Summary
为偏远、资源有限的全球环境设计和建造了一个可快速部署的离网实验室。探讨了物流增强、可扩展、多功能实验室模块的特点和关键方面。编制并介绍了基本实验室工作流程的清单和呼吸道病毒诊断测试的协议。
Abstract
最近大流行 (埃博拉、寨卡、中东呼吸综合征、流感等) 的上升突出表明, 需要采取更 "灵活" 的应对措施, 解决从交通、准入、设施、设备和与供应商沟通等诸多问题的问题培训。为了满足这一需求, 我们开发了一个创新的、可扩展的、物流增强的、移动的、实验室设施, 用于资源有限的全球环境中的紧急情况和流行病。利用临床操作的背景作为一个学术医疗中心, 我们设计了一个可快速部署的模块化 BSL-2 和 BSL-3 设施, 具有用户友好的软件, 用于在流行病期间跟踪和管理偏远地区的药品和用品。暴发。在这里, 我们介绍我们的多式联运, 移动, 可扩展的装运容器实验室单位。实验室的设计通过最大限度地减少功耗和允许备用水源, 促进了离网的使用。该股的信息和通信技术平台提供 (一) 方便用户的桌面文件; (二) 加强对病人和用品的跟踪, (三) 具有内置远程保健能力的现场综合通信。为了确保在偏远环境中的质量, 我们开发了一个基本实验室工作流程的清单和一个使用逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 进行呼吸道病毒诊断的协议。如上所述, 这种创新和全面的方法允许在资源有限的全球环境中提供实验室能力。
Introduction
快速诊断是及时控制病毒感染的重要工具, 特别是在早期症状与各种感染疾病无法区分的情况下。最近在西非爆发的埃博拉疫情(2014-2015年) 1,2, 寨卡病毒流行病 (2015-2016年) 在亚洲和拉丁美洲 3,4, 中东呼吸综合征 (mers) 冠状病毒的出现感染5,6, 和异常致命的流感 (流感) 流行病 (2017-2018) 在美国 7,8发现需要快速部署的实验室设施, 以解决多种运输、通道、设施、设备和通信等问题。
离网能力 (自主供电和供水等) 在农村、资源有限的全球环境中至关重要, 9、10、11.我们在贝洛尔医学院的临床运营和全球项目方面的经验被用来设计和建造一个基于容器的移动实验室, 该实验室具有易于部署、设置和多功能使用的功能 (BSL-2 和 BSL-3)。这种多功能、物流增强的实验室设施的图像如图 1所示。
这个可快速部署的实验室设施有一个可扩展的设计, 类似于前面描述的集装箱诊所 ("紧急智能吊舱")12,13,14, 由贝勒医学院和由美国国际开发署赞助。单个封装单元 (在运输模式下) 的尺寸为9英尺9英寸 x 8 英尺 x 8 英尺 (图 1 a, b), 并扩展到170平方英尺 (15.75 米 2) (图 1c, d).该部队可在不到十分钟内部署2至4人。
远程实验室是为 BSL-2 实验室设施 (图 2a) 建造的, 具有单独的模块化、可连接的 bsl-3 单元 (图 2A), 专为与可能通过吸入造成严重或潜在致命疾病的传染性物一起使用而设计15. 两个实验室模块的连通性有助于优化实验工作流程、共享资源和节约成本 (图 2c-e)。
这些模块是气密和防水, 以创建一个舒适, 节能的移动掩体。加热、通风和空调 (HVAC) 系统用于集中式和温控装置。一般来说, 实验室单元的设计通过使用自己的备用电源 (如太阳能电池板和/或独立的发电机) 来最大限度地减少功耗。每个单元包括一个水槽和洗眼站、电力和水连接器 (图 3a-c)。ICT 平台提供了一个可选的、基于平板电脑的文档应用程序, 用于供应跟踪和实验室结果文档 (图 3d), 该应用程序是与贝洛尔信息技术 (it) 合作开发的在连接有限的远程环境中工作经验丰富的研究小组。该系统可以使用蜂窝或无线信号运行, 并允许在没有连接的情况下提供文档, 并在重新建立连接时立即备份或传输到基于安全云的服务器。
该实验室有几个关键的感染控制功能, 包括: (a) 负压气流, (b) 手套箱或生物安全柜, (c) 健康风险管理系统: 使用4个防御等级的杀菌紫外线照明系统消灭99.7% 导致卫生保健相关感染的病原体。该设施很容易使用过氧化氢或次氯酸钠 (漂白剂) 系统进行消毒, 以高效和有效地进行去污。16
质量实验室结果的保证取决于对整个诊断测试过程的所有方面进行评估的承诺。在这里, 我们提供了 BSL-2 和 BSL-3 实验室工作流程的检查表, 以及快速呼吸道病毒诊断测试的协议。拟议的病毒性疾病诊断依赖于通过实时逆转录酶链反应 (RT-PCR) 检测标本中的病毒 RNA 或 DNA (鼻洗、血液、粪便和尿液等)。快速估计标本中病毒载量的能力使 pcr 成为病毒性疾病筛查17,18 的有效工具。实施新型分子诊断检测, 可扩大对埃博拉 19、20、21、流感8、22和结核病 (tb) 等病毒的诊断能力)23。
这项工作的目标是验证一种新型的模块化和可快速部署的实验室设施, 并为在流行病、自然灾害或其他紧急救济期间在偏远、低资源环境中工作的实验室人员提供培训指南情况。在这里, 我们在这个创新的便携式实验室提出了呼吸道流感诊断的方案。
Protocol
1. 安装
注: 部署 "类似乐戈" 的实验室单元只需要2-4 人。最理想的情况是, 4 人将被用来部署, 但它是可能的, 只有2。
- 使用叉车 (图 1a,b) 或其他合适的提升装置来处理容器。使用至少有7吨起重能力的叉车来处理这两种类型的集装箱24。
- 要设置实验室单元, 请在平坦的景观上选择一块约 90 x 60 平方英尺 (27.4 x 18.3米 2) 的补丁, 以确保没有障碍物阻碍正确的布局。确保工地有排水良好的土壤, 以确保场地排水, 因为这可能会在降雨后造成潜在的水消散问题。使用以前被夷为平地的地面, 这些地面是最小抗压强度为 10 Kn/dm2 的硬压实土。周边区域应允许接触从运输装置卸载设备所需的设备, 并容纳完成任务所需的辅助设备。
- 将一个或多个单位置于其 "运输模式" 中, 放在所选站点的中心, 并调整级别。每个单元都配备了四个调平千斤顶, 允许部署在最高等级为 6.5% (约4度) 的站点上。容器的最低高度为 ~ 6 英寸, 以确保地板排水沟和排水管正常工作。不要将插孔延长超过12英寸。将支撑支架连接到插孔的扶手上。通过在每个底部导轨的中心放置气泡调平器, 确保容器是水平的。不要扩大单位, 直到它已被正确定位!
- 通过打开面板以实现全部功能来扩展设备。首先定位两片支撑杆。连接支撑杆, 使其高度几乎与容器单元一样高。电线杆允许用户打开面板, 并在侧门打开时支撑屋顶面板的重量。有一个安全夹, 作为一个别针, 以保持面板锁定。首先取出安全夹, 然后提起并将凸轮锁销从孔中拉出来。将销钉放在杠杆后面, 并离开位于容器底部 (可扩展) 一侧的凸轮锁杆的方向。
- 考虑到这个面板有气体支柱, 一旦面板门解锁, 支柱就会释放。这将允许用户使用两片支撑杆提高屋顶 (第1面板)。将支撑杆的尖端移动到屋顶面板下, 以临时支撑它 (图 4 a)。
- 在用支撑戳支撑支撑支撑支撑支撑车顶板的同时, 找到位于容器左上角的安全链。在2-3 人的协助下, 小心地向下拖动第2小组, 直到安全链是直的, 保持小组2的重量, 并已参与。
- 通过将绞车带带包裹在气支柱的外部, 用手将其连接到把手安装上。请注意, 如果没有绞车工具, 则可以手动完成上一步, 面板两侧至少有两个人手动按住并降低它。
注意: 面板的重量为260磅!
- 确保第2小组的方式中没有人员或物品, 并使用绞车和钻头, 继续降低面板 (图 4b)。当第2面板完全降低时, 断开绞车表带并将其卷回绞车。取下绞车, 并将其放置在容器的另一侧, 准备使用。设备的两侧相同, 并对设备的另一侧执行上述相同的步骤。
- 要完成第一侧的部署, 请深入到面板 (目前是楼层), 并且每边至少有两人, 手动将面板3向上抬起到位, 作为一侧的门和前壁 (图 4C)。两人将继续持有第3小组, 而第三人将拆除支撑杆。
注意: 在面板3墙就位之前, 任何人都不应在设备内或屋顶下! - 从第3小组内部, 找到两个闩锁, 并使用安全带将其锁定到位。确保黑色屋顶板橡胶垫圈被拉出, 以面对单位的内部。必须这样做, 以防止雨水和其他水渗透到单位。
- 从容器内部, 解锁第4面板。一旦解锁, 就把第4小组 (图 4d) 推出, 让它像门一样打开。将两个安全闩锁锁在内墙上。解锁第5面板, 并重复第4面板的相同步骤。使用相同的内部安全闩锁保护此面板。一旦整个单元内部被锁定, 重新拧紧转盘, 直到地板和端壁被密封。
- 一旦容器的两侧安全地展开, 检查千斤顶, 并从可能发生的换挡中进行任何必要的调整。检查庇护所是水平每周。极端天气 (雨或风) 后, 检查容器上的千斤顶, 并进行相应调整。
- 如果计划使用可连接的实验室模块, 则展开第二个容器 (图 5)。
- 将设备连接到电源和供水。关于安装柴油发电机通过断路器箱连接到设备的详细说明可在根据手册24 中找到。
注: 远程实验室单元现已部署。该装置的内部非可折叠体积允许储存特定诊断测试所需的最低限度的设备和实验室供应。详细介绍了 bsl-3 模块加压系统的安装, 需要额外的质量控制。24
2. 个人防护和基本实验室工作流程清单
注: 任何一般安全和实验室测试要求阶段的错误都可能使整个测试过程的结果失效。
- 在准备进入安装的实验室设备之前, 请确保考虑到所有 BSL-2 或 BSL-3 的安全要求: 使用适当的人员防护设备 (PPE) 进行敷料、洗手、戴手套以及净化任何工作空间。要使用。
- 按照表 1中的检查表, 其中包含在实验室 BSL-2 和 bsl-3 模块 (组装的手套箱-负压力和 pcr 室-正压力) 运行的测试期间的个人防护安全要求。
- 净化实验室中的所有工作空间和耗材。如果计划使用次氯酸钠溶液 (0.5%) (也称为液体漂白剂) 对工作区进行净化和供应, 也可以使用70% 的乙醇清洗所有暴露在漂白剂中的区域, 因为漂白剂可以与工作区中的其他化学品混合, 产生有毒烟雾。将所有漂白剂产品放入自己指定的垃圾桶中。
- 在开始在实验室工作之前, 要熟悉实验室的布置和布局。在手套盒 (GB) 房间内处理样品适用严格的规则。GB 房间是负压力!要操作手套盒, 请查看制造商的说明。多个来源提供了有关手套盒操作的详细教程25。
注: 本分析的目的是从样品中提取和纯化核糖核酸 (RNA) 或脱氧核糖核酸 (DNA) (如果存在)。提取的 rna! dna 将通过实时 RT-PCR 进行检测, 以检测是否存在靶向病毒病原体----流感 inf (INF)。
3. 在 BSL-2 实验室设施中通过 RT-PCR 快速诊断流感病毒
- 接收和注册
- 应用个人防护设备清单 (见第2节)。INF 是需要 BSL-2 实践的第2类代理。适合 BSL-2 练习的个人防护设备是必需的。此外, 还要戴上安全眼镜和袖口实验室外套, 以最大限度地减少潜在的皮肤暴露。
- 根据世界卫生组织 (世卫组织) 的建议26, 使用无菌的 dacron 或 rayon 用塑料轴擦拭, 从呼吸道取样。
注: 棉或海藻酸钙擦拭, 或用木棍擦拭可能含有使某些病毒失活并抑制 pcr 检测26,27 的化合物。 - 当样本擦拭从患者身上取出时, 将他们从现场或诊所运送到实验室设施。通过传递窗口转移样品;这个窗口不能从两边打开。
- 在直通窗口中, 含有漂白剂样品的喷雾管 1分钟, 然后是70% 的乙醇, 然后擦干, 以便在进入实验室单位之前提供足够的净化。潜水后, 设备内的实验室技术人员将打开传递窗口, 从要注册的漂白剂容器中收集样品。通常情况下, 传递样品的人和提取样品的人是不一样的。
- 打开直通窗口并收集要注册的样品。擦拭所有用漂白剂和乙醇消毒的样品。用漂白剂擦拭直通窗口的内部, 然后再擦拭70% 的乙醇溶液。在基于交互式平板电脑的系统或笔记本电脑中注册示例。使用以下信息标识示例:
-领取日期
-开始日期
-患者年龄和性别
-标本型 (如鼻刺 )
-唯一的标识符
-其他相关信息 - 使用条形码标记管道。在每个样品管中添加条形码, 并在指定的四个空管中添加条形码。将样品移动到通风口罩上。扫描每个管上的条形码, 并确保正确的样品识别信息出现在基于平板电脑的系统或笔记本电脑屏幕上。如果条形码不可用, 请使用耐酒精标记。总是标记小瓶本身, 从来没有帽, 因为这可以在处理过程中被切换!完成注册过程。
- 样品
- 试管贴上标签后, 使用经认证的第2类生物安全柜处理样品并制作样品。一个可以用来立即测试, 另一个可以保留, 供参考或重新测试。
- 当标本到达与鼻部尖在病毒运输介质, 搅拌在培养基中的棉签尖端 30秒, 并挤压它对小瓶的一侧。然后将其从介质中取出, 并使用生物危险废物协议 (适当丢弃、高压灭菌或挂入 1: 100 氯溶液) 处理。
注: 应存储的介质的最小体积为 0.5 mL。因此, 一个3毫升的样品可以分为六个等价物 (子样本)。对于 0.5 mL 的每个样品, 使用 1 mL 冷冻储芯, 为冷冻介质提供额外的体积。 - 服用等价物时, 对每个样品使用新鲜无菌或一次性移液器, 并将其丢弃到生物危险废物容器中, 以避免交叉污染。确保每个管子都是密封和封闭的。
- 利用每个样品的一个等价物立即提取, 并将任何其他等价物存放在冰柜中 (在-80°c, 因为它是呼吸标本), 供将来使用。
- 在迁移到工作站之前, 请使用漂白剂清洁所有工作空间表面和设备, 然后使用70% 的乙醇溶液。
- 提取和纯化
- 为了保证检测质量, 请将条形码 PCR 样品的等价物从样品处理区域转移到指定提取的工作站 (BSL-2 安全柜)。这个安全柜有一套单独的移液器, 用于处理样品。
- 使用病毒 RNA 迷你试剂盒提取 RNA 样本。按照制造商的说明, 通过自旋协议纯化病毒 RNA。根据需要提取的样品数量准备主组合。将样品和裂解缓冲液在室温下混合。
- 准备需要提取的样本数。用条形码号或唯一标识符标记 1.5 mL 微型离心机管。
- 将移液器设置为 560μl. 应用干净的移液器尖端。在每个标记的管中加入560μl 的裂解缓冲液。丢弃提示。涂上干净的移液器尖端。加入140Μl 的样品。丢弃旧的, 并应用干净的移液器提示。使用其他示例重复此操作。涂上干净的移液器尖端。在负控制管中加入140Μl 缓冲液。牢固地关闭每个管。
- 脉冲涡流样品脂肪1与裂解缓冲液 15秒. 重复与样品脂肪2 和控制管。每个样品进行5米离心, 在室温下将样品培养10分钟。
- 孵育10分钟后, 重新离心管, 以去除每个管盖内的任何液滴。在样品中加入560μl 乙醇溶液。更换移液器尖端。对任何剩余或其他示例重复此操作。将每个样品管牢固地关闭, 并将每个样品的脉冲涡流为 15秒. 微离心机样品为5秒。
- 将混合物应用于自旋柱。获得干净的2毫升收集管。添加自旋列, 并将其标记为与示例匹配。将630μl 的样品转移到匹配的色谱柱上, 相应地。
- 固定瓶盖并移动到离心机。将样品均匀地分布在离心机中。离心以 6000xg 的速度进行1分钟的离心, 以去除裂解缓冲液。回到工作站。更换收集管。加入剩余的裂解缓冲液, 重复离心步骤。丢弃原来的脂肪样品管。
- 处理洗脱液, 并用两个缓冲器清洗自旋柱。应用500Μl 的缓冲区 AW1。对每个示例重复此操作。将每个样品和离心机的瓶盖固定在 6 , 000xg, 每次1分钟。重复与第二个缓冲区 AW2 和离心机在 20, 000xg 3分钟.
- 最后加入洗脱缓冲液来洗脱 RNA。将色谱柱放入干净的 1.5 mL 管中, 打开柱, 加入60Μl 的缓冲 AVE, 在室温下培养 1分钟, 在 6, 000 x克离心器1分钟。这些样本现在已经准备好进行 PCR 分析。
- PCR 扩增和检测
- 在指定 PCR 的单独区域进行 PCR 扩增。根据制造商的说明, 使用 PCR 协议对病毒靶标进行一步扩增。请注意, 主混合物是使用病毒特异性引物、探针、2x RT-PCR 缓冲液和 RT-PCR 酶制成的。将主混合添加到板材或管材中, 然后添加和混合单个样品 (参见第4.4 节)。
- 将板材转移到 PCR 机器, 并根据病毒目标扩增条件运行。一旦样品被加载到 PCR 仪器上, 大约需要90分钟才能完成运行。
- 设备使用后的维护
- 根据表 2,在设备使用后进行定期和定期维护。
4. 在 BSL-3 实验室设施中通过 RT-PCR 快速诊断流感病毒
注: 在 BSL-3 条件下, 实验协议将保持不变, 但安全措施将优先于其他任何情况。在进入 BSL-3 实验室之前, 通过透明的窗口查看, 以确保手套箱单元中已建立负压。很明显, 当墙上的粉红球可见时, 已经建立了负压。
- 接收和注册
- 一旦负压已经建立, 打开门, 进入单位。立即洗手, 然后继续进行个人防护设备。应用 PPE 和工作流 BSL-3 的检查表 (请参阅第2节)。
- 按以下顺序进行 PPE: 在手套、长袍、鞋套、面罩、面罩、第二副手套下。建议穿上保护全身的全套长袍。
- 打开机器, 让手套箱中的压力稳定下来。使用漂白剂喷雾溶液对手套箱内外使用的所有区域和用品进行净化。将漂白剂废品放入只有漂白剂的容器中。使用70% 的乙醇溶液清除任何使用漂白剂的区域。
- 通过传递窗口传输样品。
注: 在通过窗户掉落之前, 将含有样品的管道通过浸入次氯酸盐浴1-2分钟来消毒, 特别是用漂白剂溶液喷洒样品, 单独停留至少 1分钟, 然后再接收在 BSL-3 单元内。从外部传递样品的人和接受样品的人, 在 BSL-3 实验室内提取样品的人不应该是相同的。 - 接收 BSL-3 单元内的样品并进行清理, 然后再进行注册和标记步骤。
- 使用基于交互式平板电脑的系统或便携式计算机注册示例。使用以下信息标识示例 (请参阅3.1.5 节)。
- 使用条形码标记管道。如果条形码不可用, 请使用耐酒精标记。
注: 始终标记小瓶本身, 从来没有盖, 因为这可以在处理过程中切换!
- 样品
- 一旦样品被登记, 管已被标记, 将样品放入认证的手套箱通过空气锁定托盘检索样品从手套箱内。关门。然后通过手套箱打开另一扇门, 取回样品。不要同时打开两扇门。打开和关闭每个门在两个不同的步骤, 以采取安全预防措施。打开 UV-C 照明。
- 一旦样品被安全地转移到手套箱内部, 请按照前面描述的步骤在手套盒中创建样品。一个样本可以用于即时测试, 另一个可以保留用于参考或重新测试。标本到达与鼻部尖在病毒运输介质。取标本, 并把一个到每个小瓶。将棉签在介质中搅拌 30秒, 并将其挤压到小瓶的一侧, 然后将其从介质中取出并使用生物危险废物协议 (适当丢弃、高压灭菌或挂入 1: 100 氯溶液) 进行处理。
注: 应存储的介质的最小体积为 0.5 mL, 为此使用1毫升小瓶。因此, 一个3毫升的样品可以分为六个等价物 (子样本)。 - 对每个样品使用新鲜的无菌或一次性移液器, 并将其作为生物危险废物丢弃。一旦样品被引用, 将样品移动到密闭的容器中。用保护物关闭小瓶, 然后从手套盒中取出。
- 在手套箱内, 关闭生物危害废物袋, 准备一个新的废物袋, 以避免交叉污染。然后使用漂白剂对手套盒工作区进行消毒 5分钟, 并对70% 乙醇溶液进行消毒。
- 利用每个样品的一个脂肪进行即时分析, 并将其他的保存在-80°c 的冰柜中, 因为它是一个呼吸标本。去污后, 请保留一个例外进行测试, 将所有样品移出手套箱, 存放在-80°c 的冰柜中。
- 提取和纯化
- 去污后, 将 PCR 分析所需的条形码样品从样品处理区域移回手套箱。
- 在手套盒中, 执行提取过程的所有裂解步骤。根据制造商的说明, 使用病毒 RNA 迷你试剂盒提取 RNA 样品。按照制造商说明中的自旋协议进行病毒 RNA 纯化的分步说明。
- 准备需要提取的样本数。用条形码号或唯一标识符标记 1.5 mL 微型离心机管。
- 在样品和脉冲涡流的140μl 中加入560Μl 的裂解缓冲液。在室温下孵化10分钟。
注: 失活过程可能因正在提取的 BSS-3 病原体的类型而异, 在某些情况下可能需要进一步的失活。 - 裂解步骤后, 将每个样品上的瓶盖紧密密封, 并放入加压的空气锁定通道 (如果离心机放置在手套箱外)。将裂解的样品转移到生物安全柜, 完成剩余的程序。
注: RNA 的提取和纯化过程可以在手套盒或手套盒中完成, 然后根据 BSL-3 病原体和所需的协议在生物安全柜中完成。 - 确保使用漂白剂再次净化工作空间和手套箱中的用品, 并使用70% 的乙醇溶液清洗以前暴露在漂白剂下的所有区域。
- 按照3.3.6 部分中的步骤-3.3.10 清洗和纯化 RNA。
- 提取后, 将样品转移到传递窗口进行 PCR 分析。
- 根据第2部分, 在样品被取出并转移后, 对手套箱外的实验室工作空间进行去污处理。
- 在拆除个人防护设备之前, 要等到设备内的空气流通安全地达到适当的过滤周期数, 然后再开始拆除个人防护设备。根据第2部分, 在将所有个人防护设备取出并处置到个人防护设备废物容器后, 立即在实验室用肥皂和水洗手, 然后离开该装置。
- PCR 扩增和检测
注: PCR 扩增是在指定 PCR 的单独区域进行的, 并通过传递窗口与手套盒区域连接。工作空间和耗材必须在测试前进行去污。- 从传递窗口中取出提取的 RNA 样本。
- 使用一步 PCR 协议对病毒靶标进行 PCR 扩增。使用病毒特异性引物、探针、2x RT-PCR 缓冲液和 RT-PCR 酶制备主混合物。对于每个靶向检测, 请使用具有以下成分的 1.5 mL 管: 水、引物和探针、2倍缓冲液和 RT-PCR 酶。漩涡和旋转主混音。
- 将主根混合到每个带管中。一旦主混合物制备好, 即可将 PCR 试剂盒恢复到推荐温度下存储。
- 使用每个带材管之间的单独尖端将单个样品添加到每个带材管中。在 1, 500 转/分的情况下旋转样品板或管1分钟。样品已准备好加载到实时 PCR 单元。
- 将样品中的板材转移到 PCR 仪器, 并根据病毒靶点扩增条件运行机器。完成一次运行大约需要90分钟。
- 根据第2部分, 在收集结果并离开实验室之前, 取出个人防护设备并对每个工作站进行适当的净化, 并为下一次诊断测试做好准备。
- 设备使用后的维护
- 根据表 2,在设备使用后进行定期和定期维护。
注: 整个诊断周转时间约为4小时。提取时间和 PCR 设置时间可能因样本数量的不同而不同, 相应的诊断测试可能需要4-5 或更长时间。
- 根据表 2,在设备使用后进行定期和定期维护。
Representative Results
这项研究的目的是证明拟议的 BSL-2 和 BSL-3 移动实验室设施提供了一个适当的环境, 使呼吸道病毒诊断测试具有代表性的结果与高质量的测试相同固定实验室。实验室设施的设计符合职业健康和安全 (OHS) 建议中的测试要求。一旦部署了远程实验室设施 (图 4), 并安装了所有设备和用品 (图 5), 就可以进行实验室测试。
根据实验室标准作业程序, 需要适用于 BSL-2 实践的 PPE (实验室外套、防护鞋、手套、高级面罩、防护眼镜等)。对于 BSL-3 实践, 负压 PCR 实验室模块配备了经过认证的手套盒。实验室单位通过外部直通窗口进行升级, 以在样品接收步骤中保护人员。注册过程可以通过以前开发的基于平板的应用程序 (图 3d) 进行简化。在笔记本电脑上运行的其他可接受的应用程序也可以使用。
这种特殊的呼吸道病毒诊断测试可以在连接的实验室模块中进行, 以单独的诊断程序步骤, 以避免污染或生化试剂之间的潜在干扰, 这可能会影响测试结果。为了最大限度地提高诊断质量, 快速诊断测试实践利用了 (一) 基本实验室 BSL-2 和横向连接的 PCR 室 (第3节) 或 (ii) 通过直通窗口连接的 GB 和 PCR 室 (第4节)。图 6显示了所建议的实验室工作流程图, 并强调了个人防护。该图认识到每个指示步骤对人员保护的重要性, 特别是在偏远地区的实验室工作人员接受最低限度培训的情况下。
流感的快速诊断测试是通过 RT-PCR 技术完成的。该过程包含四个主要步骤。请注意, 将为协议的每个阶段分配单独的工作区。
第一步是获得一个样本, 并将其细分为几个等价物。然后, 可以用条形码来标记等价物, 以提高数据控制的有效性, 并将其存储在冰柜中, 以便进一步调查。第二步是通过离心和加热来灭活裂解缓冲液中的样品。第一步和第二步必须在生物安全柜内进行。利用单独的移液器套件和设备。建议在 PCR 室进行 PCR 测试 (如果有的话)。第三步是记录结果。第四步是设备使用后的维护, 并在实验结束时提醒人员保护。
如果样品预计将被归类为 BSL-3 + (例如, 埃博拉、寨卡、中东呼吸和储存、结核病), 则必须使用手套箱设施。在远程实验室中, GB 室有自己的直通窗口来接收样品和笔记本电脑或平板电脑进行样品注册。样本的脂肪和病毒的失活都必须在手套箱内进行。建议使用 UV-C 照明, 以避免在手术过程中受到污染。在样品失活后, 协议的进一步步骤类似于基本的实验室 bsl-2 和 bsl-3 测试, 并遵循清单第三部分 (表 1,图 6).
图 1。实验室设施原型.(A、B)运输方式;(C) 部署模式: 外部;(D) 部署模式: 内部。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2. 原理图.(A) 基本实验室 bsl-2;(B) bsl-3 模块包括手套箱和 pcr 实验室, 其中有一个用于受保护标本转移的共同传递窗口;(C) 连接的实验室设施 (a) 和 (b) 与共用公用事业。(D,E)从对立面连接的单位的照片。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3。(A) bsl-3 设施的内部有 (1) 直通窗口、水槽和 (2) 入口的洗眼站;(B) 电力连接器, (c) 水连接器;(D) 用于供应跟踪和实验室结果文件的基于平板电脑的软件。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4. 实验室设施的部署.说明 (a-d) 中在设备一侧展开的面板的说明。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5. 可连接实验室的原理图:(A) bsl-2 单元 1;(B) 手套盒和 pcr 模块2。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6.远程实验室设施中呼吸道病毒诊断 RT-PCR 测试流程图.请点击这里查看此图的较大版本.
| 远程实验室 BSL-2 | 远程实验室 BSL-3 |
| 第一部分 | 第一部分 |
| i. 实验室技术进入通过门标记的入口, 并把实验室外套, 这是挂在机架上的入口门旁边。禁止打开鞋子, 鼓励高级面罩和防护眼镜。 | i. 实验室技术从单位外部查看手套箱窗口, 以确保负压被激活。(粉红球应该是可见的单位, 以显示负压工作)。 |
| 二、实验室技术, 在水槽洗手, 戴上一次性手套, 并开始摄入样品。 | ii. 如果负压起作用, 实验室技术只进入门, 穿上挂在入口门旁边架子上的实验室外套。 禁止穿开鞋, 高级面罩和防护眼镜是可取的。 |
| 三、在通过窗口掉落前在次氯酸盐浴中浸渍的样品正坐在通过中进行实验室技术。 | iii. 实验室技术, 在水槽洗手, 戴上一次性手套, 个人防护设备, 并开始摄入样品。 |
| 四、样品接收。 | 四、以前在通过窗户之前在次氯酸盐浴中浸渍的样品正坐在通过实验室技术上。 |
| 第二部分 | v. 在样品接收中收到。 |
| v. 根据诊断程序, 标本转移到生物安全柜并灭活。 | 第二部分 |
| 为显微镜、离心机或 Rot 准备的样品。 | 在手套盒中停用的标本。 |
| 七. 进行适当的诊断测试。 | 七. 用于核酸分离的样品。 |
| 八. 将标本存放在4°C 冰箱或适当的冰柜中。 | 八. 提取后, 标本转移到直通窗口。 |
| 第三部分 | 实验室技术通过进入单位 PCR 一侧的入口 (正压) 进入。 |
| 九. 使用水槽染色 & 清洗物品。 | 实验室技术, 把实验室外套从架子旁边的入口, 洗手在水槽, 戴上手套。 |
| x. 使用笔记本电脑 & 的平衡来执行分析和文档。 | 在直通窗口接收来自手套盒的样品。 |
| 十一、通过运行高压灭菌器对设备进行消毒。 | 如有必要, 在层流柜中准备样品。 |
| 十二. 在生物危险废物容器中处理任何生物危险废物。 | 十三. 运行适当的诊断测试。 |
| 十三. 在水槽里洗手。 | 十四. 将标本存放在4°C 冰箱或适当的冰柜中。 |
| 十四. 把实验室的外套挂在架子上。 | 第三部分 |
| 从同一扇门出口。 | xv. 使用水槽染色 & 清洗物品。 |
| 十六. 使用笔记本电脑 & 的平衡来执行分析和文档。 | |
| 十七. 将小瓶转移到直通窗口到 PCR 室, 并通过运行高压灭菌器对设备进行消毒。 | |
| 十八. 在生物危险废物容器中处理任何生物危险废物。 | |
| 十九. 在水槽里洗手。 | |
| 通过同一入口门出口。 |
表1。PCR 诊断工作流的检查表。
| 维护和校准 | ||
| 实时 PCR 系统 | 每月 | 每月执行背景校准 |
| 18个月 | 每18个月进行一次背景、空间和染料校准 | |
| 离心 机 | 1年 | 通过外部或内部校准服务, 对每分钟旋转和温度进行校准 |
| 手套盒 | 日常 | 目视检查元件, 特别是对 HEPA 过滤器、手套、o 形环和软管的暴露表面是否损坏。确保管道夹具紧固到位。执行泄漏压力测试。测试压力报警器。 |
| 6个月 | 更改 HEPA 过滤器 | |
| 1年 | 校准系统 | |
| 高压 釜 | 每周 | 使用温和的非磨料洗涤剂清洁水箱和衣架 |
| 3个月 | 校准计时器和仪表 | |
| 1年或每50个周期 | 检查、彻底清洁、测试和校准 | |
| 冰箱和冰箱 | 6个月 | 检查风扇电机、蒸发器线圈、吸尘冷凝线圈和冷凝器过滤器, 并根据需要更换电池 |
| 1年 | 通过内部或外部校准服务校准冰柜 | |
表2。实时 PCR 设备维护。
| 强制性 | 推荐 |
| 实验室外套、防护鞋、手套 | 实验室外套、防护鞋、手套、口罩、眼镜 |
| 冰箱 4°C, 冰柜-20°c | 冰箱 4°C, 冰柜-20°c, 冰柜-80°c |
| 一套自动移液器 | 三套自动移液器 |
| 离心机、振动台、热循环机 | 机器人系统 |
| RT-PCR 机, 冰浴 | RT-PCR 与温度控制, 无冰冷却器 |
| 生物危害废物袋 | 处理生物危害废物的高压灭菌器 |
表3。RT-PCR 呼吸道病毒诊断试验 BSL-2 的最低要求。
Discussion
上述远程实验室设施是面向后勤、可扩展、可快速部署、多功能的, 并以以人为本的设计理念为基础, 旨在保护实验室人员和工作空间的效率。开发并提出了快速实验室设置和安全呼吸道病毒分离诊断的详细方案。
为了使设备正常工作, 必须在实验室单位保持以下条件: 环境温度 21±2°C, 允许温度为5至 40°c, 湿度为 14±5% RH, 允许最大湿度为80% 相对湿度 (非冷凝),海拔0至 2, 000 米。
能耗是离网实验室管理的重要参数之一。对于核心实验室设备, 功率效率可以相差 15-40;然而, 这里估计平均能耗是为了提供适当的服务。最高功率率 (1500-2000 w) 涉及空调、保险箱系统、PCR 机和高压灭菌器。考虑到执行协议的时间为 8小时, 实验室环境控制需要 16小时, BSL-2 实验室单位的每日能耗约为36千瓦日, BSL-3 约为 43天, 所连接设备的每日能耗约为 43天, 所连接设备的每日能耗约为73天。BSL-2\ BSL-3 + 设施。对于单个单元, 我们建议提供一个电源的功率与运行/连续功率≥8千瓦, 外科/启动功率≥10千瓦;对于连接的设备, 运行连续功率≥12千瓦, 和外科/启动功率≥14千瓦。请注意, 在 BSL-3 实验室设施中, 强烈建议使用备用能源, 以避免意外断电, 并保证在诊断测试期间手套箱和负压系统的稳定工作。
汽油动力发电机是应急能源供应的一种具有成本效益的解决方案。假设汽油发电机在100% 负载下的燃油效率约为每小时1.5 加仑。然后, 如果平均每日能耗为8小时的40% 负载和16小时的10% 负载, 则实验室单元 BSL-2 或 BSL-3 需要每天7-9 加仑的燃料, 而连接的设施则需要约15加仑/天。
远程实验室单元的设计适合离网太阳能电池板系统的功能。太阳能电池板不需要额外的燃料, 由于太阳辐射较高, 可以在非洲、亚洲和拉丁美洲的热带和亚热带地区以高生产率运行。目前, 商用太阳能电池板系统的一个单元允许每天使用高达 44 kWh/day 的电力。
无论选择哪种类型的替代电能, 实验室设施都强烈建议并预先安装脏电过滤器, 以提高电能质量并保护实验室设备。使 PCR 系统远离强的和非屏蔽的电磁辐射源, 因为强电磁辐射可能会干扰设备的正常运行。同样重要的是, 不要使用 PCR 系统附近的强振动源, 如离心机或泵, 因为过度振动会影响仪器性能。实验室设备只能安装在具有非导电污染物的环境中, 如灰尘颗粒或木屑。确保房间远离任何可能将颗粒物排出到仪器组件上的通风口。
实验室用水的使用取决于每天进行的诊断测试的数量和在该设施工作的实验室技术人员的数量。在包括提取和 PCR 测试在内的诊断过程中, 混合器的制备需要无核酸酶水, 并且必须作为其他用品和化学品提前交付。运行一次诊断试验至少需要50毫升的无核酸酶水;所需的无核酸酶水的体积取决于工作负荷 (即样品的数量)。运行高压灭菌器需要蒸馏水。一次循环的高压灭菌器耗水量为160-180 毫升;建议使用高压灭菌器进行日常使用。大多数塑料 (管道、移液器吸头等) 都是一次性的, 但也有一些是可重复使用的, 需要清洗 (大型容器、机架等)。常规自来水用于洗手之间的程序和其最小体积估计为15-20 升每天。水需要泵送压力;建议采用沉淀预过滤系统, 保护水工免受泥沙的破坏影响, 提高自来水质量。
对于冷库, 每个实验室单元至少需要一个5.1 立方英尺的冰箱 (+ 4°c) 和一个4.9 立方英尺 (-20°c 至-30°c) 的冰柜来存放样本/RNA。
实验室去污包括几个层面: 清洁 > 防腐 > 消毒 > 消毒。使用肥皂和水进行简单的清洁, 同时用戴手套的手或刷子擦洗。防腐包括用液体抗菌化学品清洗, 以抑制细菌的生长和繁殖。酒精溶液 (70%)可用作防腐剂。消毒是一种液体化学物质的应用, 用于消除工作表面和设备上几乎所有的病原微生物 (细菌孢子除外)。化学接触时间、温度和消毒剂浓度都很重要。次氯酸钠溶液 (0.5%), 或漂白剂, 是一种有效的大规模消毒剂, 用于表面净化和净水。紫外线杀菌照射是另一种消毒方法。杀菌灯产生 UV-C 光, 并导致细菌和病毒的失活。灭菌采用物理或化学方法来破坏所有微生物的生命----包括高耐受性的细菌孢子。灭菌可以用高压灭菌器进行。
所有实验室废物必须在产生时加以隔离。将固体、非锋利的传染性废物放入标记为生物危害的防漏废物袋中。如果产生的废物是尖锐的, 它必须放在防刺穿容器中。在贴有适当标签的生物危害容器中收集潜在的传染性液体废物。容器和袋子的填充量不应超过 2/。所有漂白剂产品的处置必须在自己指定的垃圾桶中进行分类。实验室废物必须温和处理, 以避免产生气溶胶和袋式容器破损。含有生物危害废物的收集袋/桶必须密封, 外部表面在使用0.5% 次氯酸钠溶液后必须进行净化。在焚烧前, 在121°c 高压灭菌器中对所有实验室废物进行30分钟的消毒。有关高压灭菌器的正确使用, 请参阅功能手册。如有可能, 在高压灭菌器中添加化学或生物指示器, 以确保适当的灭菌。所有蒸压固体和液体废物必须清楚地标记为消毒, 并设置、日期、时间和操作方式。然后, 在焚烧之前, 必须将标记的废物放置在安全、独立的区域。
正如所料, 诊断测试的工作流程取决于疾病和标本。如果建议进行病毒鉴定以采集血液样本 (例如埃博拉19), 则可以在-20°c 而不是-80°c (呼吸道病毒所必需) 储存样本。从病人身上取样时, 总是比以后对标本进行细分要好。如有可能, 对于每种类型的试样, 必须在单独的试样管中至少采集两个试样。如果不可能进行额外的采样, 则必须对样本进行细分。
如果替代样品不能在适当的温度下储存 (例如, 没有冰柜), 则应将棉签储存在纯 (100%) 中。乙醇或99% 甲基化的精神 (仅限甲醇添加剂)。在这种情况下, 必须将棉签尖端放入含有1-2 毫升乙醇的小瓶中。请注意, 此类标本仅适用于 PCR。另外, 请注意, 对于每一种特定的病毒诊断, 都需要有一个完善的检测方法, 即8、23和未知的病毒样本必须送往指定的实验室进行进一步调查19、20、 21岁
必须承认对呼吸道病毒诊断 PCR 检测实验室设备清单的强制性和建议性要求。表 3着重说明了基本和最低先进 (推荐) 设备以及 RT-PCR 诊断测试的要求。对于 BSL-3 实践, 人员的额外负压保护 (如手套盒) 至关重要。
连接的实验室模块最好是增加参与实验室测试的人员数量, 并加快一次测试所需的时间。使用自动 qPCR (例如, QiaCube) 可以替换耗时的手动 RNA 提取。虽然该仪器是笨重的 (宽度65厘米, 长度62厘米, 高度86厘米), 它可以适合移动实验室工作空间后, 重新排列家具在 BSL-2 或 BSL-3 单位。
今后的工作将侧重于发展增强现实和虚拟现实培训。AR/VR 眼镜将用于提供一个互动平台, 教授成为训练有素的实验室工作人员所需的必要技能。在实验室诊断测试中执行一些困难的多步骤程序的有用提示将包括在软件指南中。这种人员培训方法应提高远程实验室设施, 特别是偏远和资源受限地区诊断测试性能和管理的质量。
Disclosures
贝勒医学院拥有美国移动诊所临时专利申请 (美国专利申请号 15/523126, # 620078924)。提交人声明, 他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
本文的内容不一定反映美国卫生与公众服务部或与作者有关联的机构的观点或政策。这项研究得到了 Paul G. allen 家庭基金会的支持, 该基金会 "增强零影响, 紧急智能吊舱"。我们深切感谢与美国航天局约翰逊航天中心贝勒医学院、GSS 健康学院的同事们进行的富有成果的讨论与合作。我们衷心感谢赛默费舍尔公司及其代表租借 RT-PCR 机器、离心机和自动移液器, 在远程实验室设施中进行呼吸道病毒诊断测试。作者感谢玛尔塔·斯托-德斯蒙德和西德尼·斯蒂芬·索雷尔在手稿准备和录像方面的协助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave Sterilizer 'BioClave' | Benchmark Scientific, Edison, NJ, USA | B4000-16 | 16 liter, Benchtop, Dims: 22x17.5x15.7 in, Fully automatic, Extremely Compact |
| Barcode Scanner | Zebra Technologies ZIH Corp., Lincolnshire, IL, USA | Symbol LS2208 | Handheld, lightweight |
| Breaker Box Panelboard Enclosure | Square D (Schneider Electric), France | MH62WP | NEMA 3R/5/12, Dims: 20 W x 62 H x 6-1/2 in. D, Electrical distribution board |
| Centrifuge - Microcentrifuge 17,000 x g | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA | 75002440 | Holds 24 x1.5 or 2 ml tubes, Dims: 8.9x9.6x13.8 in |
| Class II Biological Safety Cabinet | NuAire, Inc., Plymouth, MN, USA | NU-602-400 | 4 Ft. Class II Type A2 Cage Changing Biological Safety Cabinet, 12" Access Opening, HEPEX Pressure Duct |
| Class III Biological Safety Cabinet (Glove box) | Germfree Laboratories, Ormond Beach, FL, USA | Model #PGB-36, Serial #C-2937 | Glove box, Portable, 36", Class III BSC. Dims: 36x20x23.75 in, Includes 2 interior outlets |
| Cryo Coolers | VWR, Radnor, PA, USA | 414004-286 | 0.5 or 1.5 ml tube benchtop coolers |
| Freezer (30°C freezer) | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA | Model ULT430A | To occupy 4.9 Cubic feet |
| Laminar Flow Cabinet | NuAire, Inc., Plymouth, MN, USA | NU-126-300 | 3 Ft. Vertical Laminar Airflow Cabinet, 8" Access Opening, HEPA filter supply, 99.99% |
| Mini Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA | 75004061 | Dims: 4.1x5.0x6.0 in |
| Pipettes automated | VWR, Radnor, PA, USA | 05-403-151 | Pipet 4-pack (2.5,10, 100 and 1,000μL volume) |
| Pipettes automated 'Finnpipette' | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA | 4700880 | Pipet 4-pack (2, 20, 200 and 1,000μL volume), Advanced Volume Gearing(AVG), Ultra durable |
| Power Generator | Cummins Power Generation, Minneapolis, MN, USA | C60 D6 | 60 kW, 60 Hz, 1 Phase, 120/240V, Diesel |
| Refrigerator | BioMedical Solutions, Inc., Stafford, TX, USA | BSI-HC-UCFS-0504W | Standard Undercounter Refrigerators & Freezers |
| Refrigerator | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA | 05LRAETSA | To occupy 5.1 Cubic feet |
| RT-PCR machine 'Step-one plus' | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA | 4376598 | Holds 96 samples, Dims: 9.7x16.8x20.2 in |
| Vortex Mix | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA | 88880017TS | Dims: 6.1x8.3x3.3 in |
| Chemicals | |||
| AgPath-ID One-Step RT-PCR Reagents | Applied Biosystems, Foster City, CA, USA | 4387391 | |
| Ethanol Koptec Pure 200 Proof | Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA | V1001 | |
| Nuclease-free Water | Ambion, Inc., Carlsbad, CA, USA | AM9906 | |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 52906 | |
| SuperScript III Platinum One-Step qRT- PCR Kit | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | 11732-088 | |
| Disposable | |||
| 1 mL cryogenic tubes | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA | 03-337-7X | |
| 1.5 mL tubes | VWR, Radnor, PA, USA | 10025-726 | |
| 10 µL Filter Tips | Neptune, VWR, Radnor, PA, USA | Neptune, BT10XLS3 | |
| 20 µL Filter Tips | Multimax, BioExpress, VWR, Radnor, PA, USA | MultiMax, P-3243-30X | |
| 200 µL Filter Tips | ART, Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA | ART, 2770 | |
| 1000 µL Filter Tips | Phenix Research Products, Candler, NC, USA | TS-059BR | |
| AB custom probes | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA | N/A | Custom probes |
| Combitips | Eppendorf, Hauppauge, NY, USA | 89232-972 | |
| Integrated DNA Technology (IDT) custom probes and primer | IDT | N/A | Custom probes |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA | 490003-978 CS | |
| MicroAmp Fast Reaction Tubes (8 tubes/strip) | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA | 4358293 | |
| MicroAmp Optical 8-Cap Strip | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA | 4323032 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA | 4311971 | |
| Supplies | |||
| Biohazard waste bags | VWR, Radnor, PA, USA | 14220-046 | 20.3 x 30.5 cm Biohazard bags |
| Gloves | Denville Scientific, Holliston, MA, USA | G4162-250 | Small, meduim or large Nitrile or latex gloves |
| Lab coat | N/A | N/A | Customizable |
| Masks | VWR, Radnor, PA, USA | 414004-663 | Advanced protection mask |
| Protective shoes | N/A | N/A | Customizable |
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