA, RNA og proteiner, er ofte optimeret uden tekniske overlapning eller kombinationer. Dette er især uheldigt, når prøverne er vanskelig at opnå, som kunne føre til høst prøver på samme betingelser på forskellige tidspunkter. Afhængigt af den cellulære veje, kan replikater indsamlet på forskellige tidspunkter generere variation. Dette manuskript tilbyder en procedure for at omgå denne forhindring ved at aktivere samtidige isolering og oprensning af hver biomolekyle fra samme prøve af orme, reducere variationer indført af forskellige isolation teknikker, timingen af prøven høst, eller ulige høst. Kontrollere disse variabler ikke blot sparer tid og ressourcer, men også letter reproducerbarhed. Her viser vi en kombinatorisk tilgang, der undgår kompromitterende RNA og protein kvalitet, omend med variable resultater med DNA. Præparater kan optimeres yderligere, ved hjælp af DNA rengøringsprocedurer. Vi viste metoden ved hjælp af materiale fra nematodeprøveudtagning C. elegans og HeLa celler.

Tidligere arbejde at udforske transkriptom og proteomet N2 WT dyr og spise-2 og rsks-1 mutanter har tilbudt indsigt i forskellige veje, herunder mekanismer, at forlænge levetiden4,34,35 ,36. I et forsøg på at efterforske mekanismen af kaloriefattige begrænsning i forlængelse af levetiden, har en stabil isotop mærkning af/med aminosyrer i celle kultur (SILAC) analyse fundet at spise 2 orme en samlet downregulation af globale proteinsyntese 36. de data, der præsenteres her er i overensstemmelse med denne konstatering, selv som mRNA niveauer af de samme mål er steget kraftigt. En anden gruppe har til formål at identificere effektorer af S6K-medieret levetid og derfor udføres en proteom skærm af rsks-1 orme34. Fra de RNAseq data fundet med den aktuelle undersøgelse, identificeret vi mindst tre gener, der bestyrker med proteiner identificeret fra dette skærmbillede; MRP-1 og homologs af CPA og neuroligin (F07C4.12) blev opdaget som varierende udtryk i rsks-1 orme i forhold til WT N234.

De data, der genereres ved hjælp af denne metode er i overensstemmelse med tidligere multiomic undersøgelser. MRNA niveauer af ni mål blev brugt til at forudsige protein niveauer i hver prøve. Af disse mål havde mange forudsigelig protein niveauer baseret på mRNA niveau. Ikke desto mindre var der markante forskelle mellem mRNA og protein niveauer. Vigtigere, tillader protokollen præsenteres her videnskabsfolk til trygt vurdere og fortolke disse forskelle ved at fjerne intersample variabilitet ved at indsamle mRNA og protein fra samme prøve. Desuden sammenlignede vi mRNA niveau til Proteinniveau indsamlet fra samme prøve eller indsamlet fra en lignende, men forskellige prøve høstet med RIPA. Vi viste, at for en række mål, der var meget lavere niveauer af protein i RIPA-ekstraheres prøven. Uden kontrol den intersample variation, ville det være umuligt at vide, om denne forskel skyldtes differentieret regulering af mRNA og protein.

Det er vigtigt at huske, at der findes protokoller optimeret specielt til disse forskellige makromolekyler, så hvis en tværsnits analyse ikke er det endelige mål for eksperimentet, så ville det være relevant at anvende disse metoder i stedet. Bruge GTCp til at isolere DNA og protein forårsager dem til at blive mindre opløselige, der kræver rekonstituering af DNA i en svag base, såsom NaOH, og solubilizing protein i en buffer med en høj koncentration af vaskemiddel med varme, med risiko for at ufuldstændige oploesning. Derudover GTCp indeholder guanidinium kaliumthiocyanat og sure phenol, der inaktiverer enzymer såsom proteaser, men vil langsomt nedbrydes protein med tiden, medmindre frosset. Det bliver til skøn af forsker til at beslutte, hvis omgåelse af disse begrænsninger vil være umagen værd.

Vigtigst, når du arbejder med RNA, en steril teknik, at holde prøve på is, medmindre andet er anført og brugen af kommercielt tilgængelige dekontaminerende anbefales reagens at holde RNA intakt. Navnlig skal større prøver flere GTCp til at starte med, hvor hver ekstraktionsmiddel også skal skaleres. Denne protokol kræver ikke nogen manuelle homogenisering af orm eller celle prøverne, når den korrekte mængde af GTCp bruges. I forbindelse med DNA isolation er udbyttet stærkt afhængige af den færdighed at genoprette den økologiske (pink) lag. Endelig, for at forbedre oploesning af proteiner under isolation, øge mængden af resolubilization buffer eller tilføje andre rengøringsmidler udover SDS kan være nødvendigt. Faktisk, proteiner fra en voksen-bare befolkning af orme i stedet for en blanding af voksne, larver og æg er meget lettere at resolubilize.

Samlet set bruger denne protokol giver en integreret tilgang til biomolekyle isolering og letter fortolkningen af sammenhænge, eller mangel på samme, mellem mRNA og protein niveauer, der kan opstå fra separat høst biomolekyler fra forskellige prøver. Ved hjælp af denne metode kan hjælpe forskerne at identificere korrekt tilfælde hvor oversættelse af mRNA til protein er ikke korrelationsmaalinger og kan føre til en dybere undersøgelse af posttranskriptionelle og posttranslationelle reguleringsmekanismer under forskellige betingelser.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

L.R.L. var finansieret af tilskud fra NIH/NIA (R00 AG042494 og R01 AG051810), Glenn Foundation for Medical Research Award for forskning i biologiske mekanismer af aldrende og Junior Fakultet tilskud fra den amerikanske sammenslutning for aldring forskning. Forfatterne vil gerne takke Anita Kumar og Shi Quan Wong for deres nyttige feedback i skrivning af dette manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4–15% Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free™ Protein Gels BIORAD 4568084
Antibodies:
CePAS7-s DHSB- U of Iowa
CeTAC1-s DHSB- U of Iowa
DLG1-s DHSB- U of Iowa
GRP78 Novus Bio. NBp1-06274
HRP Goat Anti-Mouse Li-Cor 926-80010
HRP Goat Anti-Rabbit Li-Cor 92680011
HSP60-s DHSB- U of Iowa
LMP1-s DHSB- U of Iowa
MRP-1 Abcam ab24102
Neuroligin 3 Abcam ab172798
β-actin Millipore MAB1501R
ChemiDoc MP Imaging System BIORAD
Chloroform Fisher C298-500 Health hazard, Irritant, Toxic
Coomassie Brilliant Blue ThermoSci 20279
DC Protein assay BIORAD 500-0116
Epoch 2 microplate reader BioTek
Ethanol (200 proof) Fisher 04-355-223 Flammable, health hazard
HeLa cells ATCC CCL-2 BSL2
iScript Reverse Transcription Supermix BIORAD 1708840
Hydra microdispenser: Matrix Hydra Robbins/ThermoFisher
Isopropanol Fisher A516-4 Flammable, health hazard
M9 buffer:
3 g KH2PO4
6 g Na2HPO4
5 g NaCl
Add H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving.
After solution cools down, add 1 mL sterile 1 M MgSO4
Laemmli Sample Buffer (2x) BIORAD 161-0737
NanoDrop One ThermoSci
PAGE apparatus BIORAD
Ponceau S Alfa Aesar J60744
Primers IDT 25 nmole DNA Oligo with Standard Desalting
dlg-1: F (5'-GGTCCTACCA
GGCAGTTGAG-3')
R (5'-CACGTCCGTT
AACCTCTCCC-3')
hsp-4: F (5'-AGAGGGCTTT
GTCAACCCAG-3')
R (5'-TCGTCAGGGT
TGATTCCACG-3')
hsp-70: F (5'-CGGCATGTGA
ACGTGCTAAG-3')
R (5'-GAGCAGTTGA
GGTCCTTCCC-3')
hsp-60: F (5'-ATTGAGCAAT
CGACGAGCGA-3')
R (5'-CAACACCTCC
TCCTGGAACG-3')
lmp-1: F (5'-ACAACAACAC
CGGACTCACG-3')
R (5'-ATCGAGCTCC
CACTCTTTGG-3')
tac-1: F (5'-AGTGGCAGGC
AAAGTTCCTC-3')
R (5'-TGAGCACCTT
GATCTCGTCG-3')
pas-7: F (5'-GTACGCTCAA
AAGGCTGTCG-3')
R (5'-CTGAATCGGC
ATTGGCTCAC-3')
mrp-1: F (5'-TTTGCCTTGC
GCTTGTTCTG-3')
R (5'-AGTTCCAGTG
CGGAGCATAC-3')
F07C4.12: F (5'-TGCTGAGCAT
GAAGGACTGT-3')
R (5'-TGGCAATAGC
TCCTCCGTTG-3')
HK Actin: F (5'-CTACGAACTT
CCTGACGGACAAG-3')
R (5'-CCGGCGGACT
CCATACC-3')
HK cyn-1: F (5'-GTGTCACCAT
GGAGTTGTTC-3')
R (5'-TCCGTAGATT
GATTCACCAC-3')
HK nhr-23: F (5'-CAGAAACACT
GAAGAACGCG-3')
R (5'-CGATCTGCAG
TGAATAGCTC-3')
HK ama-1: F (5'-TGGAACTCTG
GAGTCACACC-3')
R (5'-CATCCTCCTT
CATTGAACGG-3')
HK cdc-42: F (5'-CTGCTGGACA
GGAAGATTACG-3')
R (5'-CTCGGACATT
CTCGAATGAAG-3')
HK pmp-3: F (5'-GTTCCCGTGT
TCATCACTCAT-3')
R (5'-ACACCGTCGA
GAAGCTGTAGA-3')
LightCycler 96 qPCR machine Roche
RIPA buffer: 10 mM Tris-Cl (pH 8.0)
1 mM EDTA
1% Triton X-100
0.2% SDS
140 mM NaCl
1 tablet of Roche protease inhibitor per 20 mL
SsoAdvanced Universal SYBR Supermix BIORAD 1725274
SuperSignal West Femto Max Sens Substrate ThermoSci 34095
Trans-Blot Transfer apparatus BIORAD
Trans-Blot Turbo Transfer Pack BIORAD 170-4159
TRIzol reagent Invitrogen 15596026 Health hazard (skin, eyes)
Worm strains: Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
N2 (wild type) Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
eat-2 (MAH95) Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
rsks-1 (VB633) Caenorhabditis Genetics Center (CGC)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rotroff, D. M., Motsinger-Reif, A. A. Embracing Integrative Multiomics Approaches. International Journal of Genomics. 2016, 1715985 (2016).
  2. Chen, R., Snyder, M. Promise of personalized omics to precision medicine. Wiley Interdisciplinary Reviews: System Biology and Medicine. 5 (1), 73-82 (2013).
  3. Anderson, L., Seilhamer, J. A comparison of selected mRNA and protein abundances in human liver. Electrophoresis. 18 (3-4), 533-537 (1997).
  4. Harvald, E. B., et al. Multi-omics Analyses of Starvation Responses Reveal a Central Role for Lipoprotein Metabolism in Acute Starvation Survival in C. elegans. Cell Systems. 5 (1), (2017).
  5. Griffin, T. J., et al. Complementary profiling of gene expression at the transcriptome and proteome levels in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cell Proteomics. 1 (4), 323-333 (2002).
  6. Greenbaum, D., Colangelo, C., Williams, K., Gerstein, M. Comparing protein abundance and mRNA expression levels on a genomic scale. Genome Biology. 4 (9), 117 (2003).
  7. Lapierre, L. R., et al. The TFEB orthologue HLH-30 regulates autophagy and modulates longevity in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 4, 2267 (2013).
  8. Doherty, C. J., Kay, S. A. Circadian control of global gene expression patterns. Annual Reviews Genetics. 44, 419-444 (2010).
  9. Goya, M. E., Romanowski, A., Caldart, C. S., Benard, C. Y., Golombek, D. A. Circadian rhythms identified in Caenorhabditis elegans by in vivo long-term monitoring of a bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (48), E7837-E7845 (2016).
  10. Dalvin, L. A., Fautsch, M. P. Analysis of Circadian Rhythm Gene Expression With Reference to Diurnal Pattern of Intraocular Pressure in Mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (4), 2657-2663 (2015).
  11. Narayanan, A., Jacobson, M. P. Computational studies of protein regulation by post-translational phosphorylation. Current Opinion in Structural Biology. 19 (2), 156-163 (2009).
  12. Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Research. 26 (4), 399-422 (2016).
  13. Cech, T. R., Steitz, J. A. The noncoding RNA revolution-trashing old rules to forge new ones. Cell. 157 (1), 77-94 (2014).
  14. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
  15. Triant, D. A., Whitehead, A. Simultaneous Extraction of High-Quality RNA and DNA from Small Tissue Samples. Journal of Heredity. 100 (2), 246-250 (2009).
  16. Liu, X., Harada, S. RNA Isolation from Mammalian Samples. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).
  17. Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).
  18. Kopec, A. M., Rivera, P. D., Lacagnina, M. J., Hanamsagar, R., Bilbo, S. D. Optimized solubilization of TRIzol-precipitated protein permits Western blotting analysis to maximize data available from brain tissue. Journal of Neuroscience Methods. 280, 64-76 (2017).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , The C. elegans Research Community. (2006).
  20. Hoogewijs, D., Houthoofd, K., Matthijssens, F., Vandesompele, J., Vanfleteren, J. R. Selection and validation of a set of reliable reference genes for quantitative sod gene expression analysis in C. elegans. BMC Molecular Biology. 9 (1), 9 (2008).
  21. Mahmood, T., Yang, P. -C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  22. Peach, M., Marsh, N., MacPhee, D. J. Protein solubilization: Attend to the choice of lysis buffer. Protein Electrophoresis: Methods and Protocols. Kurien, B. T., Scofield, R. H. , Humana Press. 37-47 (2012).
  23. Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Science USA. 95 (22), 13091-13096 (1998).
  24. Pan, K. Z., et al. Inhibition of mRNA translation extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 6 (1), 111-119 (2007).
  25. Gaudet, P., Livstone, M. S., Lewis, S. E., Thomas, P. D. Phylogenetic-based propagation of functional annotations within the Gene Ontology consortium. Briefings in Bioinformatics. 12 (5), 449-462 (2011).
  26. Broeks, A., Gerrard, B., Allikmets, R., Dean, M., Plasterk, R. H. Homologues of the human multidrug resistance genes MRP and MDR contribute to heavy metal resistance in the soil nematode Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 15 (22), 6132-6143 (1996).
  27. Hadwiger, G., Dour, S., Arur, S., Fox, P., Nonet, M. L. A Monoclonal Antibody Toolkit for C. elegans. PLoS One. 5 (4), e10161 (2010).
  28. Kostich, M., Fire, A., Fambrough, D. M. Identification and molecular-genetic characterization of a LAMP/CD68-like protein from Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Science. 113 (14), 2595 (2000).
  29. Firestein, B. L., Rongo, C. DLG-1 is a MAGUK similar to SAP97 and is required for adherens junction formation. Molecular Biology of the Cell. 12 (11), 3465-3475 (2001).
  30. Heschl, M. F., Baillie, D. L. Characterization of the hsp70 multigene family of Caenorhabditis elegans. DNA. 8 (4), 233-243 (1989).
  31. Yoneda, T., et al. Compartment-specific perturbation of protein handling activates genes encoding mitochondrial chaperones. Journal of Cell Science. 117 (18), 4055 (2004).
  32. Takahashi, M., Iwasaki, H., Inoue, H., Takahashi, K. Reverse Genetic Analysis of the Caenorhabditis elegans 26S Proteasome Subunits by RNA Interference. Biological Chemistry. 383, 1263 (2002).
  33. Le Bot, N., Tsai, M. C., Andrews, R. K., Ahringer, J. TAC-1, a regulator of microtubule length in the C. elegans embryo. Current Biology. 13 (17), 1499-1505 (2003).
  34. McQuary, P. R., et al. C. elegans S6K Mutants Require a Creatine-Kinase-like Effector for Lifespan Extension. Cell Reports. 14 (9), 2059-2067 (2016).
  35. Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans . Molecular and Cell Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).
  36. Yuan, Y., et al. Enhanced energy metabolism contributes to the extended life span of calorie-restricted Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 31414-31426 (2012).

Tags

Biologi sag 145 multiomics proteomics transcriptomics RNAseq RT-qPCR western duppes DNA RNA protein C. elegans guanidinium kaliumthiocyanat
Kombinerede nukleotid og Protein ekstraktioner i <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mills, J., McConnell, E.,… More

Mills, J., McConnell, E., Leitão, J. A., Lapierre, L. R. Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (145), e59178, doi:10.3791/59178 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter