Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

מורפולוגית ופונקציונלית הערכה של הסרט סינפסות בתדר ספציפי אזורים של העכבר שבלול

doi: 10.3791/59189 Published: May 10, 2019
* These authors contributed equally

Summary

כתב יד זה מתאר פרוטוקול ניסיוני להערכת מאפיינים מורפולוגיים ומעמד פונקציונלי של הסינפסות של רצועת הכלים בעכברים נורמליים. המודל הנוכחי מתאים גם לרעש המושרה והקשורות לגיל synaptopathy מודלים מוגבלים. גם התוצאות של לימודי העכבר הקודמים נדונו.

Abstract

שבלול תאים שיער פנימי (IHCs) לשדר אותות אקוסטיים לולייניות גנגליון נוירונים (SGNs) דרך הסינפסות רצועת הכלים. מספר מחקרים ניסיוניים הראו כי הסינפסות תא השיער עשוי להיות המטרות הראשוניות באובדן שמיעה sensorineural (SNHL). מחקרים כאלה הציעו את המושג של שבלול "synaptopathy", אשר מתייחס שינויים מספר סינפסה בסרט, מבנה, או פונקציה שתוצאתה שידור סינפטית נורמלי בין IHCs ו SGNs. בעוד synaptopathy שבלול הוא בלתי הפיך, זה לא משפיע על סף השמיעה. במודלים ניסיוניים המושרה ברעש, נזק מוגבל לסינפסות IHC באזורי תדר נבחרים מועסק כדי לזהות את הגורמים הסביבתיים הגורמים במיוחד לsynaptopathy, כמו גם להשלכות הפיזיולוגיות של הפרעה לאוזן הפנימית הזו מעגל. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לניתוח מורפולוגיה סינפטית שבלול ותפקוד באזור תדר ספציפי בעכברים למבוגרים. בפרוטוקול זה, לוקליזציה של שבלול של אזורים בתדר ספציפי מבוצעת באמצעות מפות מקום תדר בשילוב עם נתונים cochleogram, בעקבות המאפיינים מורפולוגית של סינפסות הסרט מוערכים באמצעות סינפטית חיסוני. הסטטוס התפקודי של הסינפסות ברצועת הכלים נקבע לאחר מכן על בסיס המוני של תגובת המוח השמיעה (ABR) גל I. הדו ח הנוכחי ממחיש כי גישה זו יכולה לשמש כדי להעמיק את ההבנה שלנו של הפתוגנזה ומנגנונים של תפקוד סינפטית ב שבלול, אשר עשוי לסייע בפיתוח התערבויות טיפוליות הרומן.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תדרים בטווח של כ 20 \ u201220, 000 הרץ ניתן להיתפס כגירויים שמיעתי על ידי בני אדם. השמיעה האנושית היא בדרך כלל רגיש ביותר בקרבת 1,000 Hz, שבו רמת הלחץ הממוצע הקול הוא 20 μPa במבוגרים צעירים (כלומר, 0 דציבלים של רמת לחץ קול [dB SPL]). בכמה מצבים פתולוגיים, אובדן שמיעה מוגבל לתדרים ספציפיים. לדוגמה, בשלבים המוקדמים של אובדן שמיעה המושרה רעש (NIHL), "חריץ" (כלומר, שמיעה העלאת הסף) ניתן לצפות audiogram ב 4 kHz1. לאורך מחיצת שבלול היונקים, ההדרגתיות של נוקשות והמסה לייצר מפת תדר מעריכי, עם זיהוי צליל בתדר גבוה בבסיס של שבלול ואיתור תדר נמוך בקודקוד2. אכן, יש מפה בתדר המקום שבלול לאורך קרום בזיאר, המוביל מה שמכונה tonotopic הארגון2,3. כל מקום נתון על קרום בזיאר יש את הרגישות הגבוהה ביותר רק אחד תדר צליל מסוים, אשר מכונים בדרך כלל את התדר האופייני3,4, למרות התגובות תדרים אחרים ניתן גם לצפות.

עד כה, מודלים של עכברים שונים המועסקים לחקור פונקציה נורמלית, תהליכים פתולוגיים, ויעילות טיפולית במערכת השמיעה. ידע מדויק של הפרמטרים הפיזיולוגיים של שבלול העכבר הוא תנאי מוקדם עבור מחקרים כאלה של אובדן שמיעה. שבלול העכבר מחולק אנטומית לתוך הפונה הבסיס, באמצע, ו בסיס, המתאימות אזורי תדר שונים. על-ידי תיוג עצבי שמיעתי בתוך הגרעין שבלול לנתח אתרים המתאימים שלהם אינבציה היקפית ב שבלול, מולר ואח ' הצליח להקים את מפת תדר שבלול המקום בעכבר רגיל ב vivo5. במרווח של 7.2 – 61.8 kHz, אשר מתאים למיקומים בין 90% ו 10% מהאורך המלא של קרום בזיאר, העכבר שבלול מקום המפה תדר ניתן לתאר על ידי פונקציה רגרסיה פשוטה ליניארית, מציע קשר בין ה מרחק מנורמל מבסיס שבלול והלוגריתם של התדר האופייני5. בעכברי מעבדה, מפת תדר המקום ניתן להשתמש כדי לחקור את הקשר בין סף שמיעה בתוך טווחי תדרים ספציפיים ושבלול מראה את המספרים של תאי שיער חסרים באזורים יחסיים לאורך קרום בזיאר6. חשוב להניח, מפת תדר המקום מספקת מערכת מיקום לחקירה של נזק מבני מינימלי, כגון נזק הסינפסות רצועת הכלים של תאי השיער במקומות ספציפיים תדר שבלול בעכברים עם טראומה שמיעתי היקפית7 ,8.

ב שבלול היונקים, הסינפסות של הסרט מורכבת מסרט טרום סינפטיות, הקרנה צפופה באלקטרון המההילה הילה של שלפוחיות סינפטית מוכנות שחרור המכיל גלוטמט בתוך ה-IHC, ודחיסות פוסט-סינפטית במסוף העצבים של SGN עם קולטני גלוטמט9. במהלך התמרה צליל שבלול, הטיה של החבילה של תא השיער התוצאות ב-IHC depolarization, אשר מוביל גלוטמט לשחרר מ-Ihc אל המסופים הפוסט-סינפטיות, ובכך הפעלת מסלול השמיעה. הפעלת מסלול זה מובילה לטרנספורמציה של אותות מכניים המושרה הקול לתוך קוד תעריף ב-SGN10. אכן, הסרט ה-IHC סינפסה מתמחה במיוחד לשידורי צליל בשיעור של מאות הרץ עם דיוק גבוה בזמן, והוא בעל חשיבות קריטית למנגנון טרום-סינפטית של קידוד קול. מחקרים קודמים גילו כי הסינפסות הסרט להשתנות מאוד בגודל ומספר באזורים תדירות שונים בעכבר למבוגרים שבלול11,12, כנראה המשקף הסתגלות מבנית קידוד צליל מסוים עבור צרכי הישרדות. לאחרונה, ניסויים בבעלי חיים ניסיוניים הוכיחו כי synaptopathy שבלול תורמת לצורות מרובות של ליקויי שמיעה, כולל אובדן שמיעה המושרה רעש, הקשורות לגיל אובדן שמיעה, ואובדן שמיעה תורשתי13, 14. לפיכך, שיטות לזיהוי שינויים בקורלציה במספר סינפטית, מבנה ותפקוד באזורי תדר ספציפיים המועסקים יותר ויותר במחקרים של פיתוח שמיעה ומחלת האוזן הפנימית, באמצעות מודלים שנוצרו באמצעות מניפולציה ניסויית של משתנים גנטיים או סביבתיים15,16,17.

בדוח הנוכחי, אנו מציגים פרוטוקול לניתוח מספר סינפטית, מבנה, ותפקוד באזור תדר מסוים של קרום בזיאר בעכברים למבוגרים. לוקליזציה של תדר שבלול מבוצעת באמצעות מפת תדר מקום נתון בשילוב עם cochleogram. מאפיינים נורמליים מורפולוגית של הסינפסות בסרט שבלול מוערכים באמצעות מערכת החיסונית הפוסט-סינפטית. הסטטוס הפונקציונלי של הסינפסות סרט שבלול נקבע על בסיס המוני suprathreshold של גל ABR I. באמצעות שינויים קלים, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לבחון תנאים פיזיולוגיים או פתולוגיים במודלים של בעלי חיים אחרים, כולל חולדות, שרקנים, וגרבילים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל ההליכים בוצעו בהתאם NRC/ILAR מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (8 ה Edition). פרוטוקול המחקר אושר על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועדת השימוש של האוניברסיטה הרפואית ההון, בייג, סין.

1. בחירת חיות

  1. לכל הניסויים, השתמשו בעכבר זכר מבוגר C57BL/6J (בן 8 שבועות) כמודל החי.
    הערה: C57BL/6J עכברים נושאת אחוו של התערוכה Cdh23 מואצת הזדקנות במערכת השמיעה, משתקף כמו 40% הפסד של הסינפסות של הסרט בתור בסיס של שבלול ו 10% הפסד בתורו באמצע על ידי 6 חודשים של גיל, ואחריו מהיר להגדיל את ההפסד הזה ב שבלול כולו עם גיל18,19. לכן, אנו מייעצים זהירות בעת שימוש בעכברים C57BL/6J יותר מאשר 6 חודשים עבור מחקר השמיעה. זנים אחרים של עכברים ניתן להשתמש בהתאם למטרות ניסיוני ספציפי.
  2. לבדוק את העכברים באמצעות כיס אבחון מקצועי האוטוסקופ כדי לשלול את הפתוגיות החיצוני או האוזן התיכונה לפני הערכות שמיעה. סימנים פוטנציאליים עשויים לכלול נוזל או מוגלה בתעלת השמיעה החיצונית, אדמומיות ונפיחות ברקמה המקומית, ו ניקוב התוף.
    הערה: למרות שהוא נתקל לעתים נדירות, מזוהה פעם, עכברים עם מחלות האוזן החיצונית או התיכונה צריך להיות נשלל.

2. הערכת שמיעה

  1. עכברים מורדם תוך שימוש בהזרקה תוך הצפק של תערובת של קטמין הידרוכלוריד (100 מ"ג/ק"ג) ו-xylazine הידרוכללוריד (10 מ"ג/ק"ג). שופט את עומק ההרדמה באמצעות גירויים כואבים (למשל, רפלקס הבוהן).
    הערה: כאשר רפלקס הבוהן הוא נעדר לחלוטין, החיה הגיעה לעומק הולם של הרדמה לבדיקות שמיעה. אם נדרש זמן רב יותר עבור הקלטות ABR דו-צדדיים, יש לנהל מינון נמוך יותר (חמישית המינון המקורי) של הרדמה כדי לשחזר את מישור ההרדמה המקורי. שמור על עצמך להימנע ממנת יתר של הרדמה, כמו זה עלול להוביל למוות בעכברים.
  2. שמרו על טמפרטורת הגוף של בעל החיים המורתת ב37.5 מעלות צלזיוס בעזרת משטח חימום תרמי. מניחים את בעל החיים ההרדמה בחדר ממוגן חשמלית ומסוכך כדי למנוע הפרעות במהלך מבחן השמיעה.
    הערה: שמרו על הטמפרטורה הפיזיולוגית במהלך ההליך כולו עד שבעל החיים יהיה ער לחלוטין, על מנת למנוע מוות שנגרם על ידי היפותרמיה פוסט-הרדמה.
  3. מקום אלקטרודות המחט משנה (20 מ"מ, 28 G) בקודקוד של הגולגולת (הקלטה אלקטרודה), באזור מתחת הפרוציאני צלעות מתחת לפינה של האוזן נמדד (אלקטרודה התייחסות), ו באזור הפרומלא הצלעות (אלקטרודה הקרקע), עם עומק של 3 מ"מ מתחת לעור של ראש העכבר, בהתאמה20.
  4. השתמש ברמקול בשדה סגור כדי לבצע גירוי אקוסטי באמצעות צינורית פלסטיק של 2 ס מ עם טיפ דמוי חרוט. התאימו את הקצה לתעלת האוזן החיצונית21.
    הערה: ודא כי העכבה החשמלית של ההקלטה התייחסות אלקטרודות הוא פחות מ 3 kOhm (בדרך כלל 1 kOhm). אם העכבה גבוהה, לשנות את האתר הכניסה של האלקטרודה, לנקות את האלקטרודה עם אלכוהול, או להחליף את האלקטרודה כדי למנוע שינויים ב-ABR משרעת גל.
  5. עבור הקלטת ABR, ליצור פיפס טון (3 המשך אלפיות, 1 ms עלייה/סתיו פעמים, בקצב של 21.1/s, תדר: 4 – 48 kHz) ולהציג אותם בירידה SPLs מ 90 אל 10 dB ב 5 \ u201210 dB SPLS צעדים20. במהלך שלב זה, התגובות הם מוגבר (10,000 פעמים), מסוננים (0.1 – 3 kHz), וממוצעים (1,024 דגימות/רמת הגירוי).
    הערה: ABRs נאספים עבור כל רמת גירוי 10 שלבים dB, עם תוספת 5 שלבים dB ליד הסף.
  6. בכל תדר, לקבוע את הסף ABR, אשר מתייחס SPL מינימלי וכתוצאה מכך הקלטה ABR אמין עם אחד או יותר גלים להבדיל זה יכול להיות מזוהה בבירור על ידי בדיקה חזותית (איור 1).
    הערה: בדרך כלל יש צורך לחזור על התהליך של SPLs נמוך סביב הסף כדי להבטיח את העקביות של צורות גל. סף התגובה הוא רמת הגירוי הנמוכה ביותר שבה ניתן לצפות בצורת גל, כאשר ירידה של 5 dB יוביל להיעלמות של צורת הגל.

3. עיבוד רקמת שבלול

  1. לאחר הקלטת ABR, המתת את העכברים המקערים באמצעות פריקת צוואר הרחם, והוא מערוף אותם, חושפים את בולה מהצד הגחוני, ופותחים במספריים חדים כדי לקבל גישה לשבלול.
  2. בעזרת מלקחיים עדינים, הסר את עצמות הזמן, נתק את העורק העצמי, הוצא את הארבס מהחלון הסגלגל, וקרע את קרום החלון העגול. הפוך חור קטן בקודקוד של השבלול על ידי סיבוב בעדינות של קצה מחט (13 מ"מ, 27 G).
  3. לתקן את עצמות מבודדות עם 4% (wt/vol) פאראפורמלדהיד ב 0.1 M פוספט באגירה מלוחים (PBS, pH 7.4) לילה ב 4 ° c. באמצעות שימוש בפיפטה דק, ריקון בעדינות באמצעות החללים perilymphatic באמצעות היישום כדי הסגלגל או העגול חלונות (כמו כניסת) ואת הפתיחה בפיסגה (כפורקן).
    הערה: חלבונים מסוימים דורשים משך זמן קצר של קיבעון כדי למנוע הרס של האפיאוסקופים שלהם לאימונויניום. במקרים כאלה, עצמות הדגירה 4% פאראפורמלדהיד בטמפרטורת החדר (RT) עבור 2 h, בהתאם להוראות של היצרן עבור אימונוהיסטוכימיה. קיבעון יכול גם להתבצע באמצעות זלוף לב להסיר את הדם שבלול, הימנעות רעש הרקע בשל כתמים לא ספציפיים בשלבים מאוחרים יותר, במיוחד בדגמי העכבר של synaptopathy שבלול.
  4. לשטוף את העצמות שלוש פעמים עבור 5 דקות עם 0.1 M קר PBS להסיר פאראפורמלדהיד שיורית. Decalcify העצמות עם 10% החומצה ethylenediamאצטט (EDTA) גם ב RT עבור 4 h או ב 4 ° c עבור 24 h באמצעות טלטול עדין בשייקר אופקי ב 20 סל ד. ניתן לרענן את EDTA באמצע.
    הערה: זמני הדאלציפיקציה כפופים לריכוז ההעדפות של EDTA והעדפות המשתמשים. רקמת decalcified צריך לשמור על מידה מסוימת של קשיחות, אשר מקלה על מניפולציה של בידוד שבלול כולו טעינות בשלבים מאוחרים יותר. עצמות הזמן יכול להיות decalcified תוך 10% EDTA עם סיבוב, המאפשר לחוקרים לעזוב את המעבדה לאחר בדיקות ABR וניסויים קיבעון. זמן הדאלקיפיקציה גמיש בטווח של 20 עד 30 שעות ב -4 ° c.
  5. העבר עצם ברקה אחת מ EDTA ל 0.1 M PBS. השימוש3,5 מלקחיים דומונט ו 27 המחט G כדי לנתח את האזורים apical, באמצע בסיס שבלול בתורו ולאחר מכן לנתח את שבלול מתוך העצם תחת מיקרוסקופ לנתיחה סטריאו (כפי שמתואר בעבר22). הפוך סדרה של חתכים קטנים לאורך הרצועה הספירלית באמצעות להב תער, והסר את קרום הממברנה והקרום של רייסנר (איור 2).
    הערה: כל עוד שבלול הגזור אינו שלם, ניתן לשנות תהליך זה בהתאם לפרוטוקול הרגיל של המפעיל הפרטני.
  6. עוד לנתח את אפיתל השמיעה הנותרים כולל ספירלה לימבוס לתוך שבלול הפרט הפניות (איפקס, באמצע, בסיס עם אזור הקרס) עבור ההכנות להרכבה מלאה.
  7. תחת מטרת הנפט 40x של מיקרוסקופ אור, למדוד את אורך הקרום בזיאר עם קנה מידה של 250 יקרומטר ממוקם העין, אשר ניתן לכוונן לאורך סטריאוקיליה של ihcs.
  8. חישוב אורך של כל שבלול להפוך על ידי הוספת כל אורכי קטע (250 יקרומטר לפלח), ובמקביל להשיג את האורך הכולל של קרום בזיאר על ידי סיכום האורכים של כל סיבוב.
  9. להמיר את האורך הכולל של קרום בזיאר כולל אזור הקרס לתוך אחוזים מבוסס על המרחק מן איפקס שבלול (0% מתייחס איפקס שבלול, 100% לבסיס שבלול).
  10. המר מרחק זה לתוך התדר האופייני לשבלול באמצעות פונקציה לוגריתמית (d (%) = 1-156.5 + 82.5 × log (f), עם מדרון של 1.25 מ"מ/אוקטבה של תדירות, כאשר d הוא המרחק המנורמל מקודקוד שבלול באחוזים, f הוא תדירות kHz), כפי שתוארה בעבר5,6. כך טווח התדר באזור המקביל של קרום בזיאר על כל פנייה שבלול ניתן לרכוש.

4. מאימונולואובורנציה

  1. לאחר הניתוח, המקום כל להפוך את שבלול בנפרד 2.5 mL שפופרת צנטריפוגה ו השבלול מתהפך 10% סרום עז/PBS/0.1% טריטון X-100 עבור 1 h ב RT על מסובבי.
  2. הסר את פתרון החסימה/החדירות לעיל מכל צינור באמצעות טיפ 200 μL מתחת למיקרוסקופ הניתוח ומארג את הדגימות עם נוגדנים עיקריים מדולל ב 5% סרום עז/PBS/0.1% טריטון X-100 לילה ב 4 ° c על מסובבי.
    הערה: עבור immunolabeling של סרטים סינפטיות שבלול, להשתמש בעכבר סמן טרום המוח נגד carboxyl-מסוף כריכת חלבון 2 IgG1 (CtBP2, מתייג את התחום B של חלבון פיגומים RIBEYE, 1:400) ואת העכבר מסמן postsynaptic נגד גלוטמט קולטן 2 IgG2a (GluR2, מתייג יחידת משנה של קולטן אמפא, 1:200)23.
  3. לשטוף שלוש פעמים עבור 5 דקות עם 0.1 M קר PBS להסיר נוגדנים הראשי שיורית מודלת את הדגימות עם נוגדנים משניים מדולל ב 5% סרום עז/PBS/0.1% טריטון X-100 ב RT עבור 2 \ u20123 h בחשכה על מסובבי.
    הערה: להכין תערובות נוגדנים משני המתאים באמצעות עז נגד עכבר באלקסה Fluor 568 (IgG1, 1:500) ו עז נגד עכבר אלקסה Fluor 488 (IgG2a, 1:500), אשר משלימים את הנוגדנים העיקריים המשמשים בשלב 4.2. כדי לשפר את יעילות התיוג עבור סרטים סינפטיות, אנו ממליצים לבחור נוגדנים משניים ספציפיים. מעבדות מסוימות מרחיבות את הדגירה עם נוגדנים משניים כדי להגדיל את GluR2 immunolabeling24.
  4. לשטוף שלוש פעמים עבור 5 דקות עם 0.1 M PBS להסיר נוגדנים משניים שיורית להעביר את הדגימות מ 2.5 שפופרות צנטריפוגה ל 35 מ"מ לוחות המכילים 0.1 M PBS.
  5. מניחים טיפה של המדיום להרכבה המכילה 4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) אל השקופית ולהעביר את הדגימות מ-PBS למדיום ההרכבה. מניחים קצה אחד של שמיכות בשקופית ולשחרר כדי לאפשר את הכיסויים ליפול בעדינות.
    הערה: כדי להבטיח כי תאי השיער הפנים כלפי מעלה וכי אין קיפול או פיתול של דגימות שבלול מתרחשת במהלך ההליך, הר דגימות שבלול תחת מיקרוסקופ לנתיחה סטריאו.
  6. הצב את השקופיות בתיבת שקופיות ב-4 ° צלזיוס ללילה כדי לאפשר לשקופיות להתייבש ולאחר מכן לדמות מתחת למיקרוסקופ לייזר.

5. מורפולוגית הערכה של סרט שבלול הסינפסות

  1. שקופיות תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד עם שלושה לייזרים — 405 ננומטר UV, a 488 לייזר הארגון ננומטר, ו 561 ננומטר דיודה מוצק-מדינה (dpss) לייזר לרגש dapi (הספקטרום העירור 409 – 464 nm), אלקסה fluor 488 (הספקטרום העירור 496 – 549 nm) ו אלקסה fluor 568 (הספקטרום עירור 573 – 631 ננומטר), בהתאמה.
  2. לרכוש קונפוקלית וקד z-ערימות מעל מרחק של 8 יקרומטר מכל שבלול לפנות באמצעות 63 x ברזולוציה גבוהה שמן טבילה העדשה.
    הערה: לאחר ההגדרה, יש לשמור ולהחיל את כל הפרמטרים עבור שקופיות הדיגיטציה ולהחילו בצורה אחידה על כל השקופיות.
  3. עבור ספירות סינפטית, הגדר את הערימות z (0.3 יקרומטר) כדי להקיף את כל האורך של ihcs, ובכך להבטיח שכל הסינפטיות ניתן לדימות.
  4. מזג את התמונות המכילות דקדטה במחסנית z לקבלת הקרנת ציר z, ויבא לתוכנת עיבוד התמונה.
  5. חלק את הספירות הכוללות של הסינפטיות בכל מחסנית z באזורי תדר ספציפיים לפי מספר ה-IHCs (שווה לספירות הידניות של DAPI) כדי לחשב את מספר הדקדפי הסינפטית עבור כל IHCS. בכל אזור תדר ספציפי, הממוצע כל הסינפטיות בשלוש תמונות של שדות מיקרוסקופיים שונים המכילים 9-11 IHCs.
    1. חלוקה לרמות של אזור האינטרסים (ROIs) כולל אזורים בעלי צלעות של כל IHC באמצעות לחצן בחירות ביד חופשית. השתמש בפונקציה מדידה עבור כימות אוטומטי של דקדטה, ואת הפונקציה של פרשת השמש כדי להבחין בין כתמים סמוכים סמוך.
    2. לאחר כל ספירה אוטומטית, בצע בדיקות חזותיות עם תיקונים ידניים כדי להבטיח ספירה מהימנה.
      הערה: מומלץ להישאר מתעוור באשר לשאלה האם השקופית היא מהקודקוד, האמצעי או הבסיס של השבלול.
  6. הערכת חזותית מבנה סינפטית והפצה, כדי לבודד באופן ידני ihcs בודדים מןהשכנים שלהם על ידי כלי עיפרון (M) כדי להמחיש טוב יותר את ארכיטקטורת ציטושלד ולוקליזציה סינפטית.
  7. כדי לבחון את הסמיכות של סרטים טרום סינפטיות (CtBP2) ותיקוני קולטן פוסט סינפטית (GluR2), לחלץ את שטח voxel סביב רצועת הכלים על ידי הכלי סימון מלבני ולבודד רצועת הכלים בודדים על ידי חיתוך. באמצעות לחיצה על תמונה ≫ גודל תמונה, לרכוש מערך תמונות ממוזערות של התחזיות האלה מיניאטורי, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לזהות סינפסות לזווג (הופיע כמו זוגות מקרוב של CtBP2-חיובית ו GluR2-חיובית דקדטה) לעומת יתום סרטים (מחסור במדבקות של קולטן גלוטמט פוסט-סינפטית) (איור 3).
    הערה: סינפסות שבלול נורמלית להופיע כמו immunolabeling משולב של הסרט preסינפטיות בתוך תא השיער (anti-CtBP2) ואת התיקון של מגלוטמט פוסט סינפטיות בטרמינל עצבי השמיעה (anti-GluR2)25. כמה מעבדות להשתמש בתחזיות קונפוקלית וקד בשילוב עם דוגמנות 3d כדי לכמת את גודל התיקון הסינפטית או נפח26,27. לפני אובדן משמעותי של הסרט סינפסות, סרטים המציגות שינויים בגודל או ללא מזווג מדבקות בקולטן גלוטמט סביר להניח מעיד על תפקוד סינפטית27,28.

6. הערכה פונקציונלית של רצועת הכלים של שבלול הסינפסות

  1. לאסוף את כל גלי ABR עבור כל גירוי בתדר שהוצגו ב SPL של 90 dB עבור ניתוח של הגלים ABR של suprathreshold אני המוני.
    הערה: מחקרים נוירולוגיים ומורפולוגיים הוכיחו כי נמוך הקצב הספונטנית סיבים פגיעים במיוחד להזדקנות רעש חשיפה29,30. למרות ההפסד הפשוט של הסינפסות הסרט לא יכול להשפיע על ספי ABR, זה בדרך כלל התוצאות הנחות משמעותיות ב-ABR גל אני המוני, כי אלה afferents כולל נמוכה הקצב ספונטנית, סיבים סף גבוהה ומדרג ספונטנית גבוהה, סיבים נמוך הסף תורמים בכבדות לפעילויות מסוכם של סיבי עצב שבלול28,29,31. עוצמה suprathreshold של 90 dB SPL נבחר כאן.
  2. קביעת גל משיא לשיא אני משרעת באמצעות תוכנית ניתוח לא מקוון (איור 4). כל גל שאני במבחן ABR מורכב הסטה חיובי (p) והטיה שלילית (n) שלאחר מכן. ABR גל אני משרעת מוגדר כהפרש מתח בין Ip (השיא החיובי של גל I) ו ב (הפסגה השלילית של גל I)29.
    הערה: בתנאים פתולוגיים, synaptopathy שבלול ניתן לקבוע מבוסס על הגברה suprathreshold של גל ABR אני, אשר משקפים את התגובות התפרצות מסוכם של SGNs עורר על ידי צליל. עם זאת, רגישות שבלול כי הוא לא נפרץ עקב תפקוד OHC הוא תנאי מוקדם עבור שיטה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ABR בדיקות שמיעה בוצעו עבור 10 C57BL/6J עכברים (8 שבועות של גיל) תחת הרדמה. ABRs היתה היתה באמצעות גירויים פרץ טון ב 4, 8, 16, 32, ו 48 kHz. סף השמיעה של כל חיה זוהה באופן חזותי על ידי הבחנה לפחות אחת צורת גל ברורה ב ABR. כל העכברים הציגו ספי ABR בתגובה התפרצויות טון, נע בין 25 ו 70 dB SPL בהתאם לתדירות של הגירוי. התוצאות שלנו הראו כי הסף שמיעה היה הנמוך ביותר 16 kHz (איור 1), המתאים כ 43% מרחק הקודקוד שבלול (איור 2), הרומז רגישות אקוסטית מופחת באופן משמעותי שבלול אחרים אזורים.

שבלול שלמות הטעינות היו מבודדים מעצמות הזמן בעכברים למבוגרים תחת מיקרוסקופ לנתיחה סטריאו (איור 2א). כל הטעינות של אפיתל השמיעה היו מיוצרים לתוך שלוש חתיכות, האורכים שנמדדו ובסופו של דבר הומרו למרחק אחוזים מקודקוד שבלול. מיקום התדר על קרום בזיאר של כל סיבוב שבלול היה מחושב באמצעות פונקציה לוגריתמי, כפי שתוארה בעבר5,6 (איור 2ב).

כדי להעריך את המאפיינים מורפולוגיים של הסינפסות בסרט שבלול, נוגדנים נגד CtBP2 ו GluR2 שימשו תוויות טרום סינפטיות ומבנים פוסט סינפטית, בהתאמה. באוזניים נורמלי של עכברים למבוגרים, מכתים חיסוני חשף זוגות של סרטים סינפטיות וטלאים קולטן גלוטמט לגרות את פני השטח של קרום basolateral של IHCs, עם 8 – 20 זוגות לכל IHCS (איור 3א). למרות שהרוב המכריע של הדקדטה הופיע כזוגות שהיו באוזניים רגילות, ניתן לצפות בסרטים יתומים לעתים נדירות בהגדלה גבוהה (איור 3ב). ספירות של הסינפסות ברצועת הכלים של IHC (כתמים אימונוtive עבור שני CtBP2 ו GluR2) היו הגבוהים ביותר ב -16 באזור kHz, ירידה משמעותית כאשר המרחק ממיקום זה עלה (איור 3ג). מספר הסינפטית נקבע על בסיס התחזיות הקונמוטיות לספק הערכה של המספר המירבי של סיבי עצב השמיעה המעבירים מידע מתוך שבלול למוח29.

הסטטוס הפונקציונלי של שבלול הסרט הסינפסות נחקר בכל העכברים למבוגרים המבוססים על גל הגברה abr המוני, אשר מספקים מידע לגבי שלמות תפקודית של סיבים עצביים השמיעה29,31. גל ABR אני מגביר המוני בכל תדר של גירוי הציג ברמת לחץ קול של 90 dB נמדדו משיא לאבוס הבא, כפי שמוצג באיור 4א. גל ABR אני משרעת היה הגבוה ביותר בתדר של 16 kHz, המתאים לסף השמיעה הנמוך ביותר, וערכי משרעת באופן משמעותי ירד במרחק ממיקום זה גדל (איור 4ב). תוצאה זו היא עקבית עם שינויים שנצפו בספירת הכלים סינפסה, המציינת כי הסינפסות בתוך אזור זה שבלול עשוי להפגין את תפקוד הסינפטית החיה ביותר. יתר על כן, בשנת לימודי העכבר הקודם של רעש המושרה הקשורות לגיל נוירוניוון שבלול, suprathreshold המוני גל ABR הצטמצמה בפרופורציה לאובדן סרט, המציין כי גל ABR אני משרעת הוא מאוד בקורלציה עם מידת שבלול synaptopathy29,31.

Figure 1
איור 1 : הערכת שמיעה. ABR השוואות הסף בין תדרים שונים של גירויים פרץ טון הראו כי הסף שמיעה היה הנמוך ביותר 16 kHz ב 10 מבוגרים C57BL/6J עכברים. תגובת ה-ABR הייתה מוגבהת באופן משמעותי באזורי תדר אחרים (ANOVA בכיוון אחד עם מבחן השוואת ההשוואה הכפולה של דנטו, הכולל את הבדיקה הראשונה של השוואה מרובה; *: P < 0.01, n = 20 אוזניים). נתונים מבוטאים כממוצע ± SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : לוקליזציה של תדר שבלול בעכברים. (א) דמות ייצוגית של ההסבר המלא שבלול, אשר בוטלה מעצם הרקה תחת מיקרוסקופ לנתיחה סטריאו. (ב) שבלול העכבר מחולק לתוך apical, באמצע, ו בסיס פונה, שבו הקיר הצדדי שבלול מוסר. עיגולים אדומים על השברים של קרום שבלול בסילאר מצביעים על מיקומי התדר ואת המיקומים המקבילים שלהם מנורמל ב שבלול (0% מתייחס איפקס שבלול, 100% לבסיס שבלול). סרגל קנה מידה = 250 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : אנליזה קונפוקלית מתוך הסינפסות בסרט שבלול בעכברים. (A) מייצגים תמונות של הסינפסות של סרט עבור 4, 8, 16, 32, ו 48 kHz אזורים, חיסוני עבור סרטים טרום סינפטיות (CtBP2, אדום) ו פוסט סינפטית מבנים (GluR2, ירוק). קווים מקווקווים לבנים משמשים למתאר תאי שיער פנימיים לצורך התייחסות. סרגל קנה מידה = 10 μm. (ב) High-power התמונות הממוזערות של קונפוקלית z-ערימות להראות כי הסינפסות הסרט האלה הופיעו באופן מקרוב זוגות של CtBP2-חיוביים (אדום) ו GluR2-חיובית (ירוק) דקדטה (שמאל ובאמצע), בעוד סרטים יתומים (מימין) חסר הסינפטיות כתמי קולטן גלוטמט היו נדירים מאוד. סרגל קנה מידה = 0.5 μm. (ג) ניתוח כמותי של לזווג ברצועת הכלים עם כל האלמנטים הפרסינפטית והפוסט-סינפטית התגלו כי מספר התאים הסינפטית לתאי השיער הפנימי היה גבוה באופן משמעותי באזור 16 kHz מאשר באזורים אחרים בתדירות (ANOVA בכיוון אחד עם מבחן השוואת ההשוואה הכפולה של דנטו; *: P < 0.01, n = 6 אוזניים). נתונים מבוטאים כממוצע ± SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : ניתוח גל אבאר אני המוני בעכברים . (א) נציג abr בצורת גל מן הישן 8 שבועות C57BL/6j העכבר נחשף 16 kHz הטון טהור בעוצמה של 90 dB (גירוי התפרצות ב 0 ms). ספרות רומיות לסמן את הפסגות של גלי ABR. קווים מנוקדים לסמן את הגל אני שיא שוקת, המציין את השרעת. (ב) ניתוח כמותי של גל ממוצע אני מגביר בתגובה ל 4, 8, 16, 32, ו 48 kHz גירוי הציג ברמת לחץ קול של 90 dB. גל ABR אני המוני היו הגבוהים ביותר בתדירות של 16 kHz ונמוך באופן משמעותי בתדרים אחרים (ANOVA בכיוון אחד עם מבחן מרובה ההשוואה של דאננט לאחר השוואה; *: P < 0.01, n = 20 אוזניים). נתונים מבוטאים כממוצע ± SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מאז synaptopathy שבלול התאפיין לראשונה בעכברים למבוגרים עם שינוי סף זמני (TTS) המושרה על ידי 8 \ u201216 kHz הלהקה רעש ב 100 dB SPL עבור 2 h31, חוקרים חקרו יותר ויותר את ההשפעות של synaptopathy במגוון יונקים, כולל קופים ובני אדם32,33. בנוסף לחשיפה רעש, מספר תנאים אחרים המשויכים synaptopathy שבלול (למשל, הזדקנות, השימוש בתרופות האוטוטוקסיטים, מוטציות גנטיות), המוביל להפרעה לטווח קצר של האודישן suprathreshold, ואחריו בלתי הפיך ניוון. של עצב השמיעה בשלב המוקדם של עלבון שבלול, synaptopathy מתרחשת לעתים קרובות במיקום תדירות מסוים, במיוחד במודלים ניסיוניים שבו נזק הסינפסות ihc מוגבל כדי לבחור אזורי תדר24,31. לכן, הפרוטוקול שלנו משמעותי בכך שהוא מאפשר חקירה של מורפולוגיה סינפטית ותפקוד באזור תדרים ספציפי.

המפה בתדר המקום שבלול יכול לשמש כדי להפלות פונקציה שמיעתי נורמלית וחריגים, עוד המשקף אזור רגיל נורמלי באוזן הפנימית. מאז טכניקות הכנה לפני השטח השתמשו לראשונה להתוות תאים שיער שלמים וחסרים שולי שבלול פונה שונים, cochleogram הפך שיטה שגרתית עבור הפסד תא השיער שיער6. לכן, כדי להתאים עלבונות מורפולוגיים ב שבלול לשינויים פיזיולוגיים רלוונטיים, זה סביר לכלול מפת תדר מקום על cochleogram. שיטה זו מאפשרת אחד לקבוע את מספר ומבנה של הסינפסות בהתבסס על המיקומים שלהם לאורך קרום שבלול השבלול ביחס להקים מפות בתדר שבלול מקום, ובכך לספק מספיק מידע עבור השוואות מפורטות בין תוצאות היסטולוגית ופיסיולוגיות. עם זאת, מחקרים מסוימים להעריך synaptopathy מבוסס על קטע שבלול או מרחק לאורך תעלת שבלול, אשר אינה מאפשרת השוואות ישירות בין שבלול הפרט בשל וריאציות פנים מינים באורך קרום בזיאר. לפיכך, חשוב במיוחד לתקנן את הcochleogram על-ידי המרת אורכי שבלול נפרדים ממילימטרים לאחוז יחסי.

Synaptopathy יכול להיות מאושר באמצעות ויזואליזציה של החיסוני עבור CtBP2 חלבון (הסינפטיות סינפטית "ribeye") באזורים בזלת הצלעות של IHCs. אלה טלאים CtBP2-חיוביים יכול לשמש כסמן מבניים עבור כימות של סרטים טרום סינפטיות, ואת הנוכחות של מדבקות פחות בדרך כלל מעיד על אובדן טרום סינפטיות. למרות מחקרים קודמים דיווחו כי 98% של סרטים טרום סינפטיות משויכים עם מסופים פוסט סינפטית באוזן נורמלית30, המספר הפשוט של תיקוני CtBP2-חיוביים לא יהיה מדויק עבור ניתוח כמותי של הסינפסות מלאה, כמו זה עלול להוביל להערכת יתר של ספירות סינפסה באוזן הפצועה על-ידי מעורבות "יתומים" (סרטים מוקדמים לא משויכים עם מסופים פוסט-סינפטיים). כדי לשפר את הדיוק של מספר סינפסה, נוגדנים נוספים נגד מבנה פוסט-סינפטית כגון GluA2, GluA2/3, או PSD-95 משמשים. החלבון בצפיפות postsynaptic PSD-95, קרום guanylate קינאז ממברנה (ממאת) בחלבון פיגומים, יכול להיות מתויג באמצעות נוגדן נגד PSD-95, אשר נצפתה בעיקר על אנשי הקשר בין תאי שיער ו-SGN לסופים סיבים34, 35. עם זאת, את הנוגדן נגד GluR2 הוא ספציפי יותר עבור קולטני-type ionotropic הקולטנים בקרום פוסטסינפטית, אשר יכול לזהות באופן אמין יותר את הסינפסות של הסרט (מעמת זוגות של אימונוofoooooooooooooa הCtBP2 ו פוסט סינפטית GluR2)15. בנוסף ניתוח מורפולוגיים, ניתוח היסטולוגית של סינפסות מלאה ניתן להשתמש כאינדיקטור פונקציונלי עבור synaptopathy. בעכברים למבוגרים עם synaptopathy שבלול, הנחות ב-abr גל משרעת בעקבות המצגת של גירויים טון בינוני עד גבוה מתרחשים בתדרים tonotopically מריחה על העור הקשורות לאזורים של אובדן סינפטית26,29. מונה סינפסה מושגת באמצעות שיטה זו מוגבלים בכך שלוקח כ 10 דקות לסרוק אתר אחד על קרום בזיאר. יתר על כן, כדי להעריך וריאציות מרחבי במספר סינפטית ומורפולוגיה המבוססת על מיקום IHC, יש צורך לזהות במדויק את הגבול של גוף ה-it (למשל, באמצעות כתמים רירן VIIa) ולבצע מסוים עיבוד תמונה שלבים26 . באמצעות שיטות כאלה, מחקרים קודמים אישרו כי אובדן הסינפטית הוא גדול יותר על הצד מודיעין של IHC מאשר בצד העמוד של מודלים בעלי חיים של ניוון רעש המושרה26.

מחקרים קודמים הוכיחו כי נמוך הקצב הספונטנית סיבים, גבוה-הסף רגישים יותר נזק לרעש מאשר בקצב ספונטני גבוה, סיבים נמוכים במודלים של בעלי חיים מוגבלים synaptopathy26,30. מחקרים אלה מספקים את הרציונל עבור שימוש הגברה suprathreshold של גל ABR (נמדד באמצעות גירוי בינוני עד גבוה ברמה גבוהה) כדי להעריך את תפקוד הסינפטיות במודלים בעלי חיים עם סף ABR נורמלי מוצר עיוות מכפלה אקוסטית פליטה ( DPOAEs). מכיוון שהגל העצמי של ABR משקף את התגובות העצביות מסוכם של סיבי עצב השמיעה, כאשר synaptopathy מוערך דרך גל ABR אני משרעת, בדיקות DPOAE צריך גם להתבצע כדי להוציא נזק OHC, אשר גם יכול להפחית המוני ABR המוני בשל הפרעה של התמרה חשמלית מכניזציה. למרות הגל הראשון של הפוטנציאל פעולה מורכבים (CAP), אשר נמדד מאלקטרודות חלון עגול, מייצג גם פעילות מסוכם של עצב שבלול, שיטה זו היא פולשנית יותר ומורכב יותר מאשר ABR מדידות. אם התגובות DPOAE לחזור נורמלי לאחר הסף הזמני משמרות רעש חשופים עכברים31 או שהם עדיין לא הידרדר עכברים הזדקנות29, משרעת suprathreshold של גל abr אני יכול מאוד לנבא את מידת synaptopathy שבלול , מאז הנוירונים מושפעים מושתקים כאשר הקשרים שלהם סינפטית שלהם התקשרויות IHCs מושבש. עם זאת, אם רגישות שבלול מופחת בשל גורמים שונים (למשל, בתפקוד OHC), פוחתת בגל ABR אני משרעת לא ניתן עוד לייחס רק לאובדן סינפטית משום שהם ישקפו את השילוב של כל נזק שבלול. לכן, תנאים ניסיוניים מבוקרת עבור הכנה מודל synaptopathy מוגבל נדרשים כדי להבטיח רגישות שבלול לא נפרץ על ידי גורמים אחרים. למרבה הצער, למרות גל ABR אני משרעת מספק מידה אובייקטיבית של הפסד סיבים עצביים השמיעה בבעלי חיים, קשה למדוד אצל בני אדם. יתר על כן, פתווגיות מעורבות מעורבים synaptopathy, אובדן של תאי שיער, ונוכחות של חריגות אחרות שבלול עשוי להופיע בבני אדם, הגבלת השימוש של גל ABR אני משרעת מדידות הגדרות קליניות. השהיית גל ABR מחושב כזמן באלפיות השניה מתחילת הגירוי לשיא חיובי של כל גל, מתן תובנה לתוך זמני השידור לאורך מסלול השמיעה. אין שינויים משמעותיים גל אני ההשהיה נצפו במודלים העכבר של רעש המושרה או הקשורות לגיל synaptopathy36שבלול. עם זאת, כמה ראיות עולה כי ההשפעות של רעש מיסוך על ההשהיה ABR V גל יכול לשמש כדי לאבחן synaptopathy שבלול בבני אדם37.

מספר מחקרים שנעשו לאחרונה תמכו הרעיון כי synaptopathy שבלול הוא האירוע הראשוני העיקרי הקשורים לאובדן שמיעה נסתר, טינטון, ו hyperacusis. למרות המושג של synaptopathy שבלול במחלות האוזן הפנימית הוקמה כעת היטב, השפעתה המפורטת על יכולת השמיעה נשאר ידוע. הפרוטוקול המוצג במחקר הנוכחי מאפשר את החקירה של מורפולוגיה ותפקוד של הסינפסות בסרט שבלול בתוך אזור תדר ספציפי. לפיכך, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור synaptopathy שבלול, המנגנונים הבסיסיים שלה, ואת היעילות של התערבויות טיפוליות פוטנציאליות בדגמים שונים של בעלי חיים ניסיוניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81770997, 81771016, 81830030); פרויקט המימון המשותף של קרן בייג למדעי הטבע וועדת החינוך של בייג (KZ201810025040); הקרן למדעי הטבע של בייג (7174291); ואת הקרן למדע פוסט-דוקטורט (2016M601067).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine hydrochloride Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China H35020148 100 mg/kg
Xylazine hydrochloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA X-1251 10 mg/kg
TDT physiology apparatus Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA Auditory Physiology System III
SigGen/BioSig software Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA Auditory Physiology System III
Electric Pad Pet Fun 11072931136
Dumont forceps 3# Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada 0203-3-PO
Dumont forceps 5# Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada 0209-5-PO
Stereo dissection microscope Nikon Corp., Tokyo, Japan SMZ1270
Goat serum ZSGB-BIO, Beijing,China ZLI-9021
Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4 Millipore Corp., Billerica, MA, USA MAB397 mouse 
Purified Mouse Anti-CtBP2 BD Biosciences, Billerica, MA, USA 612044 mouse 
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA A21124 goat
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA A21131 goat
Mounting medium containing DAPI ZSGB-BIO, Beijing,China ZLI-9557
Confocal fluorescent microscopy Leica Microsystems, Wetzlar, Germany TCS SP8 II
Image Pro Plus software Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA version 6.0
Professional diagnostic pocket otoscope Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China HS-OT10
Needle electrode Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China 1029 20 mm, 28 G
Closed-field speaker Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA CF1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers. Ear and Hearing. 36, (3), 86-92 (2015).
  2. Fettiplace, R. Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea. Comprehensive Physiology. 7, (4), 1197-1227 (2017).
  3. Liberman, M. C. The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency. Journal of the Acoustical Society of America. 72, (5), 1441-1449 (1982).
  4. Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94, (3), 951-986 (2014).
  5. Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202, (1-2), 63-73 (2005).
  6. Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197, (1-2), 1-10 (2004).
  7. Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6, 25056 (2016).
  8. Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. Journal of Neuroscience. 35, (19), 7509-7520 (2015).
  9. Wichmann, C., Moser, T. Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 361, (1), 95-114 (2015).
  10. Matthews, G., Fuchs, P. The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission. Nature Reviews Neuroscience. 11, (12), 812-822 (2010).
  11. Liberman, L. D., Liberman, M. C. Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area. Hearing Research. 339, 12-22 (2016).
  12. Yang, L., et al. Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice. Acta Oto-Laryngologica. 138, (1), 25-30 (2018).
  13. Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms. Hearing Research. 349, 138-147 (2017).
  14. Moser, T., Starr, A. Auditory neuropathy--neural and synaptic mechanisms. Nature Reviews Neurology. 12, (3), 135-149 (2016).
  15. Yu, W. M., et al. A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing. Elife. 2, 01341 (2013).
  16. Buniello, A., et al. Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing. EMBO Molecular Medicine. 8, (3), 191-207 (2016).
  17. Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure. Scientific Reports. 7, (1), 1054 (2017).
  18. Kane, K. L., et al. Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice. Hearing Research. 283, (1-2), 80-88 (2012).
  19. Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta). International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8, (10), 19058-19064 (2015).
  20. Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. Mouse auditory brainstem response testing. BIO-Protocol. 6, (6), (2016).
  21. Zhou, X., Jen, P. H. -S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice. Brain Research. 1091, (1), 16-26 (2006).
  22. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
  23. Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein's journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function. Neuron. 28, (3), 857-872 (2000).
  24. Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure. Scientific Reports. 6, 24907 (2016).
  25. Rutherford, M. A. Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy. Synapse. 69, (5), 242-255 (2015).
  26. Liberman, L. D., Liberman, M. C. Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16, (2), 205-219 (2015).
  27. Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. Journal of Neuroscience. 33, (47), 18409-18424 (2013).
  28. Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
  29. Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline. Journal of Neuroscience. 33, (34), 13686-13694 (2013).
  30. Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110, (3), 577-586 (2013).
  31. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29, (45), 14077-14085 (2009).
  32. Valero, M. D., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta). Hearing Research. 353, 213-223 (2017).
  33. Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
  34. Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14, (3), 321-329 (2013).
  35. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
  36. Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice. Neurophysiology. 49, (5), 316-326 (2017).
  37. Mehraei, G., et al. Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy. Journal of Neuroscience. 36, (13), 3755-3764 (2016).
מורפולוגית ופונקציונלית הערכה של הסרט סינפסות בתדר ספציפי אזורים של העכבר שבלול
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, S. K., Du, Z. D., Song, Q. L., Qu, T. F., Qi, Y., Xiong, W., He, L., Wei, W., Gong, S. S., Liu, K. Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (147), e59189, doi:10.3791/59189 (2019).More

Yu, S. K., Du, Z. D., Song, Q. L., Qu, T. F., Qi, Y., Xiong, W., He, L., Wei, W., Gong, S. S., Liu, K. Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (147), e59189, doi:10.3791/59189 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter