Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الجمع بين النوكليوتيدات والاستخراج البروتين في ايليجانس كاينورهابديتيس

Published: March 17, 2019 doi: 10.3791/59178
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Brown University

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا للعزلة من الجيش الملكي النيبالي، والحمض النووي والبروتين من نفس العينة، في محاولة للحد من التباين، وتحسين إمكانية تكرار نتائج، وتيسير التفسيرات.

Abstract

عينة بيولوجية واحدة تحمل عددا كبيرا من المعلومات، والآن ممارسة شائعة للتحقيق الجزيئات عديدة لالتقاط صورة كاملة لمستويات متعددة من تجهيز الجزيئية والتغييرات بين ظروف مختلفة في وقت واحد. ويعرض هذا البروتوكول الأسلوب لعزل الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، والبروتين من نفس العينة من ديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس لإزالة الاختلاف وعرض عندما تكون هذه الجزيئات الحيوية المعزولة من replicates من معاملة المثل ولكن في نهاية المطاف عينات مختلفة. يتم استخراج البروتين والأحماض النووية من ديدان أسطوانية باستخدام الأسلوب ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم استخراج حمض جوانيدينيوم، مع هطول الأمطار اللاحقة، والغسيل، وسولوبيليزيشن لكل. علينا إظهار عزلة الناجحة للجيش الملكي النيبالي، والحمض النووي والبروتين من عينة واحدة من ثلاث سلالات من ديدان أسطوانية وخلايا هيلا، مع نتائج أفضل في عزل البروتين في الحيوانات الكبار. بالإضافة إلى ذلك، يحسن جوانيدينيوم ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم-استخراج البروتين من الديدان الخيطية القرار أكبر من البروتينات، مع تعزيز مستويات لا يمكن اكتشافها وكما لاحظت إيمونوبلوتينج، مقارنة باستخراج ريبا التقليدية للبروتين.

الطريقة المعروضة هنا مفيد عند التحقيق في العينات باستخدام نهج مولتيوميك، على وجه التحديد لاستكشاف البروتين والترنسكربيتوم. تقنيات تقييم مولتيوميكس في وقت واحد جذابة الجزيئية الظواهر الإشارات الأساسية البيولوجية المعقدة ويعتقد أن تحدث في مستويات التكميلية؛ ومع ذلك، أصبح شائعا بصورة متزايدة لنرى أن التغيرات في مستويات مرناً لا تعكس دائماً نفس التغيير في مستويات البروتين وأن وقت جمع ذات الصلة في سياق الأنظمة الإيقاعية. هذا الأسلوب يزيل أي تباين في إينتيرسامبلي عند فحص محتويات مختلفة داخل نفس العينة (إينتراسامبلي).

Introduction

مولتيوميكس، النهج التحليلي الذي يستخدم مزيجاً من اوميكس، مثل الجينوم، البروتين، الترنسكربيتوم، ابيجينومي، ميكروبيومي، أو ليبيدومي، قد أصبحت شعبية متزايدة عند معالجة مجموعات البيانات الكبيرة ل توصيف المرض1، 2. وقد أظهرت الأدلة المتزايدة أن يحد من نهج واحد "ome" يقدم تحليلاً جزيئية ناقصة (استعرضها روتروف وموتسينجير-Reif1). يتم إنشاء مجموعات كبيرة من البيانات، لا سيما عند أداء شاشات استخدام تقنيات عالية الإنتاجية، ولكن بغية رسم صورة كاملة أو تحديد الأهداف الأكثر صلة بالموضوع، النهج مولتيوميك الأفضل. باستخدام نهج مولتيوميكس، مع ذلك، هناك ملاحظة متكررة من التناقضات بين مرناً والبروتين مستويات3،4،،من56. جدير بالذكر أن مرناً والبروتين المستخدمة في ترانسكريبتوميك جنب ويحلل البروتين مع تسلسل الحمض النووي الريبي (رناسيق) والسائل اللوني-جنبا إلى جنب الكتلي (LC-MS/MS)، على التوالي، غالباً ما تستمد من المعالجة وكذلك عينات من replicates مختلفة، يحتمل أن الأخذ بالتباين بين نفس الظروف3،4،،من56. هارفالد et al. يؤديها أنيقة الديدان C. ايليجانس المجاعة الوقت بالطبع دراسة مقارنة الترنسكربيتوم والبروتين من البرية من نوع (وزن) لأن له-30 الديدان المسخ التي تفتقر إلى عامل نسخ هامة في طول العمر 7-المذكرة، كانت تحصد في الجيش الملكي النيبالي والبروتين من replicates الشرط نفسه، لذا ليس من نفس العينة. نتائجها تظهر ارتباط منخفضة بين مستويات مرناً ومستويات البروتين في كل نقطة الوقت (r = 0.559 إلى 0.628). في الواقع، شكلت heatmap على أربع مجموعات: الكتلة كان انخفاضا كبيرا في مرناً المستويات إلا قليلاً أو لا انخفاض في مستويات البروتين المقابلة، و "المجموعة الثانية" كان قليلاً أو لا زيادة في مستويات مرناً ولكن زيادة في مستويات البروتين، المجموعة الثالثة زيادة في مرناً المستويات ولكن انخفاضا في مستويات البروتين، و "المجموعة الرابعة" كان زيادة في مستويات مرناً ولكن فقط تغيير دقيق في مستويات البروتين4. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إدخال هذا الاختلاف إينتيرسامبلي في الحالات حيث لا يتم جمع العينات من نفس الشرط في نفس الوقت بالضبط. على سبيل المثال، مرناً والبروتينات وينظم دورة الإيقاعية تتقلب اعتماداً على الوقت من اليوم8،9، أو، وبشكل أكثر تحديداً، تعرض C. ايليجانس ل الضوء9؛ قد يتأخر التعبير عن هذه البروتينات الإيقاعية ما يصل إلى 8 ح بعد التعريفي التعبير الجيني10. ومع ذلك، أن انتشار هذه الملاحظة لا يعني بالضرورة أنه من الخطأ؛ وفي الواقع، وهذا يمكن أن تكون مفيدة. البروتين ومرناً يتم في حالة دينامية مستمرة بين تشكيل والتدهور. وعلاوة على ذلك، كثيرا ما بوستترانسلاتيونالي تعديل البروتينات لزيادة الاستقرار أو للحث على تدهور11. على سبيل المثال، وضعهم أوبيكويتينيشن يمكن أن يؤدي إلى تنشيط أو استهداف بروتوزوم أو يحلول لتدهور12. بالإضافة إلى ذلك، الكشف فضله دوراً هاما في تنظيم التعبير الجيني في مراحل النسخي وبوسترانسكريبشونال13. وهكذا، والسؤال هو كيف للحد من المتغيرات التأكد من أن التناقضات ونلاحظ في هذه الدراسات السلكية حقيقية.

هنا، فإننا نقترح أسلوب يقوم بإزالة المتغير إينتيرسامبلي بالسماح بإجراء تحليلات للجزيئات المختلفة من نفس العينة. والهدف من هذا البروتوكول هو توفير وسيلة لاستمرار عزل الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، والبروتينات من عينة واحدة من C. ايليجانس (المشار إليها أيضا كالديدان) في محاولة للحد من التباين، وتحسين إمكانية تكرار نتائج، وتيسير التفسيرات. فوائد إضافية لاستخدام نفس العينة تشمل توفير الوقت والموارد أثناء جمع العينات، تيسير مستعرضة تحليل العينات القيمة ومحدودة، بما في ذلك السلالات التي يصعب على النمو والحفاظ على، واكتساب رؤى في تنظيم التفاضلية للجزيئات استناداً إلى إينتراسامبلي الاختلافات في مستويات البروتين ومرناً.

هذا الأسلوب مناسبة لتقييم التعبير الجيني ومستويات البروتين من عينة واحدة من الديدان، مما يسمح بإجراء تقييم أكثر شمولاً لمستويات متعددة من تجهيز الجزيئية. جوانيدينيوم ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم (جتكب) كاشف14مادة كيميائية تستخدم عادة لعزل الحمض النووي الريبي، يستخدم لاستخراج البروتين والأحماض النووية من الديدان، مع هطول الأمطار اللاحقة، والغسيل، وسولوبيليزيشن لكل. هذا البروتوكول عبارة عن تجميع لمختلف البروتوكولات15،16 مع تعديلات طفيفة، صممت مع تركيز على C. ايليجانس، ولكن نحن أيضا بنجاح معزولة الرنا والبروتين والحمض النووي من بيليه خلايا هيلا بعد نفس الخطوات. على الرغم من عدم اختباره هنا، من المرجح أن تعمل على الأنسجة، وكذلك،من1718هذا البروتوكول.

Protocol

ملاحظة: يتم تنفيذ كل خطوة هطول الأمطار جزيء ضخم تسلسلياً، تليها يغسل به وفي الوقت نفسه؛ ومع ذلك، من المستحسن لإكمال عزل الحمض النووي الريبي أولاً كما أصلاً غير مستقرة.

1. جمع العينات

  1. البذور 1,000 بيضة دودة في اللوحة 10 سم مع ظروف النمو المناسبة19. تبني في 20 درجة مئوية ح 72.
    ملاحظة: بليتش الحاملة للبيض الكبار من أجل جمع البيض كما هو موضح سابقا19.
  2. أغسل اللوحة مع حوالي 5 مل من المخزن المؤقت M9 وجمع الديدان الكبار 1,000 في أنبوب.
    ملاحظة: المخزن المؤقت M9 تتكون من فوسفات الصوديوم 35 ملم مائي وكلوريد الصوديوم 102 مم، 22 مم بوتاسيوم فوسفات مونوباسيك وسلفات المغنيزيوم 1 مم في الماء المعقم19.
  3. الطرد المركزي الديدان في 1,000 س ز لمدة 1 دقيقة وتجاهل المادة طافية، ونقل الديدان الأعلاف مع 1 مل من M9 المخزن المؤقت إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
  4. الطرد المركزي مرة أخرى في 845 x ز لمدة 1 دقيقة وتجاهل معظم المادة طافية. تخزين الأعلاف الديدان في-80 درجة مئوية للحد ني ح 4.
    ملاحظة: استخدام بيليه مجمدة تنتج عائد أعلى مما بيليه طازجة. ويوصي بسلسلة من دورات تجميد/ذوبان الجليد باستخدام الإيثانول 95% أو النتروجين السائل في الثلج الجاف لصدع بشرة دودة إذا استخدام بيليه طازجة. ترك كمية صغيرة من M9 على بيليه سوف يساعد في كسر بشرة عند تجميدها.

2-النوكليوتيدات وعزل البروتين

  1. إزالة أي المادة طافية من بيليه المذابة وإضافة 1 مل كاشف جتكب الباردة. مزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً. ضع العينة على الجليد لمدة 10 دقائق ويخلط أحياناً بتحويلها رأسا على عقب.
    تنبيه: الفينول هو التآكل وعصبية وشديدة السمية وقد تسبب الحروق الكيميائية والعمى.
    ملاحظة: كنا الديدان الكبار يصل إلى 5,000 كمواد البدء مع الكميات المبلغ عنها؛ ويستند كل حجم استخدام 1 مل كاشف جتكب. عند استخدام نموذج أكبر، قد يكون ضروريا رفع مستوى.
  2. للحل من الديدان وجتكب، بإضافة 200 ميليلتر من كلوروفورم الباردة. عقد الأنبوب بين الأصابع واهتز بشدة لترك س. 15 في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 3 دقائق.
    تنبيه: كلوروفورم من سامة مهيجة وقد تسبب القروح الجلدية وغيرها من الأضرار المستهدفة للجهاز، وهو مسرطن محتمل.
  3. الطرد المركزي الأنبوب في س 13,500 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: وتشكل ثلاث طبقات بعد تدور هذه: الأعلى والمرحلة المائية واضحة والأسفل، والمرحلة العضوية الوردي والطور البيني صغير وخفيف يحتوي على الدهون والحمض النووي.
  4. استخدام ميكروبيبيتي، نقل الطبقة العليا واضحة (المرحلة المائية) إلى جديدة خالية من رناسي 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنبوب (أنبوب A) عزل الحمض النووي الريبي عن طريق ترسيب الكحول (على النحو المفصل في الخطوة 2، 5) ونقل الطبقة الوردية (المرحلة العضوية) من بيليه المتبقية إلى (أنبوب جديد الأنبوبة ب) ووضعه على الجليد.
    ملاحظة: يمكن أن تجمد في مرحلة العضوية الوردي في-80 درجة مئوية حتى عزل الحمض النووي والبروتين من هذه العينة. سوف ينتج عينات أكبر طبقة بيضاء سميكة بين المرحلة المائية والعضوية. هذا جزء يحتوي على الحمض النووي. إذا كان يمكن إزالة هذه الطبقة دون الإخلال بالمراحل الأخرى، القيام بذلك ووضعها في أنبوب منفصل (أنبوب B2).
  5. عزل الحمض النووي الريبي على النحو التالي.
    1. من المرحلة المائية واضحة في الأنبوب A، يعجل بالجيش الملكي النيبالي مع 500 ميليلتر من الايزوبروبانول 100%. احتضان لمدة 10 دقائق في الرايت ثم الطرد المركزي أنبوب أ في س 13,500 ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: بيليه بيضاء صغيرة من الجيش النيبالي الملكي يجب أن تكون مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب.
    2. صب معظم المادة طافية. إزالة بقية مع 1 مل حقنه بإبرة وتجاهل المادة طافية.
      ملاحظة: حجم الإبرة ليست مهمة؛ ومع ذلك، مقياس إبرة أكبر سوف نقدم المزيد من السيطرة حتى لا يتعرض للإزعاج بيليه. يمكن استخدام ميكروبيبيتي إذا لم تتوفر الإبر.
    3. أضف 1 مل إيثانول 75% إلى أنبوب ليغسل بيليه. تدور الأنبوب في س 5,300 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    4. إزالة المادة طافية من بيليه بالصب واستخدام المحاقن 1 مل بإبرة، كما هو موضح في الخطوة 2.5.2، وتجاهل ذلك.
    5. واسمحوا بيليه أيردري لمدة 5-10 دقائق، ولكن لا تدع ذلك أوفيردري. استخدام 50 ميليلتر من المياه خالية من رناسي لإعادة تشكيل بيليه من الحمض النووي الريبي قبل أن يصبح شفاف تماما.
      ملاحظة: هذا حجم بداية كافية للديدان 1,000 – 3,000، ولكن قد تحتاج إلى تعديلها تبعاً لكمية المواد البداية استخدمت.
    6. احتضان بيليه في 55 – 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق حله.
    7. قياس التركيز ونقاء باستخدام جهاز المطياف الضوئي. تسجيل absorbances في 260 nm لتركيز الحمض النووي الريبي وفي 230 و 280 نيوتن متر لتحديد أية شوائب.
    8. تنظيف الجيش الملكي النيبالي لإزالة أي ملوثات، مثل بقايا الفينول أو الحمض النووي، مع تنقية العمود أو يغسل الإيثانول اللاحقة والعلاج الدناز.
      ملاحظة: عند هذه النقطة، الجيش الملكي النيبالي على استعداد لإرسالها للتحليل رناسيق، أو يمكن استخدامها لجعل كدنا لاستخدام الرايت-قبكر (انظر القسم 3.1 للحصول على التفاصيل). ويمكن تخزين الحمض النووي الريبي في-80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
  6. عزل الحمض النووي كما يلي.
    1. من مرحلة العضوية الوردي في الأنبوب ب والعينة في أنبوب B2، يعجل أي الحمض النووي عن طريق إضافة 300 ميليلتر من الإيثانول 100% ومزيج من انعكاس. ترك في tube(s) في الرايت لمدة 2 – 3 دقيقة.
    2. الطرد المركزي أنابيب B و B2 في 375 x ز لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية بيليه الحمض النووي.
    3. نقل المادة طافية من أنابيب B و B2 بصب ذلك في أنبوب 2 مل جديدة (أنبوب ج) وترك الأمر على الجليد لعزل البروتين اللاحقة. أغسل بيليه الحمض النووي في الأنبوب ب أو B2 مع 1 مل سترات الصوديوم 0.1 M في الإيثانول 10% لأنابيب الطرد المركزي 30 دقيقة ب و B2 في 375 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: الصوديوم ربط العمود الفقري الحمض النووي، جعل الحمض النووي المتعجل أكثر سهولة في سترات الصوديوم والايثانول، السماح بشوائب يجب إزالتها باستخدام الطرد المركزي ذات سرعة منخفضة.
    4. كرر الخطوة يغسل كما هو موضح في الخطوة 2.6.3. ريسوسبيند بيليه في 1.5 مل إيثانول 75% وتركها في RT لمدة 20 دقيقة، مع خلط عرضية من أوبيندينج.
    5. أنبوب الطرد المركزي B و B2 في 375 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    6. تجاهل المادة طافية والسماح لتجف لمدة 5 – 10 دقائق.
    7. حل بيليه في 150 ميليلتر من هيدروكسيد الصوديوم 8 مم. ضبط إلى درجة الحموضة المطلوبة مع حبيس إذا لزم الأمر. تدور العينة في 375 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    8. استخدام ميكروبيبيتي، نقل المادة طافية (DNA) إلى أنبوب جديد. قياس التركيز وتحديد نقاء باستخدام جهاز المطياف الضوئي. تسجيل absorbances في 260 nm لتركيز الحمض النووي وفي 230 و 280 نيوتن متر لتحديد أية شوائب.
  7. عزل البروتينات كما يلي.
    1. أن يعجل بالبروتين، إضافة تصل إلى 1.5 مل الكحول 100% للمادة الوردية طافية في أنبوب ج، مزيج بعكس عدة مرات، واحتضان في RT لمدة 10 دقائق.
    2. الطرد المركزي الأنبوبة ج في س 13,500 ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
    3. تجاهل المادة طافية وتغسل بيليه مع 2 مل هيدروكلوريد غوانيدين 0.3 متر في الإيثانول 95% لمدة 20 دقيقة في أنبوب الطرد المركزي الرايت ج في س 5,300 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    4. كرر الخطوة يغسل كما هو موضح في الخطوة 2.7.3 2 x.
    5. نقل بيليه البروتين إلى أنبوب 1.5 مل جديدة (أنبوب C2) وإضافة تصل إلى 1.5 مل إيثانول 95%. دوامة وتمكنك من الجلوس على RT لمدة 20 دقيقة.
    6. الطرد المركزي أنبوب C2 في س 5,300 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية واسمحوا بيليه الجاف لمدة 10 دقائق في حل الرايت بيليه في 300 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي 5% عند 50 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
      ملاحظة: قد يكون مطلوباً وقتاً أطول في حضانة لإذابة بيليه البروتين الكامل. وفي الماضي، كان المحتضنة بيليه لما يصل إلى 6 س دون التضحية بالجودة.
    7. الطرد المركزي أنبوب C2 في س 13,500 ز لمدة 10 دقائق في 17 درجة مئوية. نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد.
    8. قياس تركيز استخدام تحليل الكمي بروتين مفضل متوافق مع المنظفات.
      ملاحظة: البروتين على استعداد لاستخدامها في صفحة الحزب الديمقراطي الصربي والنشاف الغربية. يمكن تخزينه في-20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. للتقنيات الأخرى، مثل LC-MS/MS، سيتعين المنظفات تكون دياليزيد قبالة.

3-تقييم مرناً ومستويات البروتين

  1. RT-قبكر
    1. إعداد كدنا بالنسخ العكسي مع 1 نانوغرام من الجيش الملكي النيبالي، استخدام بروتوكول ثيرموسيكلير التالية: فتيلة (5 دقائق عند 25 درجة مئوية)، النسخ العكسي (20 دقيقة في 46 درجة مئوية)، والمنظمة RT (1 دقيقة عند 95 درجة مئوية).
    2. جعل لوحة أسهم من كدنا بإضافة 100 ميليلتر لتخفيف 1: 100 لكل عينة كدنا للآبار الفردية من صفيحة 96-جيدا. وتشمل الضوابط المناسبة، مثل لا الآبار قالب/المياه فقط، وعينات المخفف متسلسل من 01:25 إلى 1: 400 (نشأت مع كدنا المجمعة من جميع العينات التي تم تحليلها) للسماح لمنحنى قياسي إثبات كفاءة التمهيدي لكل الجينات التي تم تحليلها.
      ملاحظة: يمكن استخدام هذا التنسيق مع ميكروديسبينسير 96-جيدا، مما يسمح لنقل جميع العينات في صفيحة لصفيحة الرايت قبكر والتخفيف من الاختلافات بئر بيبيتينج. يمكن إضافة المزيج المناسب الرئيسية (مثلاً، سيبر + كبسولة تفجير) إلى كل جيدا بعد ذلك مع ماصة متعددة القنوات. عموما، هذا النهج يقلل الأخطاء التي أدخلت عند كل عينة، ومن ثم زيادة خفض تقلب اليد-بيبيتينج.
    3. إضافة 3 ميليلتر من كدنا من لوحة الأسهم إلى الآبار لصفيحة الرايت qPCR.
    4. جعل مزيج رئيسي لكل مجموعة من الإشعال الذي يشمل 1 x سوبيرميكس التي تحتوي على الحمض النووي إينتيركالاتينج سينين صبغة، ميكرومتر 5 كل من الأمام وعكس كبسولة تفجير، والمياه يصل إلى 7 ميليلتر كل عينة. إضافة 7 ميليلتر للآبار المناسبة من صفيحة الرايت qPCR وتحرض طفيفة لمزيج.
      ملاحظة: وتشمل عينات لقياس الجينات التدبير المنزلي استخدامها كمرجع لتطبيع نتائج20.
    5. قم بتشغيل لوحة استخدام بروتوكول قبكر RT مناسب للإشعال المستخدمة.
  2. لطخة غربية
    ملاحظة: للحصول على معلومات مفصلة حول البقع الغربية، يرجى الرجوع إلى محمود ويانغ21.
    1. إعداد العينات للحزب الديمقراطي الصربي صفحة عن طريق الجمع بين 20 ميكروغرام من البروتين مع زيادة متساوية في حجم 2 × "لايملي عينة المخزن المؤقت" ويغلي عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    2. تحميل العينات على جل تريس-جليكاين 4 – 15% وتشغيلها في 150 ت ح 1، أو حتى تصل إلى الجبهة صبغ الجزء السفلي من الجل.
    3. نقل البروتينات من الهلام إلى غشاء النيتروسليلوز في 25 الخامس لمدة 30 دقيقة في جهاز نقل سيميدري.
    4. تأكيد نقل السليم تلطيخ الغشاء مع S بونسياو وصمة عار.
    5. دقة غسل وصمة عار من الغشاء مع تريس مخزنة المالحة (تبس) مع بوليسوربيت 20 (TBS-T) من 0.01 في المائة.
    6. كتلة الغشاء مع الحليب الخالي 5% في تي تبس ح 1 في الرايت
    7. احتضان الغشاء في جسم أساسي في التخفيف المناسبة وفقا لتوصيات للمورد. ترك الأمر على الروك في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    8. يغسل الغشاء 3 x، لمدة 5 دقائق في كل منهما، مع TBS-ت.
    9. احتضان الغشاء في جسم الثانوية المناسبة في التخفيف المناسبة وفقا لتوصيات للمورد. ترك الأمر على الروك ح 1 في الرايت
    10. يغسل الغشاء 3 x، لمدة 5 دقائق في كل منهما، مع TBS-ت.
    11. الصورة وتحديدها كمياً لطخة غربية، استخدام أساليب المفضل.

Representative Results

تم تحليل عينات الحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين، وتعرض نتائج تمثيلية باستخدام يعزل البروتين والحمض النووي الريبي هنا. بالإضافة إلى ذلك، يمكننا مقارنة العينة البروتين حصاد باستخدام الأسلوب جتكب ل أسلوب تحلل ريبا المشتركة22. لقد استخدمنا لتجربتنا، replicates المستقلة أربعة من كل الديدان WT (N2) وهما الديدان متحولة المعمرة، و أكل 2 ورسكس-123،24.

الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي كمية ونوعية

تركيز الحمض النووي الريبي عند حراكه في 50 ميليلتر من الماء تتراوح بين 0.2 – 2 ميكروغرام/ميليلتر، استخدام حوالي 3,000 الكبار الديدان مواد بداية. وتراوحت نسب امتصاص، التي تشير إلى النقاء، 2.0 إلى 2.2 ل A260/A280 و 1.9 إلى 2.5 ل A260/A230 (الجدول 1)، مما يشير إلى نجاح استخراج الحمض النووي الريبي دون تلوث مع مكونات جتكب، مثل هيدروكلوريد الفينول أو غوانيدين.

تم بنجاح استخراج الحمض النووي، ولكن النوعية المتغير. تركيز الحمض النووي عندما حراكه في 150 ميليلتر من هيدروكسيد الصوديوم تتراوح بين 0.04 إلى 1.1 ميكروغرام/ميليلتر. أن امتصاص نسب تراوحت بين 1.8 و 2.1 A260/A280 و 0.9 إلى 1.6 ل A260/A230 (الجدول 1)، مما يشير إلى نجاح استخراج الحمض النووي؛ ومع ذلك، بعض العينات كانت ملوثة بمكونات جتكب، مثل هيدروكلوريد الفينول أو غوانيدين. إذا كان من الضروري عزل الحمض النووي، يجب توخي الحذر عند فصل طبقة وسطى من انفصال جتكب، ويغسل أكثر قد يكون ضروريا.

RT-qPCR للأهداف المحددة

عزل الحمض النووي الريبي من أربع عينات مستقلة لكل سلالة دودة كانت ناجحة، وأرسلت للتحليل رناسيق، مع اللاحقة qPCR RT إجراء استخدام من سوبيرميكس التي تحتوي على صبغة سينين. أهداف تحليلها بواسطة RT-qPCR اختيرت من مجموعة بيانات كبيرة رناسيق استناداً إلى التنظيم الأكثر الأثران الجينات المشتركة في كلا طفرات مقارنة بالديدان WT. F07C4.1225عاماً هومولوج إلى نيوروليجين البشرية 3، ب إيسوفورم، كان الهدف المحدد أوبريجولاتيد المشتركة. وأدرجنا أيضا جين ينظم متفاوتاً بين كلا طفرات، mrp-126، لتحليل إضافي، والذي كان أوبريجولاتيد في 2 أكل الديدان ولكن دوونريجولاتيد في الديدان رسكس-1 . وتم تأكيد التغييرات التعبير mrp- 1 عبر RT-قبكر؛ ومع ذلك، رأي أوبريجوليشن F07C4.12 في الديدان رسكس-1 التي تنبأ بها تحليل رناسيق لا RT-قبكر (الشكل 1).

وتم التحقيق أهداف إضافية مع الأجسام المضادة للتحقق من صحة للديدان كذلك. وشملت هذه عدة علامات عضية تتميز في هادويجير et al.27. خلطات أبدى عدد من هذه العلامات على مستوى مرناً في الديدان المسخ. كما يظهر في الشكل 1، lmp 128 و حوار-129 كانت أوبريجولاتيد في 2 أكل الديدان؛ hsp-4 30و hsp 7030و lmp-1 كانت أوبريجولاتيد في الديدان رسكس-1 ؛ hsp-60 31 و نظام تقييم الأداء-732 كانت دوونريجولاتيد في 2 أكل الديدان؛ وكانت hsp-60 ، و معاهدة الصداقة والتعاون-133 دوونريجولاتيد في الديدان رسكس-1 .

إعداد البروتين المتزامن مقابل المعهد الملكي

لتأكيد كفاءة ونوعية من البروتين باستخدام أسلوب جتكب كما هو موضح أعلاه، قارنا للبروتين التي تم جمعها باستخدام الأسلوب التقليدي أكثر ريبا تحلل22. استخدام نفس الكمية من ابتداء من مواد، هي أما الكبار فقط (حوالي 10,000 الديدان) أو مختلطة سكان البالغين واليرقات والبيض (حوالي 130,000 الديدان)، الكمية الإجمالية التي تم جمعها مع جتكب كان أقل عند حراكه في نهاية متساوية الأحجام (1 الجدول ); ومع ذلك، الاستخراج من نسبة سكان البالغين فقط كان أكثر نجاحا من مجموعة سكانية مختلطة. بالإضافة إلى ذلك، كانت نوعية البروتينات مماثلة، أن كان البروتين المستخرج من جتكب وأظهر قرار أفضل من البروتينات أكبر عند التحميل متساوية من البروتين الكلي، كما هو موضح بأخذ وصمة عار في الشكل 2. وفي الواقع، أظهرت أهدافا تقييمه بواسطة لطخة غربية في الشكل 3 مستويات مماثلة في معظم الحالات؛ ومع ذلك، أظهرت البروتينات أكبر من 75 كاتشين مستويات أدنى في البروتين المستخرج من المعهد الملكي مقارنة بالبروتين المستخرج من جتكب (الشكل 3A، لين الحق؛ شريط الشكل 3B، الأصفر).

تم أيضا تقييم طريقة استخراج المقدمة هنا في خط الخلية الثديية هيلا. للإشارة، كمية البروتين المستخرجة مع المعهد الملكي من بيليه مدمجة خلايا هيلا 6 مليون (بيليه ~ 25 ميليلتر) كانت مماثلة للتي انتزعت من مجموعة سكانية مختلطة 130,000 من الديدان (ميليلتر ~ 75 مدمجة بيليه)، أو حوالي نصف ما يستخرج من 10000 الديدان الكبار (~ 100 ميليلتر استقر الجاذبية بيليه)، كما يتضح في الجدول 1. ونحن تبين أن كفاءة استخراج البروتين (الجدول 1) والقرار من البروتينات أكبر (الشكل 2) قد انخفض في جتكب مقارنة بالبروتينات المستخرجة من المعهد الملكي في خلايا هيلا، مما يوحي بهذا الأسلوب يعمل بشكل أفضل في حالة سكان البالغين من الديدان. Solubilization ناقصة بيليه بروتين من البروتينات المستخرجة من جتكب هيلا يمكن حد من هذا الأسلوب في خلايا الثدييات.

أهداف Immunoblotting تحليلها بواسطة RT-قبكر

المقبل، ونحن التحقيق في مستويات البروتين من منتجات الجينات اختبار بواسطة RT-qPCR لتحديد إذا كانت مستويات مرناً يرتبط مع مستويات البروتين. كما يظهر في الشكل 3، التغييرات التعبير متوسط من البروتين يرتبط بالتعبير مرناً متوسط تغير للعديد من الأهداف؛ ومع ذلك، بعض مستويات البروتين لا تعكس التغيرات في مستويات مرناً. في كثير من الأحيان، كانت مستويات مرناً في 2 أكل الديدان أعلى من مثيلاتها في السلالات الأخرى، ولكن مستويات البروتين كانت أما نفس أو أقل من السلالات الأخرى لنفس الهدف. الملاحظة الأبرز التي تمت مستويات عالية جداً من حوار-1 مرناً في 2 أكل الديدان، والذي لم يترجم إلى مزيد من البروتين؛ وفي الواقع، كان هناك انخفاض مستويات البروتين dlg-1 عند مقارنتها بسلالات أخرى (الشكل 3).

وأخيراً، أظهرت مستويات البروتين المستخرج من جتكب والبروتين المستخرج من المعهد الملكي فرقا ملفتة للنظر. انتزع الجيش الملكي النيبالي بنفس الطريقة على حد سواء؛ بيد أن العينة مشابهة ولكنها منفصلة تجمعها تحلل ريبا أظهرت ملحوظ خفض مستويات البروتين، لا سيما لمن أكبر من 75 كاتشين (الشكل 3 ألف، لين الحق؛ شريط الشكل 3B، الأصفر).

مقارنة مستويات البروتين ومرناً إينتراسامبلي

وكان من أهداف هذا البروتوكول تحديد إذا كان الاختلاف رأينا في مرناً، وكان مستوى البروتين الحقيقي، أو إذا كان يمكن أن يكون قطعة أثرية اختلاف إينتيرسامبلي. في الشكل 4، تمت مقارنة مجموعة فرعية أهداف داخل عينات واحدة. ويرد كل عينة الفردية كنفس الظل ولون النقطة، مع نموذج 1 يجري أحلك الظل وعينه 4 كالظل الأفتح من الرمادي (WT)، الأزرق (أكل-2) أو الأحمر (رسكس-1). وكان هناك داخل معظم العينات، تقلب انخفاض مستويات مرناً، مع تباين أكبر على مستوى البروتين، عيب محتمل لتحليل مسوحات للبقع الغربية. عندما ننظر إلى موقف كل من النقاط الملونة بين أزواج مرناً والبروتين، بالترتيب من أعلى إلى أدنى كثيرا ما لم تطابق؛ على سبيل المثال، في وزن، كان النظام مرناً hsp-60 عينة 4، 3، 2، 1، ولكن مستويات البروتين كانت 1، 2، 3، 4. وهكذا، الفروق بين مستويات البروتين ومرناً في عينة من المؤكد وجود، ولكن طريقة عرض يسمح للمستخدمين بإزالة وقت جمع كمصدر محتمل للفرق الملاحظ.

Table 1
الجدول 1: التركيزات ونسب الاستيعاب. تم قياس تركيزات الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي، ونقاء النسب في جهاز المطياف الضوئي. وقد تحددت تركيزات البروتين تحليل الكمي بروتين اللونية باستخدام. الرمادي والأزرق، والأحمر الضوء على العينات المستخدمة في قبكر RT ولطخة غربية. الأصفر يشير إلى العينات المستخدمة لمقارنة جتكب لاستخراج البروتين ريبا أو بروتين الفيروس المتنقل للبروتين هيلا. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Figure 1
رقم 1: التعبير الجيني ب RT-قبكر- تحليل RT-qPCR مرناً التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة، تأكيد الأهداف المحددة من البيانات رناسيق، ومن عضية ماركر الجينات. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري؛ n = 4. تم تعريف تركيز مرناً ضد منحنى المعياري لكل مجموعة من الإشعال. تم تطبيع جميع مرناً مستويات المتوسط لمجموعة من ستة جينات التدبير المنزلي تستخدم كمرجع الجينات، التي تشمل القانون-1، 42 مركز السيطرة على الأمراض، و قصره-1، المنظمة-23، بمب--3، و سين-1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: مقارنة بين جتكب-مقابل استخراج ريبا البروتين في خلايا هيلا والديدان- مجموع البروتين من الديدان البرية من نوع (WT) أو خلايا هيلا تحصد عبر أسلوب تحلل جتكب أو ريبا، مفصولة بصفحة الحزب الديمقراطي الصربي، والملون باللون الأزرق أخذ. تحتوي كل حارة على 25 ميكروغرام من البروتين الكلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: مستويات البروتين في الديدان. (أ) وصمة عار الغربية لأهداف التحقيق RT-qPCR) و (ب) تحليل قياس كثافة من كثافة إشارة. ويتضمن كل حارة 20 ميكروغرام من البروتين الكلي جتكب المستخرجة من البرية من نوع (WT) أو 2 أكلالديدان متحولة رسكس-1 . الصورة المعروضة تمثيل لأربعة replicates مستقلة كل سلالة الفيروس المتنقل. Β-أكتين (أسفل) كانت تستخدم للتحكم في تحميل متساوية لكل هدف؛ يتم عرض مجموعة تمثيلية واحدة فقط. الحارة اليمنى تحتوي على 20 ميكروغرام من مجموع البروتين ريبا المستخرجة من الديدان متحولة رسكس-1 . (ب) كثافة إشارة مناظرة كانت كمياً باستخدام إيماجيج. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري؛ n = 4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: مستوى مرناً إينتراسامبلي والبروتين مقارنة- يتم محاذاة مستويات البروتين ومرناً من العينات الفردية من مجموعة فرعية أهداف لكل سلالة. أن اللون هو ممثل الجدول 1. الرمادي/الأسود هو وزن والأزرق هو أكل-2وهو الأحمر رسكس-1. يقترن بجوار بعضها البعض مرناً والبروتين لنفس الهدف ومفصولة بسلالة السلكية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

هي الأمثل أساليب للعزلة بيوموليكولي، مثل الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، والبروتينات، وغالباً دون تداخل التقنية أو تركيبات. هذا الحرمان لا سيما عند عينات من الصعب الحصول على، الذي يمكن أن يؤدي إلى جمع العينات تحت نفس الظروف في أوقات مختلفة. اعتماداً على المسارات الخلوية، replicates المجمعة في أوقات مختلفة قد تولد الاختلاف. هذه المخطوطة ويوفر إجراء للالتفاف على هذه العقبة عن طريق تمكين عزلة المتزامنة وتنقيتها من كل بيوموليكولي من نفس العينة من الديدان، وتقليل الاختلافات الأخذ بتقنيات مختلفة من العزلة، وتوقيت الحصاد عينة، أو الحصاد غير متكافئة. التحكم في هذه المتغيرات ليس فقط يوفر الوقت والموارد، ولكن أيضا يسهل إمكانية تكرار نتائج. هنا، علينا أن نظهر نهج اندماجي يتجنب تعريض الجيش الملكي النيبالي ونوعية البروتين، وأن كان ذلك مع نتائج متغير مع الحمض النووي. يمكن تحسين الاستعدادات كذلك استخدام الحمض النووي إجراءات التنظيف. وقد دللنا النهج باستخدام مواد من خلايا C. ايليجانس والحلة السلكية.

وعرضت الأعمال السابقة استكشاف الترنسكربيتوم والبروتين من الحيوانات N2 WT وطفرات أكل-2 و 1-رسكس التبصر في مسارات مختلفة، بما في ذلك آليات لتمديد عمر4،34،35 ،36. في محاولة للتحقيق في إليه تقييد السعرات الحرارية في تمديد عمر، "وسم النظائر المستقرة" التي مع الأحماض الأمينية في خلية تحليل الثقافة (سيلك) وجد أن 2 أكل الديدان لها دوونريجوليشن العام تخليق البروتين العالمية 36-البيانات المقدمة هنا يتسق مع هذا الاستنتاج، حتى مع زيادة مستويات مرناً الأهداف نفسها التي هي إلى حد كبير. وتهدف إلى تحديد المستجيبة لطول العمر S6K بوساطة مجموعة أخرى، وبالتالي، تقوم شاشة البروتين من الديدان رسكس-1 34. من رناسيق البيانات الموجودة مع الدراسة الحالية، وقد حددنا ثلاثة على الأقل من الجينات التي تؤيد بالبروتينات المحددة من هذه الشاشة؛ تم اكتشاف MRP-1 وهومولوجس نيوروليجين (F07C4.12) وسلطة الائتلاف المؤقتة كما يجري خلطات المعرب عنها في الديدان رسكس-1 مقارنة بوزن N234.

البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام هذا الأسلوب يتسق مع التحقيقات مولتيوميك السابقة. واستخدمت مستويات مرناً تسعة أهداف للتنبؤ بمستويات البروتين في كل عينة. وكان العديد من هذه الأهداف، مستويات البروتين يمكن التنبؤ بها على أساس مستويات مرناً. ومع ذلك، كانت هناك اختلافات ملحوظة بين مستويات البروتين ومرناً. الأهم من ذلك، يسمح بروتوكول المعروضة هنا العلماء ثقة تقييم وتفسير هذه الاختلافات عن طريق إزالة التغير إينتيرسامبلي بجمع مرناً والبروتين من نفس العينة. وعلاوة على ذلك، نحن بالمقارنة مع مستويات مرناً لمستويات البروتين التي تم جمعها من نفس العينة أو التي تم جمعها من عينة مشابهة ولكنها مختلفة المقطوع مع المعهد الملكي. ونحن وأظهرت أن لعدد من الأهداف، كانت هناك مستويات أقل بكثير من البروتين في العينة المستخرجة من المعهد الملكي. دون مراقبة لتباين إينتيرسامبلي، أنه سيكون من المستحيل معرفة إذا كان هذا الاختلاف بسبب تنظيم التفاضلية مرناً والبروتين.

من المهم أن نضع في اعتبارنا أن هناك بروتوكولات الأمثل خصيصا لهذه الجزيئات المختلفة، حتى إذا لم يكن إجراء تحليل مستعرضة والهدف النهائي من هذه التجربة، ثم أنه سيكون وثيقة الصلة باستخدام تلك الأساليب بدلاً من ذلك. استخدام جتكب لعزل الحمض النووي والبروتين يسبب لهم ليصبح أقل قابل للذوبان، تتطلب إعادة تشكيل الحمض النووي في ضعف قاعدة، مثل هيدروكسيد الصوديوم، وسولوبيليزينج البروتين في المخزن مؤقت مع تركيزات عالية من المنظفات مع تدفئة، خطر غير مكتملة سولوبيليزاتيون. بالإضافة إلى ذلك، جتكب يحتوي على ثيوسيانات جوانيدينيوم والفينول الحمضية التي يحللها الإنزيمات مثل البروتياز، ولكن سوف تتحلل البروتينات ببطء مع مرور الوقت ما لم تجمد. سيكون للسلطة التقديرية للباحث أن يقرر إذا كان سوف يكون من المجدي التحايل على هذه القيود.

الأهم من ذلك، عند العمل مع الجيش الملكي النيبالي وتقنية معقمة وحفظ العينة على الجليد إلا إذا ذكر خلاف ذلك واستخدام تطهيرها المتاحة تجارياً كاشف يوصي بالحفاظ على سلامة الجيش الملكي النيبالي. جدير بالذكر أن عينات أكبر سوف تحتاج جتكب أكثر لتبدأ، فيه كل المذيبات استخراج ستحتاج أيضا إلى الارتقاء. لا يتطلب هذا البروتوكول أي دليل تجانس العينات دودة أو الخلية عند استخدام المبلغ الصحيح من جتكب. في سياق عزل الحمض النووي، العائد تعتمد اعتماداً كبيرا على الكفاءة لاستعادة الطبقة العضوية (الوردي). وأخيراً، لتحسين سولوبيليزيشن البروتينات خلال العزلة، زيادة حجم المخزن المؤقت ريسولوبيليزيشن أو إضافة منظفات أخرى إلى جانب الحزب الديمقراطي الصربي قد يكون ضروريا. والواقع أن البروتينات من نسبة سكان البالغين فقط من الديدان بدلاً من خليط من البالغين واليرقات والبيض أسهل بكثير ريسولوبيليزي.

عموما، استخدام هذا البروتوكول يوفر نهجاً متكاملا للعزلة بيوموليكولي ويسهل تفسير العلاقات المتبادلة، أو عدمه، بين مستويات مرناً والبروتين التي يمكن أن تنشأ عن حصاد الجزيئات الحيوية من مختلف كل على حدة عينات. باستخدام هذا الأسلوب يمكن أن تساعد العلماء على تحديد الحالات التي لا يرتبط فيها ترجمة مرناً للبروتين ويمكن أن تؤدي إلى تحقيق أعمق من الآليات التنظيمية بوسترانسكريبشونال وبوستترانسلاشونال تحت ظروف مختلفة بشكل صحيح.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وتم تمويل L.R.L. بالمنح من المعاهد الوطنية للصحة/نيا (R00 AG042494 و R01 AG051810)، مؤسسة جلين "جائزة البحوث الطبية" للبحث في الآليات البيولوجية للشيخوخة ومنحة كلية جونيور من "الاتحاد الأمريكي" "بحوث الشيخوخة". الكتاب يود أن يشكر كومار أنيتا وشي ونغ تشيوان لملاحظاتهم مفيدة في كتابة هذه المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4–15% Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free™ Protein Gels BIORAD 4568084
Antibodies:
CePAS7-s DHSB- U of Iowa
CeTAC1-s DHSB- U of Iowa
DLG1-s DHSB- U of Iowa
GRP78 Novus Bio. NBp1-06274
HRP Goat Anti-Mouse Li-Cor 926-80010
HRP Goat Anti-Rabbit Li-Cor 92680011
HSP60-s DHSB- U of Iowa
LMP1-s DHSB- U of Iowa
MRP-1 Abcam ab24102
Neuroligin 3 Abcam ab172798
β-actin Millipore MAB1501R
ChemiDoc MP Imaging System BIORAD
Chloroform Fisher C298-500 Health hazard, Irritant, Toxic
Coomassie Brilliant Blue ThermoSci 20279
DC Protein assay BIORAD 500-0116
Epoch 2 microplate reader BioTek
Ethanol (200 proof) Fisher 04-355-223 Flammable, health hazard
HeLa cells ATCC CCL-2 BSL2
iScript Reverse Transcription Supermix BIORAD 1708840
Hydra microdispenser: Matrix Hydra Robbins/ThermoFisher
Isopropanol Fisher A516-4 Flammable, health hazard
M9 buffer:
3 g KH2PO4
6 g Na2HPO4
5 g NaCl
Add H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving.
After solution cools down, add 1 mL sterile 1 M MgSO4
Laemmli Sample Buffer (2x) BIORAD 161-0737
NanoDrop One ThermoSci
PAGE apparatus BIORAD
Ponceau S Alfa Aesar J60744
Primers IDT 25 nmole DNA Oligo with Standard Desalting
dlg-1: F (5'-GGTCCTACCA
GGCAGTTGAG-3')
R (5'-CACGTCCGTT
AACCTCTCCC-3')
hsp-4: F (5'-AGAGGGCTTT
GTCAACCCAG-3')
R (5'-TCGTCAGGGT
TGATTCCACG-3')
hsp-70: F (5'-CGGCATGTGA
ACGTGCTAAG-3')
R (5'-GAGCAGTTGA
GGTCCTTCCC-3')
hsp-60: F (5'-ATTGAGCAAT
CGACGAGCGA-3')
R (5'-CAACACCTCC
TCCTGGAACG-3')
lmp-1: F (5'-ACAACAACAC
CGGACTCACG-3')
R (5'-ATCGAGCTCC
CACTCTTTGG-3')
tac-1: F (5'-AGTGGCAGGC
AAAGTTCCTC-3')
R (5'-TGAGCACCTT
GATCTCGTCG-3')
pas-7: F (5'-GTACGCTCAA
AAGGCTGTCG-3')
R (5'-CTGAATCGGC
ATTGGCTCAC-3')
mrp-1: F (5'-TTTGCCTTGC
GCTTGTTCTG-3')
R (5'-AGTTCCAGTG
CGGAGCATAC-3')
F07C4.12: F (5'-TGCTGAGCAT
GAAGGACTGT-3')
R (5'-TGGCAATAGC
TCCTCCGTTG-3')
HK Actin: F (5'-CTACGAACTT
CCTGACGGACAAG-3')
R (5'-CCGGCGGACT
CCATACC-3')
HK cyn-1: F (5'-GTGTCACCAT
GGAGTTGTTC-3')
R (5'-TCCGTAGATT
GATTCACCAC-3')
HK nhr-23: F (5'-CAGAAACACT
GAAGAACGCG-3')
R (5'-CGATCTGCAG
TGAATAGCTC-3')
HK ama-1: F (5'-TGGAACTCTG
GAGTCACACC-3')
R (5'-CATCCTCCTT
CATTGAACGG-3')
HK cdc-42: F (5'-CTGCTGGACA
GGAAGATTACG-3')
R (5'-CTCGGACATT
CTCGAATGAAG-3')
HK pmp-3: F (5'-GTTCCCGTGT
TCATCACTCAT-3')
R (5'-ACACCGTCGA
GAAGCTGTAGA-3')
LightCycler 96 qPCR machine Roche
RIPA buffer: 10 mM Tris-Cl (pH 8.0)
1 mM EDTA
1% Triton X-100
0.2% SDS
140 mM NaCl
1 tablet of Roche protease inhibitor per 20 mL
SsoAdvanced Universal SYBR Supermix BIORAD 1725274
SuperSignal West Femto Max Sens Substrate ThermoSci 34095
Trans-Blot Transfer apparatus BIORAD
Trans-Blot Turbo Transfer Pack BIORAD 170-4159
TRIzol reagent Invitrogen 15596026 Health hazard (skin, eyes)
Worm strains: Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
N2 (wild type) Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
eat-2 (MAH95) Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
rsks-1 (VB633) Caenorhabditis Genetics Center (CGC)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rotroff, D. M., Motsinger-Reif, A. A. Embracing Integrative Multiomics Approaches. International Journal of Genomics. 2016, 1715985 (2016).
  2. Chen, R., Snyder, M. Promise of personalized omics to precision medicine. Wiley Interdisciplinary Reviews: System Biology and Medicine. 5 (1), 73-82 (2013).
  3. Anderson, L., Seilhamer, J. A comparison of selected mRNA and protein abundances in human liver. Electrophoresis. 18 (3-4), 533-537 (1997).
  4. Harvald, E. B., et al. Multi-omics Analyses of Starvation Responses Reveal a Central Role for Lipoprotein Metabolism in Acute Starvation Survival in C. elegans. Cell Systems. 5 (1), (2017).
  5. Griffin, T. J., et al. Complementary profiling of gene expression at the transcriptome and proteome levels in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cell Proteomics. 1 (4), 323-333 (2002).
  6. Greenbaum, D., Colangelo, C., Williams, K., Gerstein, M. Comparing protein abundance and mRNA expression levels on a genomic scale. Genome Biology. 4 (9), 117 (2003).
  7. Lapierre, L. R., et al. The TFEB orthologue HLH-30 regulates autophagy and modulates longevity in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 4, 2267 (2013).
  8. Doherty, C. J., Kay, S. A. Circadian control of global gene expression patterns. Annual Reviews Genetics. 44, 419-444 (2010).
  9. Goya, M. E., Romanowski, A., Caldart, C. S., Benard, C. Y., Golombek, D. A. Circadian rhythms identified in Caenorhabditis elegans by in vivo long-term monitoring of a bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (48), E7837-E7845 (2016).
  10. Dalvin, L. A., Fautsch, M. P. Analysis of Circadian Rhythm Gene Expression With Reference to Diurnal Pattern of Intraocular Pressure in Mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (4), 2657-2663 (2015).
  11. Narayanan, A., Jacobson, M. P. Computational studies of protein regulation by post-translational phosphorylation. Current Opinion in Structural Biology. 19 (2), 156-163 (2009).
  12. Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Research. 26 (4), 399-422 (2016).
  13. Cech, T. R., Steitz, J. A. The noncoding RNA revolution-trashing old rules to forge new ones. Cell. 157 (1), 77-94 (2014).
  14. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
  15. Triant, D. A., Whitehead, A. Simultaneous Extraction of High-Quality RNA and DNA from Small Tissue Samples. Journal of Heredity. 100 (2), 246-250 (2009).
  16. Liu, X., Harada, S. RNA Isolation from Mammalian Samples. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).
  17. Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).
  18. Kopec, A. M., Rivera, P. D., Lacagnina, M. J., Hanamsagar, R., Bilbo, S. D. Optimized solubilization of TRIzol-precipitated protein permits Western blotting analysis to maximize data available from brain tissue. Journal of Neuroscience Methods. 280, 64-76 (2017).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , The C. elegans Research Community. (2006).
  20. Hoogewijs, D., Houthoofd, K., Matthijssens, F., Vandesompele, J., Vanfleteren, J. R. Selection and validation of a set of reliable reference genes for quantitative sod gene expression analysis in C. elegans. BMC Molecular Biology. 9 (1), 9 (2008).
  21. Mahmood, T., Yang, P. -C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  22. Peach, M., Marsh, N., MacPhee, D. J. Protein solubilization: Attend to the choice of lysis buffer. Protein Electrophoresis: Methods and Protocols. Kurien, B. T., Scofield, R. H. , Humana Press. 37-47 (2012).
  23. Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Science USA. 95 (22), 13091-13096 (1998).
  24. Pan, K. Z., et al. Inhibition of mRNA translation extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 6 (1), 111-119 (2007).
  25. Gaudet, P., Livstone, M. S., Lewis, S. E., Thomas, P. D. Phylogenetic-based propagation of functional annotations within the Gene Ontology consortium. Briefings in Bioinformatics. 12 (5), 449-462 (2011).
  26. Broeks, A., Gerrard, B., Allikmets, R., Dean, M., Plasterk, R. H. Homologues of the human multidrug resistance genes MRP and MDR contribute to heavy metal resistance in the soil nematode Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 15 (22), 6132-6143 (1996).
  27. Hadwiger, G., Dour, S., Arur, S., Fox, P., Nonet, M. L. A Monoclonal Antibody Toolkit for C. elegans. PLoS One. 5 (4), e10161 (2010).
  28. Kostich, M., Fire, A., Fambrough, D. M. Identification and molecular-genetic characterization of a LAMP/CD68-like protein from Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Science. 113 (14), 2595 (2000).
  29. Firestein, B. L., Rongo, C. DLG-1 is a MAGUK similar to SAP97 and is required for adherens junction formation. Molecular Biology of the Cell. 12 (11), 3465-3475 (2001).
  30. Heschl, M. F., Baillie, D. L. Characterization of the hsp70 multigene family of Caenorhabditis elegans. DNA. 8 (4), 233-243 (1989).
  31. Yoneda, T., et al. Compartment-specific perturbation of protein handling activates genes encoding mitochondrial chaperones. Journal of Cell Science. 117 (18), 4055 (2004).
  32. Takahashi, M., Iwasaki, H., Inoue, H., Takahashi, K. Reverse Genetic Analysis of the Caenorhabditis elegans 26S Proteasome Subunits by RNA Interference. Biological Chemistry. 383, 1263 (2002).
  33. Le Bot, N., Tsai, M. C., Andrews, R. K., Ahringer, J. TAC-1, a regulator of microtubule length in the C. elegans embryo. Current Biology. 13 (17), 1499-1505 (2003).
  34. McQuary, P. R., et al. C. elegans S6K Mutants Require a Creatine-Kinase-like Effector for Lifespan Extension. Cell Reports. 14 (9), 2059-2067 (2016).
  35. Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans . Molecular and Cell Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).
  36. Yuan, Y., et al. Enhanced energy metabolism contributes to the extended life span of calorie-restricted Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 31414-31426 (2012).

Tags

البيولوجيا، 145 قضية، مولتيوميكس، البروتيوميات، ترانسكريبتوميكس، رناسيق، الرايت-قبكر، لطخة الغربية، الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، البروتين، C. ايليجانس، ثيوسيانات جوانيدينيوم
الجمع بين النوكليوتيدات والاستخراج البروتين في <em>ايليجانس كاينورهابديتيس</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mills, J., McConnell, E.,… More

Mills, J., McConnell, E., Leitão, J. A., Lapierre, L. R. Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (145), e59178, doi:10.3791/59178 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter